Μέρος 1:Η επιγενετική ρύθμιση του κιρκάδιου γονιδίου Per1 συμβάλλει στις αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία στη μνήμη του Ιππόκαμπου

Επικοινωνία: Όντρεϊ Χουaudrey.hu@wecistanche.com

Plc κάντε κλικ εδώ στο Μέρος 2

Janine L. Kwapis1,2,3, Yasaman Alaghband1,2, Enikö A. Kramár1,2, Alberto J. López1,2, Annie Vogel Ciernia4, André O. White5, Guanhua Shu1,2, Diane Rhee1,2,

Κριστίνα Μ. Μάικλ1,2, Έμιλι Μοντελιέ6, Γιου Λιου7,8, Κριστόφ Ν. Μαγκνάν7,8, Σιουέι Τσεν7,8, Πάολο Σασόν-Κορσί6, Πιερ Μπαλντί7,8, Ντίνα Π. Ματέος1,2 &Μαρσέλο Α. Γουντ1,2,3

Η γήρανση συνοδεύεται από βλάβες τόσο στην κιρκαδιανή ρυθμικότητα όσο και στη μακροχρόνιαμνήμη. Αν και είναι σαφές ότιμνήμηη απόδοση επηρεάζεται από τον κιρκάδιο κύκλο, είναι άγνωστο εάν η διαταραχή του κιρκάδιου ρολογιού που σχετίζεται με την ηλικία προκαλεί εξασθενημένο ιππόκαμπομνήμη. Εδώ, δείχνουμε ότι η κατασταλτική αποακετυλάση ιστόνης HDAC3 περιορίζει τη μακροπρόθεσμη μνήμη, τη συναπτική πλαστικότητα και την προκαλούμενη από την εμπειρία έκφραση του κιρκάδιου γονιδίου Perlin στον γηράσκοντα ιππόκαμπο χωρίς να επηρεάζει τα ρυθμικά κιρκάδια πρότυπα δραστηριότητας. Αποδεικνύουμε επίσης ότι ο ιππόκαμπος Per] είναι κρίσιμος για μακροπρόθεσμαμνήμηδιαμόρφωση. Μαζί, τα δεδομένα μας αμφισβητούν την παραδοσιακή ιδέα ότι οι αλλαγές στον πυρήνα του κιρκάδιου ρολογιού οδηγούν σε αλλαγές που σχετίζονται με το κιρκάδιο στομνήμησχηματισμός και αντ 'αυτού υποστηρίζουν έναν πιο αυτόνομο ρόλο για την κιρκάδιο γονιδιακή λειτουργία ρολογιού στα κύτταρα του ιππόκαμπου για να καλύψουν την πιθανότητα σχηματισμού μακροπρόθεσμης μνήμης.

