Μέρος 1: Προσδιορισμός ντοπαμινεργικών νευρώνων που μπορούν και να δημιουργήσουν συνειρμική μνήμη και να τερματίσουν απότομα τη συμπεριφορική έκφραση

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Michael Schleyer, 1* Alice Weiglein, 1 Juliane Thoener, 1 Martin Strauch, 2 Volker Hartenstein, 3

Melisa Kantar Weigelt, 1 Sarah Schuller, 1 Timo Saumweber, 1 Katharina Eichler, 4,5,6 Astrid Rohwedder, 4,7 Dorit Merhof, 2 Marta Zlatic, 5,7 Andreas S. Thum, 4,8 και Bertram Gerber1,9 ,10*

1 Ινστιτούτο Νευροβιολογίας Leibniz, Τμήμα Γενετικής της Μάθησης καιΜνήμη, 39118 Magdeburg, Germany, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Germany, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute for Biology, 78464 Konstanz, Γερμανία, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institute of Neurobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Πουέρτο Ρίκο 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, {12}}EJ, Ηνωμένο Βασίλειο, 8 University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Germany, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Germany, and 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106

Μια προσαρμοστική μετάβαση από την εξερεύνηση του περιβάλλοντος για αναζήτηση ζωτικών πόρων στην εκμετάλλευση αυτών των πόρων όταν η αναζήτηση ήταν επιτυχής είναι σημαντική για όλα τα ζώα. Εδώ μελετάμε το νευρωνικό κύκλωμα που επιτρέπει στην προνύμφη Drosophila melanogaster οποιουδήποτε φύλου να διαπραγματευτεί αυτή τη μετάβαση εξερεύνησης-εκμετάλλευσης. Το κάνουμε αυτό συνδυάζοντας τον Pavlovian conditioning με υψηλής ανάλυσης παρακολούθηση συμπεριφοράς, οπτογενετικό χειρισμό μεμονωμένων νευρώνων και αναλύσεις συναπτικής οργάνωσης που βασίζονται σε δεδομένα ΗΜ. Διαπιστώνουμε ότι η οπτογενετική ενεργοποίηση του ντοπαμινεργικού νευρώνα DAN-i1 μπορεί να εδραιώσει και τα δύομνήμηκατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης και να τερματίσετε με άμεσο τρόπο τη διδαχθείσα συμπεριφορά αναζήτησης σε ένα επόμενο τεστ ανάκλησης. Ωστόσο, η ενεργοποίησή του αφήνει ανεπηρέαστη την έμφυτη συμπεριφορά. Συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση DAN-i1 μπορεί να δημιουργήσει συσχετιστικές μνήμες αντίθετου σθένους μετά από ζευγοποιημένη και μη ζευγαρωμένη προπόνηση με οσμή και η ενεργοποίησή της κατά τη δοκιμή ανάκλησης μπορεί να τερματίσει τη συμπεριφορά αναζήτησης που προκύπτει από οποιαδήποτε από αυτές τις μνήμες. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν περαιτέρω ότι στη συμπεριφορική σημασία της η ενεργοποίηση του DAN-i1 μοιάζει, αλλά δεν ισοδυναμεί με ανταμοιβή ζάχαρης. Οι αναλύσεις δενδρογράμματος όλων των συναπτικών συνδέσεων μεταξύ του DAN-i1 και των δύο κύριων στόχων του, των κυττάρων Kenyon, και του νευρώνα εξόδου του σώματος του μανιταριού MBON-i1, υποδηλώνουν περαιτέρω ότι τα σήματα DAN-i1 κατά τη διάρκεια της προπόνησης και κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανάκλησης θα μπορούσαν να παραδοθούν σε τα κύτταρα Kenyon και στο MBON-i1, αντίστοιχα, εντός προηγουμένως μη αναγνωρισμένων, τοπικά περιορισμένων διακλαδώσεων δομών. Αυτό θα παρείχε ένα κομψό μοτίβο κυκλώματος για τον τερματισμό της αναζήτησης με την επιτυχή ολοκλήρωσή της.

