Μέρος 1: Καθιέρωση του ταυτόχρονου πειραματικού μοντέλου της οστεοπόρωσης σε συνδυασμό με τη νόσο του Αλτσχάιμερ σε αρουραίους και τις διπλές επιδράσεις της εχινακοσίδης και της ακτεοσίδης από το Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ
Εθνοφαρμακολογική συνάφεια: Cistanche tubulosaείναι ένα πολύτιμο παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη θεραπεία της οστεοπόρωσης καιΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερ. Εχινακοσίδηκαι η ακτεοσίδη είναι τα κύρια ενεργά συστατικά του Cistanche tubulosa που έχουν φαρμακολογικές δραστηριότητες με ερευνητική αξία. Έχει αναφερθεί ότι η εχινακοσίδη καιακτεοσίδηθα μπορούσε να βελτιώσει την ικανότητα μάθησης και μνήμης, να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Σκοπός της μελέτης: Echinacoside and acteoside fromCistanche tubulosaέχουν δείξει σημαντικές δράσεις κατά της οστεοπόρωσης και της νόσου του Alzheimer, ενώ αυτές οι επιδράσεις δεν έχουν μελετηθεί ταυτόχρονα σε μοντέλο επίμυος. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να καθιερώσει και να επαληθεύσει το μοντέλο της οστεοπόρωσης σε συνδυασμό μεΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερσε αρουραίους και να διερευνήσει τις διπλές επιδράσεις τουεχινακοσίδηκαι ακτεοσίδη σε αυτό το ταυτόχρονο μοντέλο.
Υλικά και μέθοδοι:Τρεις ομάδες μοντέλων ωοθηκεκτομής (OVX), εικονικής χειρουργικής με D-γαλακτόζη και AlCl3 (D), ωοθηκεκτομής με D-γαλακτόζη και AlCl3 (OVX συν D) ορίστηκαν ταυτόχρονα. Οι αρουραίοι στις ομάδες θεραπείας με φάρμακα υποβλήθηκαν σε ωοθηκεκτομή. Κατά τη διεξαγωγή της ενδοπεριτοναϊκής ένεσης D-γαλακτόζης και της ενδογαστρικής χορήγησης AlCl3 στους αρουραίους των ομάδων θεραπείας φαρμάκων, οι αρουραίοι χορηγήθηκαν από το στόμαεχινακοσίδη(90 mg/kg/ημέρα),ακτεοσίδη(90 mg/kg/ημέρα), και τα φάρμακα θετικού μάρτυρα βαλερική οιστραδιόλη (0,6 mg/kg/ημέρα), ντονεπεζίλη HCl (0,8 mg/kg/ημέρα), αντίστοιχα. Μετά τη φαρμακευτική αγωγή 8 εβδομάδων, διεξήχθη αρχικά η δοκιμή Morris Water Maze (MWM) για 6 ημέρες. Οι αρουραίοι στη συνέχεια θυσιάστηκαν για τη συλλογή του αίματος, της μήτρας, του μηρού, της κνήμης και των εγκεφαλικών ιστών. Ο ορός χρησιμοποιήθηκε για βιοχημικές εξετάσεις. Οι μήτρες χρησιμοποιήθηκαν για ιστομορφομετρία. Οι δεξιοί μηροί χρησιμοποιήθηκαν για μικρο-CTκαι ιστομορφομετρία, αντίστοιχα. Οι δεξιές κνήμες χρησιμοποιήθηκαν για την εμβιομηχανική δοκιμή. Ο ιππόκαμπος που συλλέχτηκε στην παγοθήκη χρησιμοποιήθηκε για βιοχημικές δοκιμές. Ο εγκέφαλος 41 που συλλέχθηκε με αιμάτωση χρησιμοποιήθηκε για ιστομορφομετρία.
Αποτελέσματα:Σε σύγκριση με την ομάδα Sham, η ομάδα OVX plus D θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την ικανότητα μάθησης και μνήμης προκαλώντας οξειδωτική βλάβη, εξασθενίζοντας τους νευρώνες στον ιππόκαμπο και επηρεάζοντας την υδρόλυση και τη σύνθεση της ακετυλοχολίνης. Εν τω μεταξύ, οι δραστηριότητες των BALP και TRAP στην ομάδα OVX plus D αυξήθηκαν σημαντικά (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">εχινακοσίδηκαιακτεοσίδη, τα τυπικά παθολογικά χαρακτηριστικά της οστεοπόρωσης καιΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερβελτιώθηκαν.
