Μέρος 1: Η Πρωτεϊνουρική Χρόνια Νεφρική Νόσος σχετίζεται με Μεταβαλλόμενη Διάρκεια Ζωής Ερυθρών Αιμοσφαιρίων, Παραμόρφωση και Μεταβολισμό

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Rosi Bissinger, et al

¹Τομέας Ενδοκρινολογίας, Διαβητολογίας και Νεφρολογίας, Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Tübingen, Tübingen, Γερμανία;²Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Γενετικής, University of Colorado Anschutz Medical Campus, Aurora, Κολοράντο, Η.Π.Α.³Division of Hematology, University of Colorado Denver, Aurora, Colorado, USA;⁴Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Αθλητιατρικής, Γερμανικό Αθλητικό Πανεπιστήμιο της Κολωνίας, Κολωνία, Γερμανία.⁵Ινστιτούτο Έρευνας για τον Διαβήτη και Μεταβολικές Νόσους (IDM) του Κέντρου Helmholtz του Μονάχου στο Πανεπιστήμιο Tübingen, Tübingen, Γερμανία.⁶Γερμανικό Κέντρο Έρευνας για τον Διαβήτη (DZD) στο Πανεπιστήμιο Tübingen, Tübingen, Γερμανία.⁷Κέντρο Κλινικής Μετάγγισης Ιατρικής, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Tübingen, Tübingen, Γερμανία.⁸Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο Eberhard Karls Tübingen, Tübingen, Γερμανία;⁹Τμήμα Δερματολογίας, Πανεπιστήμιο Eberhard Karls Tübingen, Tübingen, Γερμανία;¹⁰Ινστιτούτο Στοματικής Βιολογίας, Οδοντιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο του Όσλο, Όσλο, Νορβηγία.¹¹Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστημιακό Ιατρικό Κέντρο Hamburg-Eppendorf, Αμβούργο, Γερμανία; και¹²Σχολή Επιστημών Υγείας, Ontario Tech University, Oshawa, Οντάριο, Καναδάς

Η αναιμία είναι μια συχνή επιπλοκή τουχρόνια νεφρική νόσος, επηρεάζοντας την ποιότητα ζωής των ασθενών. Μεταξύ διαφόρων παραγόντων, όπως η ανεπάρκεια σιδήρου και ερυθροποιητίνης, η μειωμένη διάρκεια ζωής των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) έχει εμπλακεί στην παθογένεση της αναιμίας. Ωστόσο, μηχανιστικά δεδομένα για in vivo δυσλειτουργία RBC σεΝεφρική Νόσοςλείπουν. Εδώ, περιγράφουμε την ανάπτυξη αναιμίας που σχετίζεται με χρόνια νεφρική νόσο σε ποντίκια με πρωτεϊνουρική νεφρική νόσο που προκύπτει είτε από τη χορήγηση δοξορουβικίνης είτε από επαγόμενη ανεπάρκεια ποδοκίνης. Και στα δύο πειραματικά μοντέλα, η αναιμία εκδηλώθηκε την ημέρα 10 και προχώρησε την ημέρα 30 παρά τα αυξημένα επίπεδα ερυθροποιητίνης στην κυκλοφορία και την ερυθροποίηση στο μυελό των οστών και στον σπλήνα.

Τα κυκλοφορούντα ερυθρά αιμοσφαίρια και στα δύο μοντέλα ποντικών εμφάνισαν αλλοιωμένη μορφολογία και μειωμένη οσμωτική ευαίσθητη παραμόρφωση μαζί με αυξημένη εξωτερίκευση φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική μεμβράνη πλάσματος, χαρακτηριστικό του θανάτου των RBC. Σήμανση φθορισμού των ερυθρών αιμοσφαιρίων την ημέρα 20 ποντικών με επαγόμενη από δοξορουβικίνηΝεφρική Νόσοςαποκάλυψε πρόωρη απομάκρυνση από την κυκλοφορία. Μεταβολικές αναλύσεις των ερυθρών αιμοσφαιρίων και από τα δύο μοντέλα ποντικών κατέδειξαν χρονικές αλλαγές στις οδούς ανακύκλωσης οξειδοαναγωγής και στον κύκλο Lands, μια διαδικασία αναδιαμόρφωσης των λιπιδίων της μεμβράνης. Αναιμικοί ασθενείς με πρωτεϊνουρικήΝεφρική Νόσοςείχαν αυξημένη αναλογία κυκλοφορούντων θετικών στη φωσφατιδυλοσερίνη ερυθρών αιμοσφαιρίων.

