για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Συζήτηση

Τα μοριακά υπόβαθρα του σχηματισμού εγγραμμάτων ήταν μια περιοχή με μεγάλο ενδιαφέρον. Εδώ εκμεταλλευόμαστε το μοντέλο ποντικιού TRAP για να διασαφηνίσουμε τη δυναμική της προσβασιμότητας στη χρωματίνη, την 3-Δ γονιδιωματική αρχιτεκτονική και την έκφραση γονιδίων καθ' όλη τη διάρκεια ζωής ενός κυττάρου εγγράμματος. Πρώτον, το δείχνουμε ευθέωςμνήμηΗ κωδικοποίηση έχει τεράστια και μακροχρόνια επίδραση στην προσβασιμότητα της χρωματίνης. Μόλις δημιουργηθεί αυτή η κατάσταση χρωματίνης, τα επόμενα γεγονότα όπως π.χμνήμηΗ ενοποίηση και η ανάκληση φαίνεται να έχουν μικρή επίδραση στο τοπίο της χρωματίνης. Είναι πιθανό το επιλεγμένο χρονικό σημείο για ανάκληση να μην καταγράφει πλήρως τα συμβάντα χρωματίνης των επανενεργοποιημένων κυττάρων και οι επακόλουθες αλλαγές χρωματίνης μπορεί να σχετίζονται μεμνήμηεπανενοποίηση ή εξαφάνιση8. Είναι σημαντικό, σύμφωνα με τις προηγούμενες δημοσιεύσεις12, 13,23, τα στοιχεία μας υποδηλώνουν ότιμνήμηΟ σχηματισμός είναι σε μεγάλο βαθμό ένα φαινόμενο που καθοδηγείται από ενισχυτές.

Κάντε κλικ στο Cistanche UK για μνήμη

Δεύτερον, η μελέτη μας παρέχει το πρώτο ολοκληρωμένο τοπίο της αρχιτεκτονικής του 3D-γονιδιώματος κατά τη διάρκεια διαφορετικών φάσεων τουμνήμησχηματισμό, καθώς δείξαμε εκ νέου εντοπισμό μεγάλων τμημάτων χρωματίνης και ειδικές αλληλεπιδράσεις προαγωγέα-ενισχυτή δυναμικές εντός αυτών των διαμερισμάτων που επιτρέπουν τη λεπτομερή ρύθμιση διαφορετικών μεταγραφικών προγραμμάτων. Επιπλέον, δείχνουμε ότι οι προαγωγείς γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα κάτω αλληλεπιδρούν συχνότερα με ενισχυτές που διαθέτουν μεταγραφικούς καταστολείς και αντίστροφα.

Τέλος, η εργασία μας παρέχει τα πρώτα στοιχεία για ένα συμβάν λειτουργικής εκκίνησης, που χαρακτηρίζεται από μια αρχική αύξηση της προσβασιμότητας του ενισχυτή κατά τη διάρκεια της κωδικοποίησης, χωρίς αναμενόμενες μεταγραφικές αλλαγές. Η ανάλυσή μας αποκάλυψε ότι με την επανενεργοποίηση, οι νευρώνες engram χρησιμοποιούν ένα υποσύνολο αλληλεπιδράσεων denovopromoter-enhancer, όπου οι αρχικοί ενισχυτές έρχονται σε επαφή με τους αντίστοιχους προαγωγείς τους για να ρυθμίσουν προς τα πάνω γονίδια που εμπλέκονται στη μεταφορά mRNA και στην τοπική μετάφραση πρωτεΐνης σε συναπτικά διαμερίσματα. Αυτές οι αλλαγές αντιστοιχούσαν σε αναμενόμενες μορφολογικές και λειτουργικές αλλαγές. Συλλογικά, φαίνεται ότι τα κύτταρα engram σημειώνονται σε επιγενετικό επίπεδο και η αλληλεπίδραση μεταξύ της προσβασιμότητας της χρωματίνης, της αρχιτεκτονικής 3D-γονιδιώματος και των αλληλεπιδράσεων υποκινητή-ενισχυτή περιγράφει ένα καλά συντονισμένο σύστημα που οδηγεί σε καθυστερημένη μεταγραφική έκρηξη κατά την επανενεργοποίηση του εγγράμματος.

