Μέρος 3: Η εκροή μαγνησίου από τα κύτταρα Drosophila Kenyon είναι κρίσιμη για τη φυσιολογική και βελτιωμένη με δίαιτα μακροπρόθεσμη μνήμη

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

Κάντε κλικ στοΟφέλη και παρενέργειες του Cistanche για τη μνήμη

περιοριζόταν σε ενήλικες μύγες, υποδηλώνοντας ότι το UEX έχει πιο διατηρημένο ρόλο στη νευρωνική φυσιολογία. Αντίθετα, η πτώση της έκφρασης uex είτε στους κοιλιακούς είτε στους νευρώνες a{{0}}b0 δεν επηρέασε το LTM. Η δραστηριότητα των a0 b0 νευρώνων απαιτείται μετά την προπόνηση για την εδραίωση της ορεκτικής LTM (Krashes and Waddell, 2008), ενώ η έξοδος abc και abs KC, μαζί και χωριστά, είναι απαιτείται για την έκφρασή του (Krashes and Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Ως εκ τούτου, η παρατήρηση της κανονικής απόδοσης LTM σε μύγες με απώλεια λειτουργίας uex στους κοιλιακούς και τους νευρώνες a0b0 αντιτίθεται σε μια γενική ανεπάρκεια της λειτουργίας των κοιλιακών νευρώνων κατά τον χειρισμό του uex.

Το διαιτητικό Mg2 plus δεν μπορούσε να βελτιώσει την ελαττωματική απόδοση LTM των μυγών που ήταν ιδιοσυστατικά μεταλλαγμένες uex ή έφεραν απώλεια λειτουργίας uex περιορισμένης από KC. Ωστόσο, η έκφραση uex στα ab KC των μεταλλαγμένων μυγών uex αποκατέστησε την ικανότητα του Mg2 plus να βελτιώνει την απόδοση. Επομένως, τα ab KCs είναι ο κυτταρικός τόπος για το Mg2 συν -ενισχυμένομνήμηστη μύγα.

Ίσως φαίνεται αντιφατικό ότι απαιτείται εκροή μαγνησίου κατευθυνόμενη από UEX σε KC για την υποστήριξη τηςμνήμη-ενίσχυση των επιδράσεων του Mg2 συν σίτιση, όταν το διαιτητικό Mg2 συν αυξάνει την KC [Mg2 συν ]i . Σε αυτό το στάδιο, μπορούμε μόνο να υποθέσουμε γιατί συμβαίνει αυτό. Υποθέτουμε ότι ο εγκέφαλος και τα ab KCs, ειδικότερα, πρέπει να προσαρμοστούν με ισορροπημένο τρόπο στα υψηλότερα επίπεδα ενδοκυτταρικού και εξωκυτταρικού Mg2 συν που προκύπτουν από τα συμπληρώματα διατροφής. Η ζωντανή μας απεικόνιση του KC [Mg2 plus ]i σε εγκεφάλους μεταλλαγμένων άγριου τύπου και uex υποδηλώνει ότι η εκροή που κατευθύνεται από το UEX είναι πιθανό να είναι ένας ουσιαστικός παράγοντας στην ενεργό, και ίσως προκαλούμενη από ερεθίσματα, ομοιοστατική διατήρηση αυτών των αυξημένων επιπέδων.

Ένας αριθμός τύπων κυττάρων θηλαστικών εξωθεί το Mg2 συν με τρόπο εξαρτώμενο από το cAMP, λίγα λεπτά μετά την έκθεση τους σε β-αδρενεργική διέγερση (Romani και Scarpa, 2000· Vormann και Gu¨n-ther, 1987· Jakob et al., 1989· Romani and Scarpa, 1990b· Romani and Scarpa, 1990a· Vormann and Gu¨nther, 1987· Gu¨nther et al., 1990· Howarth et al., 1994). Η παρουσία ενός τομέα CNBH υποδηλώνει ότι τα UEX και CNNM θα μπορούσαν να ρυθμιστούν άμεσα από το cAMP. Δοκιμάσαμε τη σημασία του CNBH εισάγοντας μια υποκατάσταση αμινοξέος R622K που θα αποκλείει τη δέσμευση cAMP στο UEX CNBH. Αυτή η λεπτή μετάλλαξη κατάργησε την ικανότητα του διαγονιδίου uexR622K να αποκαθιστά την απόδοση LTM σε μεταλλαγμένες μύγες uex. Χρησιμοποιήσαμε επίσης το CRISPR για να μεταλλάξουμε το CNBH στον εγγενή τόπο uex. Αν και η διαγραφή του CNBH από το CNNM4 κατήργησε τη δραστηριότητα εκροής Mg2 συν (Chen et al., 2018), οι μύγες που ήταν ομόζυγες για τη βλάβη uexT626NRR ήταν βιώσιμες, αποδεικνύοντας ότι διατηρούν επαρκές επίπεδο λειτουργίας UEX. Ωστόσο, αυτές οι μύγες εμφάνισαν μειωμένη άμεση και μακροπρόθεσμη βλάβημνήμη. Επιπλέον, η απόδοση των μυγών uexT626NRR δεν μπορούσε να βελτιωθεί με τη σίτιση με Mg2 συν. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι ένα άθικτο CNBH είναι ένα κρίσιμο στοιχείο τουμνήμη-Σχετική λειτουργία UEX. Η δέσμευση των πρωτεϊνών προσαρμογής κλαθρίνης στο CNNM4 CNBH έχει εμπλακεί στη βασοπλευρική στόχευση (Hirata et al., 2014), υποδηλώνοντας ότι το UEXT626NRR μπορεί να εντοπίζεται ακατάλληλα στα KCs. Επιπλέον, έκφραση KC της μεταλλαγμένης παραλλαγής CNNM2 E122K, η οποία διατηρεί την υπολειπόμενη λειτουργία

αλλά έχει ελάττωμα διακίνησης (Arjona et al., 2014), δεν αποκατέστησε το ελάττωμα uex LTM.

Αν και αμφισβητήθηκε εάν οι τομείς CNNM2/3 CNBH δεσμεύουν κυκλικά νουκλεοτίδια (Chen et al., 2018), διαπιστώσαμε ότι το FSK προκάλεσε αύξηση στο ab KC [Mg2 συν ]i που ήταν ευαίσθητο στη μετάλλαξη uex και ότι το UEX: :Η ΗΑ εντοπίστηκε εσφαλμένα σε αδενυλική κυκλάση rut2080 (Han et al., 1992) και dnc1 φωσφοδιεστεράση (Dudai et al., 1976) μαθαίνοντας ελαττωματικές μεταλλαγμένες μύγες. Ενώ η ετικέτα UEX::HA κατανεμήθηκε ομοιόμορφα σε g, abc και abs KCs σε μύγες άγριου τύπου, η ετικέτα UEX::HA μειώθηκε στα g και abs KCs και ήταν ισχυρότερη στους νευρώνες abc στα μεταλλαγμένα rut2080 και dnc1. Οι χρόνιοι χειρισμοί του cAMP στα μεταλλαγμένα είναι επομένως συνεπείς με το cAMP που επηρεάζει τον εντοπισμό UEX, ίσως αλληλεπιδρώντας με το CNBH. Επιπλέον, ο τροποποιημένος εντοπισμός UEX μπορεί να συμβάλει στομνήμηελαττώματα rut2080 και μύγες dnc1.

