Μέρος 4: Χαρτογράφηση της επιγονιδιωματικής και μεταγραφικής αλληλεπίδρασης κατά τη διάρκεια του σχηματισμού της μνήμης και της ανάκλησης στο σύνολο του Hippocampal Engram

ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 3

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 5

RNA-seq

ul νερό χωρίς νουκλεάση), για 30 λεπτά στους 37 C με απαλό κούναγμα. Τα επαυξημένα θραύσματα DNA ενισχύθηκαν και κωδικοποιήθηκαν με γραμμικό κώδικα χρησιμοποιώντας αντίδραση PCR (1 κύκλος; 5 λεπτά – 72c, 30 δευτερόλεπτα – 98c, 10 κύκλοι· 15 δευτερόλεπτα – 98c, 30 δευτερόλεπτα – 60c, 3 λεπτά – 72c). Ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, το ενισχυμένο DNA καθαρίστηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια 1,8x AMPure (AmpureXP beads, Beckman Coulter, A63880). Μετά το QC του βιοαναλυτή για το μέγεθος και τη διανομή της βιβλιοθήκης, οι βιβλιοθήκες αλληλουχήθηκαν στην πλατφόρμα Illumina Nextseq 550 στο MIT BioMicro Center.

Cistanche και Cistanches για τη βελτίωση της μνήμης

Ανάλυση ATAC-seq—Τα ακατέργαστα δεδομένα fastq των 40-αναγνώσεων αλληλουχίας ζευγαριού τέλους bp ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς mm9 του ποντικιού χρησιμοποιώντας Bowtie 2.0 σε λειτουργία ζευγαρώματος άκρου50. Η συλλογή Samtools51 χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση, την αφαίρεση διπλότυπων PCR (rmdup), την ευρετηρίαση αρχείων BAM (ευρετήριο) και τον υπολογισμό στατιστικών στοιχείων βιβλιοθήκης (flagstat, βλέπε Συμπληρωματικός Πίνακας 13). Τα αρχεία BAM υποβλήθηκαν σε υποδειγματοληψία από σωστά ευθυγραμμισμένες, ζευγαρωμένες και μοναδικές αναγνώσεις σε 50M. Οι ανοικτές κορυφές χρωματίνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό MACS252 Οι περιοχές με διαφορική πρόσβαση (DARs) προσδιορίστηκαν από το Diffbind v1.16.353 με προεπιλεγμένες παραμέτρους και ρυθμίσεις για χρήση του DESeq2 (αποκοπή, FDR < 0,01,="" αλλαγές="" αναδίπλωσης=""> 1,5). Ο πλήρης πίνακας κανονικοποιημένων μετρήσεων (RPKM54) ανακτήθηκε από το πακέτο DiffBind. Για μια γενιά κομματιών bigwig, τα αρχεία σήματος pileup (συσσώρευση θραύσματος ανά εκατομμύριο αναγνώσεις) σε μορφή βιογραφίας κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση κορυφής κλήσης MACS2 με τις σημαίες -B-SPMR. Στη συνέχεια, ο κανονικοποιημένος εμπλουτισμός αναδίπλωσης (FE) σε ίχνη λάμδα εισόδου δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση bdgcmp του MACS2 με τη ρύθμιση - m FE. Στη συνέχεια, τα αρχεία bedGraph μετατράπηκαν σε μορφή bigwig.