Όπως με κάθε εργασία, υπήρχαν αρκετοί περιορισμοί στη μελέτη. Η χρήση των εξαρτημένων από ταμοξιφαίνη ποντικών TRAP επιτρέπει τη χρονική ανάλυση, αλλά ανοίγει ένα παράθυρο επισήμανσης περίπου 12 ωρών που θα μπορούσε να οδηγήσει σε μη ειδική επισήμανση νευρώνων που δεν αποτελούν μέρος της εμπειρίας CFC. Επιπλέον, όπως προτάθηκε προηγουμένως37, οι νευρώνες με επισήμανση Arc μπορεί να είναι ετερογενείς και να περιλαμβάνουν διαφορετικά σύνολα που ρυθμίζουν και τα δύομνήμηδιάκριση και γενίκευση. Επιπλέον, οποιοδήποτε χρονικό σημείο πριν από 1,5–2 ώρες (πρώιμη), δεν θα είναι αρκετό για την καταγραφή μεταγραφικών και μεταφραστικών συμβάντων που προκαλούνται από ανασυνδυασμό DNA, δηλαδή την έκφραση της ανασυνδυάσης Cre και την τελική έκφραση του γονιδίου eYFP5. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι πολλές πρώιμες-παροδικές συστάδες DEG παραλείφθηκαν, καθώς είχε αποδειχθεί προηγουμένως ότι πολλά IEG επιστρέφουν στα βασικά επίπεδα μετά από 2 ώρες (εκτός από το Arc46). Τέλος, αν και η μελέτη μας επικεντρώθηκε στον ιππόκαμπο, η δομική και η συναπτική πλαστικότητα έχουν συνδεθεί με τη μακροπρόθεσμη αποθήκευση πληροφοριών σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου, όπως ο προμετωπιαίος φλοιός, η αμυγδαλή2. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να καθορίσουν εάν αυτές οι επιγενετικές αλλοιώσεις μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια παγκόσμια κρίσιμη διαδικασία που εμπλέκεται στον μακροπρόθεσμο σχηματισμό και διατήρηση των αναμνήσεων ή εάν είναι μοναδική στα κυκλώματα του ιππόκαμπου.

Μέθοδοι

Ποντίκια και συμπεριφορά

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως6, τα ποντίκια ArcCreERT2(συν) εκτράφηκαν με ομόζυγη γραμμή R26R-STOP-floxed-κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (eYFP). ~140 επόμενοι αρσενικοί απόγονοι γονοτυποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο γονότυπου του εργαστηρίου Jackson. Τα ποντίκια στεγάστηκαν τέσσερα έως πέντε ανά κλουβί σε ένα δωμάτιο αποικίας 12 ωρών (06:00–18:00) ανοιχτού-σκοτεινού στους 22 βαθμούς με υγρασία 40–60 τοις εκατό. Τροφή και νερό παρείχαν κατά βούληση. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος συμπεριφοράς κατά τη φάση του φωτός. 1 ώρα πριν από τη δοκιμή συμπεριφοράς, τα ποντίκια έλαβαν μία δόση 4-Hydroxytamoxifen (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), η οποία ανοίγει ένα παράθυρο επισήμανσης ~12 ωρών5. Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η μη ειδική ετικέτα eYFP, μία ημέρα πριν από την εργασία συμπεριφοράς (π.χ. CFC), τα ποντίκια στεγάστηκαν μόνοι σε σκοτεινό/σκοτεινό θάλαμο 24 ωρών. Επιπλέον, για να μειωθούν τα επίπεδα άγχους, προστέθηκε ένας σωλήνας στο κλουβί για καταφύγιο και φωλιά. Την επόμενη μέρα, τα ποντίκια ενέθηκαν με ΤΑΜ 1 ώρα πριν από το CFC. Μετά την εργασία συμπεριφοράς, τα ποντίκια είτε υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά από 1,5-2 ώρες και συλλέχθηκαν οι εγκέφαλοι. ή τοποθετήστε ξανά στο σκοτεινό θάλαμο για τις επόμενες 48 ώρες. Αφού τα ποντίκια αφαιρέθηκαν από το σκοτάδι, επέστρεψαν στον κανονικό κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών (06:00–18:{00), στο ίδιο δωμάτιο. 3 ημέρες αργότερα (συνολικά 5 ημέρες μετά το CFC), τα μισά από τα ποντίκια κοόρτης υποβλήθηκαν σε ευθανασία και συλλέχθηκαν εγκέφαλοι, ενώ τα άλλα μισά επέστρεψαν στην αίθουσα δοκιμών, όπου εκτέθηκαν στο σημάδι που προκαλεί φόβο (τόνος και πλαίσιο) . Όλες οι εργασίες με ποντίκια εγκρίθηκαν από την Επιτροπή για τη φροντίδα των ζώων του Τμήματος Συγκριτικής Ιατρικής στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Μασαχουσέτης. Το Cistanche μπορεί να βελτιωθείμνήμη.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Συμφραζόμενη διαμόρφωση φόβου

