Μέρος 3: Ο υποδοχέας κανναβινοειδών τύπου 2 προάγει την ίνωση των νεφρών μέσω της ενορχήστρωσης της σηματοδότησης Β-κατενίνης

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Το Cistanche είναι καλό για τα νεφρά

Ωστόσο, σπάνια έχει αναφερθεί ότι υπάρχει σχέση μεταξύ CB2 και -κατενίνης.

Το CB2 είναι μέλος της οικογένειας GPCR. Βρήκαμε προηγουμένως ότι το CB2 εκφράζεται σε σωληνοειδή κύτταρα, ινοβλάστες και μακροφάγα. Το CB2 εκφράζεται επίσης σε ποδοκύτταρα και μεσαγγειακά κύτταρα.3 Ο ρόλος του CB2 στη ΧΝΝ ήταν αμφιλεγόμενος στο παρελθόν. Παρά την ανοδική ρύθμιση του mRNA του CB2 και του κύριου ενδογενούς συνδέτη του 2-AG σε μοντέλα ΧΝΝ, αναφέρθηκε προηγουμένως ότι ένας αγωνιστής CB2 θα μπορούσε να βελτιώσει τη νεφρική ίνωση. Αντίθετα, οι προηγούμενες μελέτες μας εντόπισαν έναν επιβλαβή ρόλο του CB2 στη νεφρική ίνωση μέσω γενετικών πειραμάτων και αναλύσεων με τον πιο εκλεκτικό CB2 αντίστροφο αγωνιστή XL-001, έναν νέο αντίστροφο αγωνιστή CB2 που παρουσιάζει την ισχυρότερη συγγένεια δέσμευσης με τον υποδοχέα CB2, με την καλύτερη εκλεκτικότητα έναντι του υποδοχέα CB1 (2594-πλάσιο) και ένα Ki 0,5 nM. Αξίζει να σημειωθεί ότι η -κατενίνη και οι στόχοι της καταστέλλονται με γενετική κατάλυση ή φαρμακολογική αναστολή του CB2. Δεδομένου ότι το CB2 είναι μέλος της οικογένειας GPCR, το CB2 θα μπορούσε να ρυθμίσει την -κατενίνη. Ωστόσο, αυτή η υπόθεση πρέπει να επικυρωθεί. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το CB2 μεσολαβεί στην ενεργοποίηση της κατενίνης μέσω ενός κύματος σήματος GPCR.

Η μελέτη μας επιβεβαιώνει επίσης τον αναδυόμενο ρόλο του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος στη νεφρική ίνωση. Από τα 2 κύρια ενδοκανναβινοειδή, το ανανδαμίδιο (Ν-αραχιδονοϋλεθανολαμίνη) έχει υψηλότερη συγγένεια για το CBl, ενώ το 2-AG έχει παρόμοια συγγένεια για το CB1 και το CB2 (η συγγένειά του για το CB1 είναι ελαφρώς υψηλότερη). Ως εκ τούτου, {{ 7}}Το AG είναι ο κύριος ενδοκανναβινοειδής αγωνιστής για τον υποδοχέα CB2. Συγκεκριμένα, τονεφρόο φλοιός εμφανίζει παρόμοια υψηλά βασικά επίπεδα ανανδαμίδης και2-AG. Ωστόσο, 2-τα επίπεδα AG αυξάνονται περισσότερο στην αποφρακτικήίνωσητουονεφρό, συνοδευόμενη από τη μείωση των επιπέδων της ανανδαμίδης, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση τόσο της CB2 όσο και της CB1.'Ας σημειωθεί ότι ο επιζήμιος ρόλος της CB2 στην παθογένεση τουνεφρώνίνωσηαποδείχθηκε με γενετικές προσεγγίσεις στην πρόσφατη μελέτη μας», και επιβεβαιώνεται περαιτέρω στην παρούσα μελέτη.

