Μέρος 1|Η γενετική παραλλαγή εμπλέκει την αγγειοποιητίνη πλάσματος-2 στην ανάπτυξη υποφαινοτύπων οξείας νεφρικής βλάβης

Pavan K. Bhatraju1,2*, Max Cohen1, Ryan J. Nagao3,4, Eric D. Morrell1, Susanna Kosamo1, Xin-Ya Chai1, Robin Nance5, Victoria Dmyterko1, Joseph Delaney5, Jason D. Christie6, Kathleen D. Liu7, Carmen Mikacenic1, Sina A. Gharib1, W. Conrad Liles8, Ying Zheng3,4, David C. Christiani9,10, Jonathan Himmelfarb2 και Mark M. Wurfel1,2

Αφηρημένη

Ιστορικό:Προηγουμένως εντοπίσαμε δύοοξύςνεφρόβλάβη(AKI) υπο-φαινότυποι (AKI-SP1 και AKI-SP2) με διαφορετικούς κινδύνους κακής κλινικής έκβασης και ανταπόκρισης στη θεραπεία με αγγειοκατασταλτικό. Οι βιοδείκτες πλάσματος ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας (υποδοχέας παράγοντα νέκρωσης όγκου-1, αγγειοποιητίνη-1 και 2) διαφοροποίησαν τους υπο-φαινότυπους AKI.

Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν αυτοί οι βιοδείκτες είναι απλώς δείκτες ή αιτιολογικοί μεσολαβητές στην ανάπτυξη υπο-φαινοτύπων AKI.

Μέθοδοι:Δοκιμάσαμε για συσχετίσεις μεταξύ πολυμορφισμών μονονουκλεοτιδίου εντός τουΑγγειοποιητίνη-1, Αγγειοποιητίνη-2,καιΥποδοχέας Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων 1Αγονίδια και AKI-SP2 σε 421 βαρέως άρρωστα άτομα ευρωπαϊκής καταγωγής. Πολυμορφισμοί μονονουκλεοτιδίου με κορυφαία απόδοση (FDR < 0.05)="" δοκιμάστηκαν="" για="" έκφραση="" cis-βιοδείκτη="" και="" εάν="" ο="" γενετικός="" κίνδυνος="" για="" το="" aki-sp2="" διαμεσολαβείται="" μέσω="" κυκλοφορούντων="" βιοδεικτών.="" ολοκληρώσαμε="" επίσης="" in="" vitro="" μελέτες="" χρησιμοποιώντας="" μικροαγγειακά="" ενδοθηλιακά="" κύτταρα="" ανθρώπινου="" νεφρού.="" τέλος,="" υπολογίσαμε="" τη="" νεφρική="" κάθαρση="" των="" βιοδεικτών="" του="" πλάσματος="" χρησιμοποιώντας="" 20="" διαφορετικές="" χρονομετρημένες="" συλλογές="">

Αποτελέσματα:Μια γενετική παραλλαγή, rs2920656C > T, κοντάANGPT2συσχετίστηκε με μειωμένο κίνδυνο AKI-SP2 (αναλογία πιθανοτήτων, 0.45; 95 τοις εκατό CI, 0.31–0.66; προσαρμοσμένο FDR=0.003 ) και μειωμένη αγγειοποιητίνη του πλάσματος-2 (p = 0.002). Η ανάλυση αιτιατού συμπεράσματος έδειξε ότι για κάθε δευτερεύον αλληλόμορφο (Τ) ο κίνδυνος ανάπτυξης AKI-SP2 μειώνεται κατά 16 τοις εκατό. Η αγγειοποιητίνη πλάσματος-2 μεσολάβησε στο 41,5 τοις εκατό του κινδύνου που σχετίζεται με το rs2920656 για το AKI-SP2. Μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινου νεφρού που φέρουν το αλληλόμορφο Τ του rs2920656 παρήγαγαν αριθμητικά χαμηλότερα επίπεδα αγγειοποιητίνης-2 αν και αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντικό (p = 0.07). Τέλος, οι αναλύσεις έδειξαν ότι η αγγειοποιητίνη-2 καθαρίζεται ελάχιστα πραγματικά σε βαρέως πάσχοντα άτομα.

Συμπέρασμα:Η ανάλυση γενετικής μεσολάβησης παρέχει υποστηρικτικά στοιχεία ότι η αγγειοποιητίνη-2 παίζει αιτιολογικό ρόλο στον κίνδυνο για το AKI-SP2.