Λέξεις κλειδιά: ντοπαμίνη; εξερεύνηση-εκμετάλλευση; σώμα μανιταριών? οπτογενετική; ενίσχυση; Αναζήτηση

Cistancheμπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Δήλωση Σημασίας

Στον αγώνα για επιβίωση, τα ζώα πρέπει να εξερευνήσουν το περιβάλλον τους αναζητώντας τροφή. Μόλις βρεθεί το φαγητό, ωστόσο, είναι προσαρμοστικό να δοθεί προτεραιότητα στην εκμετάλλευσή του από τη συνέχιση μιας αναζήτησης που τώρα θα ήταν τόσο άσκοπη όσο η αναζήτηση για τα γυαλιά που φοράτε. Αυτή η αντιστάθμιση εξερεύνησης-εκμετάλλευσης είναι σημαντική για ζώα και ανθρώπους, καθώς και για συσκευές τεχνικής αναζήτησης. Ερευνούμε ποιοι από τους μόνους 10,000 νευρώνες μιας προνύμφης μύγας φρούτων μπορούν να ανατρέψουν την ισορροπία σε αυτήν την αντιστάθμιση και προσδιορίζουμε έναν μεμονωμένο νευρώνα ντοπαμίνης που ονομάζεται DAN-i1 που μπορεί να το κάνει. Δεδομένων των ομοιοτήτων στη λειτουργία των νευρώνων της ντοπαμίνης στον ζωικό βασιλιά-

Ωστόσο, αυτό μπορεί να αντικατοπτρίζει μια γενική αρχή του τρόπου με τον οποίο η αναζήτηση τερματίζεται όταν είναι επιτυχής.

Εισαγωγή

Ένα ζώο που εξερευνά το περιβάλλον του μπορεί να χρησιμοποιήσει την εμπειρία του παρελθόντος για να καθοδηγήσει την αναζήτησή του για τροφή. Όταν βρεθεί φαγητό, ωστόσο, είναι προσαρμοστικό να τερματίζεται η αναζήτηση και αντ' αυτού να εκμεταλλεύεται την πηγή τροφής. Εδώ μελετάμε τα κυκλώματα που επιτρέπουν στην προνύμφη Drosophila melanogaster να διαπραγματευτεί αυτή τη μετάβαση εξερεύνησης-εκμετάλλευσης. Η αριθμητική απλότητα του εγκεφάλου της προνύμφης, σε συνδυασμό με την κυτταρική έκφραση διαγονιδίων και τη γνώση της συναπτικής συνδεσιμότητας του (Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020), επιτρέπει τη διερεύνηση αυτού του γεγονότος σε επίπεδο εξατομικευμένων νευρώνων.

Οι προνύμφες D. melanogaster συνδέουν εύκολα τις μυρωδιές με μια ανταμοιβή τροφής (Scherer et al., 2003· Gerber and Hendel, 2006· Schipanski et al., 2008· Rohwedder et al., 2012· Apostolopoulou et al.14, Kudow 2. , 2017, 2019). Ουσιαστικά, η μαθημένη συμπεριφορά που βασίζεται σε αυτές τις συσχετίσεις οσμής-τροφής σταματά αν κατά τη διάρκεια μιας δοκιμής ανάκλησης υπάρχει η ανταμοιβή (Εικ. 1Α). Η μαθημένη συμπεριφορά μπορεί επομένως να θεωρηθεί ως αναζήτηση, η οποία τερματίζεται προσαρμοστικά από το επιδιωκόμενο αποτέλεσμα (δηλαδή, από την ανταμοιβή) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). Η έμφυτη οσφρητική συμπεριφορά δεν επηρεάζεται επίσης (Εικ. 1Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η έμφυτη συμπεριφορά οργανώνεται με αντανακλαστικό τρόπο (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). Έτσι, οι φυσικές ανταμοιβές μπορούν να προκαλέσουν δύο αποτελέσματα: κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης, παρέχουν ένα σήμα ανταμοιβής που μπορεί να συσχετιστεί με ενδείξεις που στη συνέχεια καθοδηγούν την αναζήτηση ανταμοιβής. και κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανάκλησης, μπορούν να τερματίσουν με άμεσο τρόπο αυτήν την μαθημένη αναζήτηση, εμποδίζοντας τα ζώα να απομακρυνθούν από έναν πόρο μόλις βρεθεί. Αυτή η μετάβαση αντικατοπτρίζει επομένως μια αλλαγή στη στρατηγική για την απόκτηση ανταμοιβής, όχι μια αλλαγή στα κίνητρα (δηλαδή, όχι μια απώλεια ενδιαφέροντος για την ανταμοιβή).