Έτσι, οι παρατηρήσεις μας υποδεικνύουν ότι η μειωμένη διάρκεια ζωής των ερυθρών αιμοσφαιρίων, με τη μεσολάβηση του αλλοιωμένου μεταβολισμού των ερυθρών αιμοσφαιρίων, η μειωμένη παραμόρφωση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και ο ενισχυμένος κυτταρικός θάνατος συμβάλλουν στην ανάπτυξη αναιμίας στα πρωτεϊνουρικάΝεφρική Νόσος.

Kidney International (2021) 100, 1227–1239; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.08.024

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:Cistanche, οφέλη Cistanche,Νεφρική Νόσος, νεφρική ανεπάρκεια, χρόνια νεφρική νόσος, αναιμία, κυτταρικός θάνατος. Παραμορφωσιμότητα, Κύκλος εδαφών; μεταβολισμός; πρωτεϊνουρία? ερυθρά αιμοσφαίρια; ανακύκλωση οξειδοαναγωγής

Πνευματικά δικαιώματα ª 2021, International Society of Nephrology. Δημοσιεύτηκε από την Elsevier Inc. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης με την άδεια CC BY-NC-ND

Οφέλη Cistanche νεφρική λειτουργία.

Μεταφραστική δήλωση

Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι το πρωτεϊνουρικόΝεφρική Νόσοςσε μοντέλα ποντικού οδηγεί σε πρόωρη κάθαρση ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC), προκαλώντας τελικά την ανάπτυξη αναιμίας. Αυξημένος θάνατος RBC εμφανίζεται επίσης σε ασθενείς μεχρόνια νεφρική νόσοςκαι αναιμία. Η δυσλειτουργία των ερυθρών αιμοσφαιρίων στο ουραιμικό περιβάλλον είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για την απώλεια RBC και την ανάπτυξη αναιμίας που σχετίζεται με νεφρική νόσο, ανεξάρτητα από την ενδογενή έκκριση ερυθροποιητίνης.

Η ανάπτυξη αναιμίας είναι μια τυπική επιπλοκή των προχωρημένωνχρόνια νεφρική νόσος(ΧΝΝ) και σχετίζεται με μειωμένη ποιότητα ζωής1 και αυξημένο κίνδυνο για καρδιαγγειακά συμβάματα²και νοσηλεία,³καθώς και γνωστική έκπτωση.4 Η σοβαρότητα της αναιμίας έχει θεωρηθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας θνησιμότητας τόσο σε ασθενείς με ΧΝΝ που εξαρτώνται από αιμοκάθαρση όσο και σε μη αιμοκάθαρση.⁵ Η παθοφυσιολογία της αναιμίας που σχετίζεται με νεφρική νόσο είναι πολύπλοκη και περιλαμβάνει ανεπάρκεια σιδήρου και ερυθροποιητίνης (EPO) στο πλαίσιο της φλεγμονής χαμηλού βαθμού, η οποία, με τη σειρά της, θέτει σε κίνδυνο τη φυσιολογική ερυθροποίηση σε ασθενείς με ΧΝΝ.6 Σε προχωρημένη ΧΝΝ, η απόκριση της ΕΡΟ είναι ανεπαρκής χαμηλό σε σχέση με το βαθμό αναιμίας.^7,8Ο υψηλός επιπολασμός της ταυτόχρονης ανεπάρκειας σιδήρου στη ΧΝΝ είναι συνέπεια της διαταραγμένης ομοιόστασης σιδήρου.⁹ Ένας παραμελημένος μηχανισμός απώλειας σιδήρου στη ΧΝΝ είναι η πρωτεϊνουρία, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε απώλειες δεσμευμένου με τρανσφερίνη σιδήρου από τα ούρα (έως 0,3 mg/ημέρα) όταν η πρωτεϊνουρία φτάσει στο νεφρωσικό εύρος.¹⁰