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη μνήμη

Τα ζώα έχουν ένα εσωτερικό κιρκάδιο ρολόι που οδηγεί τον ρυθμικό κύκλο των βιολογικών διεργασιών κάθε ~ 24 ώρες. Οι κιρκάδιοι ρυθμοί οδηγούν πολλά φυσιολογικά γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του κύκλου ύπνου-αφύπνισης, της συμπεριφοράς σίτισης, της θερμοκρασίας του σώματος και του μεταβολισμού. Στο κύριο κιρκάδιο ρολόι, ο υπερραχιασματικός πυρήνας (SCN), μια ομάδα γονιδίων ρολογιού πυρήνα ταλαντεύεται σε έναν αρνητικό βρόχο ανάδρασης που κυκλώνει κάθε ~24 h1,2. Εκτός από τη ρύθμιση των βασικών βιολογικών διεργασιών, το κιρκάδιο ρολόι έχει επίσης ισχυρή επίδραση στηνμνήμη. Η μακροπρόθεσμη μνήμη, η οποία εξαρτάται από τη μεταγραφή, δείχνει ένα ισχυρό φαινόμενο ώρας της ημέρας, με μέγιστη απόδοση μνήμης κατά τη διάρκεια της ημέρας (ανενεργή φάση) σε ποντίκια3,4. Συγκεκριμένα, τόσο μακροπρόθεσμα όσο και τα δύομνήμηκαι η κιρκαδιανή ρυθμικότητα είναι εξασθενημένες με την ηλικία5, υποδηλώνοντας ότι οι κοινοί μοριακοί μηχανισμοί μπορεί να αποτελούν τη βάση και των δύο διαδικασιών. Μια ιδέα είναι ότι τα γονίδια ρολογιού βρίσκονται στομνήμη-σχετικές δομές, όπως ο ραχιαίος ιππόκαμπος, μπορεί να εμποδίσουν την ικανότητα ενός ζώου να σχηματίσει μακροπρόθεσμαμνήμημε βάση την ώρα της ημέρας6. Σύμφωνα με αυτό, η διάσπαση πολλών μεμονωμένων γονιδίων ρολογιού σε όλο τον εγκέφαλο μπορεί να επηρεάσει τη μακροπρόθεσμη μνήμη του ιππόκαμπου σε νεαρά ζώα. Δεδομένου ότι καμία μελέτη μέχρι σήμερα δεν έχει διαταράξει επιλεκτικά την κιρκαδική γονιδιακή λειτουργία εντός του ραχιαίου ιππόκαμπου, δεν είναι σαφές εάν τα γονίδια ρολογιού δρουν εντός των κυττάρων του ιππόκαμπου για να επηρεάσουν μακροπρόθεσμαμνήμησχηματισμός ή αν αυτά τα ελλείμματα μνήμης προκύπτουν από επιδράσεις εκτός στόχου σε άλλες περιοχές του εγκεφάλου, όπως οι εξασθενημένοι κιρκάδιοι ρυθμοί, τα ελλείμματα ύπνου ή ακόμα και οι αναπτυξιακές ανωμαλίες.

Η γονιδιακή έκφραση μειώνεται στον γηράσκοντα εγκέφαλο, γεγονός που μπορεί να είναι συνέπεια μιας πιο καταπιεστικής δομής χρωματίνης. Η μεταγραφή ελέγχεται εν μέρει μέσω αλλαγών στη δομή της χρωματίνης, οι οποίες μπορούν να προωθήσουν δυναμικά ή να περιορίσουν την πρόσβαση στο νευρωνικό DNA μετά από ένα μαθησιακό γεγονός. Μια υπόθεση που προβάλλεται από τους Barnes και Sweatt υποστηρίζει ότι το επιγονίδιο μεταβάλλεται στους γηράσκοντες νευρώνες, με αποτέλεσμα μια κατασταλτική δομή χρωματίνης που εμποδίζει τη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση που απαιτείται για το σχηματισμό μακροπρόθεσμης μνήμης7. Αρκετές μελέτες υποστηρίζουν αυτή την ιδέα που δείχνει τροποποιημένους μηχανισμούς τροποποίησης ιστόνης στον γηράσκοντα εγκέφαλο8-10. Ωστόσο, εάν οι μηχανισμοί τροποποίησης της χρωματίνης ρυθμίζουν ασυνήθιστα την κιρκαδιανή γονιδιακή έκφραση σε μια βασική μάθηση καιμνήμηη περιοχή του εγκεφάλου είναι άγνωστη. Εδώ, εξετάσαμε αυτή τη δυνατότητα εστιάζοντας στο ρόλο της εξαρτώμενης από την ιστόνης αποακετυλάση 3 (HDAC3) ρύθμιση της μνήμης που σχετίζεται με την ηλικία και της γονιδιακής έκφρασης. Διαπιστώσαμε ότι η διαγραφή ή η διακοπή του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο βελτιώνει τις βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία στη μακροπρόθεσμη μνήμη και τη συναπτική πλαστικότητα σε ποντίκια ηλικίας 18 μηνών, ένα αποτέλεσμα που φαίνεται να μεσολαβείται εν μέρει από το βασικό κιρκάδιο γονίδιο ρολογιού Period1 (Per1). Σε γενικές γραμμές, αυτή η εργασία υποδηλώνει ότι το Per1 μπορεί να είναι ένας μηχανισμός που συμβάλλει σε αναπηρίες που σχετίζονται με την ηλικία τόσο μακροπρόθεσμαμνήμηκαι κιρκαδική ρυθμικότητα, ανάλογα με τη δομή.