Η συσκευή ρύθμισης του φόβου με βάση τα συμφραζόμενα (CFC) και το πρόγραμμα απόκτησης ήταν από την TSE- Systems. Τα ποντίκια εισήχθησαν στον θάλαμο CFC, μετά από 3 λεπτά αρχικής εξοικείωσης, παρουσιάστηκε τόνος 3 κιλών Hz με ένταση 80 DB για 30 δευτερόλεπτα και συνολοκληρώθηκε με σοκ ποδιών 0,7 mA για 1 δευτερόλεπτο. Μεταξύ των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε 70 τοις εκατό ισοπροπανόλη για τον καθαρισμό των κλουβιών. 5 ημέρες αργότερα, τα ποντίκια εισήχθησαν στο αρχικό ρυθμισμένο περιβάλλον σε συνδυασμό με τον τόνο και τα επίπεδα παγώματος μετρήθηκαν για 3 λεπτά (προεπιλεγμένες παράμετροι του λογισμικού TSE που χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση των συμπεριφορών παγώματος), για να αξιολογηθούν τα συμφραζόμεναμνήμη. Το πλαίσιο Β ήταν ένα τροποποιημένο πλαίσιο Α. Οι ράβδοι από ανοξείδωτο χάλυβα καλύφθηκαν με λευκό πλαστικό ένθετο, τα εξωτερικά τοιχώματα των θαλάμων καλύφθηκαν με σχήματα κολλητικής ταινίας για να αλλάξει η εμφάνιση του θαλάμου. Ο θάλαμος ήταν αρωματισμένος με βανίλια, ο φωτισμός του δωματίου ήταν πολύ πιο φωτεινός και τα ποντίκια μεταφέρθηκαν στη συσκευή σε διαφορετικό καρότσι από το πλαίσιο Α.

Φάρμακα

Ο ανασυνδυασμός σε διαγονιδιακά ποντίκια ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP προκλήθηκε χρησιμοποιώντας 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-ΟΗΤ διαλύθηκε σε 2,5 ml EtOH /100 τοις εκατό και ανακινήθηκε σε αναδευτήρα για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 5 ml αραβοσιτέλαου και ανακινήθηκαν σε αναδευτήρα για 1 ώρα. Τέλος, τοποθετήθηκαν σωλήνες για 30 λεπτά στους 60 βαθμούς για να επιτραπεί η πλήρης εξάτμιση του EtOH. Εφάπαξ ένεση 50 mg/kg εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά (IP).

Ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Τα ποντίκια εγχύθηκαν διακαρδιακά με παγωμένο 25 ml φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (PBS) ακολουθούμενα από 40 ml παραφορμαλδεΰδης 4 τοις εκατό σε PBS. Οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν και μετα-μονιμοποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό PFA κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς και μεταφέρθηκαν σε PBS μέχρι την τομή. Οι εγκέφαλοι τοποθετήθηκαν σε ένα στάδιο δόνησης (Leica VT1000S) χρησιμοποιώντας υπερκόλλα και τεμαχίστηκαν με πάχος τομής 40 μm. Οι φέτες πλύθηκαν με PBS και μπλοκαρίστηκαν χρησιμοποιώντας 1 τοις εκατό λευκωματίνη ορού βοοειδών (BSA) που παρασκευάστηκε σε PBS που περιέχει 0,1 τοις εκατό Triton-X100 (PBST) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Το ρυθμιστικό αποκλεισμού αναρροφήθηκε έξω και οι φέτες επωάστηκαν με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα (Συμπληρωματικός Πίνακας 11) όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς σε αναδευτήρα. Οι φέτες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές για 15 λεπτά η καθεμία με το ρυθμιστικό αποκλεισμού και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα συζευγμένα δευτερεύοντα αντισώματα Alexa Fluor 488, 594 ή 647 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις 15 λεπτών η καθεμία με ρυθμιστικό αποκλεισμού και μία τελική πλύση με PBS για 10 λεπτά, οι φέτες τοποθετήθηκαν με fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Το Cistanche μπορεί να βελτιωθείμνήμη.

In Situ Hybridization (RNAscope®)

Τα δείγματα παρασκευάστηκαν με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή για τη δοκιμασία RNAscope® multiplex fluorescent v2 (Advanced cell diagnostics, USA), με λίγες τροποποιήσεις και συνδυάστηκαν με το πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας (IHC). Πρώτον, τα δείγματα χρωματίστηκαν για πρωτογενή (Arc και GFP) και δευτερεύοντα (Alexa Fluor 488 και 594, αντίστοιχα) αντισώματα (όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο IHC παραπάνω). Οι φέτες εγκεφάλου ενσωματώθηκαν σε μια γυάλινη διαφάνεια και

αφυδατώθηκε για 30 λεπτά σε RT. Στη συνέχεια, σχεδιάστηκε ένα φράγμα γύρω από κάθε τμήμα με το υδρόφοβο στυλό Immedge™ και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου RNAscope® για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (δεν εφαρμόστηκε ανάκτηση στόχου και επεξεργασία με πρωτεάση). Με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα τμήματα υποβλήθηκαν σε υβριδισμό ανιχνευτή (RNAscope® Probe-Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), ενίσχυση και ανάπτυξη σήματος HRP-C1 χρησιμοποιώντας το κανάλι TSA® Plus Cyanine 5. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη.

Απεικονιστική ανάλυση

Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακά μικροσκόπια LSM 710 ή LSM 880 (Zeiss) με αντικειμενικούς φακούς 10×, 20×, 40× ή 63× σε ίδιες ρυθμίσεις για όλες τις συνθήκες. Οι εικόνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ 1.42q ή Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Ζυρίχη, Ελβετία). Για κάθε πειραματική συνθήκη, χρησιμοποιήθηκαν πέντε στεφανιαίες τομές από τουλάχιστον πέντε ζώα για ποσοτικοποίηση. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6μM) για την αφαίρεση της μη ειδικής επισήμανσης, πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση των διπλά θετικών κυττάρων στα CA1, CA3 και DG. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη.

Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών Eif και Gria1/mRNA—Η μονάδα επιφανειών χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση και την τρισδιάστατη απόδοση των νευρώνων αξόνων με βάση το σήμα GFP. Έπειτα, τα θετικά σημεία EiF2a, Eif4E, Eif3E και Gria1 -μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μονάδα σημείων. Τέλος, η λειτουργική μονάδα Spots Close - To - Surface Xtension εκτελέστηκε για να βρει το υποσύνολο των σημείων που είναι πιο κοντά στα αντικείμενα της επιφάνειας από το καθορισμένο όριο 1 uM και εξαίρεση των σημείων που βρίσκονται εκτός αυτού του εύρους.