Τα εργαλεία IGV55 χρησιμοποιήθηκαν για την οπτικοποίηση αρχείων bigwig. Το ChromHMM56 χρησιμοποιήθηκε για την καθιέρωση ενός μοντέλου κατάστασης χρωματίνης από δύο ανεξάρτητες μελέτες που χρησιμοποίησαν όγκο ιστού ιππόκαμπου πριν και μετά το σοκ του ποδιού21,22 και για τον προσδιορισμό της αναδίπλωσης του εμπλουτισμού των DARs έναντι του μοντέλου κατάστασης. Η ανάλυση εμπλουτισμού μοτίβων57,58 και ο σχολιασμός κορυφών πραγματοποιήθηκε από τα εργαλεία HOMER59. Όλοι οι κωδικοί είναι διαθέσιμοι σε συμπληρωματικό αρχείο λογισμικού εκχύλιση RNA και προετοιμασία βιβλιοθήκης—Ακολουθήστε αμέσως τη σταθεροποίηση και την ταξινόμηση (δείτε προετοιμασία ιστού), 4 ul πρωτεάσης προστέθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα πέψης (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Life Technologies, AM1975) . Τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασίες για 15 λεπτά στους 50 βαθμούς και μετά 15 λεπτά στους 80 βαθμούς. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 0,75 mL Trizol LS (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) και 0,2 mL διαλύματος φαινόλης: χλωροφόρμιου (Φαινόλη: Χλωροφόρμιο: Ισοαμυλική αλκοόλη, 1 φάση, VWR International, K169) σε κάθε δείγμα. έντονη ανακίνηση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Το εναιώρημα τοποθετήθηκε σε βαρείς σωλήνες γέλης κλειδώματος φάσης (PLG, 5 Prime, 2302830) και περιστράφηκε στις 13,000rpm για 5 λεπτά. Η υδάτινη φάση με νουκλεϊκά οξέα εκχυλίστηκε από τους σωλήνες σε φρέσκο ​​σωλήνα Eppendorf με ίση ποσότητα αιθανόλης 100 τοις εκατό. Ο καθαρισμός RNA πραγματοποιήθηκε με κιτ Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) για καθαρισμό RNA, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA εκλούστηκε (10 ul, DEPC) και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε στους -80 βαθμούς. Για την προετοιμασία και την ενίσχυση της βιβλιοθήκης χρησιμοποιήθηκε το SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006). 3 βιολογικά αντίγραφα (N=3) χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης. Οι βιβλιοθήκες προετοιμάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χωρίς επιπλέον βήμα κατακερματισμού (FFPE, επιλογή 2, βλέπε εγχειρίδιο), με εξάντληση του ριβοσωμικού cDNA και τελική ενίσχυση PCR (15 κύκλοι). Η αλληλουχία των βιβλιοθηκών έγινε στην πλατφόρμα Illumina HiSeq 2000 στο MIT BioMicro Center.

Ανάλυση RNA-seq—Τα ακατέργαστα δεδομένα fastq ευθυγραμμίστηκαν με την αναφορά mm9 του ποντικιού

γονιδίωμα χρησιμοποιώντας Bowtie 2.0. Οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις από σώματα γονιδίων (συμπεριλαμβανομένων των αναγνώσεων εξονίων και ιντρονίων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από τα Cufflinks 2.260 και DEseq261 με σχολιασμό γονιδίου αναφοράς UCSC mm9 για την εκτίμηση της αφθονίας μεταγραφής. Η διαφορική έκφραση γονιδίου και οι κατάντη αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας DEseq2 και προσαρμοσμένα σενάρια R. Η σχετική αφθονία των μεταγραφών μετρήθηκε με θραύσματα ανά κιλοβάση εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένα θραύσματα (FPKM).

Για την ανάλυση των μεταγραφικών προγραμμάτων, η έκφραση κάθε γονιδίου αξιολογήθηκε για διαφορετικάμνήμηφάσεις (Ενεργοποιήθηκε -πρώιμη, Ενεργοποιήθηκε -όψιμη, Επανενεργοποιήθηκε) από την αλλαγή log2 φορές (log2FC) από τη βασική κατάσταση. 1095 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DEGs) πέρασαν τα κριτήρια αποκοπής, στα οποία παρατηρήσαμε τουλάχιστον σε μία σύγκριση της τιμής P του< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Σύλληψη διαμόρφωσης χρωμοσωμάτων (Hi-C)

Πυρήνες από σταθερά κύτταρα (βλ. προετοιμασία ιστού) ταξινομήθηκαν σε σωλήνες Eppendorf 1,5 mL που περιείχαν 500 ul φρέσκου παγωμένου ρυθμιστικού λύσης (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 τοις εκατό Igepal CA{{{ 9}}, νερό βαθμού Pi και PCR) και καταψύχονται σε ξηρό πάγο και αποθηκεύονται στους -80c μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Οι βιβλιοθήκες Hi-C παρασκευάστηκαν από 100,000 κύτταρα/ανά ομάδα (συλλεγμένα από δύο ζώα) σε δύο βιολογικά αντίγραφα, χρησιμοποιώντας το εγχειρίδιο Dovetail™ Hi-C kit (v.1.03, Dovetail Genomics, Σικάγο, ΗΠΑ). Οι έξι βιβλιοθήκες Hi-C αλληλουχήθηκαν (ζευγοποιημένες) στην πλατφόρμα Illumina Nextseq 500. Ο αγωγός HOMER Hi-C χρησιμοποιήθηκε για το φιλτράρισμα πειραματικών τεχνουργημάτων όπως η κυκλοποίηση, οι αυτο-συνδέσεις και τα διπλά PCR. Οι φιλτραρισμένες αναγνώσεις ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα του ποντικού αναφοράς (mm9) και υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία χρησιμοποιώντας τη γραμμή HOMER HI-C.