Αποτελέσματα

Το HDAC3 συμβάλλει στη συσχέτιση με την ηλικίαμνήμηΑναπηρίες. Εξετάσαμε για πρώτη φορά εάν η κατασταλτική αποακετυλάση ιστόνης HDAC3 παίζει ρόλο στην ηλικία που σχετίζεται με την ηλικίαμνήμηπαρακμή. Το HDAC3 είναι ένας ισχυρός αρνητικός ρυθμιστής του σχηματισμού μνήμης και της διαταραχής του HDAC3 σε νεαρά ζώα που μπορεί να μετατρέψει ένα γεγονός μάθησης υποπίεσης σε ένα που δημιουργεί επίμονη μακροπρόθεσμη μνήμη για πολλαπλές εργασίες11-14. Χρησιμοποιήσαμε δύο μεθόδους διατάραξης του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο των γηράσκοντων ποντικών (ηλικίας 18 μηνών). Αρχικά, δημιουργήσαμε εστιακές ομόζυγες διαγραφές του HDAC3 με την έγχυση της ανασυνδυάσης AAV2.1-CaMKII-Cre (1 μL ανά πλευρά) στον ραχιαίο ιππόκαμπο των ποντικιών HDAC3flox/flox (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α). Δεύτερον, για να εμποδίσουμε επιλεκτικά την ενζυματική δραστηριότητα του HDAC3, χρησιμοποιήσαμε έναν μεταλλαγμένο ιό κυρίαρχου-αρνητικού σημείου, τον AAV2.1-CMV- HDAC3(Y298H)-v5 που εμποδίζει συγκεκριμένα τη δραστηριότητα αποακετυλάσης HDAC3 χωρίς να επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (βλ. αναφορά 12,15-17 Συμπληρωματικό Σχήμα 1β). Οι ιοί εγχέθηκαν δύοεβδομάδες πριν από την προπόνηση, επιτρέποντας τον αυστηρό χωρικό και χρονικό έλεγχο των χειρισμών hdac3 για την αποφυγή πιθανών παρενεργειών που μπορεί να προκύψουν από παρατεταμένη διαταραχή του HDAC3 κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης18,19. Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση AAV-CaMKII-Cre (Συμπληρωματικό Σχήμα 1γ), παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του Hdac3 mRNA δεν επηρεάστηκε από την προπόνηση στη θέση του αντικειμένουμνήμη(OLM), αλλά η γενετική διαγραφή του ιππόκαμπου Hdac3 διέκοψε την έκφραση του Hdac3 mRNA (Συμπληρωματικό Σχήμα 1d) εκτός από την πρωτεΐνη HDAC3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α).

Για να προσδιορίσετε αν η διαγραφή του HDAC3 βελτιώνεταιμνήμησε γηράσκοντα ποντίκια, δοκιμάσαμε τις επιδράσεις της διαγραφής hdac3 του ιππόκαμπου (HDAC3flox / flox) ή της διαταραχής της δραστηριότητας (HDAC3 (Y298H)) στη μακροπρόθεσμη μνήμη για OLM (Εικ. 1α). Σύμφωνα με πολυάριθμες αναφορές για ελλείμματα μνήμης ιππόκαμπου που σχετίζονται με την ηλικία, διαπιστώσαμε ότι τα γηράσκοντα ποντίκια άγριου τύπου (HDAC3+/+) 18 m.o. εμφάνιζαν κακή μνήμη για OLM μετά από προπόνηση 10 λεπτών, δείχνοντας καμία σημαντική αύξηση του DI μεταξύ προπόνησης και δοκιμής (Εικ. 1β, γκρίζες ράβδοι). Είναι σημαντικό, μια προπόνηση 10 λεπτών.