Τα ασπόνδυλα και τα ασπόνδυλα εξίσου, οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες (DANs) παρέχουν ενισχυτικά σήματα για συνειρμική μάθηση (Waddell, 2013· Schultz, 2015· Kaun and Rothenfluh, 2017). Στο D. melanogaster, διακριτά σύνολα DAN μεταφέρουν όρεξη και αποτρεπτική ενίσχυση, αντίστοιχα (προνύμφες: Schroll et al., 2006; Rohwedder et al., 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., flies, 2 Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (ένα παρόμοιο σενάριο μπορεί να είναι και τα αναδυόμενα ασπόνδυλα: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegasset; al., 2018). Καθιερώνοντας μια διαμερισματική δομή, αυτά τα DAN τέμνουν τις παράλληλες ίνες των κυττάρων Kenyon (KCs), τους εγγενείς νευρώνες του οσφρητικού κέντρου υψηλότερης τάξης των εντόμων, που ονομάζεται σώμα του μανιταριού. Σεβόμενοι αυτήν την ίδια διαμερισματική δομή, οι νευρώνες εξόδου του σώματος των μανιταριών (MBONs) συλλέγουν πληροφορίες στα KC και τις στέλνουν προς τα απαγωγικά κυκλώματα (βλ. Εικ. 2A–D) (larvae: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010 Eichler et al., 2017· Saumweber et al., 2018· Eschbach et al., 2020· ενήλικες: Sejourne et al., 2011· Places et al., 2013· Aso et al., 2014a, b, Oswald , 2015· Takemura et al., 2017). Συγκεκριμένα, μια πρόσφατη ανακατασκευή του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου αποκάλυψε ότι τα DAN έχουν δύο κύριους στόχους: τα KCs και τα MBON (βλ. Εικ. 2Β) (προνύμφες: Eichler et al., 2017, ενήλικες: Takemura et al., 2017).

Στην προνύμφη D. melanogaster, η ενεργοποίηση των DANs από το σύμπλεγμα pPAM μπορεί να ασκήσει ανταμοιβή κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης (Rohwedder et al., 2016). Από τις τέσσερις ημέρες αυτού του συμπλέγματος, δύο μπορούν μεμονωμένα να προσδώσουν ένα τέτοιο ανταποδοτικό αποτέλεσμα (DAN-h1 και DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Εδώ, επιλέξαμε να εστιάσουμε

Εικόνα 1. Η ζάχαρη μπορεί να δώσει σήματα ανταμοιβής και τερματισμού αναζήτησης. Οι προνύμφες εκπαιδεύτηκαν έτσι ώστε μια μυρωδιά παρουσιαζόταν είτε ζευγαρωμένη είτε όχι με ζάχαρη. Σε μια επακόλουθη δοκιμή ανάκλησης, εξετάστηκαν για την προτίμηση οσμής τους είτε απουσία είτε παρουσία της ζάχαρης (σκίτσο προς την κορυφή). Η δοκιμή απουσία ζάχαρης αποκάλυψε συνειρμική όσφρησημνήμη, ποσοτικοποιήθηκε ως θετικό PI. Η συμπεριφορική έκφραση αυτούμνήμητερματίστηκε παρουσία ζάχαρης. Έτσι, η ζάχαρη μπορεί να δώσει δύο είδη σημάτων: κατά τη διάρκεια της εκπαίδευσης, παρέχει ένα σήμα ανταμοιβής που μπορεί να συσχετιστεί με τη μυρωδιά για να καθοδηγήσει τα ζώα αργότερα στην αναζήτηση ανταμοιβής. και κατά τη διάρκεια της δοκιμής ανάκλησης, η ζάχαρη ως αναζητούμενη ανταμοιβή παρέχει ένα σήμα για τον τερματισμό αυτής της μαθημένης αναζήτησης. Μεγέθη δειγμάτων: N=29, N =28. Β, οι προνύμφες δοκιμάστηκαν για έμφυτη προτίμηση οσμής, είτε απουσία είτε παρουσία ζάχαρης (σκίτσο προς την κορυφή). Η ζάχαρη δεν επηρέασε την έμφυτη οσφρητική συμπεριφορά, υποδηλώνοντας την αντανακλαστική της οργάνωση. Μεγέθη δειγμάτων: N=20 το καθένα. Διαφορετικά γράμματα πάνω από τις γραφικές παραστάσεις του πλαισίου υποδηλώνουν ζεύγος (δοκιμή Mann–Whitney U, p, 0.{10}}5, διορθώθηκε σύμφωνα με τη Bonferroni-Holm). *Σημασία από μηδέν (δοκιμή προσήμου ενός δείγματος, p, 0,05, διορθώθηκε σύμφωνα με τον Bonferroni-Holm). ns, δεν είναι σημαντικό. Όλες οι στατιστικές δοκιμές και τα αποτελέσματά τους αναφέρονται μαζί με τα δεδομένα πηγής στο Σχήμα Εκτεταμένων Δεδομένων 1-1. Για τις τιμές προτίμησης οσμής που διέπουν τις βαθμολογίες PI αυτού του πειράματος, βλέπε Εικόνα 9Α.