Συμπεράσματα:Το μοντέλο της οστεοπόρωσης σε συνδυασμό μεΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερσε αρουραίους ήταν εφικτό και καθιερώθηκε με επιτυχία.Εχινακοσίδηκαι η ακτεοσίδη έδειξαν επίσης κάποια σημαντικά αποτελέσματα σε αυτό το ταυτόχρονο μοντέλο και θα μπορούσαν να είναι πιθανοί 56 υποψήφιοι απόCistanche tubulosaμε διπλά αποτελέσματα για περαιτέρω μελέτη.
Λέξεις-κλειδιά:οστεοπόρωση? Η ασθένεια Αλτσχάϊμερ; διπλά εφέ? εχινακοσίδη; ακτεοσίδη; Cistanche tubulosa
CΤο istanche lost empire herbs βελτιώνει τη νόσο του Αλτσχάιμερ
1. Εισαγωγή
Η οστεοπόρωση είναι μια εκφυλιστική ασθένεια των οστών που χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια οστικής μάζας και καταστροφή της μικροαρχιτεκτονικής, η οποία μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο κατάγματος ευθραυστότητας (Rachner et al., 2011).Η ασθένεια Αλτσχάϊμερ(AD) είναι μια κοινή νευροεκφυλιστική νόσος στους ηλικιωμένους που χαρακτηρίζεται από συνεχή διανοητική έκπτωση, γνωστική εξασθένηση και απώλεια ικανότητας ανεξάρτητης διαβίωσης στην κλινική (Reitz 76 et al., 2011). Ο σχηματισμός γεροντικής πλάκας που προκαλείται από την εναπόθεση αμυλοειδούς, τα νευροϊνίδια που προκαλούνται από την υπερφωσφορυλίωση tau και ο νευρωνικός εκφυλισμός στον εγκέφαλο είναι τα τυπικά παθολογικά χαρακτηριστικά της AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Επιφανειακά, η OP και η AD είναι εντελώς ανεξάρτητα νοσήματα με διαφορετική παθολογία και κλινικά χαρακτηριστικά. Ωστόσο, η OP και η AD συχνά παρατηρούνται ότι συνυπάρχουν στην κλινική πράξη (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Ο επιπολασμός και των δύο ασθενειών αυξανόταν με την ηλικία, ειδικά σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Li et al., 2017; Stern, 2012). Όλο και περισσότερα στοιχεία έδειξαν ότι τα άτομα που έχουν διαγνωστεί με AD έχουν αυξημένο κίνδυνο ΟΠ (Zhou et al., 2014).
Είναι απαραίτητο να μελετηθούν και να διευκρινιστούν οι σχέσεις μεταξύ της οστεοπόρωσης καιΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερin vitro και in vivo. Προτού πραγματοποιηθούν οι μελέτες in vivo, είναι σημαντικό να επιλέξετε τα κατάλληλα ζωικά μοντέλα οστεοπόρωσης ή νόσου Alzheimer. Το μοντέλο της οστεοπόρωσης θα μπορούσε να καθιερωθεί με διάφορα είδη μεθόδων, όπως η ενδογαστρική χορήγηση ρετινοϊκού οξέος, η χειρουργική επέμβαση ωοθηκεκτομής και η ενδομυϊκή ένεση γλυκοκορτικοειδών (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Ειδικότερα, το μοντέλο μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης που προκλήθηκε από ωοθηκεκτομή σε αρουραίους ήταν κλασικό καιέχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στις περισσότερες μελέτες (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Η σποραδική νόσος Αλτσχάιμερ είναι ο κύριος τύπος της νόσου του Αλτσχάιμερ. Το ζώομοντέλα ΣποραδικώνΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερθα μπορούσε να προκληθεί με διάφορες μεθόδους όπωςένεση D-γαλακτόζης ή -αμυλοειδές, ενδογαστρική χορήγηση AlCl3,και ούτω καθεξής(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Επιπλέον, τομοντέλο σύνδεσης της νόσου του Alzheimer που προκαλείται από μακροχρόνια ενδοπεριτοναϊκήΗ έγχυση D-γαλακτόζης σε συνδυασμό με ωοθηκεκτομή έχει επίσης μελετηθεί πολύ (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Προκειμένου να αποκαλυφθεί η σημασία της οστεοπόρωσης καιΝόσος Alzheimer, είναι απαραίτητο να καθιερωθεί το μοντέλο της οστεοπόρωσης συνδυαστικάμε τη νόσο του Αλτσχάιμερ για τη μελέτη των κοινών μηχανισμών των φαρμάκωνοστεοπόρωση καιΝόσος Αλτσχάιμερασ.