Μορφολογία σπονδυλικής στήλης - Οι σπονδυλικές στήλες ταξινομήθηκαν σε τρεις τύπους με βάση το μήκος της σπονδυλικής στήλης (L), τη διάμετρο της κεφαλής (Dh) και τη διάμετρο του αυχένα (Dn). Αδύναμα αγκάθια – Dn=L, Λεπτά αγκάθια – L > Dn και Dh Μεγαλύτερη ή ίση με Dn, Ακάνθια μανιταριού – Dh Μεγαλύτερη ή ίση με 2Dn, Διευρυμένα αγκάθια μανιταριού – Dh Μεγαλύτερη ή ίση με 2Dn.Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Προετοιμασία ιστού

Ο ιστός του ιππόκαμπου εξήχθη και καταψύχθηκε με φλας. Μετά την εκχύλιση, τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν αμέσως σε {{0}}.5 mL παγωμένο PBS με αναστολείς πρωτεάσης (Pi) (11836170001, Roche ). Για να μετριαστεί όσο το δυνατόν περισσότερο ο αντίκτυπος ταξινόμησης, μόνο στα πειράματα NC-RNAseq και capture-HiC, το εναιώρημα σταθεροποιήθηκε με 1 τοις εκατό (για NC-RNAseq/HiC) ή 2 τοις εκατό (pc-HiC) παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, σβησμένο με Γλυκίνη 2,5Μ για 5 λεπτά και πλύθηκε δύο φορές με 5 mL PBS. Αυτή η διαδικασία διατηρεί το τοπίο μεταγραφής και χρωματίνης και ελαχιστοποιεί την προκατάληψη ταξινόμησης. Για τα ATACseq, RNAseq και capture-HiC, το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 1200 g, στους 4 βαθμούς, για 5 λεπτά και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 5 mL NF{20}} υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (0,5 τοις εκατό Triton X-100/ 0,1 Μ Σακχαρόζη/5 mM MgCl2/1 mM EDTA/ 10 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, Pi). Έπειτα, το εναιώρημα ομογενοποιήθηκε (γουδοχέρι Α) με 30 πινελιές και το γουδοχέρι πλύθηκε με επιπλέον 5 mL NF{36}} ρυθμιστικού διαλύματος για ένα συνδυασμένο σύνολο 10 mL. Το εναιώρημα συλλέχτηκε όλο σε έναν κωνικό σωλήνα 15 mL, διηθήθηκε με φίλτρο πλέγματος 70 μm (08–771-2, Falcon) και επωάστηκε σε πάγο για 30 λεπτά. Οι σφαιροποιημένοι πυρήνες (όλοι οι φυγόκεντροι ήταν 4 μοιρών, 1.600 × g για 15 λεπτά) επαναιωρήθηκαν σε 10 mL PBS συν 1 τοις εκατό BSA συν Pi και επωάστηκαν σε πάγο για 1 ώρα. Οι πυρήνες περιδινήθηκαν και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1 mL PBST συν 1 τοις εκατό BSA συν Pi και επωάστηκε με πρωτογενή αντισώματα NeuN, Arc και GFP για όλη τη νύχτα σε 4 βαθμούς. Τα μη συνδεδεμένα αντισώματα ξεπλύθηκαν δύο φορές με 5 mL PBS και τελικά επαναιωρήθηκαν σε 1 mL PBS συν 1 τοις εκατό BSA συν Pi και δευτερεύοντα αντισώματα για 2-4 ώρες στους 4 βαθμούς. Μετά από δύο πλύσεις, οι πυρήνες επαναιωρήθηκαν σε 0,5 mL (PBS συν 1 τοις εκατό BSA συν Pi) και διηθήθηκαν με φίλτρο πλέγματος 40 μm για ταξινόμηση FACS. 4',6-Διυδροχλωρική διαμιδίνη-2'-φαινυλινδόλη (DAPI) προστέθηκε απευθείας στους σωλήνες FACS (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Το Cistanche μπορεί να βελτιωθείμνήμη.