Εικόνα 2. Το κύκλωμα του πίνακα DAN-KC-MBON. Το χίασμα του έσω λοβού. Οι πληροφορίες οσμής επεξεργάζονται για να προκαλέσουν μια έμφυτη προσέγγιση, καθώς και προς την περιοχή του κάλυκα του σώματος του μανιταριού KCs (μωβ. εμφανίζεται πλήρως ένα παράδειγμα KC στη δεξιά πλευρά). Οι πληροφορίες ανταμοιβής γεύσης επεξεργάζονται επίσης για να καθοδηγήσουν την έμφυτη συμπεριφορά, καθώς και μέσω κυρίως αμινεργικών ρυθμιστικών νευρώνων (που εμφανίζεται είναι DAN-i1, τιρκουάζ/μαύρο) προς μεμονωμένα διαμερίσματα των λοβών του σώματος των μανιταριών (στην αριστερή πλευρά, υποδεικνύονται τα διαμερίσματα). Κάθε ένα από τα τέσσερα διαμερίσματα του έσω λοβού (hk) λαμβάνει είσοδο από ένα μόνο DAN που επίσης νευρώνει το ίδιο διαμέρισμα στο ετερόπλευρο ημισφαίριο. Τα MBON του έσω λοβού αντλούνται από μεμονωμένα διαμερίσματα, συνήθως και των δύο ημισφαιρίων (εμφανίζεται το MBON-i1, ματζέντα/κίτρινο) και αποδίδουν την έξοδο τους, σε διαμορφώσεις που διαφέρουν μεταξύ των διαμερισμάτων, κατά μήκος του ημισφαιρικού διαχωρισμού. Συλλογικά, τα MBON είναι υπεύθυνα γιαμνήμη-βασισμένη συμπεριφορά αναζήτησης. Τα δεδομένα βασίζονται στους Eichler et al. (2017) και οι Saumweber et al. (2018). B, Η μήτρα DAN-KC-MBON στο διαμέρισμα i. Το DAN-i1 και τα περισσότερα KC δημιουργούν αμοιβαίες χημικές συνάψεις και τόσο το DAN-i1 όσο και το KC παρέχουν έξοδο στο MBON-i1. Για απλότητα, μόνο οι συνάψεις με τους αριστερούς νευρώνες DAN-i1 και MBON-i1 εμφανίζονται λεπτομερώς. Η ίδια συνδεσιμότητα βρίσκεται στα περισσότερα, αν όχι σε όλα, άλλα διαμερίσματα (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). Το C, DAN-i1 (τιρκουάζ) λαμβάνει είσοδο από το εξωτερικό του σώματος του μανιταριού (σκούρο γκρι) ομόπλευρα με το κυτταρικό του σώμα (περιοχή με την ένδειξη 1) και στη συνέχεια νευρώνει το διαμέρισμα i και στα δύο ημισφαίρια (με την ετικέτα 2 και 3). Το MBON-i1 (ματζέντα) διασχίζει τη μέση γραμμή δύο φορές. Λαμβάνει είσοδο στο διαμέρισμα i και των δύο ημισφαιρίων και παρέχει έξοδο σε περιοχές που γειτνιάζουν με το σώμα του μανιταριού και των δύο ημισφαιρίων. D, Ίδιο με το C, αλλά σε μια ελαφρώς κεκλιμένη όψη, που δείχνει ανακατασκευές σκελετού των αριστερών νευρώνων DAN-i1 και MBON-i1 και ένα παράδειγμα KC (μαύρο). Τα δεδομένα βασίζονται στους Eichler et al. (2017). Ε, δενδρόγραμμα του αριστερού νευρώνα DAN-i1. Οι έγχρωμες κουκκίδες αντιπροσωπεύουν τις συνάψεις εξόδου από το DAN-i1. Τα τρίγωνα αντιπροσωπεύουν τις συνάψεις εισόδου στο DAN-i1. Τα χρώματα αντιπροσωπεύουν τον νευρώνα συνεργάτη της αντίστοιχης σύναψης. Όλες οι άλλες συνάψεις μέσα στο σώμα του μανιταριού φέρουν την ένδειξη "Άλλο". Δεν εμφανίζονται συνάψεις που σχηματίζει το DAN-i1 με νευρώνες έξω από το σώμα του μανιταριού, ιδιαίτερα στην περιοχή 1 (Eschbach et al., 2020). Οι γραμμές με ραβδώσεις υποδεικνύουν περιοχές όπου ο νευρώνας διασχίζει τη μέση γραμμή του εγκεφάλου. F, Ίδιο όπως στο Ε, αλλά για τον αριστερό νευρώνα MBON-i1. Δεν εμφανίζονται συνάψεις που σχηματίζει το MBON-i1 με νευρώνες έξω από το σώμα του μανιταριού. Για εκδόσεις υψηλής ανάλυσης των νευρώνων DAN-i1 και MBON-i1 και των δύο ημισφαιρίων, καθώς και όλων των ώριμων KCs, ανατρέξτε στις Εκτεταμένες Εικόνες 2-1, 2-2 και 2-3, αντίστοιχα .