Cistanche tubulosa(Schenk) Το Wight είναι ένα παρασιτικό φυτό, το οποίο διανέμεται κυρίως στις ερήμους στη βορειοδυτική Κίνα. Οι αποξηραμένοι χυμώδεις μίσχοι τουCistanche tubulosa(CT) χρησιμοποιούνται ως ένα διάσημο τονωτικό φάρμακο που ονομάζεται Cistanches Herba με την κινεζική του ονομασία Roucongrong στην Κινεζική Φαρμακοποιία (2015). Έχει τιμηθεί ως «τζινσενγκ των ερήμων» και χρησιμοποιείται ευρέως για τις θεραπείες των πόνων μέσης και γονάτων, της γυναικείας στειρότητας και της δυσκοιλιότητας στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική (Jiang and Tu, 2009). Τα κύρια ενεργά συστατικά της CT είναι οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs), η εχινακοσίδη (ECH) καιακτεοσίδη(ACT) είναι οι αντιπροσωπευτικές ενώσεις στα PhGs (Morikawa et al., 2014). Ειδικότερα, το ECH και το ACT τυπικά επιλέγονται ως δείκτες για τον ποιοτικό έλεγχο στην αξονική τομογραφία λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους και των διαφόρων φαρμακολογικών τους δράσεων, όπως οι επιδράσεις της νευροπροστασίας, η προστασία των οστών,
αντιοξειδωτικά, αντιγήρανση και βελτίωση της ικανότητας μάθησης και μνήμης (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Ωστόσο, οι επιδράσεις του ECH και του ACT στην οστεοπόρωσησυνδυασμένο μεΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερδεν είχαν ακόμη μελετηθεί μαζί σε μοντέλο αρουραίου.Έτσι, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να δημιουργήσει ένα συνδυασμένο μοντέλο οστεοπόρωσης σε αρουραίουςμε τη νόσο του Αλτσχάιμερ και να διερευνήσει τις επιπτώσεις τουεχινακοσίδηκαι ακτεοσίδη σε αυτόταυτόχρονο μοντέλο, έτσι ώστε να παρέχει πειραματικά στοιχεία για περαιτέρω μελέτη τουμοριακός μηχανισμός εχινακοσίδης ή ακτεοσίδης στην ακόλουθη έρευνα.
cistanche pharma specialΓιαΕΝΑ Δ
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Των ζώων
Ογδόντα θηλυκοί αρουραίοι Wistar 8-εβδομάδων (Αριθμός πιστοποιητικού: SCXK 2018-0006), βάρους 180~200 g, αποκτήθηκαν από το Σινο-Βρετανικό εργαστήριο SIPPR/BK. Animal Ltd (Σαγκάη, Κίνα) και μεγάλωσε στο Πειραματικό Κέντρο Φαρμακευτικών Ζώων στο Φαρμακευτικό Πανεπιστήμιο της Κίνας.
2.2. Χημικά και αντιδραστήρια
Ένυδρο χλωρικό άλας, πενικιλλίνη G νάτριο, D-γαλακτόζη, εξαένυδρο χλωριούχο αργίλιο, βαλερική οιστραδιόλη, ντονεπεζίλη HCl αγοράστηκαν από την Aladdin Industrial Corporation (Σαγκάη, Κίνα).Εχινακοσίδη(HPLC 94 τοις εκατό) ελήφθη από την Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα).Ακτεοσίδη(HPLC 98 τοις εκατό ) αγοράστηκε από την Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Κίνα). Έγιναν δοκιμές κιτρινορροφητικής συνδεδεμένης με την ενζυμική κιτλοτρανσφεράση της ειδικής για τα οστά αλκαλικής φωσφατάσης (BALP), της ανθεκτικής σε τρυγικό οξύ όξινης φωσφατάσης (TRAP), της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), της μηλοναλδεΰδης (MDA), της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) και της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης (ChAT) (ELISA) αγοράστηκε από την Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Λήφθηκε καθολικό σταθεροποιητικό ιστού απόChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα).