2 | ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ ΤΗΣ ΦΥΣΗΣ (2018)9:3323 | DOI: 10.1038/s41467-018-05868-0 |www.nature.com/naturecommunications

Σχήμα 1 Η διαγραφή ή η διατάραξη του HDAC3 βελτιώνει τις αναπηρίες που σχετίζονται με την ηλικία στη μνήμη του ιππόκαμπου. μια διαδικασία OLM. Το AAV εγχύθηκε 2 εβδομάδες πριν από την προπόνηση. β 18-m.o. Τα ποντίκια HDAC3flox/flox έδειξαν σημαντικά καλύτερη μνήμη για το OLM σε σύγκριση με τα ματάκια άγριου τύπου (HDAC3+/+) (Αμφίδρομη ANOVA: Σημαντική αλληλεπίδραση γονότυπου x συνεδρίας (F(1,29) = 15,96, p< 0.001),="" sidak’s="" posthoc="" tests,="" ***p="">< 0.001,="" n="14(5F)," 17(6f)).="" c="" total="" exploration="" was="" similar="" for="" both="" groups="" at="" test="" (t(29)="1.67," ***p="0.11)." d="" disrupting="" hdac3="" activity="" in="" the="" dorsal="" hippocampus="" with="" aav-hdac3="" (y298h)-v5="" also="" ameliorated="" hippocampal="" memory="" impairments="" in="" 18-m.="" o.="" mice="" (two-way="" anova:="" main="" effect="" of="" session="" (f(1,16)="15.96," p="">< 0.001),="" sidak’s="" post="" hoc="" tests,="" ***p="">< 0.001,="" *p="">< 0.05,="" n="9,10;" all="" males).="" e="" total="" exploration="" time="" was="" similar="" for="" both="" groups="" at="" test="" (t(16)="0.28," p="0.78)." f="" orm="" experimental="" procedure,="" 2="" weeks="" after="" the="" completion="" of="" olm.="" g="" both="" 18-m.o.="" hdac3flox/flox="" mice="" and="" hdac3+/+="" littermates="" showed="" little="" preference="" for="" the="" novel="" object="" (two-way="" anova,="" no="" main="" effects="" or="" interaction,="" n="14(5" f),="" 17(6="" f)).="" h="" total="" exploration="" time="" was="" similar="" for="" both="" groups="" at="" test="" (t(29)="0.59," p="0.56)." i="" disrupting="" hdac3="" activity="" in="" the="" dorsal="" hippocampus="" with="" aav-hdac3(y298h)="" also="" had="" no="" effect="" on="" orm,="" with="" neither="" group="" showing="" a="" preference="" for="" the="" novel="" object="" (two-way="" anova,="" no="" main="" effects="" or="" interaction,="" n="9,10;" all="" males).="" j="" groups="" showed="" similar="" total="" exploration="" time="" at="" test="" (t(16)="0.28," p="0.78)." data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem;="" black="" circles,="" males;="" gray="" squares,="" females="" normally="" produce="" strong="" long-term="" memory="" in="" young="" mice20.="" in="" contrast,="" 18-m.o.="" hdac3flox/flox="" littermates="" formed="" robust="" long-term="" memory="" (fig.="" 1b,="" teal="" bars),="" with="" a="" significant="" increase="" in="" preference="" for="" the="" moving="" object="" at="" rest="" relative="" to="" training.="" hdac3flox/flox="" mice="" showed="" a="" significantly="" higher="" di="" at="" test="" than="" hdac3+/+="" mice="" despite="" similar="" levels="" of="" total="" exploration="" during="" the="" test="" session="" (fig.="" 1c).="" we="" observed="" similar="" effects="" with="" the="" activity-specific="" aav-hdac3(y298h)="" virus.="" aging,="" 18-m.o.="" empty="" vector="" (ev)="" control="" mice="" showed="" poor="" memory="" for="" olm="" whereas="" mice="" infused="" with="" aav-hdac3(y298h)="" into="" the="" dh="" showed="" significantly="" higher="" preference="" for="" the="" moving="" object="" with="" no="" change="" in="" total="" exploration="" (fig.="" 1d,="" e).="" in="" contrast="" to="" the="" poor="" long-term="" memory="" observed="" in="" 18-m.o.="" wildtype="">