στο DAN-i1 επειδή έχει αναλυθεί προηγουμένως με περισσότερες λεπτομέρειες (Saumweber et al., 2018) και επειδή αποδίδει πιο ισχυρό αποτέλεσμα ανταμοιβής από το DAN-h1 (Saumweber et al., 2018, μη δημοσιευμένα δεδομένα). Αρχικά παρέχουμε μια λεπτομερή περιγραφή της χωρικής διάταξης όλων των συνάψεων μεταξύ του DAN-i1 και των δύο μεγάλων εταίρων εξόδου του, του MBON-i1 και των KC. Στη συνέχεια, ρωτάμε εάν η οπτογενετική ενεργοποίηση του DAN-i1 μπορεί να μεσολαβήσει όχι μόνο σε ένα σήμα ανταμοιβής κατά τη διάρκεια της προπόνησης αλλά και σε ένα σήμα για να τερματίσει οξεία η εκμάθηση αναζήτησης της ανταμοιβής κατά τη δοκιμή ανάκλησης.

cistanche bodybuilding

Υλικά και μέθοδοι

Πειραματικό μοντέλο και λεπτομέρειες θέματος. Προνύμφες τρίτου σταδίου σίτισης και των δύο φύλων (D. melanogaster), ηλικίας 5 ημερών μετά την ωοτοκία, χρησιμοποιήθηκαν καθ' όλη τη διάρκεια. Οι μύγες διατηρήθηκαν σε τυπικό μέσο, ​​στη μαζική καλλιέργεια στους 25 βαθμούς, 60 τοις εκατό -70 τοις εκατό σχετική υγρασία και έναν κύκλο φωτός/σκότους 12/12 ωρών. Πήραμε μια κουταλιά μέσου τροφής από ένα φιαλίδιο τροφής, επιλέξαμε τυχαία τον επιθυμητό αριθμό προνυμφών, τις ξεπλύναμε για λίγο με νερό της βρύσης και ξεκινήσαμε το πείραμα.

Χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακές προνύμφες για να εκφράσουμε το κανάλι ιόντων ChR2-XXL με πύλη φωτός σε DAN. Για το σκοπό αυτό, το στέλεχος τελεστή UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (παραχωρήθηκε ευγενικά από τον R. Kittel, University Leipzig), διασταυρώθηκε σε ένα από τα δύο στελέχη οδηγών: είτε 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer et al., 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder et al., 2016) (Bloomington Stock Center αρ. 41347) ή το στέλεχος οδηγού split-Gal4 SS00864 (Eichler 2017, et al. et al., 2018) για τη λήψη διπλών ετερόζυγων απογόνων. Ένα πρόγραμμα οδήγησης ελέγχει ότι τα στελέχη του προγράμματος οδήγησης διασταυρώθηκαν σε ένα τοπικό αντίγραφο του w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Ως τελεστής ελέγχει ένα στέλεχος που φέρει τις θέσεις προσγείωσης που χρησιμοποιούνται για το Gal4 (attP2) ή το split-Gal4 (attP40/attP2), αλλά χωρίς να έχει εισαχθεί τομέας Gal4 ("κενό") (Pfeiffer et al., 2010), διασταυρώθηκε σε UAS- ChR{31}}XXL. Επιβεβαιώσαμε το μοτίβο έκφρασης των 58E02 και SS00864 διασταυρώνοντάς τα στο pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Επειδή το ChR{41}}XXL είναι αρκετά ευαίσθητο ώστε να ενεργοποιείται στο φως της ημέρας (δεν φαίνεται), οι μύγες ανατράφηκαν σε φιαλίδια που σκουραίνουν συνεχώς από μαύρο χαρτόνι. Για το πείραμα που παρουσιάζεται στο Σχήμα 8Ε, το UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) διασταυρώθηκε στο 58E02-Gal4.

