Αναστολή του πολλαπλασιασμού των νεφρικών κυττάρων αιλουροειδών Crandell-Rees από γήρανση που προκαλείται από ακτίνες Χ

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Manabu KOIKE^1,2)*, Γιασουτόμο ΓΙΟΥΤΟΚΟΥ¹⁾και τον Άκι ΚΟΙΚΕ¹⁾

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ.Ραδιοαντίσταση και ραδιοτοξικότητα έχουν αναφερθεί μετά από θεραπείες για τον καρκίνο σε αιλουροειδή. Η βελτιστοποίηση των δόσεων ακτινοβολίας για την πρόκληση κυτταροτοξικών επιδράσεων μόνο σε καρκινικά κύτταρα και όχι σε φυσιολογικά κύτταρα είναι κρίσιμη για την επίτευξη αποτελεσματικής ακτινοθεραπείας. Ωστόσο, οι μηχανισμοί αντίστασης στην ακτινοβολία, ραδιοτοξικότητας και απόκρισης βλάβης του DNA (DDR) σε κύτταρα αιλουροειδών δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί. Ένα σπάσιμο διπλού κλώνου DNA (DSB) είναι ο πιο τοξικός τύποςDNAβλάβες που προκαλούνται από ακτίνες Χ και δέσμες βαρέων ιόντων που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία καρκίνων. Crandell-Rees FelineΝεφρό(CRFK) τα κύτταρα είναι ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα κύτταρα γάτας στην έρευνα της επιστήμης της ζωής. Εδώ, το αναφέρουμεDSB- η πυροδοτούμενη γήρανση που προκαλείται από τις ακτίνες Χ είναι σημαντική για την αναστολή του πολλαπλασιασμούCRFKκύτταρα. Δείξαμε μέσω της ανάλυσης πολλαπλασιασμού κυττάρων ότι οι ακτίνες Χ σε δόσεις 2 Gy και 10 Gy είναι τοξικές γιαCRFKκύτταρα που ακτινοβολούν κύτταρα CRFK αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό τους. Σε ακτινοβολημένα με Χ κύτταρα CRFK, ανιχνεύθηκε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη γήρανση που προκαλείται από DSB σύμφωνα με μορφολογικές αλλαγές και χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία χρώσης γαλακτοσιδάσης που σχετίζεται με τη γήρανση. Επιπλέον, τα στοιχεία μας έδειξαν ότι σεCRFKκύτταρα, η κύρια οδός DDR, η οποία περιλαμβάνει τη φωσφορυλίωση τουH2AXστο Ser139, ενεργοποιήθηκε κανονικά από κινάσες ATM. Τα ευρήματά μας είναι χρήσιμα για την κατανόηση της κυτταρικής γήρανσης που προκαλείται από ακτίνες Χ και για την αποσαφήνιση των βιολογικών επιπτώσεων της ακτινοβολίας, π.χ. τοξικότητας, σε κύτταρα αιλουροειδών. Επιπλέον, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η κυτταρική σειρά CRFK είναι μια εξαιρετική μήτρα για την αποσαφήνιση της ραδιοανθεκτικότητας και της ραδιοτοξικότητας σε κύτταρα γάτας.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:γάτα, ζώο συντροφιάς, σπάσιμο διπλού κλώνου DNA, ακτινοβολία, γήρανση

Εκχύλισμα Cistanche deserticola: βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Τα ζώα συντροφιάς αναλαμβάνουν όλο και πιο σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη κοινωνία. Λόγω της παράτασης της διάρκειας ζωής των ζώων συντροφιάς, ο αριθμός των ηλικιωμένων σκύλων και γατών έχει αυξηθεί και πολλοί σκύλοι και γάτες διαγιγνώσκονται πρόσφατα με καρκίνο κάθε χρόνο [26, 27]. Η ακτινοθεραπεία, η οποία είναι μία από τις τρεις κύριες θεραπείες για τον καρκίνο, χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο στα κτηνιατρικά νοσοκομεία ως εναλλακτική λύση για τη θεραπεία του καρκίνου σε σκύλους και γάτες [24, 26]. Για να επιτευχθεί η πιο αποτελεσματική ακτινοθεραπεία, είναι σημαντικό να εξισορροπηθεί η τοξικότητα μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Εν τω μεταξύ, αν και παρατηρείται ραδιοαντίσταση σε γάτες και όγκους γάτας μετά από ακτινοθεραπεία καρκίνου, ο μηχανισμός αυτής της αντίστασης δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί [24].