Κυτταρομετρία ροής

Για την κυτταρομετρία ροής, οι πυρήνες περιορίστηκαν πρώτα χρησιμοποιώντας παραμέτρους της περιοχής παλμού προς τα εμπρός και πλάγιας διασποράς (FSC-A και SSC-A) εξαιρουμένων των υπολειμμάτων, ακολουθούμενη από αποκλεισμό συσσωματωμάτων χρησιμοποιώντας πλάτος παλμού (FSC-W και SSC-W). Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε χρώση ισοτύπου ελέγχου για να ρυθμιστούν οι πύλες NEUN plus, ARC plus και GFP plus. Για να εξασφαλιστεί ένας ομοιογενής νευρωνικός πληθυσμός, ο πληθυσμός NeuN plus περιορίστηκε πριν από την κάλυψη των πληθυσμών με βάση το ARC plus και το GFP συν φθορισμό. Ταξινομήσαμε τέσσερις διαφορετικούς πληθυσμούς από τρία διαφορετικά χρονικά σημεία. Περίπου 1,5–2 ώρες μετά την έκθεση σε FS i) NeuN συν /GFP συν ii) NeuN συν /GFP-. Μετά από πέντε ημέρες, ελλείψει ανάκτησης, συλλέξαμε iii) NeuN συν /GFP συν . Σε μια διαφορετική ομάδα, τα ποντίκια εκτέθηκαν ξανά στο εξαρτημένο ερέθισμα. 1,5–2 ώρες μετά την επανέκθεση συλλέξαμε iv) NeuN plus /ARC plus /GFP plus . Όλοι οι πυρήνες ταξινομήθηκαν σε σωλήνες Eppendorf 1,5 mL που περιείχαν; 500 ul PBS συν 1 τοις εκατό BSA συν Pi για ATCAseq, 200 ul ρυθμιστικού διαλύματος πέψης (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE, Cat. AM1975, Invitrogen) για RNAseq, 500 ul φρέσκο ​​παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM Tris pH=8, 10 mM NaCl, 0,2 τοις εκατό Igepal CA-630, νερό ποιότητας Pi και PCR) για Hi-C/capture-HiC. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το Flowjo (v10).

ChIP-qPCR

Αμέσως μετά την ακόλουθη ταξινόμηση, 10,000 κύτταρα σφαιροποιήθηκαν στους 4 βαθμούς, 1.600 × g για 15 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS. Το ChIP διεξήχθη με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή για το κιτ ChIP-IT High Sensitivity® (HS) (Κατάλογος Αρ. 53040, Active Motif, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) και anti-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) αντισώματα. Οι δοκιμασίες ChIP πραγματοποιήθηκαν σε μια μονάδα PCR σε πραγματικό χρόνο σύνδεσης Bio-Rad CFX96 χρησιμοποιώντας μίγμα αντιδραστηρίων SsoFast™ EvaGreen® qPCR (Bio-Rad, 172–5202). Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν ως εισαγόμενα. Οι αλληλουχίες των ζευγών εκκινητών για προσδιορισμούς ChIP-qPCR παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 12.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