Τα φυσιολογικά μας δεδομένα που χρησιμοποιούν Magnesium Green σε κυτταροκαλλιέργεια θηλαστικών και τον γενετικά κωδικοποιημένο MagIC reporter στα ab KCs δείχνουν ότι το Fly UEX διευκολύνει την εκροή Mg2 συν. Η διέγερση του εγκεφάλου της μύγας με FSK προκάλεσε μεγαλύτερη αύξηση του ab KC [Mg2 συν ]i σε εγκεφάλους μεταλλαγμένων uex από ό,τι σε μάρτυρες άγριου τύπου, γεγονός που παρέχει τις πρώτες ενδείξεις ότι το UEX περιορίζει την αύξηση του [Mg2 συν ]i σε Drosophila KCs. Οι εγγραφές μας MagIC αποκάλυψαν επίσης μια αργή ταλάντωση (με κέντρο γύρω από 0.015 Hz, περίπου μία φορά το λεπτό) του ab KC [Mg2 συν ]i που εξαρτιόταν από το UEX. Δεν καταλαβαίνουμε ακόμη τη φυσιολογική λειτουργία αυτής της διακύμανσης [Mg2 plus ]i αν και πιθανότατα αντανακλά μια ιδιότητα των κυττάρων σε επίπεδο ομοιοστατικών συστημάτων. Η βιοχημική ταλαντωτική δραστηριότητα παίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές πτυχές της κυτταρικής φυσιολογίας (Nova´k και Tyson, 2008). Πιο συγκεκριμένα, η κιρκαδική διακύμανση του [Mg2 συν ]i συνδέει τον δυναμικό μεταβολισμό της κυτταρικής ενέργειας με την ελεγχόμενη από το ρολόι μετάφραση μέσω της οδού Mg2 συν ευαίσθητου mTOR (μηχανιστικός στόχος της ραπαμυκίνης) (Feeney et al., 2016). Είναι, επομένως, πιθανό οι αργές ταλαντώσεις Mg2 συν να ενώσουν τους ρόλους για το cAMP, το UEX, τη ροή ενέργειας (Plac¸ais et al., 2017) και τη μετάφραση εξαρτώμενη από mTOR που βασίζεται στη συναπτική πλαστικότητα που σχετίζεται με LTM (Casadio et al., 1999 Huber et al., 2000· Beaumont et al., 2001· Hou and Klann, 2004· Hoeffer et al., 2008).

Επικοινωνήστε για κοινή χρήση αντιδραστηρίων και πόρων

Μπορείτε να δείτε μια πλήρη λίστα αντιδραστηρίων στον Πίνακα Βασικών Πόρων.

Περαιτέρω πληροφορίες και αιτήματα για πόρους και αντιδραστήρια θα πρέπει να απευθύνονται και θα εκπληρωθούν από τον επικεφαλής επαφής, Scott Waddell (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk).

Πειραματικό μοντέλο και λεπτομέρειες θέματος

Στελέχη μύγας

Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, οι μύγες ανατράφηκαν με τυπική τροφή με καλαμποκάλευρο κάτω από έναν κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών σε 60 τοις εκατό υγρασία και 25°C. Οι μύγες δοκιμής και ελέγχου για τα πειράματα GAL80ts αυξήθηκαν στους 18°C. Σε πειράματα χρησιμοποιήθηκαν μύγες μεικτού φύλου ηλικίας 1–7- ημερών.

Το Canton-S ήταν το άγριου τύπου στέλεχος. Οι γραμμές οδήγησης GAL4 που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είναι οι c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl et al., 2011), MB247-GAL4 (Zars et al., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) και uex-GAL4 (Kvon et al., 2014); Vienna Drosophila Resource Center, VDRC, VT23256-GAL4). Οι σειρές UAS που λαμβάνονται από το κέντρο αποθεμάτων είναι UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) και UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Οι διάφορες μεταλλαγμένες και διαγονιδιακές σειρές περιγράφονται, uexMI01943 (Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992) και dnc1 (Dudai et al., 1976). , tubP-GAL80ts (McGuire et al., 2003) και PhsILMiT (BDSC, 24613). Οι γραμμές εκτομής uexMI01943.ex1 και uexMI01943.ex2 Minos δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τη διαδικασία που περιγράφεται στο Arc et al., 1997. Το λεπτομερές σχήμα ζευγαρώματος φαίνεται στο Σχήμα 2 — Σχήμα συμπλήρωμα 2Α. Οι πιθανές γραμμές εκτομής δημιουργήθηκαν από μεμονωμένες μύγες που εμφανίζουν τον κίτρινο φαινότυπο χρώματος σώματος. Το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε από έξι τέτοιες γραμμές και το DNA που πλευρίζει το uexMI01943 MiMIC ενισχύθηκε με PCR και αναλύθηκε η αλληλουχία του. Οι γραμμές uexMI01943.ex1 και uexMI01943.ex2 αναγνωρίστηκαν ότι περιέχουν ακριβείς εκτομές, έχοντας αποκαταστήσει τη γονιδιωματική αλληλουχία άγριου τύπου. Ανατρέξτε στον Πίνακα πόρων για την PCR και τις αλληλουχίες εκκινητών. Σχηματική λεπτομέρεια της αλληλουχίας της εισαγωγής UexMI01943 MiMIC και στις εκτομές φαίνεται στο Σχήμα 2 — συμπλήρωμα εικόνας 2Β. Για την κατασκευή διαγονιδιακών μυγών UAS-uex κλωνοποιήθηκε μια πλήρους μήκους κωδικοποιητική αλληλουχία uex (CDS) με RT-PCR. Το ολικό RNA απομονώθηκε από μύγες άγριου τύπου χρησιμοποιώντας TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) και μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας σύστημα σύνθεσης πρώτου κλώνου SuperScript III (Invitrogen, 18080400). Αυτό το συνολικό μίγμα cDNA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για την ενίσχυση του Uex CDS. Δείτε τον Πίνακα Πόρων για τις αλληλουχίες εκκινητών. Το προϊόν PCR υποβλήθηκε σε πέψη με SacII και XhoI και στη συνέχεια απολινώθηκε στις συμπληρωματικές θέσεις του pUAST (Brand and Perrimon, 1993). Τα κλωνοποιημένα με pUAST uex CDS αναλύθηκαν πλήρως και επαληθεύτηκαν ότι αντιπροσωπεύουν τα 2505 bp του πλαισίου ανάγνωσης cDNA uex άγριου τύπου (σημείωση, και οι τέσσερις πιθανές ισομορφές uex mRNA, FlyBase Release 6, κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη αμινοξέων 834). Οι διαγονιδιακές μύγες UAS-uex δημιουργήθηκαν εμπορικά (Bestgene) με μετασχηματισμό με τον φορέα pUAST-uex. Χαρτογραφήσαμε την εισαγωγή χρωμοσώματος UAS-uex 10 ανεξάρτητων διαγονιδιακών γραμμών και ελέγξαμε συμπεριφορικά τρεις γραμμές, που ονομάζονται UAS-uex3M, UAS-uex5M και UAS-uex8M, με ένα ένθετο στο τρίτο χρωμόσωμα. Οι μύγες UAS-uex3M ήταν αυτές που χρησιμοποιήθηκαν σε όλη τη μελέτη και αναφέρονται ως UAS-uex στο χειρόγραφο.

Οι διαγονιδιακές μύγες UAS-uexR622K δημιουργήθηκαν παρόμοια με τις μύγες UAS-uex. Μια εσφαλμένη μετάλλαξη εισήχθη στο κωδικόνιο 622 του UEX εντός της περιοχής CNBH, μιμούμενη εκείνη που είχε προηγουμένως κατασκευαστεί στην περιοχή δέσμευσης cAMP της ρυθμιστικής υπομονάδας της πρωτεϊνικής κινάσης Α (Bubis et al., 1988). Η μετάλλαξη αλλάζει το κωδικόνιο CGT που κωδικοποιεί Arg σε ΑΑΑ που κωδικοποιεί Lys. Η μετάλλαξη εισήχθη στο άγριου τύπου uex CDS χρησιμοποιώντας Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S) όπως περιγράφεται στην ενότητα "Βελτιωμένες μέθοδοι για τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση χρησιμοποιώντας Gibson Assembly Master Mix" (Σημείωση Εφαρμογής NEB). Τα σετ εκκινητών που χρησιμοποιούνται περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα πόρων. Το προϊόν της συναρμολόγησης Gibson ενισχύθηκε περαιτέρω με PCR και το προκύπτον προϊόν κλωνοποιήθηκε στον φορέα pUAST και αναλύθηκε η αλληλουχία του. Οι εισαγωγές διαγονιδίων χαρτογραφήθηκαν όπως για το UAS-uex και μία από τις δύο εισαγωγές που χαρτογραφήθηκαν στο τρίτο χρωμόσωμα χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα συμπεριφοράς.