(Εικ. 1β, δ), βραχυπρόθεσμη μνήμη για OLM (δοκιμασμένη 60 m μετά

απόκτηση· Συμπληρωματικό Σχήμα 2α) ήταν άθικτο τόσο για hdac3+/+ όσο και για HDAC3flox/flox ποντίκια (Συμπληρωματικό Σχήμα 2β, γ) και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο άγχος μεταξύ αυτών των ομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ). Επίσης, δεν παρατηρήσαμε σημαντική διαφορά στην κίνηση μεταξύ των ομάδων κατά τη διάρκεια της εξοικείωσης (Συμπληρωματικά Σχήματα 2ε, στ, 8α, β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι οι βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία στην OLM βελτιώνονται με τη διαγραφή ή τη διακοπή του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο.

Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν ο εστιακός χειρισμός του HDAC3 επηρέασε την αναγνώριση αντικειμένωνμνήμη(ORM), η οποία δεν απαιτεί τον ραχιαίο ιππόκαμπο για ανάκτηση20. Σε αυτή την εργασία, ένα οικείο αντικείμενο αντικαθίσταται από ένα νέο αντικείμενο (Εικ. 1στ). Η διαγραφή του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο δεν έσωσεμνήμηγια ORM, με τα ποντίκια HDAC3+/+ και HDAC3flox/flox να μην δείχνουν προτίμηση για το νέο αντικείμενο κατά τη δοκιμή σε σύγκριση με την προπόνηση (Εικ. 1g). Και πάλι, οι ομάδες δεν διέφεραν στα συνολικά επίπεδα εξερεύνησης κατά τη διάρκεια της δοκιμαστικής περιόδου (Εικ. 1η). Ομοίως, η ειδική για κάθε δραστηριότητα διαταραχή της HDAC3 στον ιππόκαμπο δεν ήταν σε θέση να βελτιώσει τις βλάβες orm που σχετίζονται με την ηλικία (Εικ. 1i, j). Έτσι, οι βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία σε μακροχρόνια ORM δεν βελτιώθηκαν με τη διαγραφή του ιππόκαμπου ή τη διακοπή του HDAC3.

Μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διαγραφή ή η διακοπή του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο μπορεί να βελτιώσει τη μακροπρόθεσμη σχετιζόμενη με την ηλικίαμνήμηελλείμματα για μια εργασία που εξαρτάται από τον ιππόκαμπο (OLM, Εικ. 1α–ε) χωρίς να επηρεάζεται η μνήμη για μια ανεξάρτητη εργασία του ιππόκαμπου (ORM, Εικ. 1στ–ι). Είναι σημαντικό ότι όλα τα ποντίκια έδειξαν άθικτα βραχυπρόθεσμαμνήμηγια το OLM (Συμπληρωματικό Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι αυτά τα ζώα αποκτούν μνήμη κανονικά, αλλά αποτυγχάνουν να ενοποιήσουν αυτές τις πληροφορίες σε παρατηρήσιμες μακροπρόθεσμεςμνήμη. Καθώς η βραχυπρόθεσμη μνήμη είναι ανεξάρτητη από τη μεταγραφή (για ανασκόπηση21), αυτό το εύρημα είναι συνεπές με την ιδέα ότι η γονιδιακή έκφραση που προκαλείται από τη μάθηση μεταβάλλεται σε γηράσκοντα ποντίκια, με αποτέλεσμα διαταραχές που σχετίζονται με την ηλικία στη μακροπρόθεσμη μνήμη.

Η διαταραχή hdac3 αντιστρέφει τις βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία στο LTP.