Λέξεις-κλειδιά: Οξεία νεφρική βλάβη, Γενετική, Ενδοθήλιο

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:emily.li@wecistanche.com

Το Cistanche deserticola αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Ιστορικό

Οξύςνεφρόβλάβη(AKI) επηρεάζει το 40-60 τοις εκατό των ασθενών που εισάγονται στη μονάδα εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ) και συμβάλλει σε κακά βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα αποτελέσματα. Οι γενετικές μελέτες μέχρι σήμερα έχουν επικεντρωθεί σε συσχετίσεις μεταξύ γενετικών παραλλαγών και του κινδύνου για τη σύγκριση περιπτώσεων (ΑΚΙ) με μάρτυρες (χωρίς AKI). Ωστόσο, αυτό το πλαίσιο μπορεί να είναι περιορισμένο λόγω των περιπτώσεωνΟξύςνεφρόβλάβηείναι εξαιρετικά ετερογενείς με διαφορετικούς κατακρημνιστές και βιολογικά προφίλ. Ο συνδυασμός τέτοιων ασθενών με AKI για τη μεγιστοποίηση του μεγέθους του δείγματος μπορεί να οδηγήσει σε αραίωση γενετικών στατιστικών σημάτων που μπορεί να υπάρχουν μόνο σε ένα παθοφυσιολογικά διακριτό υποσύνολο του πληθυσμού AKI. Ένας άλλος περιορισμός είναι ότι το AKI σε βαρέως πάσχοντες πληθυσμούς είναι συχνά μια επιπλοκή σοβαρών προσβολών, όπως σήψη, χειρουργική επέμβαση, σοκ, πνευμονία και τραύμα. Η χρήση ελέγχων χωρίς την ανάπτυξηΟξύςνεφρόβλάβημπορεί να είναι προβληματική. Οι μάρτυρες που φέρουν μια γενετική παραλλαγή υψηλού κινδύνου ενδέχεται να μην αναπτύξουν AKI εάν δεν εμφανίσουν επίσης παρόμοια οξεία προσβολή με τα κρούσματα, και επομένως θα ταξινομηθούν ως μη κρούσματα, μειώνοντας οποιοδήποτε πιθανό σήμα συσχέτισης. Η χρήση βιολογικά διακριτών υποφαινοτύπων AKI σε μελέτες γενετικής συσχέτισης υπερνικά τους προηγούμενους περιορισμούς στον φαινοτυπικό προσδιορισμό του AKI εστιάζοντας ειδικά στον πληθυσμό AKI και συγκρίνοντας δύο βιολογικά διακριτούς υπο-φαινότυπους.

Προσφάτως εντοπίσαμε δύο υπο-φαινότυπους AKI (AKI-SP1 και AKI-SP2) εφαρμόζοντας μεθοδολογία ανάλυσης λανθάνουσας τάξης σε μια ομάδα 29 κλινικών μεταβλητών και μεταβλητών βιοδεικτών σε δύο ανεξάρτητους βαρέως πάσχοντες πληθυσμούς AKI. Συγκεκριμένα, το AKI-SP2 συσχετίστηκε με χειρότερα νοσοκομειακά αποτελέσματα (π.χ. θνησιμότητα, νέα αιμοκάθαρση και 7-ημέρα νεφρική μη ανάρρωση) σε σύγκριση με το AKI-SP1. Στη συνέχεια, εντοπίσαμε αυτούς τους υπο-φαινότυπους AKI σε μια προηγουμένως ολοκληρωμένη πολυκεντρική τυχαιοποιημένη δοκιμή ελέγχου, Έγχυση βαζοπρεσσίνης έναντι νορεπινεφρίνης σε ασθενείς με σηπτικό σοκ (VASST). Η δοκιμή VASST μελέτησε εάν η επιλογή της θεραπείας με αγγειοκατασταλτικό βελτίωσε τη θνησιμότητα σε άτομα με σηπτικό σοκ. Ενώ ο πληθυσμός AKI στην κλινική δοκιμή δεν είχε διαφορά στη θνησιμότητα από τη θεραπεία με αγγειοκατασταλτικό, το AKI-SP1 είχε όφελος θνησιμότητας με τη βαζοπρεσσίνη σε σύγκριση με το AKI-SP2 που δεν είχε διαφορά θνησιμότητας. Από όσο γνωρίζουμε, αυτό είναι το πρώτο παράδειγμα αναγνώρισης υποομάδων AKI που ανταποκρίνονται στη θεραπεία σε βαρέως πάσχοντες.