Another factor that is thought to contribute to anemia in CKD patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >πριν από 60 χρόνια.^6,11,12Μια πρόσφατη μελέτη που χρησιμοποιεί ένα τεστ αναπνοής μονοξειδίου του άνθρακα έδειξε ότι η διάρκεια ζωής των ερυθροκυττάρων μειώθηκε προοδευτικά από 120 ημέρες σε ασθενείς με ΧΝΝ σταδίου 1 σε 60 ημέρες σε ασθενείς με ΧΝΝ σταδίου 5.¹³Συγκεκριμένα, η μετάγγιση αλλογενών ερυθρών αιμοσφαιρίων από υγιείς δότες σε ασθενείς με ΧΝΝ ακολουθήθηκε από ταχεία κάθαρση των μεταγγισμένων ερυθρών αιμοσφαιρίων χωρίς ένδειξη αιμόλυσης.¹²Ένας εύλογος μηχανισμός για αυτήν την παρατήρηση μπορεί να είναι η διέγερση ενός κυτταρικού θανάτου που μοιάζει με απόπτωση σε ερυθρά αιμοσφαίρια, που υποδηλώνει ένα μοτίβο τραυματισμού στο οποίο η ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης δεν διακυβεύεται και το κυτταροπλασματικό περιεχόμενο παραμένει ανέπαφο.¹⁴Τα ερυθρά αιμοσφαίρια που υφίστανται κυτταρικό θάνατο εμφανίζουν διάφορες μορφολογικές αλλοιώσεις που προκύπτουν από κυτταροσκελετική βλάβη, όπως σχηματισμός επιφανειακών φυσαλίδων, απώλεια ελαστικότητας μεμβράνης και/ή κυτταρική αφυδάτωση.¹⁵Σε μοριακό επίπεδο, ο θάνατος των ερυθρών αιμοσφαιρίων σχετίζεται με ενδοκυτταρική συσσώρευση Ca2þ, μεταβολή της κυτταρικής ενεργειακής κατάστασης και διάσπαση της ασυμμετρίας των φωσφολιπιδίων, οδηγώντας τελικά σε εξωτερίκευση της φωσφατιδυλοσερίνης (PS) στην εξωτερική πλασματική μεμβράνη.^15,16Κατά συνέπεια, τα μακροφάγα και τα εξειδικευμένα δενδριτικά κύτταρα αναγνωρίζουν γρήγορα τα εξωτερικά ερυθρά αιμοσφαίρια, οδηγώντας σε ερυθροφαγοκυττάρωση και τον καταβολισμό τους σε σπλήνα και ήπαρ.¹⁷

Λόγω της συγχυτικής παθοφυσιολογίας της αναιμίας που σχετίζεται με τη νεφρική νόσο στους ανθρώπους, απαιτούνται μελέτες σε ζώα για τον εντοπισμό των μηχανισμών που συμβάλλουν. Νεφροπάθεια που προκαλείται από δοξορουβικίνη (DIN) σε ποντίκια 129S1/SvImJ18 και ποντίκια με επαγόμενη ανεπάρκεια ποδοκίνης (Nphs2Dipod)¹⁹είναι 2 μοντέλα που χαρακτηρίζονται από την πρόκληση πρωτεϊνουρίας νεφρωσικού εύρους εντός των ημερών, εξέλιξη σενεφρική ανεπάρκειαμετά από 3 εβδομάδες και θάνατος σε 6 έως 7 εβδομάδες.^19–21Και τα δύο μοντέλα ποντικιών ανακεφαλαιώνουν αποτελεσματικά όλα τα στάδια της ανθρώπινης ΧΝΝ. Στην παρούσα μελέτη, δοκιμάσαμε αν είναι προοδευτικήνεφρική ανεπάρκειασε αυτά τα ποντίκια με πρωτεϊνουρικόΝεφρική Νόσοςεπηρεάζει τη διάρκεια ζωής των ερυθρών αιμοσφαιρίων και συμβάλλει στην αναιμία. Παράλληλα, εξετάσαμε τον φαινότυπο RBC στο αίμα που ελήφθη από ασθενείς με ΧΝΝ με πρωτεϊνουρία νεφρωσικού εύρους.

