Μέρος 2: Χαρτογράφηση της επιγονιδιωματικής και μεταγραφικής αλληλεπίδρασης κατά τη διάρκεια του σχηματισμού μνήμης και της ανάκλησης στο σύνολο του Hippocampal Engram
Mar 15, 2022
για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com
Διακεκριμένα μεταγραφικά προγράμματα των συνόλων engram κατά το σχηματισμό και την ανάκληση μνήμης
Για να διασαφηνίσουμε πώς οι αλλαγές στην προσβασιμότητα της χρωματίνης και οι αλληλεπιδράσεις υποκινητή-ενισχυτή επηρέαζαν την έκφραση γονιδίων, πραγματοποιήσαμε πυρηνικό RNA-seq (nRNA-seq) από όλους τους νευρωνικούς υποπληθυσμούς. Η διαφορικά εκφρασμένη γονιδιακή μας ανάλυση (DEG) αποκάλυψε μικρό αριθμό αλλαγών στην πρώιμη φάση σε σύγκριση με τους νευρώνες βασικής κατάστασης (Βασική έναντι πρώιμης, 88 DEGs, Εικ. 5α, Συμπληρωματικός Πίνακας 8). Αυτό ήταν ιδιαίτερα απροσδόκητο δεδομένου του εκτεταμένου βαθμού οργάνωσης της χρωματίνης που παρατηρήθηκε σε αυτό το χρονικό σημείο (Εικ. 2α). Αντίθετα, οι νευρώνες από την όψιμη φάση παρουσίασαν υψηλότερους αριθμούς DEG παρά το γεγονός ότι υπήρχε μεγαλύτερη ομοιότητα στην προσβασιμότητα της χρωματίνης σε αυτά τα χρονικά σημεία (Εικ. 5α). Για να επικυρώσουμε τα μεταγραφικά μας ευρήματα, συγκρίναμε τα αποτελέσματά μας με προηγούμενα δημοσιευμένα δεδομένα ενεργοποιημένων κοκκωδών κυττάρων DG 1 ώρα μετά την νέα έκθεση32, 24 ώρες μετά το FS20 και μετά από παρατεταμένη διέγερση (6 ώρες) καλλιεργημένων φλοιωδών νευρώνων ποντικού με KCl33 (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 4α ). Είναι ενδιαφέρον, αν και αυτή η σύγκριση αποκάλυψε σημαντική επικάλυψη μεταξύ γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω από το σύνολο δεδομένων μας και 1 ώρα μετά την νέα έκθεση32 (P=0.006) ή 24 ώρες μετά την FS20 (P=0.0005), δεν παρατήρησε καμία σημαντική επικάλυψη με γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στα ενεργοποιημένα κύτταρα engram και στα άλλα σύνολα δεδομένων, επιβεβαιώνοντας το μοναδικό μεταγραφικό τοπίο των επανενεργοποιημένων κυττάρων engram κατά την ανάκληση.
Κάντε κλικ στοΟφέλη και παρενέργειες του Cistanche για τη μνήμη
Στη συνέχεια, εκμεταλλευτήκαμε την προηγουμένως δημοσιευμένη υπολογιστική προσέγγιση34 που μετρά τις αλλαγές στις αναγνώσεις ώριμου RNA (εξόνια) και προ-mRNA (εσώνια). Όπως αναμενόταν, οι εξωνικές αλλαγές συσχετίζονται με τις παγκόσμιες μεταγραφικές αλλαγές όπως μετρώνται από το DEseq2 (αναγνώσεις τόσο εξονίου όσο και εσωνίου), σε όλα ταμνήμηφάσεις (Extended Data Σχ. 4β). Ωστόσο, η μέτρηση των αναλογιών εξωνίου/ιντρονίου υποδεικνύει ότι αλλοιωμένα μεταγραφήματα (ρυθμισμένα προς τα πάνω και προς τα κάτω) κατά τη διάρκειαμνήμηΗ ενοποίηση (Πρώιμη έναντι όψιμης) καθοδηγείται κυρίως από ιντρονικές αναγνώσεις, υποδηλώνοντας ότι αυτό το μεταγραφικό προφίλ αντικατοπτρίζει ως επί το πλείστον ανώριμα μεταγραφήματα που απαιτούν πρόσθετα στάδια επεξεργασίας RNA (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 4γ). Αντίθετα, τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω κατά την ανάκληση (Όψιμη έναντι Επανενεργοποιημένης) οδηγούνται κυρίως από εξωνικά μεταγραφήματα, αντανακλώντας έτσι μια πιο ώριμη κατάσταση του RNA (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 4γ).