Συγκεκριμένα, καμία μεμονωμένη μεταβλητή δεν ήταν στατιστικά καλύτερη από τις άλλες μεταβλητές για τον προσδιορισμό του AKI-SP2 (Πίνακας 1). Αντίθετα, ένα μοντέλο τριών μεταβλητών, που χρησιμοποιεί αγγειοποιητίνη πλάσματος-2 (ANG-2), αγγειοποιητίνη-1 (ANG-1) και διαλυτό υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης όγκου{{8 }} (sTNFR-1), είχε τη βέλτιστη προγνωστική απόδοση για διαφοροποίησηΟξύςνεφρόβλάβηυπο-φαινότυποι (C-statistic 0.93). Το χαμηλότερο ANG-2, το χαμηλότερο sTNFR-1 και το υψηλότερο ANG-1 συσχετίστηκαν με χαμηλότερο κίνδυνο για AKI-SP2. Μελέτες σε ζωικά μοντέλα ΑΚΙ έχουν δείξει ότι αυτοί οι βιοδείκτες πλάσματος εμπλέκονται στην

παθοφυσιολογία και βαρύτητα της ΑΚΙ. Ωστόσο, είναι άγνωστο εάν αυτοί οι βιοδείκτες του πλάσματος παίζουν αιτιολογικό ρόλο στην ανάπτυξη της κλινικήςΟξύςνεφρόβλάβηυπο-φαινότυποι. Ο προσδιορισμός των αιτιολογικών δεικτών θα μπορούσε να ενημερώσει τους στόχους για την ανάπτυξη φαρμάκων για την πρόληψη ή τη θεραπεία της ανάπτυξηςΟξύςνεφρόβλάβησε βαρέως πάσχοντες και θα μπορούσε να βοηθήσει στη διαστρωμάτωση του κινδύνου των ασθενών.

Η ανάλυση γενετικής διαμεσολάβησης είναι μία από τις πολλές προσεγγίσεις αιτιολογικής συναγωγής που μπορεί να προσδιορίσει τον πιθανό μηχανισμό με τον οποίο μια ανεξάρτητη μεταβλητή (π.χ. γενετική παραλλαγή) επηρεάζει το αποτέλεσμα (π.χ. υποφαινότυποι AKI) μέσω ενός επεξηγηματικού μεσολαβητή (π.χ. βιοδείκτης ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας) . Αυτή η προσέγγιση έχει εφαρμοστεί ευρέως σε κλινικά δεδομένα για την κατανόηση των αιτιολογικών μηχανισμών της νόσου. Υποθέσαμε ότι οι cis-ποσοτικοί τόποι χαρακτηριστικών (QTLs) στοANGPT1, ANGPT2 και TNFRSF1Aγονίδια επηρεάζουν την ανάπτυξη υποφαινοτύπων AKI ρυθμίζοντας τα επίπεδα κυκλοφορίας των αντίστοιχων βιοδεικτών τους (ANG-1, ANG-2 ή sTNFR-1).

Μέθοδοι

Πληθυσμοί μελέτης

Αναφέραμε προηγουμένως την ταυτοποίηση των υποφαινοτύπων AKI χρησιμοποιώντας μια προοπτικά συλλεγόμενη κοόρτη ΜΕΘ: ταυτοποίηση Πολυμορφισμών Μεμονωμένων Νουκλεοτιδίων (SNPs) που προδιαθέτουν σε Αλλοίωση Κινδύνου Οξύ Πνευμονοτραυματισμού (iSPAAR). Ο πληθυσμός iSPAAR είναι μια μελέτη περιπτώσεων ελέγχου σε όλο το γονιδίωμα για τον κίνδυνο συνδρόμου οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS) που περιλάμβανε ασθενείς με και χωρίς ARDS. Ο πληθυσμός του iSPAAR περιελάμβανε άτομα από τυχαιοποιημένες δοκιμές ελέγχου που είχαν ολοκληρωθεί προηγουμένως και από μια μελλοντικά εγγεγραμμένη κοόρτη ΜΕΘ. Λεπτομέρειες του σχεδιασμού της μελέτης για κάθε πληθυσμό που είναι εγγεγραμμένος στο iSPAAR έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Αλβουτερόλη για τη θεραπεία της οξείας πνευμονικής βλάβης (ALTA), δοκιμή θεραπείας με υγρά και καθετήρες (FACTT), εντερικό ωμέγα-3 λιπαρό οξύ, γάμμα-λινολενικό οξύ και συμπλήρωμα αντιοξειδωτικών σε οξεία πνευμονική βλάβη (OMEGA)

και Μοριακή Επιδημιολογία Οξείας Αναπνευστικής Δυσκολίας (ΜΕΑ) στο Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης. Στο iSPAAR, η εγγραφή στη μελέτη έλαβε χώρα 48 ώρες μετά την εισαγωγή στη ΜΕΘ. Κατά την εγγραφή στη μελέτη συλλέχθηκαν DNA και πλάσμα για γονότυπο και ανάλυση βιοδεικτών και στη συνέχειαΟξύςνεφρόβλάβηδιαπίστωση. Το AKI ορίστηκε ως αύξηση της κρεατινίνης ορού (SCr) μεγαλύτερη από ή ίση με 0,3 mg/dl ή 50 τοις εκατό από την "βασική γραμμή" SCr. Η βασική τιμή SCr ορίστηκε ως η χαμηλότερη τιμή πριν από την εγγραφή στη μελέτη. Το AKI ορίστηκε επίσης χρησιμοποιώντας τροποποιημένα κριτήρια παραγωγής ούρων (ημερήσια παραγωγή αντί για κάθε 6 ώρες).