Οι διαγονιδιακές γραμμές μύγας UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W και UAS-CNNM2T568I δημιουργήθηκαν με μετασχηματισμό με κατασκευές pUAST που περιέχουν άγριου τύπου ή σημειακές μεταλλαγμένες εκδόσεις του CNNDHAM: HA), που περιγράφεται στο Arjona et al., 2014. Άγριου τύπου ή μεταλλαγμένες εκδόσεις του CNNM2 ενισχύθηκαν από αρχικούς κλώνους mCNNM2::HA σε πλασμίδια pCiNEO{_IRES_GFP (Arjona et al., 2014). Τα Primers περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα Πόρων. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε πέψη με XhoI και XbaI και απολινώθηκαν στις συμπληρωματικές θέσεις στο pUAST. Οι εισαγωγές κάθε δομής στο τρίτο χρωμόσωμα αναγνωρίστηκαν με χαρτογράφηση όπως περιγράφεται παραπάνω και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα συμπεριφοράς. Σημειώστε ότι όλες οι κατασκευές κωδικοποίησης CNNM2 που χρησιμοποιούνται στη μελέτη έχουν ετικέτα HA, αν και η σημείωση συχνά παραλείπεται για συντομία.

Οι διαγονιδιακές γραμμές μύγας UAS-MagFRET-1 δημιουργήθηκαν με μετασχηματισμό με κατασκευές pJFRC-MUH που περιέχουν MagFRET-1 CDS, το οποίο υποκλωνοποιήθηκε από το πλασμίδιο pCMVMagFRET-1, που περιγράφεται στους Lindenburg et al. , 2013. Τα Primers περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα πόρων. Τα προϊόντα PCR υπέστησαν πέψη με XhoI και XbaI και απολινώθηκαν στις συμπληρωματικές θέσεις στο pJFRC-MUH. Η εισαγωγή του κατασκευάσματος έγινε από το σύστημα διαγένεσης ειδικής θέσης και η θέση προσγείωσης είναι attP2 (στο τρίτο χρωμόσωμα).

Οι διαγονιδιακές μύγες UAS-MagIC και UAS-MARIO δημιουργήθηκαν με μετασχηματισμό με κατασκευές pTW που περιείχαν τα MagIC/MARIO CDS, τα οποία υποκλωνοποιήθηκαν από τα πλασμίδια MagIC/pcDNA3 και MARIO/pcDNA3, που παρέχονται ευγενικά από τον T. Nagai: (Maeshima et al., 2018 και Koldenkova et al., 2015). Τα MagIC/MARIO CDS ενισχύθηκαν αρχικά με PCR από MARIO/pcDNA3 και MagIC/pcDNA3 αντίστοιχα και κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pENTR/D-TOPO. Τα Primers περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα Πόρων. Σημειώστε ότι το MARIO sense primer σχεδιάστηκε για να επικαλύπτεται με την αλληλουχία του pcDNA3 στη θέση εισαγωγής του MARIO. Τα MagIC/MARIO CDS κλωνοποιήθηκαν περαιτέρω στον φορέα προορισμού Gateway pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

Ο τόπος uexD που επεξεργάστηκε CRISPR/Cas9 δημιουργήθηκε εμπορικά από την GenetiVision. Το σχήμα επεξεργασίας φαίνεται στο Σχήμα 2 — Σχήμα συμπλήρωμα 2C. Ο τόπος uex βρίσκεται σε αντίστροφο προσανατολισμό στο χρωμόσωμα 2R, εκτείνοντας μια περιοχή 49.141 bp μεταξύ των θέσεων 3.900.285 και 3.949.425 (FlyBase, Release 6). Η ακόλουθη περιγραφή σχετίζεται με αυτές τις συντεταγμένες εντός του τόπου uex. Για τη δημιουργία uexD, δύο πλασμίδια gRNA και ένα πλασμίδιο δότη DNA διπλής έλικος (dsDNA) κατασκευάστηκαν και εγχύθηκαν σε έμβρυα nos-Cas9 (BDSC, 54591). Όπως υποδεικνύεται στην Εικόνα 2 — συμπλήρωμα εικόνας 2C και περιγράφεται λεπτομερώς στον Πίνακα πόρων, το ανάντη gRNA1 βρίσκεται στο Exon 6 και στοχεύει την αλληλουχία 30.930.30.952. Το αντίστοιχο κατάντη gRNA2 βρίσκεται μεταξύ του Exon 7 και του Exon 8 μεταξύ 33.988 και 34.010. Και τα δύο gRNA κλωνοποιήθηκαν ξεχωριστά σε pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410). Η θέση κοπής του gRNA1 θα πρέπει να είναι μεταξύ 30.946 και 30.947 ενώ το gRNA2 θα πρέπει να οδηγεί σε περικοπή μεταξύ 33.993 και 33.994. Ένας βραχίονας ομολογίας 795 bp προς τα πάνω (30,152,30,946) και 977 bp κατάντη ομολογίας βραχίονας (33,994,34,970) κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο DNA του δότη. Ένα κωδικόνιο τερματισμού (STOP, και στα τρία πλαίσια ανάγνωσης) εισήχθη μεταξύ των δύο βραχιόνων ομολογίας και ακολουθήθηκε από μια κασέτα GFP που οδηγείται από έναν προαγωγέα 3xP3. Η ραχοκοκαλιά του DNA του δότη κατασκευάστηκε από την GenetiVision και η πλήρης αλληλουχία δότη για τη γραμμή uexD είναι διαθέσιμη κατόπιν αιτήματος. Η επιτυχής επεξεργασία αναγνωρίστηκε με την έκφραση του GFP στα μάτια της μύγας και επιβεβαιώθηκε με γονιδιωματική PCR και προσδιορισμό αλληλουχίας. Στις μύγες uexD, ένα θραύσμα 3047 bp από 30.947 έως 33.993 αντικαταστάθηκε από την αλληλουχία μεταξύ των δύο βραχιόνων ομολογίας στο πλασμίδιο δότη, κυρίως το σήμα STOP και την κασέτα GFP. Το αλληλόμορφο uexD περικόπτει το uex ORF. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για επαλήθευση γονιδιωματικής PCR περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα Πόρων. Το διαγονίδιο nos-Cas9 (στο χρωμόσωμα Χ) αφαιρέθηκε με διασταύρωση.