Έχουν διεξαχθεί πολυάριθμες μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις της ακτινοβολίας σε κύτταρα που προέρχονται από ανθρώπους και τρωκτικά [6, 10, 23, 28]. Το γονιδιωματικό DNA είναι ο κύριος βιολογικός στόχος των θεραπειών που χρησιμοποιούν ακτινοβολία όπως οι ακτίνες Χ και οι δέσμες βαρέων ιόντων. Η θραύση διπλού κλώνου (DSB) είναι ο πιο κρίσιμος τύπος βλάβης του DNA που προκαλείται από την ακτινοβολία. Διάφορα μονοπάτια απόκρισης βλάβης DNA (DDR), συμπεριλαμβανομένης της ανίχνευσης βλάβης στο DNA, της σηματοδότησης DDR και της επιδιόρθωσης του DNA, ενεργοποιούνται όταν εμφανίζεται DSB. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα ανακάμπτουν από τραυματισμό ακτινοβολίας και το προσβεβλημένο DNA επισκευάζεται με ακρίβεια και αποτελεσματικότητα [8, 25]. Στα κύτταρα σκύλου και γάτας, τα DSBs μπορούν κυρίως να επισκευαστούν με έναν μη ομόλογο μηχανισμό επιδιόρθωσης άκρων σύνδεσης (NHEJ), ο οποίος προκαλεί τη σύνδεση των άκρων DSB του ετεροδιμερούς Ku, που αποτελείται από Ku70 και Ku80 [14-17]. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί αυτό. Επιπλέον, στο πρώιμο στάδιο επιδιόρθωσης, κινάσες, όπως οι κινάσες DNA-PK και ATM, ενεργοποιούνται και αυτές φωσφορυλιώνουν το Ser139 της ιστόνης H2AX κοντά σε θέσεις DSB [5, 6]. Είναι πιθανό τα DSB να ενεργοποιούν προγραμματισμένους μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης και της γήρανσης, όταν τα κύτταρα δεν μπορούν να επισκευαστούν [9, 32]. Οι μοριακοί μηχανισμοί διαφόρων DDRs, όπως η επιδιόρθωση του DNA, σε κύτταρα γάτας, έχουν μελετηθεί ελάχιστα.

Το απαθανατισμένο αιλουροειδές Crandell-ReesΝεφρό(CRFK) Η κυτταρική σειρά είναι μια από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες σειρές κυττάρων γάτας. Η κυτταρική σειρά CRFK ιδρύθηκε για πρώτη φορά το 1964 από τονεφρόφλοιός θηλυκού γατιού 12-εβδομάδων [3]. Οι Crandell et al. [3] περιέγραψε ότι η κυτταρική σειρά CRFK είναι χρήσιμη στην έρευνα για τον ιό της αιλουροειδούς και τη διαγνωστική ιατρική και έχει αποκτήσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην έρευνα για τον καρκίνο. Επί του παρόντος, η κυτταρική σειρά CRFK είναι απαραίτητη στην έρευνα της επιστήμης της ζωής, συμπεριλαμβανομένης της έρευνας για τον καρκίνο και τους ιούς. Έτσι, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τη ραδιοευαισθησία των κυττάρων CRFK, των οποίων οι διάφορες μοριακές οδοί έχουν αναλυθεί, για τη λήψη πρωτογενών ερευνητικών πληροφοριών για την αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών των βιολογικών επιδράσεων της ακτινοβολίας στις γάτες. Ωστόσο, επί του παρόντος δεν υπάρχουν αναφορές για τις επιδράσεις και τους μηχανισμούς της ακτινοβολίας στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRFK.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τις βιολογικές επιδράσεις των ακτίνων Χ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRFK. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι οι ακτίνες Χ κατέστειλαν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRFK. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι η καταστολή του πολλαπλασιασμού οφειλόταν στην αυξημένη κυτταρική γήρανση που προκαλείται από τα DSB. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε στα κύτταρα CRFK ότι η κύρια οδός DDR ενεργοποιείται κανονικά από τις κινάσες ATM.

εκχύλισμα cistanche tubolosa: θεραπεία νεφρικής νόσου

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Κυτταρικές καλλιέργειες, χημικές ουσίες και ακτινογραφίες

Τα κύτταρα CRFK (HSRRB, Osaka, Ιαπωνία) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα προσκολλημένα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με ακτίνες Χ σε 1, 2 ή 1{8}} Gy και με ρυθμό δόσης 0.71–0.77 Gy/min (200 kV/20 mA με 0,5-mm Al και 0,5-mm φίλτρα Cu) χρησιμοποιώντας Pantak HF320S (Shimadzu, Kyoto, Japan) σε θερμοκρασία δωματίου, όπως περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες [17]. Το KU-55933, ένας αναστολέας κινάσης ATM, αγοράστηκε από την Wako Pure Chemical (Οσάκα, Ιαπωνία). Το KU{19}} αραιώθηκε σε DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) και αραιώθηκε σε μέσο καλλιέργειας αμέσως πριν από τη χρήση.