Για να προσδιορίσουμε τη νεφρική κάθαρση των βιοδεικτών πλάσματος, εγγράψαμε μια υποψήφια κοόρτη στις ιατρικές και χειρουργικές μονάδες εντατικής θεραπείας Harborview, την Κρίσιμη ΑσθένειαΟξύςνεφρόβλάβηΚοόρτη (CIA). Τα άτομα ήταν κατάλληλα για εγγραφή εάν πληρούσαν 2 από τα 4 κριτήρια του συνδρόμου συστηματικής φλεγμονώδους απόκρισης, είχαν κλινικά ύποπτη λοίμωξη και είχαν εγκατεστημένο ουροποιητικό καθετήρα. Ολοκληρώθηκε μια χρονομετρημένη συλλογή ούρων που διήρκεσε τουλάχιστον 2-4 ώρες και συλλέχθηκαν δείγματα πλάσματος EDTA στην αρχή και στο τέλος της χρονομετρημένης συλλογής ούρων. Η εκκαθάριση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο Εκκαθάριση(X) = U(X) * V/ P(X), όπουU(X) αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας στα ούραX, V υποδεικνύει τον όγκο των ούρων κατά την περίοδο συλλογής 2–4- ωρών καιP (X) αντιπροσωπεύει τις μέσες συγκεντρώσεις της διαλυμένης ουσίας στο πλάσμαX από την αρχική και την τελική αιμοληψία.

Στρατηγική γονότυπου

Ο προσδιορισμός γονότυπου πραγματοποιήθηκε σε 421 ασθενείς ευρωπαϊκής καταγωγής χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina 660 (Illumina, San Diego, CA). Τα δεδομένα γονότυπου ελέγχθηκαν ποιοτικά χρησιμοποιώντας ένα δείγμα φίλτρου ρυθμού κλήσης > 0.97, συχνότητα δευτερεύοντος αλληλόμορφου (MAF) > 0.01 και ρυθμός κλήσης SNP > 0,95. Μετά από ποιοτικό έλεγχο, 238 SNPs ±50 kilobases ofANGPT1, ANGPT2,καιTNFRSF1Aβρέθηκαν. Μετά από ανισορροπία σύνδεσης (LD) κλάδεμα ενός r²από {{0}}.8, καταργήθηκαν 48 SNP, οδηγώντας σε συνολικά 190 SNP που χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμές συσχέτισης. Ο καταλογισμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον πίνακα αναφοράς του 1000 Genomes Project χρησιμοποιώντας το IMPUTE2 v2.3.0.

Αξιολόγηση πρωτεϊνών πλάσματος

Οι βιοδείκτες πλάσματος και ούρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροχημιφωταυγείς ανοσοπροσδιορισμούς (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD), όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Το αίμα συλλέχθηκε σε αποστειρωμένους σωλήνες επεξεργασμένους με EDTA, τα ούρα συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένα δοχεία και αμφότερα φυγοκεντρήθηκαν αμέσως. Το πλάσμα και τα ούρα μοιράστηκαν στη συνέχεια και καταψύχθηκαν στους -80 βαθμούς. Τα δείγματα αποθηκεύτηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους, αλλά αποψύχθηκαν σε μία μόνο παρτίδα και μόνο μία φορά για την εκτέλεση των μετρήσεων βιοδεικτών για αυτήν τη μελέτη. Όλες οι μετρήσεις βιοδεικτών πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν στο Harbor-view Pulmonary Research Laboratories.

Σε αναλύσεις Silico

Για να ελέγξουμε τα SNP για την έκφραση των αποτελεσμάτων QTL, ρωτήσαμε την Πύλη Genotype-Tissue Expression (GTEx).

Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα του ανθρώπινου νεφρού (HKME Cs) καθαρίστηκαν από τους εμβρυϊκούς νεφρούς μετά από εκούσιες διακοπές εγκυμοσύνης μεταξύ 100 και 135 ημερών μετά τη σύλληψη. Λήφθηκε ενημερωμένη συγκατάθεση για τη χρήση εμβρυϊκών ιστών από ασθενείς. Στη συνέχεια, επιλέξαμε τυχαία 9 διαφορετικούς δότες HKMEC, αποψύξαμε και τοποθετήσαμε μισό εκατομμύριο κύτταρα σε φιάλες Τ25 επικαλυμμένες με 0,2 τοις εκατό ζελατίνη και διατηρήθηκαν σε βασικό μέσο EBM-2 που περιέχει 1 τοις εκατό αντιβιοτικό-αντιμυκητιακό (Life Technologies), 10 τοις εκατό FBS, 100 ug/mL ECGS, 50 ug/mL ηπαρίνης και 20 ng/mL VEGF (R&D), για 48 ώρες μέχρι τη συρροή. Στις 48 ώρες, καθαρίσαμε το γονιδιωματικό DNA από τα HKMEC και συλλέχθηκαν τα υπερκείμενα των κυττάρων. Γονοτυπήσαμε επιτυχώς κύτταρα από 8 δότες.

Στατιστική ανάλυση

Οι δημογραφικές μεταβλητές των ασθενών αναφέρονται είτε ως μέσος όρος συν /−τυπική απόκλιση είτε ως διάμεσος και τεταρτημόριο. Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε λογιστική παλινδρόμηση για να ελέγξουμε για συσχέτιση μεταξύ των 190 SNP και της ανάπτυξης του AKI-SP2 σε σύγκριση με το AKI-SP1 χρησιμοποιώντας ένα προσθετικό γενετικό μοντέλο (Golden Helix, MT). Το μοντέλο μας χρησιμοποιήθηκε για τις ακόλουθες συμμεταβλητές: ηλικία, φύλο, σήψη και τα πρώτα πέντε κύρια συστατικά. Η μέθοδος Eigenstrat v4.2 χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των κύριων συνιστωσών και οι πέντε πρώτες συμπεριλήφθηκαν ως συμμεταβλητές. Οι λόγοι πιθανοτήτων (ORs) αναφέρονται με διαστήματα εμπιστοσύνης 95 τοις εκατό. Για την ανάλυση μεταξύ γενετικών παραλλαγών και υπο-φαινοτύπων AKI, διορθώσαμε για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας ουδό Benjamini-Hochberg ψευδούς ποσοστού ανακάλυψης (FDR) < 0,10,="" ο="" οποίος="" εκτιμά="" ότι="" λιγότερο="" από="" το="" 10="" τοις="" εκατό="" των="" συσχετίσεων="" με="" τιμή="" fdr="" ίσο="" ή="" χαμηλότερο="" αυτό="" το="" επίπεδο="" είναι="" ψευδώς="" θετικά="" [31].="" σε="" μια="" ανάλυση="" ευαισθησίας,="" χρησιμοποιήθηκε="" ένας="" τεκμαρτός="" γονότυπος="" για="" τον="" εντοπισμό="" πρόσθετων="" snp="" που="" σχετίζονται="" με="" το="">