Πειραματική ρύθμιση. Για πειράματα συμπεριφοράς, οι προνύμφες εκπαιδεύτηκαν σε τρυβλία Petri εσωτερικής διαμέτρου 9 cm και δοκιμάστηκαν σε τρυβλία Petri εσωτερικής διαμέτρου 9 ή 15 cm (και τα δύο από το Sarstedt) όπως αναφέρεται στα θρυλικά σχήματα, σε όλες τις περιπτώσεις γεμάτα με 1 τοις εκατό αγαρόζη (βαθμός ηλεκτροφόρησης Ροθ). Όπως και η οσμή, χρησιμοποιήσαμε οξικό ν-αμυλεστέρα αραιωμένο 1:20 σε παραφινέλαιο (AM; CAS: 628-63-7; Merck) και σε ορισμένες περιπτώσεις επιπλέον αδιάλυτη 1-οκτανόλη (OCT; CAS: {{ 9}}· Merck).

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν μέσα σε ένα περιβάλλον κουτί 43 43 73cm εξοπλισμένο με ένα προσαρμοσμένο τραπέζι φωτός που διαθέτει μια διάταξη LED 24 12 (470nm, Solarox) και μια πλάκα διάχυσης πάχους 6-mm από παγωμένο πλεξιγκλάς από πάνω για να εξασφαλίσετε ομοιόμορφο μπλε φως για ενεργοποίηση ChR2-XXL (120mW/cm2). Τα τρυβλία Petri τοποθετήθηκαν απευθείας στην κορυφή της πλάκας διάχυσης. Τα τρυβλία Petri περιβάλλονταν από έναν δακτύλιο διάχυσης πολυαιθυλενίου. πίσω από τον δακτύλιο διάχυσης, 30 υπέρυθρες λυχνίες LED (850 nm, Solarox) τοποθετήθηκαν για να παρέχουν φωτισμό που ήταν αόρατος στις προνύμφες, αλλά επέτρεψε την καταγραφή και παρακολούθηση της συμπεριφοράς τους για ανάλυση εκτός σύνδεσης. Για το σκοπό αυτό, πάνω από το τρυβλίο Petri τοποθετήθηκε μια κάμερα (Basler acA204090umNIR; Basler) εξοπλισμένη με φίλτρο υπέρυθρης διέλευσης. Για πρόσθετες λεπτομέρειες σχετικά με την πειραματική ρύθμιση, βλέπε Saumweber et al. (2018).

cistanche bodybuilding

Συνειρμική εκμάθηση οσμής-ζάχαρης. Τα μαθησιακά πειράματα ακολούθησαν καθιερωμένα πρωτόκολλα (Michels et al., 2017). Τα δοχεία οσμής προετοιμάστηκαν με την προσθήκη 10 ml ουσίας οσμής σε ειδικά κατασκευασμένα δοχεία τεφλόν (εσωτερική διάμετρος 5 mm με διάτρητο καπάκι με 7 οπές διαμέτρου 0,5 mm το καθένα). Οι δίσκοι Petri καλύφθηκαν με τροποποιημένα καπάκια διάτρητα στο κέντρο από 15 οπές διαμέτρου 1 mm η καθεμία για βελτίωση του αερισμού.

Για εκπαίδευση οσμής-ζάχαρης, 20 προνύμφες τοποθετήθηκαν στη μέση ενός τρυβλίου Petri γεμάτο με αγαρόζη που περιείχε 2mol/L D-φρουκτόζη (CAS: 57-48-7; Roth) ως ανταμοιβή (1) και εξοπλισμένο με δύο οσμές δοχεία στις αντίθετες πλευρές, και τα δύο γεμάτα με AM (AM1). Μετά από 2,5 λεπτά, οι προνύμφες μετατοπίστηκαν σε ένα φρέσκο ​​τρυβλίο Petri με απλή, άγευστη αγαρόζη, εξοπλισμένο με δύο άδεια δοχεία (EM), όπου πέρασαν επίσης 2,5 λεπτά. Πραγματοποιήθηκαν τρεις τέτοιοι «ζευγοποιημένοι» κύκλοι προπόνησης, σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιώντας φρέσκα πιάτα Petri. Στις μισές περιπτώσεις, η εκπαίδευση ξεκίνησε με πιάτα Petri που περιείχαν ανταμοιβή όπως υποδεικνύεται (AM1/EM), ενώ στις άλλες μισές περιπτώσεις η σειρά αντιστράφηκε (EM/AM1). Για κάθε ομάδα προνυμφών που εκπαιδεύτηκαν AM1/EM (ή EM/AM1), μια δεύτερη ομάδα εκπαιδεύτηκε αμοιβαία, δηλαδή με «μη ζευγαρωμένες» παρουσιάσεις οσμής και ανταμοιβής (AM/EM1, ή EM1/AM, αντίστοιχα).