Προσδιορισμός βιώσιμου αριθμού κυττάρων

Χρησιμοποιήθηκε δοκιμή αποκλεισμού Trypan Blue για τον προσδιορισμό του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2,2 × 104 κύτταρα ανά τρυβλίο σε τρυβλία 60-mm. Την επόμενη μέρα, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με ακτίνες Χ και επωάστηκαν για 5 ημέρες μετά την ακτινοβόληση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS), εναιωρήθηκαν σε διάλυμα Trypsin-EDTA (T3924, Sigma-Aldrich), συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, χρωματίστηκαν με 0.4 w/v τοις εκατό διάλυμα Trypan Blue ( Wako Pure Chemical) ή 0,4 τοις εκατό Trypan Blue (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας TC10™ Automated Cell Counter (Bio-Rad). Όλες οι ακτινοβολίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Ανοσοκηλίδωση

Η εκχύλιση ολικής πρωτεΐνης και η ανάλυση western blot πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [11, 17] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Οι συνολικές πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε Extra PAGE One Precast Gel 5–20 τοις εκατό (Nacalai Tesque, Kyoto, Ιαπωνία) ή Super Sep ACE Gel 5–20 τοις εκατό (Wako Pure Chemical). Τα κλασματοποιημένα προϊόντα μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες Hybond-P (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν στο Blocking One (Nacalai Tesque) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού anti-H2AX (JBW301) (Upstate Biotechnology Inc., Charlottesville, VA, USA) ή μονοκλωνικό αντίσωμα ακτίνης ποντικού ( Sigma-Aldrich). Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με το αντι-ποντικού IgG HRP-Linked Whole Ab (από πρόβατα) (NA931) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανοσοστύπωση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Select Western Blotting Detection System (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Οι πρωτεϊνικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ChemiDoc XRS (Bio-Rad).

Ανοσοκυτταροχημεία

Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12, 17] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα καλλιεργημένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, διαπερατήθηκαν με 0.5 τοις εκατό Triton X-100 σε PBS για 5 λεπτά, μπλοκαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα αποκλεισμού και επωάστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού anti-H2AX (JBW301) (Upstate Biotechnology Inc.) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο των κυττάρων με PBS, η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor 568- (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) ή ένα συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη δευτερογενές αντίσωμα (Cappel Laboratories, Durham, NC, USA ). Στη συνέχεια, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με 0,025 μg/ml φθορίζουσας χρωστικής 4,6-διαμινο{-2-φαινυλινδόλης (DAPI) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Γερμανία). Ελήφθησαν εικόνες κυττάρων χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού Olympus BX51 (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία) εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα (Olympus DP50, Olympus).

Δοκιμασία χρώσης γαλακτοσιδάσης που σχετίζεται με τη γήρανση (SA- -gal)

Για αυτόν τον προσδιορισμό, κύτταρα (5 × 103) επιστρώθηκαν σε πλάκες 35-mm και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης Senescence -Galactosidase (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) 5 ημέρες μετά ακτινοβολία σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με 0,025 μg/ml φθορίζουσας χρωστικής DAPI. Οι εικόνες των χρωματισμένων κυττάρων μετά από 18 ώρες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο Olympus CKX41 εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα (Olympus DP12, Olympus) ή χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο φθορισμού Olympus BX51 εξοπλισμένο με ψηφιακή κάμερα (Olympus DP50). Το ποσοστό των θετικά χρωματισμένων κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση τριών τυχαίων πεδίων με τουλάχιστον 100 κύτταρα το καθένα χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J. Το μέγεθος του πυρηνικού κυττάρου προσδιορίστηκε με ανάλυση τριών τυχαίων πεδίων των 10 κυττάρων το καθένα χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J. Όλες οι ακτινοβολίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Δοκιμασία απόπτωσης αννεξίνης V/ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ).