εχινακοσίδη
2.3. Ζωικά μοντέλα και θεραπείες
Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν και επιβλέπονταν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Φαρμακευτικού Πανεπιστημίου της Κίνας. Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών σε δωμάτιο ελεγχόμενης θερμοκρασίας (22±2 βαθμοί) και τροφοδοτήθηκαν με τυπική σφαιροποιημένη χορτονομή και νερό βρύσης.
Μετά την προσαρμογή μιας εβδομάδας, το μοντέλο της οστεοπόρωσης επιτεύχθηκε με τη διενέργεια χειρουργικής επέμβασης ωοθηκεκτομής (French et al., 2008). Μετά την ολοκλήρωση της επέμβασης, η νατριούχος πενικιλίνη G ψεκάστηκε στο ράμμα του τραύματος για μία φορά για να αποφευχθεί η μόλυνση. Στη συνέχεια, οι αρουραίοι τράφηκαν κανονικά για τρεις εβδομάδες. Σύμφωνα με την αναφορά (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), το μοντέλο τουΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερθα μπορούσε να προκληθεί με μακροχρόνια ενδοπεριτοναϊκή ένεση D-γαλακτόζης σε συνδυασμό με ωοθηκεκτομή ή μακροχρόνια ενδογαστρική χορήγηση AlCl3. Για τη μελέτη της σκοπιμότητας του μοντέλου της οστεοπόρωσης σε συνδυασμό με τη νόσο του Αλτσχάιμερ, τρεις ομάδες μοντέλου ωοθηκεκτομής (ομάδα OVX), ψευδής χειρουργική επέμβαση με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 150 mg/kg/ημέρα D-γαλακτόζης και ενδογαστρική χορήγηση 30 mg/kg/ημέρα AlCl3 (ομάδα D), ωοθηκεκτομή με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 150 mg/kg/ημέρα D-γαλακτόζης και ενδογαστρική χορήγηση 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX συν D ομάδα) ορίστηκαν σε αυτή τη μελέτη.
Επομένως, οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε οκτώ ομάδες (n{0}} για κάθε ομάδα) μετά από 3 εβδομάδες και έλαβαν από του στόματος θεραπεία με φάρμακα για 8 εβδομάδες: Sham ομάδα. Ομάδα OVX; Ομάδα D; Ομάδα OVX συν D. Ομάδα θεραπείας με βαλερική οιστραδιόλη (ομάδα EV, OVX συν D συν 0.6 mg/kg/ημέρα βαλερική οιστραδιόλη). Ομάδα θεραπείας με ντονεπεζίλη HCl (ομάδα DPZ, OVX συν D συν 0,8 mg/kg/ημέρα ντονεπεζίλης HCl).εχινακοσίδηομάδα θεραπείας (ομάδα ECH, OVX συν D συν 90 mg/kg/ημέρα εχινακοσίδη).ακτεοσίδηομάδα θεραπείας (ομάδα ACT, OVX συν D συν 90 mg/kg/ημέρα ακτεοσίδης). Σύμφωνα με την Αρχή Μετατροπής Ισοδύναμης Δόσης Ανθρώπου-Αρουραίου και τη δόση από σχετική αναφορά (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), υιοθετήθηκαν οι δόσεις των ομάδων θεραπείας με φάρμακα σε αυτήν τη μελέτη.