Οι μύγες CRISPR/Cas{0}}με επεξεργασία uex::HA δημιουργήθηκαν από τη WellGenetics χρησιμοποιώντας το σύστημα ScarlessDsRed που αναπτύχθηκε από το εργαστήριο της Kate O'Connor-Giles (αδημοσίευτο, πρωτότυπο πλασμίδιο δωρεά στην Addgene, #80822). Μια ετικέτα 6XHA συντήχθηκε στο πλαίσιο με το καρβοξυτελικό άκρο του UEX εισάγοντας την κωδικοποιητική αλληλουχία 6XHA αμέσως πριν από το φυσικό κωδικόνιο STOP στον τόπο uex (Εικόνα 3—Σχήμα συμπλήρωμα 1Α). Η διαδικασία περιλάμβανε δύο βασικά βήματα. Στο βήμα 1, μια ετικέτα 6XHA μαζί με ένα τρανσποζόνιο pBAC που περιέχει μια κασέτα DsRed εισήχθη στο πλαίσιο με το κωδικόνιο STOP του uex χρησιμοποιώντας CRISPR/Cas{11}}διαμεσολαβούμενη επεξεργασία γονιδιώματος με κατευθυνόμενη από ομολογία επισκευή (HDR) χρησιμοποιώντας 1 gRNA και ένας δότης πλασμιδίου dsDNA. Το gRNA βρίσκεται 50 bp από το κωδικόνιο STOP uex και θα πρέπει να κατευθύνει μια τομή μεταξύ 48.587 και 48.588. Το gRNA κλωνοποιήθηκε σε ένα πλασμίδιο pCFD3-dU63gRNA. Ένας 1.200 bp ανάντη βραχίονας (47.438,48.637) και 1.033 bp κατάντη βραχίονας (48.641.49.673) κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο DNA δότη με τον σκελετό pUC57-Kan (2579 bp). Δείτε τον Πίνακα πόρων για gRNA και αλληλουχίες εκκινητών. Μια μετάλλαξη Protospacer Adjacent Motif (PAM) (TCC σε TCG, 48.581.48.583) εισήχθη στον δότη για την προώθηση του HDR. Μια ετικέτα 6ΧΗΑ, ακολουθούμενη από ένα τρανσποζόνιο pBAC που περιέχει μια κασέτα DsRed που οδηγείται από υποκινητή 3XP3, εισήχθη μεταξύ των δύο βραχιόνων ομολογίας. Ένα μοτίβο αναγνώρισης pBAC TTAA είναι ενσωματωμένο στο κωδικόνιο STOP του 6XHA. Η πλήρης αλληλουχία δότη είναι διαθέσιμη κατόπιν αιτήματος. Πλασμίδια δότη και gRNA εγχύθηκαν σε έμβρυα nos-Cas9 (NIG-FLY, CAS0002). Η επιτυχής επεξεργασία αναγνωρίστηκε με την έκφραση του DsRed στα μάτια της μύγας και επιβεβαιώθηκε με γονιδιωματική PCR και προσδιορισμό αλληλουχίας. Ταυτοποιήθηκαν έξι ανεξάρτητες θετικές γραμμές και τέσσερις πέρασαν την επικύρωση PCR. Από αυτές τις τέσσερις γραμμές, μία επιπλέον πέρασε την επικύρωση αλληλουχίας και είναι η ενδιάμεση γραμμή που αναπαρίσταται στο Σχήμα 3 — συμπλήρωμα εικόνας 1Α. Τέσσερα ισογενοποιημένα και ισορροπημένα αποθέματα δημιουργήθηκαν από αυτή τη γραμμή. Στο βήμα 2, ο δείκτης επιλογής DsRed αποκόπηκε με μεταφορά PiggyBac (PBac) με τη βοηθητική γραμμή Tub-PBac (BDSC, 8285). Πέντε ομόζυγες βιώσιμες γραμμές με επιτυχή εκτομή επικυρώθηκαν με γονιδιωματική PCR και προσδιορισμό αλληλουχίας. Ένα οριζόμενο uex::HA χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα στο χειρόγραφο.

Για να κατασκευάσουμε τις μύγες CRISPR/Cas{{0}}που επεξεργάστηκαν uexT626NRR, σχεδιάσαμε και κλωνοποιήσαμε ένα gRNA και σχεδιάσαμε και παραγγείλαμε (Sigma) ένα μονόκλωνο ολιγο-δεοξυνουκλεοτίδιο (ssODN). Οι αλληλουχίες gRNA και ssODN περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα πόρων. Καθώς σχεδιάζαμε να κάνουμε μια απλή υποκατάσταση αμινοξέος R622K στην περιοχή UEX CNBH, ο δότης ssODN των 120 bp επικεντρώθηκε στο κωδικόνιο R622 και φέρει την αλλαγή κωδικονίου CGT σε ΑΑΑ (στα 31.179,31.181) που αντιστοιχεί στο R622K. Η αναμενόμενη θέση κοπής του gRNA (μεταξύ 31.192 και 31.193) απέχει μόνο 11 bp από το αναμενόμενο σημείο μετάλλαξης. Για να ενισχύσουμε την πιθανότητα HDR, η οποία σύμφωνα με πληροφορίες είναι χαμηλή χρησιμοποιώντας ssODN ως δότη, εγχύαμε εμπορικά (GenetiVision) υλικό επεξεργασίας σε έμβρυα 250 lig4 KO vasa-Cas (Zimmer et al., 2016). Λάβαμε 37 βιώσιμες μύγες G0 από τα έμβρυα που έλαβαν ένεση. Συνολικά 224 μύγες G1 υποβλήθηκαν σε γονιδιωματική PCR μονής μύγας και αλληλουχία για διαλογή για την αναμενόμενη μετάλλαξη. Τα Primers περιγράφονται αναλυτικά στον Πίνακα Πόρων. Προσδιορίσαμε 59 υποτιθέμενες επεξεργασμένες γραμμές από τον πρώτο γύρο διαλογής, και από αυτές οι 12 επιβεβαιώθηκαν. Παρά τη χρήση του lig4 KO vasa-Cas9, εντοπίσαμε μόνο μη ομόλογα συμβάντα σύνδεσης άκρου (NHEJ) αντί για σημειακές μεταλλάξεις με τη μεσολάβηση HDR. Από τις 12 επεξεργασμένες γραμμές, οι έξι ήταν ομόζυγες θανατηφόρες και οι άλλες έξι ήταν βιώσιμες. Σε τέσσερις από τις ομόζυγες βιώσιμες γραμμές, βρήκαμε μια αντικατάσταση του G με το Τ στη θέση 31.192 μαζί με μια εισαγωγή 6 bp στο πλαίσιο του ATCTTC μεταξύ 31.192 και 31.193. Αυτή η επεξεργασία NHEJ αντιστοιχεί στο T626! Αλλαγή NRR στην πρωτεϊνική αλληλουχία του UEX (Εικόνα 5Α). Το χρωμόσωμα Χ vasa-Cas9 αφαιρέθηκε από αυτές τις γραμμές με διασταύρωση και μια γραμμή που αναφέρεται ως uexT626NRR χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα συμπεριφοράς στο χειρόγραφο.

Λεπτομέρειες μεθόδου

Πειράματα συμπεριφοράς

Για πειράματα συμπεριφοράς με Τ-λαβύρινθο, χρησιμοποιήθηκαν μύγες του φύλου 1–7-ημέρας. Οι οσμές ήταν 4-μεθυλκυ-κυκλοεξανόλη (MCH) και 3-οκτανόλη (OCT), αραιωμένα ~1:103 (συγκεκριμένα, 9 ml MCH ή 7 ml OCT σε 8 ml ορυκτέλαιο). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία 23°C και σχετική υγρασία 55-65%.