Για να συμβιβάσουμε την ασυμφωνία μεταξύ των παρατηρούμενων αλλαγών της χρωματίνης και της μεταγραφικής κατάστασης σε κάθε υποπληθυσμό, πραγματοποιήσαμε ανάλυση συσχέτισης των DARs και DEGs, που προσδιορίστηκαν κατά τα διαφορετικά χρονικά σημεία τουμνήμησχηματισμός και ανάκληση. Για αυτήν την ανάλυση, τα DAR στις μη κωδικοποιητικές περιοχές (διαγονιδιακές και ιντρονικές) χαρτογραφήθηκαν στους αντίστοιχους προαγωγείς τους χρησιμοποιώντας τα δεδομένα μας pc-HiC. Συνολικά, βρήκαμε μια χαμηλή συσχέτιση (P=2.81 × 10−2) μεταξύ της διαφορικής προσβασιμότητας της χρωματίνης και των αλλαγών έκφρασης γονιδίων που συμβαίνουν στην πρώιμη φάση (Βασική έναντι πρώιμης, Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 4δ). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με την προηγούμενη εργασία21, αναφέροντας ότι οι τροποποιήσεις ιστόνης έχουν μικρή συσχέτιση με τις μεταγραφικές αλλοιώσεις κατά τη διάρκειαμνήμηαπόκτηση. Απροσδόκητα, παρατηρήσαμε μια ισχυρότερη επικάλυψη και ομοιότητα μεταξύ των αλλαγών της χρωματίνης που συμβαίνουν κατά τη διάρκειαμνήμηκωδικοποίηση (Πρώιμη) με το αλλαγμένο μεταγραφικό τοπίο κατά τη διάρκεια της ενοποίησης μνήμης (Όψιμη) και επανενεργοποιημένους νευρώνες εγγράμματος (P {{0}}.13 × 10−8, 2,42 × 10 −7, αντίστοιχα, Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 4δ). Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω αυτήν την ανάλυση, πραγματοποιήσαμε μια συσχέτιση Pearson μεταξύ των τιμών log2FC από τα DAR και των τιμών log2FC των DEG που σχολιάστηκαν σε αυτήν την περιοχή (οι διαγονιδιακές περιοχές χαρτογραφήθηκαν μέσω του συνόλου δεδομένων pc-HiC, Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 4e, Συμπληρωματικός Πίνακας 9) . Η ανάλυσή μας αποκάλυψε ότι οι πρώιμες αλλαγές χρωματίνης (Βασική έναντι πρώιμης, DARs) συσχετίστηκαν σημαντικά με την καθοδική ρύθμιση των γονιδίων στην όψιμη φάση (Πρώιμη έναντι όψιμης, εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 4e, γκρίζα γραμμή, r=− 0.14, p < 0.0001).="" επιπλέον,="" μετά="" την="" ανάλυση="" των="" deg="" σε="" ιντρονικές="" και="" εξωνικές="" αναγνώσεις,="" παρατηρήσαμε="" ότι="" η="" συσχέτιση="" καθοδηγήθηκε="" σε="" μεγάλο="" βαθμό="" από="" ιντρονικές="" αναγνώσεις="" (εσώνια="" r="−0,21," p=""><0,0001, εξόνια="" r="−0,09," p="" {{="" 29}}.02).="" αντίθετα,="" οι="" πρώιμες="" αλλαγές="" χρωματίνης="" (βασική="" έναντι="" πρώιμης,="" dars)="" έδειξαν="" θετική="" συσχέτιση="" με="" degs="" από="" τα="" επανενεργοποιημένα="" κύτταρα,="" η="" οποία="" οδηγήθηκε="" κυρίως="" από="" εξωνικές="" αναγνώσεις="" (introns="" r="−0,007," p="0.73" ,="" exons="" r="0.11," p="0.04)." αυτά="" τα="" δεδομένα="" παρέχουν="" περαιτέρω="" στοιχεία="" για="" ένα="" συμβάν="" εκκίνησης="" και="" μεταγραφική="" υστέρηση,="" στην="" οποία="" οι="" αλλαγές="" της="" χρωματίνης="" που="" συμβαίνουν="" κατά="" την="" πρώιμη="" φάση="" επιτρέπουν="" τις="" μεταγραφικές="" αλλαγές="" που="" παρατηρούνται="" σε="" μεταγενέστερο="" χρονικό="" σημείο,="" κυρίως="" σε="" επανενεργοποιημένα="" κύτταρα="">