Το σωματικό βάρος κάθε αρουραίου μετρήθηκε κάθε εβδομάδα. Μετά από όλη τη θεραπεία με φάρμακα που διήρκεσε για 8 εβδομάδες, πραγματοποιήθηκε αρχικά δοκιμή Morris Water Maze (MWM) για 6 ημέρες. Μετά από αυτό, 6 αρουραίοι από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν για τη συγκομιδή των υλικών. Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 3,0 mL/kg 10 τοις εκατό ένυδρη χλωράλη και συλλέχθηκε αίμα από την κοιλιακή αορτή. Το αίμα τοποθετήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για να πήξει και φυγοκεντρήθηκε στα 3500 r/min για 10 λεπτά. Ο ορός συλλέχθηκε σε σωλήνα φυγοκέντρησης 1,5 mL (NEST Biotechnology) και αποθηκεύτηκε σε -80 βαθμό μέχρι να χρησιμοποιηθεί για βιοχημικές δοκιμές. Στη συνέχεια συλλέχθηκαν οι ιστοί της μήτρας, του μηρού, της κνήμης και του εγκεφάλου. Οι μήτρες χρησιμοποιήθηκαν για ιστομορφομετρία. Ο δεξιός μηρός χρησιμοποιήθηκε για Micro-CT και ιστομορφομετρία, αντίστοιχα. Οι δεξιές κνήμες χρησιμοποιήθηκαν για την εμβιομηχανική δοκιμή. Ο ιππόκαμπος που συλλέχτηκε στην παγοθήκη χρησιμοποιήθηκε για βιοχημικές δοκιμές. Μετά από αυτό, οι άλλοι τρεις αρουραίοι από κάθε ομάδα εγχύθηκαν από την καρδιά με αλατούχο διάλυμα και καθολικό σταθεροποιητικό ιστού για τη συλλογή του εγκεφάλου για ιστομορφομετρία.
2.4. Δοκιμή Morris Water Maze (MWM).
Οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε έλεγχο χωρικής μάθησης αναφοράς και μνήμης στο τεστ MWM μετά από 8 εβδομάδες παρέμβασης. Η δοκιμή MWM πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας τις μεθόδους που αναφέρθηκαν προηγουμένως (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Εν συντομία, 5 συνεχόμενες ημέρες με τέσσερις δοκιμές την ημέρα, οι αρουραίοι εκπαιδεύτηκαν να χρησιμοποιούν μια ποικιλία οπτικών ενδείξεων που βρίσκονται στον τοίχο της πισίνας για να βρουν μια κρυφή βυθισμένη πλατφόρμα (διάμετρος 11 cm, ύψος 29 cm) σε μια κυκλική πισίνα (διάμετρος 130 cm, ύψος 50 cm) γεμάτο με μη τοξικό νερό με μελάνη άνθρακα. Η πισίνα χωρίστηκε νοητά σε τέσσερα τεταρτημόρια και τέσσερις θέσεις εκκίνησης βρίσκονταν στις διασταυρώσεις των τεταρτημορίων. Η πλατφόρμα βρισκόταν στο κέντρο ενός από τα τεταρτημόρια και η θέση ήταν σταθερή κατά τη διάρκεια των δοκιμών. Σε κάθε δοκιμή, οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν τυχαία σε επιλεγμένες τοποθεσίες, στραμμένες προς τον τοίχο της πισίνας. Κάθε δοκιμή τερματιζόταν όταν ο αρουραίος έφτασε στην πλατφόρμα ή μετά από 60 δευτερόλεπτα και ο χρόνος που παρήλθε καταγράφηκε ως καθυστέρηση διαφυγής. Οι αρουραίοι που δεν κατάφεραν να φτάσουν στην πλατφόρμα οδηγήθηκαν σε αυτήν. Μετά από κάθε δοκιμή κρυφής πλατφόρμας, ο αρουραίος παρέμενε στην πλατφόρμα για 10 δευτερόλεπτα. Ο μέσος χρόνος καθυστέρησης τεσσάρων δοκιμών ανά ημέρα υπολογίστηκε ως τα αποτελέσματα της εκπαίδευσης. Την 6η ημέρα, όλοι οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία ανίχνευσης στην οποία κολύμπησαν για 60 δευτερόλεπτα στην πισίνα χωρίς πλατφόρμα. Ως τελικά αποτελέσματα καταγράφηκαν οι χρόνοι διέλευσης στη θέση της πλατφόρμας και ο χρόνος ταξιδιού στο τεταρτημόριο στόχου. Οι αρουραίοι παρακολουθήθηκαν από μια κάμερα τοποθετημένη στην οροφή ακριβώς πάνω από την πισίνα και όλες οι δοκιμές καταγράφηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MORRIS MAZE που παρέχεται από την Beijing zhongshidichuang Science and Technology Development Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα)