Δεύτερον, χρησιμοποιήσαμε προσαρμογή γραμμικής παλινδρόμησης για την ηλικία, το φύλο και τη σήψη για να προσδιορίσουμε τις συσχετίσεις μεταξύ SNP με κορυφαία απόδοση και καταγραφής₂μετασχηματισμένες συγκεντρώσεις βιοδεικτών. Τρίτον, ολοκληρώσαμε μια ανάλυση αιτιώδους συμπεράσματος για να ελέγξουμε τη συσχέτιση μεταξύ γενετικών παραλλαγών και AKI-SP2 και την πιθανή μεσολάβηση της συσχέτισης από τις συγκεντρώσεις βιοδεικτών στο πλάσμα. Η ανάλυση διαμεσολάβησης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μη γραμμική υλοποίηση της μοντελοποίησης δομικών εξισώσεων που εφαρμόστηκε στο πακέτο διαμεσολάβησης για το STATA [32, 33]. Πρόσθετες λεπτομέρειες της ανάλυσης αιτιώδους συμπερασμάτων παρέχονται στο διαδικτυακό συμπλήρωμα. Τέταρτον, προσδιορίσαμε συσχετίσεις μεταξύ γενετικών παραλλαγών και βαρύτητας AKI, που μετρήθηκε με τη μέγιστη κρεατινίνη ορού, μέσω λογιστικής παλινδρόμησης. Πρόσθετες λεπτομέρειες για τα υλικά και τις μεθόδους παρέχονται στο διαδικτυακό συμπλήρωμα. Στην ανάλυση, αξιολογήσαμε 190 SNP και χρησιμοποιήσαμε ένα συντηρητικόp-τιμήαπό 0.05/190 =2.6 × 10^{− 4}. Δεδομένου ότι περίπου το 40 τοις εκατό των ασθενών στη ΜΕΘ αναπτύσσουν AKI και μια αναμενόμενη αναλογία ελέγχου (AKI-SP1) προς περίπτωση (AKI-SP2) 1,5, αναμενόμενο μέγεθος δείγματος 421 και MAF τουλάχιστον { {16}}.30, θα έχουμε 81 τοις εκατό ισχύ για να εντοπίσουμε έναν σχετικό κίνδυνο 1,5 ή μεγαλύτερο [34]. Οι αναλύσεις ολοκληρώθηκαν χρησιμοποιώντας STATA (Έκδοση 15) και Goldenhelix (Έκδοση 4.0). Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Human Subjects Division του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον. Ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλα τα υποκείμενα που εγγράφηκαν.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά πληθυσμών Από τους 425 ασθενείς από την κοόρτη επικύρωσης στην προηγούμενη εργασία μας, οι 421 είχαν διαθέσιμα δεδομένα γονότυπου. Τα δημογραφικά και τα αρχικά κλινικά χαρακτηριστικά περιγράφονται στον Πίνακα 1. Όλα τα άτομα ήταν ευρωπαϊκής καταγωγής. Συνολικά 267 (63 τοις εκατό) ταξινομήθηκαν ως AKI-SP1 και 154 (37 τοις εκατό) ως AKI-SP2. Τα άτομα που ανέπτυξαν AKI-SP2 είχαν υψηλότερη βαρύτητα της νόσου κατά την παρουσίαση (μέση βαθμολογία οξείας φυσιολογίας και χρόνιας αξιολόγησης της υγείας (APACHE) III, 111 ± 26 έναντι 74 ± 24), είχαν περισσότερες πιθανότητες να έχουν σήψη (84 τοις εκατό έναντι 66 τοις εκατό ) και ήταν πιο πιθανό να υποβληθούν σε θεραπεία με αγγειοσυσπαστικά (79 τοις εκατό έναντι 42 τοις εκατό) σε σύγκριση με το AKI-SP1.

Γενετική παραλλαγή κοντά στο ANGPT2, rs2920656, σχετίζεται με το AKI-SP2

Από τις 190 SNP ±50 κιλοβάσεις των γονιδίων, 72 ήταν κοντά στο ANGPT1, 100 ήταν κοντά στο ANGPT2 και 18 ήταν κοντά στο γονίδιο TNFRSF1A. Εντοπίσαμε ένα SNP που συναντούσε FDR < 0,05="" που="" συσχετίστηκε="" με="" το="" aki-sp2="" σε="" σύγκριση="" με="" το="" aki-sp1="" (πίνακας="" 2="" και="" εικ.="" 1).="" δεν="" παρατηρήθηκαν="" σημαντικές="" συσχετίσεις="" με="" snp="" μέσα="" ή="" κοντά="" στο="" angpt1="" ή="" το="" tnfrsf1a="" (πίνακας="" s2="" και="" s3).="" το="" snp="" που="" δείχνει="" την="" ισχυρότερη="" συσχέτιση="" με="" τον="" κίνδυνο="" για="" το="" aki-sp2="" ήταν="" rs2920656="" (or,="" 0,45;="" 95="" τοις="" εκατό="" ci,="" 0,31–0,66;="" p="">< 1,4="" ×="" 10−="" 5,="" fdr="0,003)." αυτό="" το="" ιντρονικό="" snp="" είναι="" ≈="" 30="" kb="" κατάντη="" στη="" θέση="" 3'="" του="" angp="" t2="" και="" εξηγεί="" περίπου="" το="" 3="" τοις="" εκατό="" της="" διακύμανσης="">