Το Cistanche αντιμετωπίζει τη χρόνια νεφρική νόσο και προστατεύει τα νεφρά

ΜΕΘΟΔΟΙ

Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τα υλικά και τις μεθόδους παρέχονται στα Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι.

Μελέτες ποντικιών

Πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε 8-ποντίκια άγριου τύπου 129S1/SvImJ και των δύο φύλων ηλικίας μιας εβδομάδας (Charles River). Το DIN προκλήθηκε με μία μόνο ένεση δοξορουβικίνης (14,5 mg/g σωματικού βάρους), όπως περιγράφηκε προηγουμένως.^18,22Για τον έλεγχο της μυελοτοξικής επίδρασης της δοξορουβικίνης που δεν σχετίζεται με την ανάπτυξη νεφροπάθειας, ποντίκια C57BL/6 ανθεκτικά στη δοξορουβικίνη υποβλήθηκαν επίσης στο ίδιο πρωτόκολλο θεραπείας.23 Επιπλέον, παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν σε 8-ποντίκια εβδομάδων με επαγόμενη διαγραφή ποδοκίνης (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G]8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) ή ποντίκια Nphs2Dipod, τα οποία υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δοξυκυκλίνη για 14 ημέρες.¹⁹Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τον Οδηγό Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Εργαστηριακών Ζώων και τον Γερμανικό Νόμο για την Ευημερία των Ζώων, με έγκριση από τις τοπικές αρχές (Regierungspräsidium Tübingen, αριθμοί έγκρισης M12/17 και M17/19G ).

Ο πειραματικός σχεδιασμός των μελετών σε ποντίκια περιγράφεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1.

Ασθενείς

Η μελέτη ασθενών διεξήχθη σε συμμόρφωση με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Tübingen (556/2018BO2). Δείγματα αίματος και ούρων λιθίου-ηπαρίνης ελήφθησαν από ασθενείς με πρωτεϊνουρία νεφρωσικού εύρους και διατηρημένο ρυθμό σπειραματικής διήθησης (GFR, στάδια 1-2, n 10) και ασθενείς με μειωμένο GFR (CKD στάδιο 3-5, n 15) στο Πανεπιστήμιο Νοσοκομείο Tübingen. Ως ομάδα ελέγχου, αίμα από υγιείς εθελοντές που ταιριάζουν με την ηλικία και το φύλο (n 25) χορηγήθηκε από την τράπεζα αίματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Tübingen. Όλα τα ανθρώπινα δείγματα συλλέχθηκαν μετά από ενημερωμένη συγκατάθεση. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών αναφέρονται στον Πίνακα 1.

Αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής

Διαφορετικές παράμετροι του θανάτου των ερυθρών κυττάρων προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής.¹⁴ Για να προσδιοριστεί η διάρκεια ζωής των RBC in vivo, 25 ml χρωστικής 5,6-διοξεικής καρβοξυφλουορεσκεΐνης ηλεκτριμιδυλεστέρα [5(6)-CFDA, SE] εγχύθηκαν σε συγκέντρωση 9,96 mM (διαλυτοποιημένο σε διμεθυλοσουλφοξείδιο) στο ρετρό -τροχιακό πλέγμα ποντικών άγριου τύπου 129S1/SvImJ και με ένεση δοξορουβικίνης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.²⁴ Στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, λήφθηκε αίμα από το οπισθοτροχιακό πλέγμα των ποντικών και το ποσοστό των κυττάρων 5(6)-CFDA, SEþ ανιχνεύθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Τέλος, τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo (FlowJo LLC).