Όρεξη αμέσως και αργότεραμνήμητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφεται (Krashes and Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Παρτίδες από 100–120 μύγες αφέθηκαν από την πείνα για 21–23 ώρες πριν από την προπόνηση σε φιαλίδια ασιτίας των 35 ml που περιείχαν ~2 ml άγαρ 1 τοις εκατό (ως πηγή νερού) και διηθητικό χαρτί 2 cm 4 cm. Παρασκευάστηκαν ζαχαρόχαρτα (5 cm 7,5 cm) για προπόνηση με εμποτισμό με 4 ml σακχαρόζης 2 Μ και ξήρανση όλη τη νύχτα. Τα χαρτιά νερού του ίδιου μεγέθους εμποτίστηκαν με νερό και αφέθηκαν όλη τη νύχτα. Για ευχάριστη προπόνηση, οι μύγες μεταφέρθηκαν από ένα σωλήνα ασιτίας σε έναν προπονητικό σωλήνα με ένα στεγνό χαρτί «νερού» και αμέσως προσαρτήθηκαν στον βραχίονα εκπαίδευσης του λαβύρινθου Τ και εκτέθηκαν στη μυρωδιά CS για 2 λεπτά, ακολουθούμενα από 30 δευτερόλεπτα καθαρος ΑΕΡΑΣ. Στη συνέχεια, οι μύγες μεταφέρθηκαν σε άλλο σωλήνα εκπαίδευσης με ξηρό ζαχαρόχαρτο, προσαρτήθηκαν στον λαβύρινθο Τ και εκτέθηκαν στην οσμή CS συν για 2 λεπτά. Αμεσοςμνήμηδοκιμάστηκε μεταφέροντας μύγες στο σημείο επιλογής Τ και επιτρέποντάς τους 2 λεπτά να επιλέξουν μεταξύ των δύο ρευμάτων οσμών. Για τον προσδιορισμό 24 ωρώνμνήμη, οι μύγες αφαιρέθηκαν από τον εκπαιδευτικό σωλήνα και μεταφέρθηκαν σε τυπικά φιαλίδια τροφής με καλαμποκάλευρο για 1 ώρα, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πίσω σε φιαλίδια λιμοκτονίας για 23 ώρες μέχρι τη δοκιμή. Ο δείκτης απόδοσης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μυγών στο βραχίονα CS συν μείον τον αριθμό στον βραχίονα CS, διαιρεμένος με τον συνολικό αριθμό των μυγών. Το MCH και το OCT χρησιμοποιήθηκαν εναλλακτικά ως CS plus ή CS και ένα μεμονωμένο δείγμα, ή n, αντιπροσωπεύει τον μέσο Δείκτη Απόδοσης από δύο αμοιβαία εκπαιδευμένες ομάδες.

Για τεστ συμπεριφοράς μετά τη σίτιση με Mg2 συν, μύγες ηλικίας 1–2-ημέρας στεγάστηκαν σε φιαλίδια με Mg2 συν συμπληρωμένη τροφή για 1–5 ημέρες προτού λιμοκτονήσουν για όρεξη για προπόνηση και δοκιμές, όπως περιγράφεται παραπάνω. Για την παρασκευή τροφίμου 80 mM [Mg2 συν ], προστέθηκαν 40 ml διαλύματος MgCl2 1 M σε 460 ml κανονικής υγρής τροφής για μύγες. Παρασκευάστηκε τροφή 1 mM [Mg2 συν] με αραίωση 0,5 ml 1 M MgCl2 σε 39,5 ml νερό MilliQ και προσθήκη σε 460 ml υγρή τροφή. Το φαγητό μοιράστηκε σε κλάσματα και ψύχθηκε για να στερεοποιηθεί. Η τροφή με συμπλήρωμα MgS04 και CaCl2 παρασκευάστηκε με τον ίδιο τρόπο.

Aversive άμεσα και 24 ώρεςμνήμητα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Hirano et al., 2013; Perisse et al., 2016; Tully and Quinn, 1985). Ομάδες 100-120 μυγών εκπαιδεύτηκαν είτε με έναν κύκλο αποστροφής είτε με πέντε κύκλους σε απόσταση 15 λεπτών μεταξύ των δοκιμών (προπόνηση σε απόσταση). Για αποτρεπτικό άμεσομνήμη, οι μύγες δοκιμάστηκαν μετά από εκπαίδευση ενός κύκλου. Αποτρεπτικό 24ωρομνήμηδοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά πρωτόκολλα. Στο πρωτόκολλο που διευκολύνεται από τη νηστεία, οι μύγες έμειναν από την πείνα για 16 ώρες πριν από την εκπαίδευση ενός κύκλου (Hirano et al., 2013). Για προπόνηση σε απόσταση, οι μύγες δεν λιμοκτονούσαν πριν από την προπόνηση. Οι μύγες τρέφονταν με κανονική τροφή για μύγες για 24 ώρες μετά από εκπαίδευση με διευκόλυνση νηστείας και σε απόσταση μεταξύ τους, πριν δοκιμαστούν γιαμνήμηεκτέλεση. Κατά τη διάρκεια κάθε αποτρεπτικού κύκλου εκπαίδευσης, οι μύγες εκτέθηκαν για 1 λεπτό σε μια πρώτη οσμή (CS συν ) σε συνδυασμό με δώδεκα ηλεκτροπληξία 90 V σε διαστήματα 5 δευτερολέπτων. Μετά από 45 δευτερόλεπτα καθαρού αέρα, παρουσιάστηκε μια δεύτερη οσμή (CS) για 1 λεπτό χωρίς σοκ. Ο δείκτης απόδοσης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μυγών στον βραχίονα CS μείον τον αριθμό στο CS συν

βραχίονα, διαιρούμενο με τον συνολικό αριθμό των μυγών. Το MCH και το OCT χρησιμοποιήθηκαν εναλλακτικά ως CS plus ή CS και ένα μεμονωμένο δείγμα, ή n, αντιπροσωπεύει τον μέσο Δείκτη Απόδοσης από δύο αμοιβαία εκπαιδευμένες ομάδες.

Οι δοκιμές αισθητηριακής οξύτητας (Σχήμα 2 - δεδομένα πηγής 1) πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται (Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) με τροποποιήσεις. Για τον έλεγχο της οσφρητικής οξύτητας, οι μη εκπαιδευμένες μύγες δόθηκαν 2 λεπτά για να επιλέξουν μεταξύ μιας αραιωμένης οσμής όπως χρησιμοποιείται στην προετοιμασία και του αέρα που διοχετεύεται μέσω ορυκτελαίων στον λαβύρινθο Τ. Ένας Δείκτης Αποφυγής υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μυγών στον βραχίονα αέρα μείον τον αριθμό στον βραχίονα οσμής, διαιρεμένος με τον συνολικό αριθμό των μυγών. Η αποφυγή ηλεκτροπληξίας πραγματοποιήθηκε και υπολογίστηκε με παρόμοιο τρόπο. Οι ανεκπαίδευτες μύγες επέλεξαν για 1 λεπτό ανάμεσα σε δύο σωλήνες που περιείχαν ηλεκτρικά δίκτυα, αλλά μόνο ένας ήταν συνδεδεμένος στην πηγή ρεύματος. Ένας δείκτης αποφυγής υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μυγών στον μη ηλεκτρισμένο βραχίονα μείον τον αριθμό στον ηλεκτρισμένο βραχίονα, διαιρεμένος με τον συνολικό αριθμό των μυγών. Για να εκτιμηθεί η οξύτητα του σακχάρου, οι πεινασμένες μύγες δόθηκαν 2 λεπτά για να επιλέξουν μεταξύ ενός βραχίονα του λαβύρινθου Τ που περιείχε ένα αποξηραμένο ζαχαρόχαρτο και στον άλλο που περιείχε ένα αποξηραμένο διηθητικό χαρτί «νερού». Και τα δύο χαρτιά ετοιμάστηκαν όπως στο ορεκτικόμνήμηαναλύσεις. Ένας Δείκτης Προτίμησης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των μυγών στον βραχίονα ζάχαρης μείον αυτόν στον άλλο βραχίονα, διαιρεμένος με τον συνολικό αριθμό των μυγών. Διαπιστώσαμε ότι η διατήρηση του φωτός στο δωμάτιο συμπεριφοράς και η ροή αέρα που διέρχεται από τους δοκιμαστικούς σωλήνες ενίσχυσε σημαντικά τον Δείκτη Προτίμησης στις μύγες άγριου τύπου και επομένως εφάρμοσε αυτές τις συνθήκες για όλες τις δοκιμές προτίμησης σακχάρου.