Τα εργαλεία Hi-C του HOMER χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση ανάλυσης κύριου συστατικού (PCA) στα δεδομένα Hi-C για τον εντοπισμό υποπυρηνικών διαμερισμάτων (Α και Β) σε ανάλυση 50 Kb (βλ. συμπληρωματικό λογισμικό). Για ανάλυση διακόπτη διαμερίσματος, πρώτα αφαιρέσαμε τις τιμές PC1 μεταξύ των ομάδων. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τις κορυφαίες μεταβάσεις BtoA ως περιοχές με αλλαγή PC1 πάνω από το 90ο εκατοστημόριο και τις κορυφαίες μεταβάσεις AtoB ως περιοχές με αλλαγή PC1 κάτω από το 10ο εκατοστημόριο. Δεδομένου ότι τα υποπυρηνικά διαμερίσματα ρυθμίζονται ως μονάδες πολλών εκατοντάδων kilobases, ενοποιήσαμε διαδοχικά τμήματα AtoB ή BtoA 50 Kb που βρίσκονταν σε απόσταση 100 Kb το ένα από το άλλο. Ενοποιημένους τομείς που είχαν συνολικό μέγεθος μικρότερο από 200 Kb, απορρίψαμε. Ο διακόπτης διαμερίσματος λήφθηκε υπόψη μόνο εάν μια αρνητική τιμή μετατράπηκε σε θετική τιμή (και αντίστροφα). Τέλος, οι θετικές και αρνητικές τιμές του πρώτου συστατικού συγκρίθηκαν μεταξύ των τριών πληθυσμών του νευρώνα (Βασικός, Ενεργοποιημένος - πρώιμος και Ενεργοποιημένος - όψιμος).

Λήψη Hi-C από προωθητή

Μετά τη στερέωση και τη διαλογή (βλ. προετοιμασία ιστού) τα κύτταρα ταξινομήθηκαν σε σωλήνες Eppendorf 1,5 mL που περιείχαν 500 ul φρέσκου παγωμένου ρυθμιστικού λύσης (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 τοις εκατό Igepal CA{ {9}}, νερό ποιότητας Pi και PCR), καταψύχεται σε ξηρό πάγο και αποθηκεύεται στους -80c μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Οι βιβλιοθήκες Hi-C προετοιμάστηκαν από 10,000 κελιά /ανά ομάδα (N=3–4), όπως περιγράφηκε προηγουμένως62, με κάποια τροποποίηση. Τα δείγματα περιδινήθηκαν (4 βαθμοί, 1.600 g για 20 λεπτά) και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 400 ul ρυθμιστικού διαλύματος Cutsmart 1,2x (New England Biolabs,

ΗΠΑ). Η πρώτη περιοριστική πέψη πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο αρχικό πρωτόκολλο με 1.500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, ΗΠΑ), ως 6-κόφτης βάσης (αντί για BglII στο αρχικό πρωτόκολλο). Μετά την επισήμανση με βιοτίνη και την ολονύκτια σύνδεση (δείτε το αρχικό πρωτόκολλο για λεπτομέρειες), τα δείγματα περιδινήθηκαν (4 βαθμοί, 1.600 × g για 15 λεπτά) και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 25 μΙ PBS. Το εναιώρημα επωάστηκε σε 65c με 3 ul πρωτεϊνάσης Κ για 12-16 ώρες. Ο καθαρισμός του Hi-C DNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο αρχικό πρωτόκολλο με 100 ul σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (Dynabeads M{-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Για το δεύτερο ένζυμο περιορισμού, χρησιμοποιήσαμε τον 4-κόπτη βάσης Hpych4V (10 U / ανά δείγμα, R0620S, New England Biolabs, ΗΠΑ). Μετά την αντίδραση A-tailing (δείτε το αρχικό πρωτόκολλο για λεπτομέρειες), τα δείγματα ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR (17 κύκλοι) και καθαρίστηκαν με σφαιρίδια AMPure XP. Οι βιβλιοθήκες Hi-C εκλούστηκαν σε 20 μΙ 10 mM Tris-HCl (ρΗ 8,5). Σχεδιασμός συστήματος σύλληψης δολώματος για Promoter Capture Hi-C – Μια λίστα με 5000 προαγωγείς γονιδίων ποντικιού ελήφθη από το πρωτόκολλο που δημοσιεύτηκε προηγουμένως στο Schoenfelder. et al.29. Ο κατάλογος περιέχει μόνο μεταγραφές με βιοτύπο περιοχών που κωδικοποιούν πρωτεΐνη, με θέσεις θραυσμάτων περιορισμού HindIII. Σχεδιάστηκαν δύο ανιχνευτές σύλληψης 120 bp, ένας σε κάθε άκρο του θραύσματος. Οι ανιχνευτές συντέθηκαν από την Agilent Technologies σύμφωνα με το σύστημα εμπλουτισμού στόχων SureSelect (Agilent Technologies).