Τα κύτταρα (2,2 × 104) επιστρώθηκαν σε πλάκες 60-mm και ακτινοβολήθηκαν με ακτίνες Χ την επόμενη ημέρα. Πέντε ημέρες μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με διάλυμα Annexin V Alexa Fluor 488-PI (Tali™ Apoptosis Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη χρώση χρησιμοποιήθηκε μια 200-πλάσια αραίωση του διαλύματος χρώσης PI. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν επισημασμένα αποπτωτικά κύτταρα με Annexin V χρησιμοποιώντας το κυτταρόμετρο που βασίζεται σε εικόνα Tali (Invitrogen). Όλες οι ακτινοβολίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

Τα στατιστικά αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις (n{0}}). Η στατιστική ανάλυση εξαιρουμένου του πυρηνικού μεγέθους πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δοκιμών πολλαπλής σύγκρισης ANOVA και Ryan (ANOVA4 στο WEB, https://www.hju.ac.jp/~kiriki/anova4/). Το μέγεθος του πυρήνα αξιολογήθηκε με τη δοκιμή t Student. Μια τιμή P μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

έρημο ζώο κιστανάκι

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CRFK με ακτίνες Χ

Για να διερευνηθεί η επίδραση των ακτίνων Χ στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRFK, ακτινοβολήθηκε στα 2 και 10 Gy. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός αναστέλλεται σημαντικά με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Ρ<0.05). these="" findings="" indicate="" that="" the="" proliferation="" was="" inhibited="" by="" x-rays="" at="" both="">

Επαγωγή DSBs σε κύτταρα CRFK με ακτίνες Χ

Η φωσφορυλίωση του H2AX στο Ser139 είναι ένα από τα κύρια και πρώιμα κυτταρικά DDR στα DSB [8, 20, 28]. Το H2AX είναι ένας βιοδείκτης χρυσού προτύπου για DSB [8, 20, 28]. Προηγουμένως, χρησιμοποιώντας western blotting, προσδιορίσαμε την αλλαγή στην έκφραση H2AX στα κύτταρα CRFK μεταξύ 1 ώρας και 24 ωρών μετά την ακτινοβόληση με ακτίνες Χ σε μία δόση των 10 Gy [17]. Ως αποτέλεσμα, το επίπεδο έκφρασης του H2AX ήταν το υψηλότερο μετά από 1 ώρα [17]. Για να εξεταστεί εάν η φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ προκλήθηκε σε δοσοεξαρτώμενη στα συνολικά εκχυλίσματα από κύτταρα CRFK 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση, πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος western με το αντίσωμα αντι-Η2ΑΧ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η ανάλυση western blot έδειξε ότι η έκφραση του Η2ΑΧ αυξήθηκε ανάλογα με τη δόση των ακτίνων Χ. Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν η εστία H2AX ανιχνεύθηκε σε ακτινοβολημένα κύτταρα με δοκιμασία ανοσοχρώσης χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-Η2ΑΧ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι εστίες H2AX σχηματίστηκαν στους πυρήνες των κυττάρων CRFK σε 1 ώρα μετά την ακτινοβόληση (Εικ. 2Β).

Εξαρτημένη από ATMκινάση φωσφορυλίωση του H2AXat Ser139 σε ακτίνες CRFK κυττάρων

Ένας από τους σημαντικούς ρόλους της ATGM κινάσης ή του DNA-PK στην DDR που προκαλείται από τις ακτίνες Χ είναι η φωσφορυλίωση του H2AX που περιβάλλει τις θέσεις DSB σε διάφορα ανθρώπινα κύτταρα και κύτταρα τρωκτικών [18, 29]. Ωστόσο, ένας τέτοιος ρόλος δεν έχει ακόμη διερευνηθεί σε κύτταρα γάτας, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων CRFK. Για να επιβεβαιωθεί εάν η κινάση ATM είναι υπεύθυνη για την επαγόμενη από ακτίνες Χ φωσφορυλίωση H2AX στο Ser139 σε κύτταρα CRFK, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα μέσο που περιείχε τον αναστολέα κινάσης ATM KU-55933 (10 μΜ) ή διαλύτη (DMSO) για 1 ώρες πριν από την ακτινοβόληση (10 Gy). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, ο σχηματισμός εστιών H2AX αναστάλθηκε σε κύτταρα που ακτινοβολήθηκαν παρουσία KU- 55933. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το ATM είναι η κύρια κινάση για τη φωσφορυλίωση του H2AX στο Ser139 που προκαλείται από ακτινοβολία σε κύτταρα CRFK.