Αν και μια προηγούμενη αναφορά έδειξε ότι το CB2 εκφράζεται τόσο από φλεγμονώδη κύτταρα όσο και από ποδοκύτταρα σε υψηλό βασικό επίπεδο,8 το CB2 και ο κύριος ενδογενής συνδέτης του 2-AG στην πραγματικότητα ρυθμίζονται προς τα πάνω μετά από UUO και IRI.7 Ιδιαίτερα, στη νεφρική ίνωση ποντικών και μια ποικιλία ανθρώπινων νεφροπαθειών, το CB2 εκφράζεται κυρίως στο νεφρικό σωληναριακό επιθήλιο καθώς και σε διάμεσους ινοβλάστες και λευκοκύτταρα (Εικόνα 2, Συμπληρωματικό Σχήμα S1), υποδηλώνοντας ότι η ανοδική ρύθμιση του CB2 είναι ένα κοινό παθολογικό χαρακτηριστικό στα ινώδη νεφρά. Στις μελέτες μας σε ζώα, υιοθετήσαμε τον in situ υβριδισμό φθορισμού του CB2 για να αναγνωρίσουμε το πρότυπο έκφρασής του λόγω του χαμηλού κόστους του. Η χρώση αποκάλυψε ότι το CB2 εκφράζεται κυρίως στο σωληναριακό επιθήλιο. Ο λόγος πίσω από αυτή την απόκλιση μπορεί να έγκειται στην ευαισθησία της τεχνικής υβριδισμού φθορισμού in situ στην ανίχνευση πολύ άφθονων mRNA και στον χρόνο έκθεσης για απεικόνιση. Παρατηρήσαμε το CB2 όχι μόνο στην κυτταρική μεμβράνη, αλλά και στη σωληναριακή κυτταροπλασματική περιοχή, υποδηλώνοντας εσωτερίκευση του υποδοχέα σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα, όπως τα ενδοσώματα και τα λυσοσώματα. ελέγχθηκαν σε ποντίκια CB2 νοκ-άουτ (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε τον σχηματισμό ετεροδιμερών CB2 με CB1 σε επηρεασμένο από UUOνεφράκαι σωληνοειδών κυττάρων που προκαλούνται από τον αυξητικό παράγοντα- -μετασχηματισμού (Συμπληρωματικό Σχήμα S4), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα διεγερτικά τους αποτελέσματα μπορεί να είναι συνεργιστικά. Ωστόσο, η έκφραση CB1 δεν επηρεάστηκε από το AM1241 ή το XL-001, γεγονός που προσθέτει περαιτέρω πολυπλοκότητα στους μηχανισμούς. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως σχετικά με τις αμοιβαία ανασταλτικές επιδράσεις των CB2 και CB1, «θα πρέπει να διεξαχθούν περισσότερες μελέτες για την επαλήθευση των διασυνδεδεμένων επιδράσεών τους, μια έρευνα πέρα ​​από το πεδίο της τρέχουσας μελέτης. Ωστόσο, τα προηγούμενα και τα παρόντα ευρήματά μας αποκαλύπτουν σταθερά ότι ο αποκλεισμός του CB2 είναι μια πιθανή στρατηγική θεραπευτικής παρέμβασης για την πρόληψη της νεφρικής ίνωσης. Μαζί με την ενημέρωση των ασθενών με ΧΝΝ, τα ευρήματά μας παρέχουν προειδοποιήσεις για την υγεία στην ταχέως αναπτυσσόμενη ομάδα.

Εικόνα 10| Ο υποδοχέας κανναβινοειδών τύπου 2 (CB2) είναι ένας κατάντη στόχος της -κατενίνης (-cat). (α) Η ανάλυση βιοπληροφορικής αποκάλυψε την παρουσία πιθανών θέσεων δέσμευσης παράγοντα Τ-κυττάρου (TCF) στην περιοχή προαγωγέα CB2 ανθρώπου και ποντικού γονίδια. Οι αλληλουχίες και οι θέσεις των υποτιθέμενων TBS στα γονίδια CB2 επισημαίνονται (κόκκινο), ενώ η συναινετική αλληλουχία TBS δίνεται στο κάτω μέρος αυτού του πίνακα. (β) Αποτελέσματα ανάλυσης αντιπροσωπευτικής ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChlP) που δείχνουν τη δέσμευση του TCF ή του λεμφοειδούς ενισχυτή-δεσμευτικού παράγοντα (LEF)-1 στην περιοχή προαγωγέα γονιδίου CB2. Ο άνθρωποςνεφρόεγγύς σωληναριακά (HKC)-8 κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο έκφρασης -κατενίνης (pFlag- -cat) ή pcDNA3 για 24 ώρες. Τα κυτταρικά προϊόντα κατακρημνίσθηκαν με ένα αντίσωμα έναντι TCF, LEF-1, ιστόνης Η3 ή μη ανοσολογικού lgG και ο προσδιορισμός τσιπ πραγματοποιήθηκε για προαγωγείς γονιδίου CB2. Το ολικό αραιωμένο προϊόν λύσης χρησιμοποιήθηκε ως ολικό γονιδιωματικό εισερχόμενο DNA. (γ) Γραφική παρουσίαση του επιπέδου mRNA CB2. Κύτταρα HKC-8 επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο pFlag- -cat ή pcDNA3. Το ολικό RNA αναλύθηκε με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">των καταναλωτών ενδοκανναβινοειδών, τόσο για ψυχαγωγικούς όσο και για ιατρικούς σκοπούς. Η χρόνια βαριά χρήση θα μπορούσε να οδηγήσει στη συνεχή ενεργοποίηση των υποδοχέων CB1 και CB2, η οποία μπορεί να έχει αρνητικές επιπτώσεις στηννεφρόυγεία.