Προετοιμασία και προσδιορισμός αλληλουχίας βιβλιοθήκης Hi-C σύλληψης προαγωγέα – Για τη σύλληψη προϊόντων απολίνωσης Hi-C που περιέχουν αλληλουχίες προαγωγέα, χρησιμοποιήσαμε το προηγουμένως δημοσιευμένο πρωτόκολλο29. Εν συντομία, αναστολείς υβριδισμού (Agilent Technologies) προστέθηκαν στις βιβλιοθήκες DNA Hi-C. Το ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης και το RNA δολώματος σύλληψης παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Στη συνέχεια, οι αναστολείς DNA βιβλιοθήκης Hi-C/υβριδισμού θερμάνθηκαν για 5 λεπτά στους 95 βαθμούς, πριν τη μείωση της θερμοκρασίας στους 65 βαθμούς. Το DNA της βιβλιοθήκης Hi-C αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού (προθερμασμένο για 5 λεπτά έως 65 βαθμούς ) και στη συνέχεια με το προσαρμοσμένο σύστημα δολώματος σύλληψης (προθερμασμένο για 3 λεπτά έως 65 βαθμούς ), αποτελούμενο από 10,000 βιοτινυλιωμένο Τα RNA που στοχεύουν τα άκρα του θραύσματος περιορισμού HindIII των 5000 προαγωγέων γονιδίων ποντικού (Agilent Technologies, βλέπε Συμπληρωματικό Υλικό για σχεδιασμό δολώματος σύλληψης). Μετά από 24 ώρες στους 65 βαθμούς στη μηχανή PCR, διεξήχθη pulldown βιοτίνης (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) και πλύσεις ακολουθώντας το πρωτόκολλο εμπλουτισμού SureSelect Target (Agilent Technologies). Μετά την τελική πλύση, τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 30 μL NEBuffer 2 χωρίς προηγούμενη έκλουση DNA και πραγματοποιήθηκε PCR μετά τη σύλληψη (τέσσερις κύκλοι ενίσχυσης χρησιμοποιώντας εκκινητές γενικής χρήσης illumine) σε DNA που δεσμεύτηκε στα σφαιρίδια μέσω βιοτινυλιωμένου RNA. Οι βιβλιοθήκες Capture Hi-C αλληλουχήθηκαν με ζεύγη άκρου (Nextseq 500, Illumina).

Ανάλυση Hi-C σύλληψης προωθητή – η διοχέτευση HiCUP63 χρησιμοποιήθηκε για την επεξεργασία των ακατέργαστων αναγνώσεων αλληλουχίας fastq. Αυτός ο αγωγός χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση των ζευγών ανάγνωσης στο γονιδίωμα του ποντικιού (mm9), για το φιλτράρισμα πειραματικών τεχνουργημάτων (όπως κυκλοποιημένες αναγνώσεις και επανασυνδέσεις) και για την αφαίρεση διπλών αναγνώσεων. Για τα δεδομένα pc-HiC, τα αρχεία BAM που προέκυψαν υποβλήθηκαν σε υποδειγματοληψία και επεξεργασία με χρήση της έκδοσης 1.2.064 του CHiCAGO, ακολουθώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις για την κλήση σημαντικών αλληλεπιδράσεων. Πλήρεις λεπτομέρειες αυτού του αγωγού είναι διαθέσιμες από την Babraham Bioinformatics

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Στερεοταξική έγχυση αδενοειδούς ιού

Τα ποντίκια ArcCreERT2 αναισθητοποιήθηκαν με αβερτίνη και για έγχυση ιού AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (Serotype5, που ελήφθη από UNC ιικό πυρήνα). Αρχικά, έγινε μια μικρή τρύπα στο κρανίο πάνω από τον ραχιαίο ιππόκαμπο (σε σχέση με το Bregma: πρόσθιο-οπίσθιο −2.0 και μεσόπλευρο ± 1,5), κατέβηκε μια σύριγγα Hamilton με 33-gauge βελόνα έως -1,8 DV και 500 ηl ιού εγχύθηκαν με ρυθμό ροής 50 ηl ανά λεπτό και στους δύο ιππόκαμπους. Η βελόνα αποσύρθηκε, μετά από μια περίοδο 10 λεπτών μετά την ένεση και τα ποντίκια αφέθηκαν να αναρρώσουν για 4 ημέρες.