Επαγωγή γήρανσης σε κύτταρα CRFK με ακτίνες Χ

Για να διερευνηθεί εάν η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CRFK σε απόκριση στην ακτινοβολία σχετίζεται με τη γήρανση και την απόπτωση, τα κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με ακτίνες Χ στα 2 και 10 Gy. Πρώτον, 5 ημέρες μετά την ακτινοβόληση, τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση SA- -gal, μια δοκιμασία χρυσού προτύπου για τη γήρανση. Παρατηρήσαμε ειδικές για τη γήρανση μορφολογίες όπως ένα μεγάλο και επίπεδο κυτταρικό σχήμα (Εικ. 4Α) και μη φυσιολογικούς πυρήνες, συμπεριλαμβανομένων μεγεθυσμένων ή πολυπύρηνων πυρήνων (Εικ. 4Β), σε ακτινοβολημένα κύτταρα. Επιπλέον, σε ακτινοβολημένα κύτταρα CRFK, τα θετικά σε gal κύτταρα SA αυξήθηκαν σημαντικά με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4A–C). Επίσης, αναλύσαμε ποσοτικά τη μεγέθυνση του μεγέθους του κυτταρικού πυρήνα, που είναι ένας άλλος δείκτης για τα γηρασμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4D, το μέγεθος του κυτταρικού πυρήνα ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στα ακτινοβολημένα κύτταρα CRFK (Ρ<0.05). altogether,="" these="" findings="" indicate="" that="" x-rays="" highly="" induce="" senescence="" in="" crfk="" cells.="" next,="" to="" examine="" whether="" x-rays="" induced="" apoptosis="" in="" the="" irradiated="" crfk="" cells,="" apoptosis="" was="" quantified="" using="" tali™="" image-based="" cytometer.="" dual="" staining="" with="" fluorescent="" annexin="" v="" and="" pi="" was="" performed="" to="" detect="" apoptotic="" cells.="" cells="" stained="" positive="" for="" annexin="" v="" are="" considered="" apoptotic="" cells.="" as="" shown="" in="" fig.="" 5,="" the="" proportion="" of="" apoptotic="" cells="" was="" significantly="" higher="" in="" the="" 10-gy="" group="" than="" in="" the="" non-irradiated="" group="" and="" the="" 2-gy="" group="" but="" was="" lower="" (approximately="" 6%)="" in="" the="" 10-gy="" group.="" in="" addition,="" no="" significant="" increase="" in="" apoptosis="" was="" observed="" in="" the="" 2-gy="" group="" compared="" with="" the="" non-irradiated="">

Οφέλη για την υγεία του κιστάνου: αντικαρκινικό

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η κατανόηση της βιολογικής επίδρασης της ακτινοβολίας στα κύτταρα της γάτας είναι σημαντική για την αποσαφήνιση της ραδιοτοξικότητας και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών πρωτοκόλλων για τη θεραπεία του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ο πολλαπλασιασμός της γάταςνεφρόΗ κυτταρική σειρά CRFK καταστέλλεται σημαντικά με ακτίνες Χ σε δόσεις 2 και 10 Gy. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν ότι οι ακτίνες Χ είναι τοξικές για την ανάπτυξη των κυττάρων CRFK υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Επιπλέον, τα γηρασμένα κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά στα ακτινοβολημένα κύτταρα CRFK. Εν τω μεταξύ, τα ευρήματά μας αποκαλύφθηκαν στα κύτταρα CRFK, η κινάση ATM επάγει τη φωσφορυλίωση του H2AX στο Ser139, το οποίο είναι ένα από τα κύρια DDR σε DSB που παράγονται από ακτίνες Χ. Τα DSB που προκαλούνται από την ακτινοβολία σύμφωνα με πληροφορίες μπορούν να προκαλέσουν γήρανση και απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπου και τρωκτικών [4, 22]. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι ο μηχανισμός γήρανσης που ενεργοποιείται από τα DSBs συνέβαλε στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CRFK με ακτίνες Χ.