Anti-UEX αντίσωμα και western blot

Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα UEX αναπτύχθηκε εμπορικά από την Eurogentec. Δύο πεπτίδια συντέθηκαν ως αντιγόνα: το πεπτίδιο 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) και το Πεπτίδιο 2 H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) και ενέθηκαν σε κουνέλια. Μόνο το Πεπτίδιο 2 προκάλεσε μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση και υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία. Ο τελικός ορός καθαρίστηκε έναντι του πεπτιδίου 2 και χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση στυπώματος western ως αραίωση 1:2000.

Για κάθε δείγμα σε western blot, πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από 20 μύγες με ομογενοποίηση σχολαστικά σε 120 ml ρυθμιστικού δείγματος πρωτεΐνης που περιέχει ένα μείγμα 30 ml 2-μερκαπτοαιθανόλης (Bio-Rad), 270 ml 4 Ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli (BioRad) και 900 ml νερού χωρίς νουκλεάση (Invitrogen). Στη συνέχεια, τα δείγματα βράστηκαν σε θερμοστάτη 100°C για 3 λεπτά και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά πριν από τη φόρτωση. Ένας όγκος δείγματος ισοδύναμος με τέσσερις κεφαλές φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα γέλης SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν στη μεμβράνη PVDF και μπλοκαρίστηκαν σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα στους 25°C με ανάδευση 35 rpm. Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε σε διάλυμα αντι-UEX (1:2000 αντι-UEX κουνελιού σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα) όλη τη νύχτα στους 4°C με ανάδευση 35 rpm. Η μεμβράνη πλύθηκε γρήγορα τρεις φορές και ακολούθησαν 3 10 λεπτά πλύσεις σε διάλυμα TBST (100 ml διαλύματος TBS 10, BioRad, αραιωμένο σε 900 ml νερού MilliQ, με 0,1 τοις εκατό Tween 20) και στη συνέχεια επωάστηκε με συζευγμένο με HRP δευτερογενές διάλυμα αντισωμάτων (1:5000 κατσικίσιο αντι-κουνέλι σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα) για 1–2 ώρες στους 25°C με ανάδευση 35 rpm. Η μεμβράνη πλύθηκε και πάλι γρήγορα για τρεις φορές και ακολούθησαν 3 10 λεπτά πλύσεις σε TBST. Οι ζώνες πρωτεΐνης οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας υπόστρωμα κηλίδωσης Western Pierce ECL (Life technology, 32134). Στη συνέχεια, η μεμβράνη αφαιρέθηκε με χρήση διαλύματος Millipore ReBlot Plus Mild (Merck, 2502), μπλοκαρίστηκε ξανά σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα και ανιχνεύθηκε με πρωτεύον αντίσωμα ποντικού anti-Tubulin (1:2000, Sigma, T6199) και αντίστοιχο συζευγμένο HRP κατσίκας αντι- δευτερογενές αντίσωμα ποντικού (1:5000) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται παραπάνω.

Ανοσοχρώση

Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται (Wu and Luo, 2006). Εγκέφαλοι από 1- έως 5-ημέρες ενήλικες μύγες ανατέμθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν για 20 λεπτά σε PBS με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές για λίγο σε 0.5 τοις εκατό PBT (2,5 ml Triton-X100 σε 497,5 ml PBS) και τρεις πλύσεις 20 λεπτών. Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοι αποκλείστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε PBT που περιείχε 5 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενή και δευτερεύοντα αντισώματα με ήπια περιστροφή (35 rpm) στους 4°C για 1 ή 2 ημέρες. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν αντι-GFP κουνελιού (1:250, Invitrogen Α11122) και αντι-ΗΑ κουνελιού (1:250, ΝΕΒ 3724Τ). Alexa 488-συζευγμένο κατσικίσιο αντι-κουνέλι (1:250; Invitrogen, A11034) ήταν το δευτερεύον αντίσωμα. Πριν και μετά τη δευτερεύουσα επώαση αντισωμάτων, οι εγκέφαλοι υποβλήθηκαν σε δύο γρήγορες πλύσεις που ακολουθήθηκαν από τρεις πλύσεις των 20 λεπτών σε 0,5 τοις εκατό PBT. Οι χρωματισμένοι εγκέφαλοι τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες σε Vectashield (Vector Labs H1000) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο Leica TCS SP5 σε μεγέθυνση 40 (HCX PL APO 40, 1,3 CS αντικειμενικός εμβάπτισης λαδιού, Leica). Οι στοίβες εικόνων συλλέχθηκαν σε ανάλυση 1024 1024 με βήματα 1 mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας τα Φίτζι (Schindelin et al., 2012). Για ποσοτικοποίηση στο σχήμα 3G και H, ορθογώνια ROI περίπου 40 25 mm για την υδρόγειο ή στρογγυλά ROI με διάμετρο 15 mm για ab, a'b' και EB σχεδιάστηκαν χειροκίνητα σε ένα μόνο τμήμα μιας σάρωσης z-stack του εγκεφάλου μύγας. Αντίστοιχες ROI σχεδιάστηκαν επίσης στο ανώτερο έσω πρωτοεγκέφαλο (SMP) ως περιοχή ελέγχου υποβάθρου και ο μέσος φθορισμός υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ImageJ. Η ένταση ROI των λοβών MB και του EB κανονικοποιήθηκε σε αυτήν της αντίστοιχης έντασης SMP. Ένας μέσος όρος μεταξύ αριστερού και δεξιού εγκεφάλου χρησιμοποιήθηκε για ένα μόνο σημείο δεδομένων. Για ποσοτικοποίηση στα Σχήματα 7C και D, οι ROI υποδεικνύονται στα σχήματα και η ένταση ROI υπολογίστηκε παρόμοια με τα αποτελέσματα στο Σχήμα 3Η. Στο Σχήμα 7Γ, σχεδιάστηκε μια γραμμή μέσω του ευρύτερου τμήματος της άκρης του λοβού α. Το προφίλ έντασης αυτής της γραμμής λήφθηκε μέσω του ImageJ. Τριάντα σημεία δεδομένων στη μέση ενός τέτοιου προφίλ που εκτείνεται σε μια γραμμή περίπου 15 mm εξήχθησαν για κάθε προφίλ γραμμής. Το προφίλ κανονικοποιήθηκε περαιτέρω στη μέση τιμή των πρώτων πέντε σημείων δεδομένων (F0) και υπολογίστηκε ως (F F0)/F0. Οι μέσες τιμές αυτών των κανονικοποιημένων προφίλ από διαφορετικούς εγκεφάλους σχεδιάστηκαν (Εικόνα 7C, μεσαίο πλαίσιο). Το αριστερό και το δεξί προφίλ του εγκεφάλου υπολογίστηκαν και εμφανίζονται ξεχωριστά. Στο Σχήμα 7D, οι σχετικές εντάσεις από διαφορετικά ROI που αντιπροσωπεύουν διαφορετικές περιοχές προστίθενται μαζί για να δημιουργήσουν ένα μέτρο συνολικής έντασης για το MB.