ATAC-ακολουθ

προετοιμασία βιβλιοθηκών— Οι βιβλιοθήκες ακολουθιών ATAC παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο 49 με μικρή τροποποίηση. 10,000 κύτταρα από κάθε ομάδα, ανασύρθηκαν από 8–10 διαφορετικά ποντίκια και θεωρήθηκαν ως N=1. 3-4 βιολογικά αντίγραφα (N=3-4) χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης. Αμέσως μετά την ακόλουθη ταξινόμηση, τα κύτταρα περιδινήθηκαν (4 μοίρες, 1.600 × g για 15 λεπτά) και επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​50 ul ψυχρού ρυθμιστικού λύσης (0,15 τοις εκατό NP-40 αντί για Igpal) και ανακινήθηκαν σε πάγο για 10 λεπτά . Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε αντίδραση τμηματοποίησης (Nextera DNA δείγματος προετοιμασίας κιτ 24 αντιδράσεις, FC{-121–1030, Illumina) σε όγκο 25 ul (12,5 ul TD, 1,25 ul TDE1, 11,25 ul νερό χωρίς νουκλεάση), για 30 min στους 37c με απαλό λίκνισμα. Τα επαυξημένα θραύσματα DNA ενισχύθηκαν και κωδικοποιήθηκαν με γραμμικό κώδικα χρησιμοποιώντας αντίδραση PCR (1 κύκλος; 5 λεπτά – 72c, 30 δευτερόλεπτα – 98c, 10 κύκλοι· 15 δευτερόλεπτα – 98c, 30 δευτερόλεπτα – 60c, 3 λεπτά – 72c). Ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, το ενισχυμένο DNA καθαρίστηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια 1,8x AMPure (AmpureXP beads, Beckman Coulter, A63880). Μετά το QC του βιοαναλυτή για το μέγεθος και τη διανομή της βιβλιοθήκης, οι βιβλιοθήκες αλληλουχήθηκαν στην πλατφόρμα Illumina Nextseq 550 στο MIT BioMicro Center. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη.

Ανάλυση ATAC-seq—Τα ακατέργαστα δεδομένα fastq των 40-αναγνώσεων αλληλουχίας ζευγαριού τέλους bp ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς mm9 του ποντικιού χρησιμοποιώντας Bowtie 2.0 σε λειτουργία ζευγαρώματος άκρου50. Η συλλογή Samtools51 χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση, την αφαίρεση των διπλότυπων PCR (κόκκινο επάνω), την ευρετηρίαση αρχείων BAM (ευρετήριο) και τον υπολογισμό στατιστικών στοιχείων βιβλιοθήκης (flagstat, βλέπε Συμπληρωματικός Πίνακας 13). Τα αρχεία BAM υποβλήθηκαν σε υποδειγματοληψία από σωστά ευθυγραμμισμένες, ζευγαρωμένες και μοναδικές αναγνώσεις σε 50M. Οι ανοικτές κορυφές χρωματίνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό MACS252 Οι περιοχές με διαφορική πρόσβαση (DARs) προσδιορίστηκαν από το Diffbind v1.16.353 με προεπιλεγμένες παραμέτρους και ρυθμίσεις για χρήση του DESeq2 (αποκοπή, FDR < 0,01,="" αλλαγές="" αναδίπλωσης=""> 1,5). Ο πλήρης πίνακας κανονικοποιημένων μετρήσεων (RPKM54) ανακτήθηκε από το πακέτο DiffBind. Για μια γενιά κομματιών bigwig, τα αρχεία σήματος pileup (συσσώρευση θραύσματος ανά εκατομμύριο αναγνώσεις) σε μορφή βιογραφίας κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση κορυφής κλήσης MACS2 με τις σημαίες -B-SPMR. Στη συνέχεια, ο κανονικοποιημένος εμπλουτισμός αναδίπλωσης (FE) σε ίχνη λάμδα εισόδου δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση bdgcmp του MACS2 με τη ρύθμιση - m FE. Στη συνέχεια, τα αρχεία bedGraph μετατράπηκαν σε μορφή bigwig. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Τα εργαλεία IGV55 χρησιμοποιήθηκαν για την οπτικοποίηση αρχείων bigwig. Το ChromHMM56 χρησιμοποιήθηκε για την καθιέρωση ενός μοντέλου κατάστασης χρωματίνης από δύο ανεξάρτητες μελέτες που χρησιμοποίησαν τον όγκο του ιστού του ιππόκαμπου πριν και μετά το σοκ του ποδιού21,22 και για τον προσδιορισμό των προσφορών εμπλουτισμού πτυχής έναντι του μοντέλου κατάστασης. Η ανάλυση εμπλουτισμού μοτίβων57,58 και ο σχολιασμός κορυφών πραγματοποιήθηκαν από τα εργαλεία HOMER59. Όλοι οι κωδικοί είναι διαθέσιμοι σε ένα συμπληρωματικό αρχείο λογισμικού