την ανάπτυξη του AKI-SP2 (R2 ). Επειδή μόνο ένας μικρός αριθμός ατόμων ήταν ομόζυγοι rs2920656 (n=26), δοκιμάσαμε επίσης συσχετίσεις μεταξύ rs2920656 και AKI-SP2 σε ένα κυρίαρχο γενετικό μοντέλο, το οποίο έδωσε συνεπή αποτελέσματα (OR, 0,42; 95 τοις εκατό CI, 0,28–0,64; p < 1,4="" ×="" 10−="" 6="" ).="" δοκιμάσαμε="" επίσης="" για="" πρόσθετους,="" δυνητικά="" ισχυρότερους,="" συσχετισμούς="" εντός="" του="" τόπου="" angpt2="" χρησιμοποιώντας="" τεκμαρτές="" γονότυπους,="" αλλά="" δεν="" βρήκαμε="" συσχετισμούς="" ισχυρότερους="" από="" αυτόν="" που="" παρατηρήθηκε="" με="" το="" rs2920656="" (πίνακας="" s4).="" σε="" μια="" ανάλυση="" ευαισθησίας,="" δοκιμάσαμε="" εάν="" η="" συμπερίληψη="" ασθενών="" σε="" κρίσιμη="" κατάσταση="">Οξύςνεφρόβλάβηθα επηρεάσει τη γενετική συσχέτιση. Ομαδοποιήσαμε ασθενείς χωρίς AKI και AKI-SP1 μαζί και προσδιορίσαμε εάν το rs2920656 εξακολουθεί να συσχετίζεται ισχυρά με μειωμένο κίνδυνο AKI-SP2. Σε αυτή την ανάλυση, 839 ασθενείς δεν είχαν είτε AKI είτε AKI-SP1 και 154 είχαν AKI-SP2. Ο κίνδυνος ανάπτυξης AKI-SP2 ξανά μειώθηκε σημαντικά με την ύπαρξη τουλάχιστον ενός αλληλόμορφου Τ για το rs2920656 (OR 0.31; 95 τοις εκατό CI, 0.19–0.52; p < 0,001)="" (πίνακας="" s5).="" σε="" μια="" άλλη="" ανάλυση="" ευαισθησίας,="" δοκιμάσαμε="" εάν="" το="" rs2920656="" συσχετίστηκε="" με="" μειωμένο="" κίνδυνο="" aki-sp2="" σε="" καθεμία="" από="" τις="" τέσσερις="" διαφορετικές="" μελέτες="" που="" συμπεριλήφθηκαν="" στο="" ispaar.="" σε="" καθεμία="" από="" τις="" τρεις="" τυχαιοποιημένες="" δοκιμές="" ελέγχου="" (alta,="" factt="" και="" omega)="" και="" την="" προοπτική="" κοόρτη="" της="" μεα="" (mea),="" η="" εκτίμηση="" του="" σημείου="" ήταν="" συνεπής="" με="" το="" δευτερεύον="" αλληλόμορφο="" του="" rs2920656="" που="" καταδεικνύει="" μειωμένο="" κίνδυνο="" για="" την="" ανάπτυξη="" του="" aki-sp2="" (πίνακας="" s6="" ).="" έτσι,="" το="" rs2920656="" αναλύθηκε="" περαιτέρω="" για="" να="" προσδιοριστεί="" η="" συσχέτιση="" με="" τις="" συγκεντρώσεις="" βιοδεικτών="">

Το αλληλόμορφο Τ του rs2920656 σχετίζεται με μειωμένο ANG πλάσματος-2

Στη συνέχεια αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων rs2920656 και ANG-2 στο πλάσμα. Η προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο και τη σήψη, κάθε αντίγραφο του αλληλόμορφου Τ του rs2920656 συσχετίστηκε με μειωμένες συγκεντρώσεις log2 ANG-2 στο πλάσμα (=− 0,09, 95 τοις εκατό CI {{9} }.15, − 0.04· P=0.002). Τα άτομα που ήταν ομόζυγα για το αλληλόμορφο C έδειξαν τις υψηλότερες συγκεντρώσεις ANG στο πλάσμα-2 (40.683 pg/ml, διατεταρτημόριο εύρος (IQR) 19,374-73,205), ενώ τα άτομα που ήταν ομόζυγα για το αλληλόμορφο Τ παρουσίασαν τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις ANG-2 στο πλάσμα (28.308 pg/ml (IQR 14,340-42, 944). Επιπλέον, από τα 100 SNP που δοκιμάστηκαν κοντά στην περιοχή του γονιδίου ANGP T2, το rs29206565 ήταν το πιο ισχυρά συνδεδεμένο με το ANG πλάσματος -2 συγκεντρώσεις (Εικ. 2).

Η ανάλυση διαμεσολάβησης υποδηλώνει ότι το ANG-2 είναι αιτιώδες στην ανάπτυξη του AKI-SP2

Δοκιμάσαμε για στοιχεία ότι η συσχέτιση μεταξύ rs2920656 και κινδύνου για AKI-SP2 προκαλείται μέσω των συγκεντρώσεων ANG-2 στο πλάσμα (Εικ. 3). Η συνολική επίδραση του rs2920656 στο AKI-SP2 ήταν συνολική=− 0.16 ανά αλληλόμορφο (95 τοις εκατό CI -0.24, − 0 .10, p=1.0 × 10− 4 ), που υποδηλώνει ότι για κάθε δευτερεύον αλληλόμορφο (αλληλόμορφο Τ) της γενετικής παραλλαγής ο κίνδυνος ανάπτυξης AKI-SP2 μειώνεται κατά 16 τοις εκατό . Η ανάλυση αιτιώδους διαμεσολάβησης ανίχνευσε μια σημαντική έμμεση επίδραση για το rs2920656 στο AKI-SP2 που προκλήθηκε μέσω συγκεντρώσεων ANG-2 στο πλάσμα (έμμεση, - 0,07 ανά αλληλόμορφο, 95 τοις εκατό CI -0.11, - 0,03, p { {34}}.001), που σημαίνει ότι το ποσοστό επίδρασης μεταξύ rs2920656 και AKI-SP2 που προκαλείται από συγκεντρώσεις ANG-2 είναι 41,5 τοις εκατό .