Ο μηχανισμός στον οποίο βασίζεται η διαφορά στη ραδιοευαισθησία μεταξύ των ανθρώπων, των σκύλων και των γατών και ο μηχανισμός επιδιόρθωσης των κυττάρων της γάτας δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι το DDR που εξαρτάται από την κινάση ATM ενεργοποιείται από ακτίνες Χ σε κύτταρα CRFK. Επιπλέον, αυτή η μελέτη και προηγούμενες μελέτες καταδεικνύουν ότι τα DSB που προκαλούνται από ακτίνες Χ σε κύτταρα CRFK μπορούν να ανιχνευθούν με ανάλυση western blot και ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο αντίσωμα αντι-Η2ΑΧ [17]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα CRFK είναι χρήσιμα για την αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών του DDR σε κύτταρα γάτας. Ο Moor [24] περιέγραψε ότι η ακτινοθεραπεία για τις γάτες είναι διαφορετική από αυτή για τους σκύλους όσον αφορά τις αποκρίσεις του όγκου και την φυσιολογική τοξικότητα των ιστών. Fujii et al. [7] έδειξε ότι οι ινοβλάστες στις γάτες είναι πιο ραδιοανθεκτικοί από εκείνους στους ανθρώπους σε μια ανάλυση σχηματισμού αποικιών και οι εστίες H2AX που προκαλούνται από την ακτινοβολία μπορούν να επιδιορθωθούν ταχύτερα και πιο αποτελεσματικά στους ινοβλάστες της γάτας. Επιπλέον, πρότειναν την πιθανότητα η βλάβη του DNA και των χρωμοσωμάτων που προκαλείται από τις ακτίνες Χ να επιδιορθώνεται πιο αποτελεσματικά στα λεμφοκύτταρα της γάτας παρά στα λεμφοκύτταρα του ανθρώπου ή του σκύλου. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι οι διαφορές στη ραδιοαντίσταση μεταξύ των ανθρώπων, των σκύλων και των γατών μπορεί να σχετίζονται με τη διαφορά στη δυνατότητα επιδιόρθωσης του DNA. Πρόσφατα, δείξαμε χρησιμοποιώντας κύτταρα CRFK ότι οι πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του πυρήνα NHEJ, π.χ. Ku70, Ku80 και XLF της γάτας, συσσωρεύονται σε θέσεις DSB που προκαλούνται από το μικρολέιζερ 405-nm [17]. Έχουμε επίσης αποκαλύψει ότι η στρατολόγηση της γάτας XLF, του ανθρώπου XLF ή του σκύλου XLF εξαρτάται από την παρουσία του Ku [13, 14, 17]. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν έντονα ότι η χωροχρονική ρύθμιση των βασικών παραγόντων NHEJ, συμπεριλαμβανομένων των Ku70, Ku80 και XLF, είναι σημαντική για τη ρύθμιση της επισκευής NHE [10, 19]. Συλλογικά, τα κύτταρα CRFK μπορεί να είναι χρήσιμα στην αποκάλυψη των μοριακών μηχανισμών που διέπουν όχι μόνο τις διαφορές της ραδιοαντίστασης μεταξύ των κυττάρων γάτας, σκύλου και ανθρώπινων κυττάρων, αλλά και DDRs, συμπεριλαμβανομένης της επισκευής NHEJ που εξαρτάται από το Ku που διατηρείται σε αυτά.

Η επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT) είναι ένας σημαντικός μηχανισμός κακοήθους μετασχηματισμού, π.χ. αλλαγή της αντίστασης των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοβολία και στα αντικαρκινικά φάρμακα. Πρόσφατα, τα κύτταρα CRFK έχουν αναφερθεί ότι έχουν τα χαρακτηριστικά των ινοβλαστών, ιδιαίτερα όσον αφορά τη μορφολογία, τη βιοχημεία και τη μοριακή βιολογία, αν και τα κύτταρα CRFK έχουν καθιερωθεί ως επιθηλιακή κυτταρική σειρά [21]. Επιπλέον, οι van Beusekom et al. [31] ανέφερε ότι ο TGF- 1 άλλαξε τη μορφολογία των κυττάρων CRFK από επιθηλιακό φαινότυπο σε ινοβλαστικό φαινότυπο και ότι προκάλεσε σημαντικά την έκφραση ορισμένων γονιδίων δεικτών EMT στα κύτταρα CRFK, υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα CRFK μπορούν να υποβληθούν σε EMT. Στην παρούσα μελέτη, η γήρανση φάνηκε πιο σημαντική από την απόπτωση για την καταστολή της ανάπτυξης σε ακτινοβολημένα κύτταρα CRFK. Συνολικά, η κυτταρική σειρά CRFK μπορεί να είναι μια εξαιρετική μέθοδος όχι μόνο για την αποσαφήνιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ ή μεταξύ της γήρανσης που προκαλείται από ακτίνες Χ, της ραδιοανθεκτικότητας και/ή της ραδιοτοξικότητας στη γάτανεφρόεπιθηλιακά κύτταρα αλλά και για την αποσαφήνιση των επιδράσεων του EMT έναντι της ακτινοβολίας και των χημειοθεραπευτικών.