Παραμόρφωση RBC και εκτατομετρία ωσμωτικής κλίσης Η παραμόρφωση των RBC μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή οπτικής περιστροφής κυψελών με υποβοήθηση λέιζερ (LORCA MaxSis; RR Mechatronics), ο οποίος έχει περιγραφεί λεπτομερώς αλλού.²⁵ Οι αναλύσεις οσμωτικής διαβάθμισης εκτατομετρίας (osmoscan) πραγματοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας το LORCA MaxSis και μετρήθηκε η παραμορφωσιμότητα υπό διάφορες οσμωτικές συνθήκες.²⁶

Ιστολογική εξέταση

Για τη χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, οι σπλήνες και τα μηριαία οστά χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Όλες οι αντικειμενοφόρες πλάκες χρωματίστηκαν με το πρωτεύον αντίσωμα Ter 119 (BD Pharmingen, αραίωση 1:500). Για χρώση με περιοδικό οξύ-Schiff, φέτες νεφρών πάχους 2,5-mm χρωματίστηκαν με αντιδραστήριο περιοδικού οξέος-Schiff (Carl Roth) και αιματοξυλίνη (abcam). Πραγματοποιήθηκε χρώση May-Grünwald-Giemsa (μέθοδος Pappenheim) για τον προσδιορισμό των αλλαγών σχήματος RBC, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.²⁷ Η απομόνωση σπειραμάτων έγινε με τη χρήση προσέγγισης βιοτινυλίωσης και ταξινόμησης κυττάρων.¹⁹ Για την ανίχνευση πρωτεΐνης της ποδοκίνης, εφαρμόστηκε ένα αντίσωμα από τη Sigma (Ρ0372).¹⁹ Το Roti-Mount Fluor Care 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI; Carl Roth) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων.

Υγρή χρωματογραφία εξαιρετικά υψηλής απόδοσης μεταβολομική φασματομετρία μάζας από ερυθρά αιμοσφαίρια ποντικού

Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως δημοσιεύτηκαν προηγουμένως.²⁸ Εν συντομία, η αναλυτική πλατφόρμα χρησιμοποιεί ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας εξαιρετικά υψηλής απόδοσης Vanquish (Thermo Fisher Scientific) συνδεδεμένο διαδικτυακά με ένα φασματόμετρο μάζας Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρέχονται ως αριθμητικοί μέσοι όροι SEM ή ως διάμεσοι με διατεταρτημόριο εύρος (25ο-75ο εκατοστημόριο) με n που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των χρησιμοποιημένων ζώων ή των ασθενών που περιλαμβάνονται, αντίστοιχα. Τα δεδομένα δοκιμάστηκαν για κανονικότητα με τη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov, τη δοκιμή D' Ag-ostino και τη δοκιμή Shapiro-Wilk. Οι διακυμάνσεις αναλύθηκαν με τη δοκιμή Bartlett για ίσες διακυμάνσεις. Μετά τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Tukey ή Dunn, η μη ζευγαρωμένη δοκιμή Student t ή η δοκιμή Mann-Whitney U πραγματοποιήθηκε από το GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). Το P < 0.05="" με="" 2-ακριβή="" δοκιμή="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="" σημαντικό.="" πρόσθετα="" γραφήματα="" σχεδιάστηκαν="" μέσω="" του="" graphpad="" prism="">

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η πειραματική πρωτεϊνουρική νεφρική νόσος προκαλεί αναιμία σε ποντίκια