ΜνήμηΗ κωδικοποίηση, η ενοποίηση και η ανάκληση είναι μια δυναμική διαδικασία που απαιτεί πολλά κύματα καθυστερημένης γονιδιακής μεταγραφής12,32,33. Ως εκ τούτου, για τον εντοπισμό διαφορετικών μεταγραφικών προγραμμάτων σε όλαμνήμηΦάσεις, αξιολογήσαμε την έκφραση κάθε γονιδίου από μη ενεργοποιημένους νευρώνες (Basal) έως πρώιμες (Ενεργοποιημένοι νωρίς), όψιμες (Ενεργοποιημένοι-όψιμες) και νευρώνες που ενεργοποιήθηκαν εκ νέου κατά την ανάκληση (Επανενεργοποιημένοι). Όλα τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs, n=1095) που πληρούσαν τα κριτήρια αποκοπής (p-value < 0).01,="" log2="" (αναλογία="" φορές)=""> 1) συγκεντρώθηκαν αμερόληπτα (k-μέσος όρος) (Εικ. 5β, γ). Εντοπίστηκαν τέσσερις κύριες ομάδες. θ) 260 γονίδια
που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω στην όψιμη φάση (Dw-late cluster), ii) 207 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στην τελευταία φάση (Up-late cluster), iii) 186 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στην πρώιμη φάση, και διατηρήθηκαν σε όλαμνήμηφάσεις (Stable cluster) και iv) 438 γονίδια
που ρυθμίστηκαν μοναδικά προς τα πάνω στους επανενεργοποιημένους νευρώνες, κατά τη διάρκειαμνήμηανάκληση (Σύστημα επανενεργοποίησης). Παρόμοια με τη σύγκριση ανά ζεύγος μας, οι μεταγραφικές αλλαγές στους ενεργοποιημένους-όψιμους νευρώνες συσχετίστηκαν υψηλότερα με τις ιντρονικές αναγνώσεις και το μεταγραφικό τοπίο των επανενεργοποιημένων νευρώνων φαίνεται να είναι πιο ώριμο και παρουσίασε υψηλότερη συσχέτιση με τις εξωνικές αναγνώσεις (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 5a,b).
Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση γονιδιακής οντολογίας (GO) για κάθε σύμπλεγμα (Εικ. 5δ), για να αναγνωρίσουμε εμπλουτισμένα μονοπάτια εντός διαφορετικώνμνήμηφάσεις. Το σύμπλεγμα μεταγραφικής υπογραφής του όψιμου εμπλουτίστηκε για γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της «ανασταλτικής λειτουργίας συνάψεων», τα οποία έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ρόλο στη νευρωνική διεγερσιμότητα35,36 (Εικ. 5e). Στο σύμπλεγμα Up-late, παρατηρήσαμε σύνολα γονιδίων που εμπλέκονται στη θετική ή αρνητική ρύθμιση της μεταγραφής, όπως η οικογένεια ογκογονιδίων του μυοαπονευρωτικού ινοσαρκώματος v-maf, η πρωτεΐνη Β (Mafb), η οικογένεια σαλιγκαριού ψευδάργυρος δάχτυλο 2 (Snai2) και το RE{{{ 8}}παράγοντας μεταγραφής σιγής (Ανάπαυση) (Εικ. 5ε). Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι το 15 τοις εκατό (32/207) του προαγωγέα του γονιδίου στο Dw-late cluster λιμάνι περιέχει είτε Snai2 (p-value - 1 × 10−9) είτε Rest (p-value - 1 × 10−3) θέσεις δέσμευσης. Αυτή η δυναμική των μεταγραφικών ρυθμιστών δείχνει προς μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ των συστάδων Dw- και Up-late. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι λειτουργικά διακριτά νευρωνικά σύνολα υπάρχουν σε ένα μόνομνήμηengram, στο οποίο τα σύνολα που εξαρτώνται από το ογκογονίδιο του οστεοσαρκώματος FBJ (Fos) και το νευρωνικό PAS τομέα πρωτεΐνης 4 (Npas4) υφίστανται διακριτές συναπτικές τροποποιήσεις μετά από CFC και οδηγούν συμπεριφορές καθοδηγούμενες από τη μνήμη σε αντίθετες κατευθύνσεις37. Αποδείχθηκε ότι οι διεγερτικές συναπτικές εισροές προάγουνμνήμηη γενίκευση και οι ανασταλτικές προάγουν τη διάκριση της μνήμης. Αν και αυτά τα διαφορετικά σύνολα δεν μπορούσαν να διαφοροποιηθούν στην τρέχουσα μελέτη, αυτές οι παρατηρήσεις μπορεί να εξηγήσουν την αμφίδρομη έκφραση θετικών ή αρνητικών μεταγραφικών ρυθμιστών, καθώς και γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω και προς τα κάτω που εμπλέκονται στη νευρωνική διεγερσιμότητα.
Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη
Το σύμπλεγμα Σταθερών εμπλουτίστηκε ως επί το πλείστον για μεταγραφές που εμπλέκονται σε κυτταροσκελετικό, αναδιαμόρφωση άξονα και εξαρτώμενο από τον ιππόκαμπομνήμη38, συμπεριλαμβανομένων των ελαφρών και βαρέων πολυπεπτιδικών νευρονημάτων (Neal, Neath) και της μυοσίνης, βαρύ πολυπεπτίδιο 10, μη μυϊκό (Myh10) (Εικ. 5d,e). Για την απεικόνιση και την παρακολούθηση αλλαγών που σχετίζονται με τον κυτταροσκελετό στους δενδρίτες και τις σπονδυλικές στήλες, ο ανταποκριτής loop-eYFP (εξαρτώμενος από το TAM) παραδόθηκε από αδενο-σχετιζόμενο ιό (AAV) σε ποντίκια DG ofArc-CreERT2 (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 6a). Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι οι Ενεργοποιημένοι-όψιμοι και Επανενεργοποιημένοι νευρώνες φιλοξενούν σημαντικά υψηλότερο αριθμό μανιταριών και λεπτών αγκάθων (P< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">
Η μοναδική μεταγραφική υπογραφή των επανενεργοποιημένων νευρώνων εγγραμμάτων (Σύστημα επανενεργοποίησης) χαρακτηρίστηκε ως επί το πλείστον από κατηγορίες «μεταφοράς/σύνδεσης RNA» και «μεταφραστικούς μηχανισμούς πρωτεΐνης» (Εικ. 5δ). Αυτό το μεταγραφικό πρόγραμμα περιλαμβάνει αυξημένη έκφραση των μελών της οικογένειας κινεσίνης 5a και c (Kif5a, Kif5c), έναρξη ευκαρυωτικής μετάφρασης (Eif) παράγοντα 3 υπομονάδα A, D (3a, 3d), υπομονάδα παράγοντα 4 H (Eif4h), υπομονάδα παράγοντα 5 A ( Eif5a) και ριβοσωμική πρωτεΐνη (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (Εικ. 5d,e), που αναφέρθηκε προηγουμένως ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στη μεταφορά του mRNA στο συναπτικό διαμέρισμα και στον αυτόνομο έλεγχο της τοπικής μετάφρασης39 . Για περαιτέρω επικύρωση αυτών των ευρημάτων σε μεταφραστικό επίπεδο, μετρήσαμε την έκφραση πρωτεΐνης και τον εντοπισμό τριών μελών από την οικογένεια Eif με ανοσοϊστοχημεία (IHC). Τα Serval Eif-members αναφέρθηκε προηγουμένως ότι εμπλέκονται ειδικά στη μετάφραση σε συναπτικά διαμερίσματα39, επομένως, αναλύσαμε ξεχωριστά την έκφραση πρωτεΐνης στο σώμα και τους άξονες δενδρίτη των ενεργοποιημένων νευρώνων (Εικ. 5στ). Οι επανενεργοποιημένοι νευρώνες είχαν υψηλότερη έκφραση των πρωτεϊνών Eif3e στο σώμα, σε σύγκριση με τους Ενεργοποιημένους πρώιμους και όψιμους νευρώνες (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 6γ). Αντίθετα, το Eif4e ήταν σημαντικά πιο άφθονο στους άξονες των Επανενεργοποιημένων νευρώνων, σε σύγκριση με τους Ενεργοποιημένους πρώιμους και όψιμους νευρώνες (Ps<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">μνήμη.