Η θεραπεία υπέρ της γήρανσης είναι μια νέα αντικαρκινική στρατηγική που βασίζεται στην πρόκληση γήρανσης των καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να εφαρμοστεί αυτή η στρατηγική στη θεραπεία των γατών, είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί ο μοριακός μηχανισμός πρόκλησης γήρανσης σε κύτταρα αιλουροειδών. Από την άλλη, οι Li et al. [22] έχουν περιγράψει ότι οι σενολυτικοί παράγοντες, μια κατηγορία μικρών μορίων που μπορούν επιλεκτικά να σκοτώσουν τα γηρασμένα κύτταρα, έχουν μεγάλες δυνατότητες να μειώσουν ουσιαστικά τις παρενέργειες που προκαλούνται από την ακτινοθεραπεία ενώ εύλογα αποφεύγουν την καρκινογένεση. Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι ένας σενολυτικός παράγοντας ABT-737 εξαλείφει τα γηρασμένα κύτταρα που προκαλούνται από την ιονίζουσα ακτινοβολία από τους πνεύμονες των ακτινοβολημένων ποντικών [35]. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα γηρασμένα κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά στα ακτινοβολημένα κύτταρα CRFK. Τα ευρήματά μας και περαιτέρω μελέτες που χρησιμοποιούν κύτταρα CRFK μπορεί να είναι διαθέσιμα για βασική έρευνα για την ανάπτυξη όχι μόνο θεραπείας της πρόπτωσης της αιλουροειδούς αλλά και σμηνολυτικών παραγόντων προκειμένου να μειωθούν οι παρενέργειες που προκαλούνται από την ακτινοθεραπεία.

CRFKείναι μια από τις πιο σημαντικές κυτταρικές σειρές θηλαστικών και χρησιμοποιείται ευρέως σε πειράματα, συμπεριλαμβανομένων αυτών σε ιούς, όπως ο κορωνοϊός με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-CoV) ή ο SARS-CoV-2. Επιδιόρθωση DNA και έρευνα καρκίνου σε γάτες.χρόνιοςνεφρό νόσος; και την παραγωγή εμβολίων [1, 2, 17, 30, 33, 34]. Τα κύτταρα CRFK μπορούν να μολυνθούν με διάφορους ιούς, συμπεριλαμβανομένων των ογκοϊών [1-3, 34]. Με βάση αυτά, υποθέτουμε ότι η κυτταρική σειρά CRFK μπορεί να είναι κατάλληλη για βασική έρευνα σχετικά με αλλαγές στη ραδιοευαισθησία που προκαλείται από ιογενή λοίμωξη και για την επίδραση της ακτινοθεραπείας σε όγκους που προκαλούνται από ιογενή λοίμωξη.CRFKΤα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αποσαφήνιση των μηχανισμών που κρύβουν τη ραδιοαντίσταση και τη ραδιοτοξικότητα στα επιθηλιακά κύτταρα των νεφρών της γάτας και την επίδραση της ιογενούς μόλυνσης στη ραδιοευαισθησία. Συμπερασματικά, τα κύτταρα CRFK μπορεί να είναι εξαιρετικές κυτταρικές σειρές για τη διεξαγωγή έρευνας σχετικά με τη ραδιοτοξικότητα σε γάτες και βασική έρευνα για την ανάπτυξη νέων μεθόδων θεραπείας του καρκίνου.

οφέλη για την υγεία του cistanche tubolosa

ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ.Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ.Αυτή η εργασία πραγματοποιήθηκε με την υποστήριξη των Εθνικών Ινστιτούτων για την Κβαντική και Ραδιολογική Επιστήμη και Τεχνολογία, και του Τμήματος Ρυθμιστικής Βιολογίας, Σχολή Επιστημών του Πανεπιστημίου Σαϊτάμα.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Altamura, G., Power, K., Martano, M., Degli Uberti, B., Galiero, G., De Luca, G., Maiolino, P. and Borzacchiello, G. 2018. Felis catus

Ο τύπος του ιού θηλώματος-2 Ε6 συνδέεται με το E6AP, προάγει τη δέσμευση E6AP/p53 και ενισχύει την πρωτεασωμική αποικοδόμηση του p53. Sci. Απ. 8: 17529.

2. Chu, H., Chan, JF, Yuen, TT, Shuai, H., Yuan, S., Wang, Y., Hu, B., Yip, CC, Tsang, JO, Huang, X., Chai, Y., Yang, D., Hou, Y., Chik, KK,

Zhang, X., Fung, AY, Tsoi, HW, Cai, JP, Chan, WM, Ip, JD, Chu, AW, Zhou, J., Lung, DC, Kok, KH, To, KK, Tsang, OT, Chan, KH and Yuen, KY 2020. Συγκριτικός τροπισμός, κινητική αντιγραφής και προφίλ κυτταρικής βλάβης του SARS-CoV-2 και του SARS-CoV με επιπτώσεις για κλινικές εκδηλώσεις, μεταδοτικότητα και εργαστηριακές μελέτες του COVID-19 : μια μελέτη παρατήρησης. Lancet Microbe 1: e14–e23.

3. Crandell, RA, Fabricant, CG and Nelson-Rees, WA 1973. Ανάπτυξη, χαρακτηρισμός και ευαισθησία σε ιούς νεφρικής κυτταρικής σειράς αιλουροειδών (Felis catus) (CRFK). In Vitro 9: 176–185.