Μετά την επαγωγή, ποντίκια 129S1/SvImJ με ποντίκια DIN και Nphs2Dipod ανέπτυξαν πρωτεϊνουρία νεφρωσικού εύρους (Εικόνα 1α και Συμπληρωματικό Σχήμα S2C) και προοδευτικήνεφρική ανεπάρκειαχαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα ουρίας στο πλάσμα από την ημέρα 20 και μετά (Εικόνα 1β και Συμπληρωματικό Σχήμα S2D). Κατά τη διάρκεια των πρώτων 10 ημερών, τα ποντίκια παρουσίασαν αύξηση σωματικού βάρους με ασκίτη (Εικόνα 1γ και Συμπληρωματικό Σχήμα S2E), αντανακλώντας την κατακράτηση νατρίου που προκαλείται από την απέκκριση πρωτεασών σερίνης ή πρωτεασουρίας.¹⁸ Μετά από αυθόρμητη αντιστροφή της κατακράτησης νατρίου, αυτά τα ποντίκια έχασαν σταθερά βάρος. Σε ποντίκια με DIN και σε ποντίκια Nphs2Dipod, εικόνες μικροσκοπίου φωτός, που καταγράφηκαν μετά από 10 ημέρες, αποκάλυψαν τυπικές ιστομορφολογικές αλλαγές συμβατές με εστιακή τμηματική σπειραματική σκλήρυνση (Εικόνα 1δ και Συμπληρωματικό Σχήμα S2B). Αυτά απουσίαζαν σε ποντικούς C57BL/6 στους οποίους έγινε ένεση δοξορουβικίνης (Εικόνα 1δ). Η θεραπεία με δοξορουβικίνη προκάλεσε έντονη μείωση της αιμοσφαιρίνης, του αριθμού των ερυθρών αιμοσφαιρίων και του αιματοκρίτη (Εικόνα 1e–g) από την ημέρα 10 και μετά σε ποντίκια 129S1/SvImJ και C57BL/6, τα οποία στα τελευταία κανονικοποιήθηκαν στις ημέρες 20 και 30. Αντίθετα, στις ημέρες 20 και 30, τα ποντίκια με ένεση 129S1/SvImJ με δοξορουβικίνη και ανεπάρκεια ποδοκίνης ανέπτυξαν προοδευτική αναιμία, που χαρακτηρίζεται από μειωμένο μέσο σωματικό όγκο (Εικόνα 1h) και μειωμένη αιμοσφαιρίνη (Συμπληρωματικό Σχήμα S2F), υποδηλώνοντας ότι η αναιμία σχετίζεται με προοδευτικήνεφρική ανεπάρκειακαι όχι με θεραπεία με doxorubicin per se.

Η αναιμία στην πειραματική πρωτεϊνουρική νεφρική νόσο δεν προκαλείται από διαταραγμένη ερυθροποίηση

Και τα δύο μοντέλα αναιμικών ποντικών εμφάνισαν μια σημαντική αύξηση στο ποσοστό των κυκλοφορούντων δικτυοερυθροκυττάρων (Εικόνα 2α και Συμπληρωματικό Σχήμα S3C). Οι συγκεντρώσεις EPO στο πλάσμα αυξήθηκαν δραματικά την ημέρα 10 σε 129S1/SvImJ με DIN και υγιή ποντίκια C57BL/6 αλλά κανονικοποιήθηκαν ξανά τις ημέρες 20 και 30 (Εικόνα 2β). Σε ποντίκια με έλλειψη ποδοκίνης, οι συγκεντρώσεις EPO στο πλάσμα αυξήθηκαν την ημέρα 10 και παρέμειναν αυξημένες τις ημέρες 20 και 30 (Συμπληρωματικό Σχήμα S2H). Σε ιστολογικές αναλύσεις από μυελό των οστών και σπλήνα, ο αριθμός των ερυθροειδών πρόδρομων κυττάρων σε σύγκριση με τους μυελοειδείς προδρόμους αυξήθηκε την ημέρα 30 (Εικόνα 2d–g), υποδεικνύοντας διεγερμένη ερυθροποίηση σε αναιμικά ποντίκια 129S1/SvImJ με DIN.