Ο αυξημένος μηχανισμός μετάφρασης διευκολύνει τις αλλαγές στο σχήμα, το μέγεθος και τον αριθμό της σπονδυλικής στήλης, με αποτέλεσμα ενισχυμένη συναπτική πλαστικότητα39–41. Επιπλέον, οι σπονδυλικές στήλες με μεγαλύτερη διάμετρο κεφαλής είναι πιο πιθανό να περιέχουν ριβοσώματα για τοπική πρωτεϊνική σύνθεση, μεγαλύτερες μετασυναπτικές πυκνότητες, οι οποίες αγκυρώνουν περισσότερους υποδοχείς γλουταμινικού AMPA και καθιστούν αυτές τις συνάψεις λειτουργικά ισχυρότερες41,42. Σύμφωνα με αυτές τις αναφορές, οι Επανενεργοποιημένοι νευρώνες παρουσίασαν μεγαλύτερο αριθμό διευρυμένων διαμέτρων κεφαλής (51 τοις εκατό από όλα τα αγκάθια των μανιταριών), σε σύγκριση με την ομάδα Ενεργοποιημένοι -όψιμο (18 τοις εκατό ) (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 6δ). Επιπλέον, βρήκαμε σημαντική αύξηση τόσο στα επίπεδα του γλουταμινικού υποδοχέα 1, του ιοντοτροπικού, του mRNA AMPA1 (Gria1) (Εκτεταμένα δεδομένα Εικ. 6e) και της πρωτεΐνης Gria1 μόνο στους δενδριτικούς άξονες των Επανενεργοποιημένων νευρώνων, σε σύγκριση με τους Ενεργοποιημένους -πρώιμους και - όψιμους νευρώνες (Εικ. 5g). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι διαφορετικά χρονικά διαχωρισμένα μεταγραφικά προγράμματα συγχρονίζονται για να διατηρηθεί η νευρωνική διεγερσιμότητα, οι δομικές αλλαγές, η μετάφραση πρωτεΐνης και η συναπτική πλαστικότητα, καθ' όλη τη διάρκεια ζωής του συνόλου engram.
Τα ρυθμιστικά στοιχεία με αντίθετα μεταγραφικά αποτελέσματα αλληλεπιδρούν με τους υποκινητές καθώς η μνήμη προχωρά από την κωδικοποίηση στην ανάκληση
Στη συνέχεια ρωτήσαμε πώς η αλληλεπίδραση μακράς εμβέλειας προαγωγέα-ενισχυτή και η κατάσταση της χρωματίνης θα μπορούσαν να οδηγήσουν στις συντονισμένες αλλαγές γονιδιακής έκφρασης που παρατηρήθηκαν σε καθεμία από τις μεταγραφικές συστάδες. Για να το επιτύχουμε αυτό, μετρήσαμε την προσβασιμότητα της χρωματίνης σε ενισχυτές που αλληλεπιδρούν με προαγωγείς, από κάθε μεταγραφικό σύμπλεγμα (Εικ. 6a–c). Επιπλέον, η βαθμολογία αλληλεπίδρασης αυτών των ενισχυτών σχεδιάστηκε μαζί έναντι της προσβασιμότητας της χρωματίνης και της αντίστοιχης γονιδιακής τους έκφρασης (Συμπληρωματικός Πίνακας 10).
Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη
Συνολικά, όλες οι ομάδες έδειξαν σημαντική σταδιακή αύξηση στην προσβασιμότητα της χρωματίνης στους ενισχυτές. Είναι σημαντικό ότι βρήκαμε ότι η προσβασιμότητα στη χρωματίνη συνέβη πριν από την 3D - αναδιάταξη χρωματίνης και αλλαγή έκφρασης γονιδίου, παρέχοντας περαιτέρω υποστήριξη μιας μεταγραφικής καθυστέρησης (Εικ. 6a–c, Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 7a,b). Συγκεκριμένα, στο Reactivation-cluster, η ανάλυσή μας αποκάλυψε μια διφασική διαδικασία, στην οποία η πρώιμη φάση τουμνήμηΟ σχηματισμός οδηγεί σε ένα συμβάν εκκίνησης, όπου οι ενισχυτές γίνονται πιο προσιτοί αλλά αποτυγχάνουν να δείξουν αναμενόμενες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Η επανενεργοποίηση των κυττάρων του εγγράμματος συσχετίστηκε με την αναδιοργάνωση των αλληλεπιδράσεων προαγωγέα-ενισχυτή, όπου οι αρχικοί ενισχυτές ήρθαν σε επαφή με τους αντίστοιχους προαγωγείς τους σε υψηλότερη συχνότητα και παρατηρήθηκε μεταγραφικό κύμα (Εικ. 6a-c). Το Cistanche μπορεί να βελτιωθείμνήμη.