Μετά την εκπαίδευση, οι προνύμφες μεταφέρθηκαν στη μέση ενός δοκιμαστικού τρυβλίου Petri και δοκιμάστηκαν για την προτίμησή τους στην οσμή. Είναι σημαντικό ότι η δοκιμή ανάκλησης διεξήχθη είτε σε ένα απλό πιάτο Petri για αξιολόγησημνήμη-βασισμένη στη συμπεριφορά αναζήτησης ή σε ένα πιάτο Petri που περιέχει ανταμοιβή για να προσδιοριστεί εάν η παρουσία ανταμοιβής τερμάτισε τομνήμη-βασισμένη αναζήτηση. Και στις δύο περιπτώσεις, η μία πλευρά του δοκιμαστικού δίσκου Petri ήταν εξοπλισμένη με δοχείο ΑΜ και η άλλη πλευρά με δοχείο ΕΜ. Ο αριθμός των προνυμφών και στις δύο πλευρές προσδιορίστηκε από την εικόνα της κάμερας 3 λεπτά μετά την έναρξη της δοκιμής. Από αυτούς τους αριθμούς, μια προτίμηση οσμής υπολογίστηκε ως εξής:

Έτσι, οι τιμές PI μπορεί να κυμαίνονται από 1 έως 1, με θετικές τιμές να υποδεικνύουν ότι οι προνύμφες προτιμούσαν την οσμή περισσότερο μετά από ζευγάρωμα παρά χωρίς σύζευξη. Οι θετικές τιμές PI υποδεικνύουν αναλόγως έναν ορεκτικό συσχετισμόμνήμηπου ερμηνεύεται καλύτερα ωςμνήμη-βασισμένη συμπεριφορά αναζήτησης. Οι αρνητικές τιμές PI, αντίθετα, υποδεικνύουν αποστροφική συσχέτισημνήμη.

Συνειρμική μάθηση με οπτογενετική ενεργοποίηση DAN. Για τα οπτογενετικά πειράματα, η εκπαίδευση και η δοκιμή πραγματοποιήθηκαν αναλόγως. Ωστόσο, όλα τα πιάτα Petri ήταν γεμάτα με απλή αγαρόζη (δηλαδή, δεν χρησιμοποιήθηκαν ανταποδοτικές γεύσεις). Αντίθετα, για προπόνηση σε ζευγάρια, το AM συνδυάστηκε με συνεχή διέγερση μπλε φωτός για να ενεργοποιηθεί είτε το 58E02-DAN είτε το 864- DAN για 2,5 λεπτά, ακολουθούμενο από 2,5 λεπτά σκοταδιού χωρίς οσμή (AM1/EM). Για προπόνηση χωρίς ζεύγη, η παρουσίαση οσμής και η διέγερση με φως εμφανίστηκαν ξεχωριστά (AM/EM1). Για το πείραμα που παρουσιάζεται στο Σχήμα 8Ε, η οσμή και το φως παρουσιάστηκαν για 5 λεπτά το καθένα. το πείραμα κατά τα άλλα ακολουθούσε τις διαδικασίες που περιγράφονται από τους Rohwedder et al. (2016).

Μετά από τρεις τέτοιους κύκλους εκπαίδευσης, διεξήχθη η δοκιμή ανάκλησης και η προτίμηση οσμής και το PI υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται. Ουσιαστικά, η δοκιμή ανάκλησης διεξήχθη είτε χωρίς ενεργοποίηση μπλε φωτός για να προσδιοριστεί εάν τα DAN μεσολαβούν σε ένα σήμα ανταμοιβής κατά τη διάρκεια της προπόνησης είτε με ενεργοποίηση μπλε φωτός για να καθοριστεί εάν, επιπλέον, τα DAN μπορούν να μεσολαβήσουν σε ένα σήμα για τον τερματισμό της αναζήτησης.