4. d'Adda di Fagagna, F. 2008. Ζώντας σε ένα διάλειμμα: κυτταρική γήρανση ως απάντηση βλάβης στο DNA. Nat. Rev. Cancer 8: 512-522.

5. Durocher, D. and Jackson, SP 2001. DNA-PK, ATM και ATR ως αισθητήρες βλάβης του DNA: παραλλαγές σε ένα θέμα; Curr. Γνώμη. Cell ΒίοΙ. 13: 225–231.

6. Firsanov, DV, Solovjeva, LV and Svetlova, MP 2011. Η φωσφορυλίωση H2AX στις θέσεις των θραύσεων διπλού κλώνου DNA σε καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς θηλαστικών. Clin. Epigenetics 2: 283-297.

7. Fujii, Y., Yurkon, CR, Maeda, J., Genet, SC, Kubota, N., Fujimori, A., Mori, T., Maruo, K. and Kato, TA 2013. Συγκριτική μελέτη της ραδιοαντίστασης μεταξύ κύτταρα αιλουροειδών και ανθρώπινα κύτταρα. Ακτινοβολία. Res. 180: 70–77.

8. Huang, RX και Zhou, PK 2020. Μονοπάτια σηματοδότησης απόκρισης βλάβης DNA και στόχοι για ευαισθητοποίηση ακτινοθεραπείας στον καρκίνο. Μεταφορά σήματος. Στόχος. Εκεί. 5: 60.

9. Jackson, SP 2002. Ανίχνευση και επιδιόρθωση θραυσμάτων διπλού κλώνου DNA. Carcinogenesis 23: 687-696.

10. Koike, M. 2002. Dimerization, translocation, and localization ofKu70 and Ku80 proteins. J. Radiat. Res. (Τόκιο) 43: 223–236.

11. Koike, M. and Koike, A. 2008. Συσσώρευση πρωτεϊνών Ku80 σε θραύσματα διπλού κλώνου DNA σε ζωντανά κύτταρα. Exp. Cell Res. 314: 1061–1070.

12. Koike, M., Shiomi, T. and Koike, A. 2001. Dimerization and πυρηνικός εντοπισμός των πρωτεϊνών Ku. J. Biol. Chem. 276: 11167–11173.

13. Koike, M., Yutoku, Y. and Koike, A. 2011. Συσσώρευση Ku70 σε θραύσματα διπλού κλώνου DNA σε ζωντανά επιθηλιακά κύτταρα. Exp. Cell Res. 317: 2429–2437.

14. Koike, M., Yutoku, Y. and Koike, A. 2017. Κλωνοποίηση, εντοπισμός και σχηματισμός εστίασης σε θέσεις βλάβης DNA του σκύλου XLF. J. Vet. Med. Sci. 79: 22–28.

15. Koike, M., Yutoku, Y. and Koike, A. 2017. Κλωνοποίηση, εντοπισμός και σχηματισμός εστίασης σε θέσεις βλάβης DNA του σκύλου Ku70. J. Vet. Med. Sci. 79: 554–561.

16. Koike, M., Yutoku, Y. and Koike, A. 2017. Κλωνοποίηση κυνικού Ku80 και εντοπισμός και συσσώρευση του σε θέσεις βλάβης DNA. FEBS Open Bio 7: 1854–1863.

17. Koike, M., Yutoku, Y. and Koike, A. 2019. Το Feline XLF συσσωρεύεται σε θέσεις βλάβης του DNA με τρόπο εξαρτώμενο από το Ku. FEBS Open Bio 9: 1052–1062.

18. Koike, Μ., Sugasawa, J., Yasuda, Μ. and Koike, Α. 2008. Ιστο-ειδική εξαρτώμενη από DNA-PK φωσφορυλίωση H2AX και εξάλειψη γάμμα-Η2ΑΧ μετά από ακτινοβολία Χ in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 376: 52–55. [Medline] [CrossRef]

19. Koike, M., Awaji, T., Kataoka, M., Tsujimoto, G., Kartasova, T., Koike, A. and Shiomi, T. 1999. Διαφορικός υποκυτταρικός εντοπισμός συστατικών πρωτεϊνικής κινάσης που εξαρτώνται από το DNA Ku και DNA-PKcs κατά τη μίτωση. J. Cell Sci. 112: 4031–4039. [Medline]

20. Kopp, B., Khoury, L. and Audebert, M. 2019. Επικύρωση του βιοδείκτη H2AX για αξιολόγηση γονοτοξικότητας: ανασκόπηση. Αψίδα. Toxicol. 93: 2103–2114. [Medline] [CrossRef]