Είχε προταθεί προηγουμένως ότι οι αλληλεπιδράσεις προαγωγέα-ενισχυτή είναι εξαιρετικά δυναμικές και οι αλληλεπιδράσεις με διακριτούς συνδυαστικούς ενισχυτές οδηγούν σε αλλαγή κατεύθυνσης στη γονιδιακή έκφραση, ανάλογα με το αν ο ενισχυτής διαθέτει μοτίβα καταστολέα ή ενεργοποιητή14, 18. Το Cistanche μπορεί να βελτιωθείμνήμη.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω αυτό, χρησιμοποιήσαμε χρώμιο για να διαχωρίσουμε αμερόληπτα το γονιδίωμα σε διαφορετικές καταστάσεις που ορίζονται από τοποθεσίες μοτίβων που δεσμεύουν είτε μεταγραφικούς ενεργοποιητές1 (πρώιμη απόκριση ανάπτυξης 1 (Egr1), Ap1), μεταγραφικούς καταστολείς43,44 (πλειόμορφο γονιδιακό αδένωμα 1 (Plagl ), υπερμεθυλιωμένο στον καρκίνο 2 (Hic2), μεθυλική πρωτεΐνη δέσμευσης CpG 2 (Mecp2), Snai2 και Rest) ή TF που επηρεάζουν αμφίδρομα τη μεταγραφή και εμπλέκονται στην αρχιτεκτονική του 3D-γονιδιώματος25,44,45 (CCCTC-binding factor ( CTCF), παράγοντας μεταγραφής E2F 1 (E2f), Yy1). Αυτό εντόπισε τρεις διαφορετικές συνδυαστικές καταστάσεις θέσεων δέσμευσης TF (ισχυρός καταστολέας, δισθενής και ισχυρός ενεργοποιητής, Εικ. 6d,e). Είναι ενδιαφέρον ότι το σύμπλεγμα με μείωση της γονιδιακής έκφρασης (Dw-late) έδειξε μια προοδευτικά αυξανόμενη συσχέτιση από την κωδικοποίηση έως την ανάκτηση με ενισχυτές που περιέχουν μεταγραφικούς καταστολείς και δισθενή μοτίβα (Εικ. 6d, ανώτερος χάρτης θερμότητας· Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 7c,d). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι παρά την παρατηρούμενη προσβασιμότητα στη χρωματίνη, τα γονίδια ρυθμίζονται προς τα κάτω λόγω της καταστολής που προκύπτει από αυτά τα ρυθμιστικά στοιχεία. Το Cistanche μπορεί να βελτιωθείμνήμη.
Αντίθετα, στο σύμπλεγμα Επανενεργοποίησης, παρατηρήσαμε έναν αυξητικό εμπλουτισμό για ενισχυτές που περιέχουν μεταγραφικούς ενεργοποιητές μαζί με μοτίβα που αγκυρώνουν δομές βρόχου (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 7c,d). Ως εκ τούτου, φαίνεται ότι κατά τη νευρωνική δραστηριότητα, αρκετοί προαγωγείς μπορούν να χρησιμοποιήσουν ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών ενισχυτών για να δημιουργήσουν νέες αλληλεπιδράσεις προαγωγέα-ενισχυτή που μπορούν να συντονίσουν διαφορικά την έκφραση γονιδίου. Σε αυτό το μοντέλο, οι προαγωγείς των προς τα κάτω ρυθμιζόμενων γονιδίων αλληλεπιδρούν με ενισχυτές που διαθέτουν μεταγραφικούς καταστολείς, ενώ τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω είναι το αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων προαγωγέα-ενισχυτή που φέρνουν τους μεταγραφικούς ενεργοποιητές σε στενή επαφή με τους αντίστοιχους προαγωγείς. Συλλογικά, τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν έναν διαδοχικό επαναπρογραμματισμό της προσβασιμότητας της χρωματίνης, της αρχιτεκτονικής τρισδιάστατου γονιδιώματος και των αλληλεπιδράσεων προαγωγέα-ενισχυτή κατά τη διάρκεια του σχηματισμού εγγραμμάτων (Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 8).