Η μειωμένη διάρκεια ζωής των RBC είναι η κύρια αιτία αναιμίας στην πειραματική πρωτεϊνουρική νεφρική νόσο

Η εξωτερίκευση του PS στο εξωτερικό φύλλο της πλασματικής μεμβράνης RBC είναι δείκτης κυτταρικού θανάτου και προαγωγέας ερυθροφαγοκυττάρωσης.14 Ο θάνατος των ερυθρών αιμοσφαιρίων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αναλύσεις διαλογής κυττάρων φθορισμού επιφανείας PS V-bound.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}διπλασιάζεται υψηλότερα την ημέρα 20 σε ποντίκια με DIN (4,16 τοις εκατό T {0.86 τοις εκατό ) σε σύγκριση με υγιή ποντίκια (1.{{7). }} τοις εκατό 0.11 τοις εκατό ) (Εικόνα 3α). Ομοίως, τα ποντίκια Nphs2Dipod παρουσίασαν περίπου 2-πλάσια αύξηση στην έκθεση σε PS (1,27 τοις εκατό T 0,20 τοις εκατό ) σε σύγκριση με υγιή ποντίκια (0,58 τοις εκατό 0,05 τοις εκατό ) την ημέρα 30 (Συμπληρωματικό Σχήμα S3A). Είναι γνωστό ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια αποβάλλονται από την κυκλοφορία από τα μακροφάγα που κατοικούν στη σπλήνα.¹⁷ Αυτή η παρατήρηση μπορεί, επομένως, να εξηγήσει την υψηλότερη αναλογία σπλήνας/σωματικού βάρους των ποντικών Nphs2Dipod (Συμπληρωματικό Σχήμα S2G), όπου τα διπλάσια RBCs αποικοδομούνται σε σύγκριση με τα υγιή ποντίκια C57BL/6.

Καθώς η πρωτεϊνουρία νεφρωσικού εύρους οδηγεί σε δυσπρωτεϊναιμία,²⁹ διερευνήσαμε περαιτέρω εάν ο ενισχυμένος θάνατος των ερυθρών κυττάρων μπορεί να διεγείρεται από ένα συστατικό στο πλάσμα ποντικών με DIN. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3β, η έκθεση σε PS τις ημέρες 10 και 20 ήταν διπλάσια μετά την επώαση (30 λεπτά στους 37 ○C) υγιών ερυθρών αιμοσφαιρίων στο πλάσμα ποντικών 129S1/SvImJ με ένεση δοξορουβικίνης σε σύγκριση με την επώαση στο πλάσμα υγιών ποντικών. Η εισροή Ca2þ στα ερυθρά αιμοσφαίρια, που διαμεσολαβείται από μη εκλεκτικά κανάλια κατιόντων που καλύπτονται από τάση και ανεξάρτητα από την τάση, 30,31 είναι ένας από τους βασικούς ρυθμιστές του θανάτου των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Σε RBC που συλλέχθηκαν τις ημέρες 20 και 30 από ποντίκια 129S1/SvImJ με DIN, οι ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca2þ αυξήθηκαν (Εικόνα 3γ). Αυτό

το φαινόμενο ανακεφαλαιώθηκε σε ποντικούς Nphs2Dipod την ημέρα 20 (Συμπληρωματικό Σχήμα S3B).

Και στα δύο μοντέλα ποντικών, υπήρχε σημαντική αρνητική συσχέτιση του ποσοστού των θετικών σε PS RBC, με τη σοβαρότητα της αναιμίας που αντανακλάται από τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης (Εικόνα 3δ και Συμπληρωματικό Σχήμα S3D). Επιπλέον, υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση με τη νεφρική βλάβη που αντανακλάται από τη συγκέντρωση ουρίας στο πλάσμα (Εικόνα 3e και Συμπληρωματικό Σχήμα S3E) και σε μικρότερο βαθμό με την πρωτεϊνουρία (Εικόνα 3στ και Συμπληρωματικό Σχήμα S3F). Για να αντισταθμιστεί η απώλεια RBC στην αναιμία, ο σχηματισμός νέων ερυθρών αιμοσφαιρίων διεγέρθηκε και στα δύο ποντίκια, όπως υποδεικνύεται από το αυξημένο ποσοστό των κυκλοφορούντων δικτυοερυθροκυττάρων, και συσχετίστηκε σημαντικά με το μέγεθος των ερυθρών αιμοσφαιρίων που εκθέτουν PS (Εικόνα 3g και Συμπληρωματικό Σχήμα S3G).

^{Κάντε κλικΕΔΩγια το Μέρος 2.}