Το αλληλόμορφο Τ του rs2920656 σχετίζεται με μειωμένη σοβαρότητα AKI στις 7 ημέρες

Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε τη συσχέτιση του rs2920656 με παραδοσιακά κριτήρια για τη σοβαρότητα του AKI, όπως η μέγιστη κρεατινίνη ορού και η αύξηση της κρεατινίνης ορού εντός 7 ημερών μετά την εγγραφή στη μελέτη. Σε ένα κυρίαρχο γενετικό μοντέλο, το αλληλόμορφο Τ του rs2920656 συσχετίστηκε με μείωση της κρεατινίνης ορού κατά -0,44 mg/dL (95 τοις εκατό CI, - 0).77 , − 0.10), p=0.01) μετά από προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, τον δείκτη μάζας σώματος και την κατάσταση της σήψης. Το δευτερεύον αλληλόμορφο του rs2920656 συσχετίστηκε επίσης με μείωση της αύξησης της κρεατινίνης ορού μεταξύ της βασικής γραμμής και της ημέρας 7 (= − 0,25, 95 τοις εκατό CI, − 0,46, − 0,03· p=0.03)

Το αλληλόμορφο T του rs2920656 σχετίζεται με χαμηλότερο ANG-2 στην κυτταρική καλλιέργεια

Πραγματοποιήσαμε πειράματα in vitro και αναλύσεις σε silico για να προσδιορίσουμε τη λειτουργική σημασία του rs2920656. Από 8 διαφορετικά ανθρώπινα έμβρυανεφρόιστόςδείγματα, 2 ήταν CC, 5 ήταν CT και 1 ήταν TT για το rs2920656. Σε ένα κυρίαρχο γενετικό μοντέλο, οι συγκεντρώσεις ANG-2 ήταν αριθμητικά μεγαλύτερες σε ενδοθηλιακά κύτταρα από δότες ομόζυγους για το αλληλόμορφο C και χαμηλότερες σε φορείς του αλληλόμορφου Τ, p=0.07 (Εικ. 4). Στη βάση δεδομένων του έργου GTEx, το rs2920656 δεν συσχετίστηκε με την έκφραση γονιδίου ANGPT2. Ωστόσο, δύο άλλα SNP (rs41311412 και rs2515591) που είναι σε μέτρια LD (r2=0.23 και D'=0.86) με rs2920656 σχετίστηκαν με μειωμένη έκφραση γονιδίου ANGPT2 (p=4.1 × 10− 5 ) στην κνημιαία αρτηρία, έναν ιστό που είναι πολύ εμπλουτισμένος για ενδοθηλιακά κύτταρα (Πίνακας S7).

Το ANG του πλάσματος-2 καθαρίζεται ελάχιστα από τα νεφρά Για να προσδιοριστεί εάν υπάρχουν διαφορέςνεφρόλειτουργίαθα μπορούσε να επηρεάσει τις συγκεντρώσεις ANG{{0}} στο πλάσμα, μετρήσαμε την νεφρική κάθαρση ANG{{1} σε βαρέως άρρωστα άτομα με και χωρίς AKI. Σε 20 διαφορετικές συλλογές δειγμάτων ούρων σε χρονική διάρκεια με δεσμευμένα δείγματα πλάσματος, η διάμεση κρεατινίνη ορού ήταν 0,86 mg/dL με ένα εύρος τεταρτημορίου (IQR) από 0,69 έως 1,45 mg/dL. Η διάμεση συγκέντρωση ANG-2 στο πλάσμα ήταν 10.261 pg/mL (IQR 6210–19.115 pg/mL). Αντίθετα, οι συγκεντρώσεις ANG στα ούρα-2 ήταν 50- φορές χαμηλότερες με διάμεσο 206 pg/mL (IQR 11–839 pg/mL). Η υπολογισμένη νεφρική κάθαρση του ANG-2 ήταν < 1="" ml/min="" για="" όλες="" τις="" χρονομετρημένες="" συλλογές="" ούρων,="" υποδηλώνοντας="" ότι="" οι="" συγκεντρώσεις="" ang="" στο="" πλάσμα-2="" δεν="" αυξάνονται="" απλώς="" ως="" συνάρτηση="" της="" επιδείνωσης="" του="" aki="" (πίνακας="">