2.5. Βιοχημική δοκιμή με ELISA
Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή των κιτ ELISA, η δραστηριότητα της ειδικής για τα οστά αλκαλικής φωσφατάσης (BALP), η δραστικότητα της όξινης φωσφατάσης (TRAP) ανθεκτικής σε τρυγικό άλας, η δραστικότητα δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD) και η περιεκτικότητα σε μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) στον ορό δοκιμάστηκαν από τη BioTek Synergy. 2 αναγνώστης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών (BioTek, Η.Π.Α.). Οι ιστοί του ιππόκαμπου από κάθε ομάδα πλύθηκαν με PBS (0.01 Μ, pH 7,4) για να αφαιρεθεί το αίμα ή οι ακαθαρσίες που απομένουν στην επιφάνεια του ιστού. Οι ιστοί του ιππόκαμπου στη μία πλευρά ζυγίστηκαν και στη συνέχεια κόπηκαν σε κομμάτια όσο το δυνατόν μικρότερα. Οι ιστοί του ιππόκαμπου ομογενοποιήθηκαν σύμφωνα με την αναλογία 1:9 (βάρος ιστού: όγκος PBS). Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στους 4 βαθμούς, 3000 r/min για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αραιώθηκε για να μετρηθεί η συγκέντρωση πρωτεΐνης με τη μέθοδο BCA. Η δραστηριότητα της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE), η δραστικότητα της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης (ChAT), η δραστικότητα της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) και η περιεκτικότητα σε μηλονοδιαλδεΰδη (MDA) στον ιστό του ιππόκαμπου στη συνέχεια δοκιμάστηκαν με μεθόδους ELISA.
2.6. Ιστομορφομετρία ιππόκαμπου
Οι εγκεφαλικοί ιστοί (n=3/ομάδα) στερεώθηκαν σε καθολικό σταθεροποιητικό ιστού. Τα δείγματα εγκεφαλικού ιστού στη συνέχεια πλύθηκαν, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη βαθμίδωσης, ενσωματώθηκαν με κερί παραφίνης και κόπηκαν σε στεφανιαίες τομές των 5 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ). Μετά από αυτό, οι στεφανιαίες τομές των εγκεφαλικών ιστών φωτογραφήθηκαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon, Ιαπωνία). Παρατηρήθηκαν ιδιαίτερα οι μορφολογικές αλλαγές των CA1, CA2, CA3 και DG στον ιππόκαμπο.
2.7. Ιστομορφομετρία και μορφομετρία μήτρας
Οι επιλεγμένες μήτρες (n{{0}}/ομάδα) στερεώθηκαν σε καθολικό σταθεροποιητικό ιστού. Τα δείγματα ιστού της μήτρας στη συνέχεια πλύθηκαν, αφυδατώθηκαν με βαθμιδωτή αιθανόλη, ενσωματώθηκαν με κερί παραφίνης και κόπηκαν σε εγκάρσιες τομές των 5 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ). Παρατηρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν οι εγκάρσιες τομές της μήτρας. Επιλέχθηκαν τυχαία πέντε οπτικά πεδία, η διάμετρος της εγκάρσιας τομής της μήτρας και το πάχος του επιθηλίου του βλεννογόνου της μήτρας στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus 6.0. Μετρήθηκαν επίσης οι αριθμοί των μητρικών αδένων στο lamina propria.