Το κατασκεύασμα έκφρασης ανθρώπινου CNNM4 cDNA που χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση της εκροής Mg2 συν σε κυτταρική καλλιέργεια είναι αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως (Yamazaki et al., 2013). Ένα κατασκεύασμα που εκφράζει Drosophila uex δημιουργήθηκε με την εισαγωγή μιας ετικέτας FLAG μπροστά από το κωδικόνιο STOP του CDS uex. Τα CNNM4 και uex cDNA με επισήμανση FLAG στη συνέχεια εισήχθησαν στην ετικέτα pCMV-4A (Agilent) για έκφραση σε κύτταρα HEK293. Τα κύτταρα ΗΕΚ293 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (Nissui) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό ορό εμβρύου βοοειδών (FBS) και αντιβιοτικά. Τα πλασμίδια έκφρασης επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Για ανοσοχρώση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3,7 τοις εκατό φορμαλδεΰδη σε PBS για 20 λεπτά και στη συνέχεια διαπερατήθηκαν με 0,2 τοις εκατό Triton X-100 σε PBS για 5 λεπτά, και τα δύο σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια αποκλείστηκαν με PBS που περιείχε 3 τοις εκατό FBS και 10 τοις εκατό αλβουμίνη βόειου ορού (ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C με αντίσωμα κουνελιού anti-FLAG (F7425, Sigma-Aldrich) αραιωμένο σε ρυθμιστικό αποκλεισμού, πλύθηκαν 3 με PBS και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με Alexa 488-συζευγμένο αντι- IgG κουνελιού (Invitrogen) και ροδαμίνη-φαλλοιδίνη (για απεικόνιση της F-ακτίνης, Invitrogen) αραιωμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, τοποθετήθηκαν καλυπτρίδες σε διαφάνειες και απεικονίστηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο (FluoView FV1000; Olympus).

Η απεικόνιση Mg2 plus με Magnesium Green πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται (Yamazaki et al., 2013), με μικρές τροποποιήσεις. Για να αποφευχθεί η πιθανή μείωση του [Mg2 συν]i με τις εκφρασμένες πρωτεΐνες, τα επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293 καλλιεργήθηκαν σε μέσα ανάπτυξης συμπληρωμένα με 40 mM MgCl2 μέχρι την απεικόνιση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης Mg2 συν (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM γλυκόζη, και 5,5 mM HEPES-KOH [ρΗ 7,4 mM μαγνησίου]), συμπεριλαμβανομένου του μαγνησίου (Invitrogen), για 30 λεπτά στους 37˚C. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης και προβλήθηκαν με μικροσκόπιο Olympus IX81 εξοπλισμένο με κάμερα ORCA-Flash 4.0 CMOS (Hamamatsu) και λάμπα υδραργύρου SHI-1300L (Olympus). Ο φθορισμός μετρήθηκε κάθε 20 δευτερόλεπτα (διέγερση στα 470-490 nm και εκπομπή στα 505-545 nm) υπό τον έλεγχο του λογισμικού Metamorph (Molecular Devices). Το ρυθμιστικό μετά άλλαξε σε Mg2 συν ελεύθερο ρυθμιστικό (MgCl2 στο ρυθμιστικό φόρτωσης αντικαταστάθηκε με 60 mM NaCl). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διαγράμματα γραμμής (μέσος όρος 10 κελιών). Μετά την απεικόνιση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με PBS που περιείχε 3,7 τοις εκατό φορμαλδεΰδη και υποβλήθηκαν σε μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού για να επιβεβαιωθεί η έκφραση πρωτεΐνης.

Μετρήσεις συγκέντρωσης Mg2 με βάση FRET σε σταθερούς εγκεφάλους μύγας

Μύγες ηλικίας μίας έως δύο ημερών με γονότυπο c739. Το UAS-MagFRET-1 τοποθετήθηκε σε φιαλίδια με τροφή 1 mM ή 80 mM [Mg2 συν ] για 4 ημέρες προτού συλλεχθούν. Οι εγκέφαλοι μύγας ανατέμθηκαν σε PBS και σταθεροποιήθηκαν για 20 λεπτά σε PBS με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές σύντομα σε 0,5 τοις εκατό ΡΒΤ (2,5 ml Triton-X100 σε 497,5 ml PBS) και τρεις πλύσεις 10 λεπτών. Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοι τοποθετήθηκαν σε γυάλινες διαφάνειες στο Vectashield (Vector Labs H1000) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ευρέως πεδίου Scientifica Slicescope με αντικειμενικό στόχο εμβάπτισης στο νερό 40, 0,8 NA και μια κάμερα Andor Zyla sCMOS με λογισμικό Andor Solis (v4.27). Προκειμένου να ληφθεί η αναλογία FRET που υποδεικνύει τη συγκέντρωση Mg2 συν του νευρώνα ab, αποκτήθηκαν χρονοσειρές εναλλακτικά μεταξύ του καναλιού cerulean και του καναλιού κιτρίνης στα 3 Hz με 512 512 pixel και 16 bit. Το μήκος κύματος διέγερσης και για τα δύο κανάλια είναι 436 nm, ενώ το φίλτρο εκπομπής για το cerulean είναι 460–500 nm και για το κιτρίνη είναι 520–550 nm. Η απόκτηση της σειράς ξεκινά από το κανάλι cerulean και διαρκεί για 5 δευτερόλεπτα, μετά αλλάζει στο κανάλι κιτρίνης και διαρκεί για άλλα 5 δευτερόλεπτα, και αυτός ο κύκλος επαναλαμβάνεται για δύο ακόμη φορές. Ως εκ τούτου, αποκτήθηκε μια στοίβα εικόνας 30 δευτερολέπτων (90 καρέ) για κάθε εγκέφαλο. Οι στοίβες εικόνων αναλύθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ImageJ και προσαρμοσμένα σενάρια Matlab. Εν συντομία, τα ορθογώνια ROI (Εικόνα 1Ε, αριστερό πλαίσιο) σχεδιάστηκαν χειροκίνητα στους κοιλιακούς λοβούς (ένας σε έναν λοβό και ένας στον λοβό β για κάθε ημισφαίριο) και έξω από τους κοιλιακούς λοβούς (ένας για κάθε ημισφαίριο) ως έλεγχος φόντου. Η ένταση φθορισμού από το δήθεν κανάλι υπολογίστηκε διαιρώντας κάθε ROI κάθετου ή οριζόντιου λοβού με το ROI υποβάθρου και υπολογίστηκε ο μέσος όρος μεταξύ των δύο ημισφαιρίων για κάθε λοβό και υπολογίστηκε ο μέσος όρος στα 15 πλαίσια για κάθε κύκλο. Αυτό από το κανάλι κιτρίνης ελήφθη με παρόμοιο τρόπο. Μια αναλογία FRET λήφθηκε από τις παραπάνω εντάσεις, που υπολογίστηκε περαιτέρω μεταξύ των τριών κύκλων απόκτησης, που απεικονίζεται ως ένα σημείο δεδομένων στο Σχήμα 1Ε (δεξιός πίνακας).

Συνεστιακή απεικόνιση Mg2 συν σε εγκέφαλο μύγας εκφυτεύματος

Εγκέφαλοι μοσχευμάτων που εκφράζουν c739-UAS-MagIC που καθοδηγείται από το GAL4 τοποθετήθηκαν στον πυθμένα ενός τρυβλίου με γυάλινο πυθμένα 35 mm (Αρ. μέρους P35G-1).5–14 C, MatTek Corporation), κάτω από το εξωκυττάριο αλατούχο διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM τρεαλόζη, 10 mM γλυκόζη, 7 mM σακχαρόζη, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1,5 mM CaCl2, 4 mM 2,7 moslarity pH 7,3]) μετά από ανατομή σε ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς ασβέστιο (Barnstedt et al., 2016). Για να προσδιοριστεί η ευαισθησία Mg2 συν του UAS-MagIC καθώς και η απόκριση του UAS-MagIC σε άλλες χημικές ουσίες όπως το EDTA, EGTA και CaCl2 (Εικόνα 8Β), οι εγκέφαλοι επωάστηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα αλατούχου διαλύματος με 20 mg/ml διγιτονίνη για 6 λεπτά πριν από την απεικόνιση (Koldenkova et al., 2015). Για να διερευνηθεί η διακύμανση του Mg2 συν ως απόκριση στην εφαρμογή Forskolin (FSK) (Εικόνα 8C–I), οι εγκέφαλοι τοποθετήθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα αλατούχου διαλύματος χωρίς διγιτονίνη ή επώαση. Και στις δύο περιπτώσεις, το αλατούχο διάλυμα αναφέρεται στο ρυθμιστικό διάλυμα (είτε με ή χωρίς διγιτονίνη) στο οποίο είναι βυθισμένος ο εγκέφαλος.

Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε σε ομοεστιακό μικροσκόπιο LSM780 (Zeiss) με αντικειμενικό φακό 20 αέρα χρησιμοποιώντας το λογισμικό ZEN 2011. Το τμήμα Venus του MagIC ενθουσιάστηκε με ένα λέιζερ 488 nm και η εκπομπή του συλλέχθηκε στην περιοχή 520–560 nm. Το mCherry διεγέρθηκε με λέιζερ 561 nm και η εκπομπή του συλλέχθηκε στην περιοχή 600–640 nm. Οι χρονικές σειρές αποκτήθηκαν στα 0,5 Hz με 512 512 pixel και 16 bit. Μετά από 60 δευτερόλεπτα βασικής μέτρησης Venus/mCherry, 2–20 ml φυσιολογικού ορού ή άλλου σχετικού χημικού διαλύματος προστέθηκαν μέσω μικροπιπέτας στο πιάτο με συνεχή λήψη εικόνας. Τα αποτελέσματα των εφαρμοζόμενων παραγόντων στην εκπομπή Venus/mCherry καταγράφηκαν στη συνέχεια για 15-20 λεπτά.

Οι στοίβες εικόνων αναλύθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ImageJ και προσαρμοσμένα σενάρια Python. Εν συντομία, οι ορθογώνιες ROI σχεδιάστηκαν χειροκίνητα στους κοιλιακούς νευρώνες (ένας για κάθε ημισφαίριο, Εικόνα 8Α) και ένα άλλο ROI ίδιου μεγέθους σχεδιάστηκε στη μέση αλλά έξω από τα MB ως έλεγχος φόντου. Η ένταση φθορισμού από το κανάλι Venus (ή mCherry) υπολογίστηκε αφαιρώντας το ROI φόντου από το ROI του κάλυκα, αντίστοιχα, και υπολογίστηκε ο μέσος όρος μεταξύ των δύο ημισφαιρίων. Αυτό αναφέρεται ως «Σχεδ. Ένταση (au)» στο Σχήμα 8D και Ε. Η αναλογία μεταξύ της έντασης Venus και mCherry υπολογίστηκε ως «MagIC Ratio» στο Σχήμα 8B και C και στο Σχήμα 8F και G. Για το Σχήμα 8H, η ένταση για τα δύο κανάλια υπολογίστηκε χωριστά. Σε αυτή την περίπτωση, «Σχετ. Ένταση (DF/F0)' αναφέρεται στη σχετική ένταση φθορισμού κανονικοποιημένη στη μέση ένταση από τη βασική περίοδο F0, που υπολογίζεται ως (FF0)/F{{9} }. Η σχετική ένταση DF/F0 της Αφροδίτης χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του PSD (Εικόνα 8I) μέσω της συνάρτησης python psd (κάτω από το matplotlib.pyplot), η οποία υιοθέτησε τη μέθοδο μέσου περιοδογραφήματος του Welch (Bendat et al., 2000).

Αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο

Για κάθε δείγμα, 120 μύγες καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και οι κεφαλές τους ομογενοποιήθηκαν πλήρως σε αντιδραστήριο TRIzol (Invitrogen). Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα σύνθεσης First-Strand SuperScript III (Invitrogen). Παρασκευάστηκαν πέντε ανεξάρτητα δείγματα για κάθε διαφορετική επεξεργασία ή γονότυπο. Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR εις τριπλούν για κάθε δείγμα cDNA σε όργανο LightCycler 480 (Roche) χρησιμοποιώντας SYBR Green I Master Mix (Roche). Οι καμπύλες τήξης αναλύθηκαν μετά την ενίσχυση και τα αμπλικόνια οπτικοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του εκκινητή. Τα σχετικά επίπεδα μεταγραφής υπολογίστηκαν με τη μέθοδο 2-DDCt (Livak and Schmittgen, 2001) και ο γεωμετρικός μέσος όρος των τιμών Ct τριών γονιδίων αναφοράς (Gapdh, Tbp και Ef1a 100E) χρησιμοποιήθηκε για κανονικοποίηση. Τα Primers περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα Πόρων.

Αντίστροφη PCR

Χρησιμοποιήθηκε αντίστροφη PCR για τη χαρτογράφηση της θέσης εισαγωγής MiMIC σε μύγες uexMI01943. Το γονιδιωματικό DNA παρασκευάστηκε από 15 ενήλικες μύγες. DNA ισοδύναμο με δύο μύγες στη συνέχεια χωνεύτηκε σε μια αντίδραση περιορισμού 25 ml με Mbo I και 10 ml του προϊόντος απολινώθηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C όλη τη νύχτα για να κυκλοποιηθούν τα θραύσματα. 5 ml του προϊόντος απολίνωσης χρησιμοποιήθηκαν για αντίστροφη PCR. Το προϊόν PCR καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας αντίδραση Exo/SAP (Thermo Fisher, 78201) πριν τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του. Η αλληλουχία συγκρίθηκε με το γονιδίωμα του D. melanogaster (FlyBase, Release 6) με BLAST και ταιριάζει ομοιόμορφα με την περιοχή 3,882,886,3,882,641 στο 2R, σύμφωνα με την αναφερόμενη εισαγωγή uexMI01943 στο FlyBase. Τα Primers περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα Πόρων.

Πρόβλεψη και ευθυγράμμιση τομέα πρωτεϊνών

Η ευθυγράμμιση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Geneious R10.2.2. Η πρόβλεψη του τομέα πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με InterPro (Finn et al., 2017; Jones et al., 2014) και Phyre2 (Kelley et al., 2015). Η ευθυγράμμιση του τομέα πρωτεϊνών και της δομής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TM-align (Zhang and Skolnick, 2005). Η οπτικοποίηση της δομής της πρωτεΐνης αποδόθηκε στο Chimera 1.11.2 (Pettersen et al., 2004).

Ποσοτικοποίηση και στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα συμπεριφοράς αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Excel και Prism 6. Τα δεδομένα απεικόνισης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ και προσαρμοσμένα σενάρια MATLAB ή Python. Χρησιμοποιήθηκαν μη ζευγαρωμένες δοκιμές t δύο ουρών για τη σύγκριση δύο ομάδων και η μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από ένα post-hoc τεστ Tukey χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση πολλαπλών ομάδων. Το όριο στατιστικής σημασίας ορίστηκε στο p<>

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον FJ Arjona και τον JGJ Hoenderop για τους μυϊκούς κλώνους CNNM2 και τα σχόλια στο χειρόγραφο. Είμαστε ευγνώμονες στον T Nagai για τους κλώνους του MagIC και του MARIO και στο Bloomington Stock Center και στο VDRC για τις μύγες. Ευχαριστούμε τους P Cognigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs και M Goodwin για την τεχνική υποστήριξη και άλλα μέλη της ομάδας Waddell για τη συζήτηση. Ευχαριστούμε τους N Halidi, C Monico και τη μονάδα Micron Advanced Bioimaging Unit (υποστηριζόμενη από τα Well-Come Strategic Awards 091911/B/10/Z και 107457/Z/15/Z) για την υποστήριξη και τη βοήθειά τους σε αυτό το έργο. Το EM χρηματοδοτήθηκε από μια μακροπρόθεσμη υποτροφία EMBO (ALTF 184-2109). Η KDJ αναγνωρίζει την υποστήριξη από το Rhodes Trust. Η SW χρηματοδοτήθηκε από μια Wellcome Principal Research Fellowship (200846/ Z/16/Z) και μια προηγμένη επιχορήγηση ERC (789274).