Παραλλαγές αυτού του πρωτοκόλλου υποδεικνύονται στα θρυλικά σχήματα.

Έμφυτη οσφρητική συμπεριφορά. Οι περιέκτες οσμής και τα τρυβλία Petri παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Συλλέχθηκαν κοόρτες από 20 προνύμφες από το φιαλίδιο, πλύθηκαν για λίγο με νερό βρύσης και τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri με ένα δοχείο ΑΜ στη μία πλευρά και ένα άδειο δοχείο στην άλλη πλευρά. Μετά από 3 λεπτά, η έμφυτη προτίμηση οσμής προσδιορίστηκε σύμφωνα με την Εξίσωση 1. Αυτή η δοκιμή προτίμησης διεξήχθη είτε απουσία ή παρουσία ζάχαρης, είτε απουσία ή παρουσία ενεργοποίησης μπλε φωτός, για να προσδιοριστεί εάν αυτές οι συνθήκες δοκιμής αλλάζουν έμφυτη οσφρητική συμπεριφορά.

Ανάλυση διαμορφώσεων συμπεριφοράς μετά την προπόνηση με 864-ενεργοποίηση DAN. Η συμπεριφορά των προνυμφών παρακολουθήθηκε σε βίντεο και αναλύθηκε όπως περιγράφεται λεπτομερώς από τους Paisios et al. (2017). Εν συντομία, αναλύθηκαν δύο όψεις της χημειοταξίας των προνυμφών. Αρχικά, η διαμόρφωση του ευνουχισμού κεφαλής (HC ανά δευτερόλεπτο) (HC/s) υπολογίστηκε ως εξής:

Σε αυτό το μέτρο, η γωνία κατεύθυνσης (HA) περιγράφει τον προσανατολισμό του κεφαλιού του ζώου σε σχέση με τη μυρωδιά, με απόλυτες γωνίες κατεύθυνσης (abs (HA)) 0 μοιρών ή 180 μοιρών, για παράδειγμα, υποδεικνύοντας ότι η οσμή είναι μπροστά ή πίσω από τις προνύμφες, αντίστοιχα. Αυτό το μέτρο αποδίδει έτσι θετικές βαθμολογίες για την έλξη (δηλαδή, όταν το HC κατευθύνει τις προνύμφες προς το στόχο αντί για την οσμή), ενώ αποδίδει αρνητικές βαθμολογίες για την αποστροφή.

Ανοσοϊστοχημεία. Οι εγκέφαλοι προνυμφών ανατέμθηκαν σε ελεύθερο αλατούχο διάλυμα Ca{{{0}}και σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα Bouin αραιωμένο 1:2 με αλατούχο διάλυμα ελεύθερου Ca21- για 7 λεπτά. Τρία βήματα πλύσης (κάθε 10 λεπτά) σε PBST (0,3 τοις εκατό Triton-X 100 σε PBS) ακολουθήθηκαν από επώαση με τα πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Μετά από τρεις πλύσεις (κάθε 10 λεπτά) σε PBS, ο ιστός επωάστηκε με τα δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρία τελευταία στάδια πλύσης σε PBS (κάθε 10 λεπτά), τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε Vectashield (Vector Laboratories). Τα παρασκευάσματα εξετάστηκαν υπό ομοεστιακό μικροσκόπιο DM 6000 CS (Leica Microsystems).

cistanche bodybuilding

Ως αντισώματα, χρησιμοποιήσαμε είτε μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-FASII (DSHB, αραιωμένο 1:50 σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 4 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας) και αντίσωμα κουνελιού anti-GFP (A11122, Invitrogen, αραιωμένο 1:1{ {28}}00 σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει 4 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας) ως κύρια αντισώματα και αντίσωμα κατά ποντικού Cy3 (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) και Alexa-488 κατά κουνελιού αντίσωμα (Α11034, Invitrogen), και τα δύο αραιωμένα 1:200 σε PBS, ως δευτερεύοντα αντισώματα. ή χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ChR2 (ProGen Biotechnik) αραιωμένο 1:100 σε 0,3 τοις εκατό PBST ως πρωτεύον αντίσωμα, αντίσωμα κατά ποντικού Cy3 (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), αραιωμένο 1:300 σε 0,3 τοις εκατό PBST , ως το δευτερεύον αντίσωμα, και Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), αραιωμένο 1:300 σε 0,3 τοις εκατό PBST, για αντιχρώση.