2.8. Micro-CT
Οι επιλεγμένοι δεξιοί μηροί (n=3/ομάδα) σαρώθηκαν σε μια θέση με την απόσταση του αντικειμένου από την πηγή 121 mm και την απόσταση της κάμερας από την πηγή 171 mm χρησιμοποιώντας ένα SkyScan 1176 micro X- αξονική τομογραφία ακτίνων (μικρο-CT) σαρωτής (Bruker, Γερμανία). Η περιφερική πλάκα ανάπτυξης επιλέχθηκε ως επιφάνεια αναφοράς. Με απόσταση 1 mm κάτω από την επιφάνεια αναφοράς, επιλέχθηκε μια περιοχή πάχους 1,8 mm ως όγκος ενδιαφέροντος (VOI, 100 στρώματα). Οι προκύπτουσες εικόνες σε κλίμακα του γκρι είχαν μέγεθος pixel 17,76 μm από την ανακατασκευή των οστών (65 kV, 385 μA). Χρησιμοποιήθηκε μια ημι-αυτόματη μέθοδος διαμόρφωσης περιγράμματος για την επιλογή δοκίδων από φλοιώδες οστό. Χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι άμεσης τρισδιάστατης μέτρησης για την εκτίμηση του ποσοστού του όγκου των οστών (BV/TV), της πυκνότητας της επιφάνειας των οστών (BS/TV), του διαχωρισμού των δοκιδωτών (Tb. Sp), του αριθμού δοκιδωτών (Tb. N), του πάχους της δοκιδωτής (Tb. Th) , δείκτης μοντέλου δομής (SMI), παράγοντας δοκιδώδους προτύπου (Tb. Pd) και μέση οστική πυκνότητα (μέση BMD) για την ίδια VOI χρησιμοποιώντας τοCTΠρόγραμμα αναλυτή (Bruker, Γερμανία). Η τρισδιάστατη απεικόνιση του VOI χρησιμοποιώντας έναν προσαρμοστικό αλγόριθμο απόδοσης έγινε με το λογισμικό CTvol (Bruker, Γερμανία).
φυτικό εκχύλισμα κιστάνς
2.9. Ιστομορφομετρία οστών
Οι επιλεγμένοι δεξιοί μηροί (n=3/ομάδα) στερεώθηκαν σε καθολικό σταθεροποιητικό ιστού και στη συνέχεια απασβεστοποιήθηκαν σε διάλυμα 10 τοις εκατό EDTA-2Na για 3 εβδομάδες. Τα απασβεστωμένα δείγματα πλύθηκαν, αφυδατώθηκαν με αιθανόλη βαθμίδωσης, ενσωματώθηκαν με κερί παραφίνης και κόπηκαν σε διαμήκεις τομές των 5 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ). Φωτογραφήθηκαν οι διαμήκεις τομές του μηριαίου. Παρατηρήθηκαν οι δομές οστού ιστού κάθε ομάδας, ιδιαίτερα οι δομές του δοκιδωτού οστού.
2.10. Εμβιομηχανική δοκιμή
Οι δεξιές κνήμες (n=4/ομάδα) που επιλέχθηκαν τυχαία αξιολογήθηκαν για τη δοκιμή κάμψης τριών σημείων χρησιμοποιώντας μια καθολική μηχανή δοκιμών (SHIMADZU, Ιαπωνία). Οι διάμετροι αυτών των δειγμάτων μετρήθηκαν με παχύμετρο βερνιέρου στην περιοχή των 2.16-2.38 mm (d). Το δείγμα στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε δύο εγκάρσιες ράβδους στήριξης με απόσταση 25 mm (L) μεταξύ των δύο σιδηροτροχιών και η φυσιολογική καμπυλότητα του δείγματος ήταν προς τα πάνω. Η ράβδος φόρτωσης του φορτίου βρισκόταν στο κέντρο του δείγματος και έπεφτε με σταθερό ρυθμό 1,5 mm/min μέχρι να σπάσει το δείγμα. Τα δεδομένα δύναμης (F) και μετατόπισης καταγράφηκαν αυτόματα σε έναν υπολογιστή που συνδέθηκε με τη μηχανή δοκιμής και η καμπύλη φορτίου-παραμόρφωσης σχεδιάστηκε ταυτόχρονα. Οι τιμές του μέγιστου φορτίου (N) και της απορρόφησης ενέργειας (mJ) καταγράφηκαν ταυτόχρονα από το λογισμικό δοκιμής υλικών TRAPEZIUM X. Οι τιμές της μέγιστης τάσης (MPa) υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: Τάση (σ)=ροπή κάμψης (M) / Συντελεστής τομής (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. Στατιστική ανάλυση
Τα αποτελέσματα των ομάδων μοντέλου συγκρίθηκαν με την ομάδα Sham και αυτά των ομάδων που έλαβαν θεραπεία με φάρμακο συγκρίθηκαν με την ομάδα OVX συν D. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni χρησιμοποιώντας το λογισμικό Graph Pad Prism 5.0. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD, και τιμές P μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.
μυρικετίνηκαικιστανάκι