Αν και μια προηγούμενη αναφορά έδειξε ότι η -αρρεστίνη 1 παίζει ρόλο στη νεφρική ίνωση και την ενεργοποίηση της -κατενίνης, διευκρινίζουμε περαιτέρω τους λειτουργικούς μηχανισμούς της οδού CB2/-κατενίνης με τη μεσολάβηση της -αρρεστίνης 1-. Βρήκαμε την -αρρεστίνη Το 1 είναι πιο άφθονο από το -αρρεστίνη 2 σε ποντικούς IRI (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Είναι ευρέως γνωστό ότι η -αρρεστίνη 1 είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του GPCR και τη μεταγωγή σήματος προς τα κάτω μέσω Src, AKT, εξωκυττάριας κινάσης πρωτεΐνης ρυθμιζόμενης με σήμα (ERK1/2) και άλλες κινάσες.2ότι η ενεργοποίηση του Src θα μπορούσε να μεσολαβήσει σε πολλά μονοπάτια υπέρ της ίνωσης, όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και ο μετατροπέας σήματος και ο ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT)3," δεν θα μπορούσαμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα αυτές οι οδοί να είναι και οι κατάντη οδοί του CB2. οι παρατηρήσεις μας υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση -κατενίνης διαμεσολαβείται από το σύμπλεγμα CB2-επαγόμενης -αρρεστίνης 1/Src. Επιπλέον, η -αρρεστίνη 1 είναι ένας κύριος ρυθμιστής σημείου ελέγχου και χρησιμεύει ως πρωτεΐνη ικριώματος για την έναρξη της ενεργοποίησης - Η κατενίνη μετατοπίζοντάς την στον πυρήνα. Ένα άλλο νέο εύρημα είναι ότι το CB2 είναι στόχος της -κατενίνης. Αρκετοί στόχοι της -κατενίνης έχουν προηγουμένως εντοπιστεί σε αυτή τη μελέτη. Ως εκ τούτου, είναι αξιοσημείωτο ότι η οδός CB2/ -κατενίνης φαίνεται να δημιουργούν έναν βρόχο αμοιβαίας ενεργοποίησης που προάγει συνεργατικά την παθογένεση της νεφρικής ίνωσης.

Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το CB2 που εκφράζεται με ανώμαλο τρόπο εμπλέκεται κρίσιμα στη νεφρική ίνωση μέσω της επαγόμενης από 1--αρρεστίνης ενεργοποίησης της κατενίνης. -η κατενίνη πυροδοτεί την έκφραση του CB2, η οποία διευκολύνει την ενεργοποίηση του υποδοχέα και τη μετάδοση του κύματος σήματος. Αυτά τα αποτελέσματα (i) απεικονίζουν μια νέα οδό CB2/-κατενίνης που προάγει τη νεφρική ίνωση και (ii) υποδηλώνουν ότι η στοχευμένη αναστολή της CB2 ή της -αρρεστίνης 1 μπορεί να προστατεύει από την ίνωση μέσω της αναστολής του βρόχου αμοιβαίας ενεργοποίησης.

ΣΥΝΟΠΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ

Για λεπτομερείς μεθόδους, δείτε τις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Ζωικά μοντέλα

Αρσενικά ποντίκια C57BL/6 αγοράστηκαν από το Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Southern Medical University (Guangzhou, Κίνα). Για το μοντέλο IRI, οι αμφίπλευροι μίσχοι κόπηκαν με σφιγκτήρες μικροανευρύσματος για 32 λεπτά στις 37,5 μοίρες κατά την περίοδο ισχαιμίας και ανάρρωσης. Το μοντέλο UUO καθιερώθηκε με τριπλή απολίνωση του αριστερού ουρητήρα με 4-0 μετάξι μετά από τομή στην κοιλιακή μέση γραμμή. Για το μοντέλο UIRI, οι αριστεροί μίσχοι κόπηκαν για 35 λεπτά χρησιμοποιώντας σφιγκτήρες μικροανευρύσματος και οι ετερόπλευροινεφρόαφαιρέθηκε 1 ημέρα πριν από τη θυσία. Για το μοντέλο νεφροπάθειας που προκαλείται από φολικό οξύ, αρσενικά ποντίκια C57BL/6 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φολικό οξύ μέσω μιας μονής ενδοπεριτοναϊκής ένεσης 25 mg/kg σωματικού βάρους. Η in vivo έκφραση του Wnt1 ή CB2 ή η εξουδετέρωση της -αρρεστίνης 1 σε ποντίκια διεξήχθη με μια προσέγγιση παροχής γονιδίου που βασίζεται σε υδροδυναμική. από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων στο Southern Medical University, Guangzhou, Κίνα. Ζεύγη αναπαραγωγής μηδενικών ποντικών CB2 (CB2/) ηλικίας 6-8 εβδομάδων, σε φόντο C57BL/6N, αγοράστηκαν από την Cyagen Biosciences (αριθμός αποθέματος KOCMP{ {19}}Cnr2, Cyagen Biosciences, Guangzhou, Κίνα). Η ανεπάρκεια του υποδοχέα CB2 επιβεβαιώθηκε με αντίστροφη μεταγραφή-PCR.

Δείγματα βιοψίας ανθρώπινου νεφρού και κυτταροκαλλιέργεια

Ο άνθρωποςνεφρότομές (3 μm) ελήφθησαν από βιοψίες νεφρού που πραγματοποιήθηκαν στο Νοσοκομείο Nanfang και στο Λαϊκό Νοσοκομείο της Περιφέρειας Huadu, στο Southern Medical University, Guangzhou, Κίνα. Οι βιοψίες φυσιολογικού ελέγχου προήλθαν από μη όγκουςνεφρόιστούςασθενών που είχαν καρκίνωμα νεφρού. Οι μελέτες που αφορούσαν τομές ανθρώπινου νεφρού πραγματοποιήθηκαν με ενημερωμένη συγκατάθεση του ασθενούς και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Ιδρύματος στο Νοσοκομείο Nanfang και το Λαϊκό Νοσοκομείο της Περιφέρειας Huadu. Ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (HKC-8) παρέχονται από τον Dr. Lorraine C. Racusen (Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, Βαλτιμόρη, MD). Τα πυρηνικά και τα κυτταροπλασματικά κλάσματα διαχωρίστηκαν με ένα εμπορικό κιτ (BestBio, Shanghai, China).

Προσδιορισμός των επιπέδων κρεατινίνης ορού και αζώτου ουρίας αίματος

Τα επίπεδα κρεατινίνης ορού και αζώτου ουρίας αίματος προσδιορίστηκαν με έναν αυτόματο χημικό αναλυτή (AU480 Chemistry Analyzer, Beckman Coulter, Atlanta, GA).

Υβριδισμός in situ

Οι ανιχνευτές CB2 αγοράστηκαν από την Boster Technology, Wuhan, Κίνα.Νεφρότομές (8 μm) στερεώθηκαν με φορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό και αξιολογήθηκαν με χρώση φθορισμού του CB2 χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, Κίνα).

Ιστολογία και ανοσοϊστοχημική και ανοσοφθορισμός χρώση

Ενσωματωμένο σε παραφίνηνεφρόΟι τομές χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας χρώση με περιοδικό οξύ-Schiff και τρίχρωμο Masson για τον εντοπισμό τραυματισμένων σωληναρίων και τον προσδιορισμό της εναπόθεσης κολλαγόνου. Οι βλάβες προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας τεχνική με τη βοήθεια υπολογιστή. Η ανοσοϊστοχημική χρώση και η χρώση ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε σε παραφίνη και κατεψυγμένες τομές, αντίστοιχα. Τα αντισώματα περιγράφονται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.