Για να ελέγξουμε αν η HDAC3 συμβάλλει επίσης σε διαταραχές της συναπτικής πλαστικότητας που σχετίζονται με την ηλικία, εξετάσαμε τη μακροπρόθεσμη ενίσχυση (LTP) σε οξείες φέτες ιππόκαμπου μετά από διαγραφή ή διακοπή του HDAC3. Η LTP είναι επίσης μειωμένη με την ηλικία, ιδιαίτερα όταν το πρωτόκολλο διέγερσης πλησιάζει το όριο επαγωγής LTP22. Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση του ιού, παρασκευάσαμε φέτες ιππόκαμπου και προκαλέσαμε LTP με μία μόνο αμαξοστοιχία 5 εκρήξεων θήτα σε παράπλευρες εισόδους Schaffer και καταγεγραμμένα EPSP πεδίου από κορυφαίους δενδρίτες ca1b. Αυτή η σχετικά ήπια μορφή διέγερσης παρήγαγε ένα σταθερό επίπεδο LTP σε νεαρές φέτες HDAC3+/+ (Εικ. 2α). Διαγραφή του HDAC3 στον ιππόκαμπο ενισχυμένο LTP, με τα ποντίκια HDAC3flox/flox να παρουσιάζουν σημαντικά υψηλότερη ενίσχυση από τα χειριστήρια άγριου τύπου. Όπως προβλεπόταν, η γήρανση-18-m.o. Τα ποντίκια HDAC3+/+ παρουσίασαν εξασθενημένη LTP και η διαγραφή hdac3 βελτίωσε αυτό το έλλειμμα, παράγοντας LTP συγκρίσιμη με εκείνη των νεαρών ποντικών άγριου τύπου (Εικ. 2β, γ) χωρίς καμία επίδραση στην αρχική συναπτική μετάδοση (Σχήμα 2g, h).

Παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα με τη διακοπή που σχετίζεται με τη συγκεκριμένη δραστηριότητα. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ένα σχέδιο εντός των θεμάτων στο οποίο νεαρά και παλιά ποντίκια άγριου τύπου εγχύθηκαν με τον ιό ελέγχου (AAV-EV) σε έναν ιππόκαμπο και AAV-HDAC3 (Y298H) στον ετερόπλευρο ιππόκαμπο. Όπως και πριν, διαπιστώσαμε ότι η διατάραξη της δραστηριότητας του HDAC3 ενίσχυσε την LTP σε φέτες από νεαρά ποντίκια (Εικ. 2δ) και βελτίωσε τις σχετιζόμενες με την ηλικία διαταραχές της LTP σε φέτες από γηράσκοντα ποντίκια (Σχήμα 2ε, στ) χωρίς να παρεμβαίνει στην αρχική συναπτική μετάδοση (Εικ. 2i, j). Επομένως, είτε η διαγραφή είτε η διακοπή του HDAC3 μπορεί να βελτιώσει τις αναπηρίες που σχετίζονται με την ηλικία στο LTP του ιππόκαμπου.

Ένα υποσύνολο γονιδίων με προβλήματα ηλικίας βελτιώνεται με τη διαγραφή hdac3. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η διαγραφή ή η διατάραξη του HDAC3 βελτιώνει τις αναπηρίες που σχετίζονται με την ηλικία στη μακροπρόθεσμη μνήμη και τη συναπτική πλαστικότητα. Στη συνέχεια, ρωτήσαμε εάν τα ελλείμματα που σχετίζονται με την ηλικία στην έκφραση του γονιδίου του ιππόκαμπου θα μπορούσαν επίσης να βελτιωθούν με τη διαγραφή του HDAC3. Υποθέσαμε ότι η απορρύθμιση της δραστηριότητας του HDAC3 στον παλιό εγκέφαλο οδηγεί σε μια ασυνήθιστα κατασταλτική δομή χρωματίνης που περιορίζει τη γονιδιακή έκφραση, η οποία τελικά βλάπτει μακροπρόθεσμα τη μακροπρόθεσμημνήμη. Για να προσδιορίσουμε ποια συγκεκριμένα γονίδια ρυθμίζονται από το HDAC3 στον νεαρό και γηράσκοντα εγκέφαλο, τρέξαμε ένα πείραμα αλληλούχισης RNA στο οποίο συγκρίναμε νεαρά (3-m.o.) ποντίκια άγριου τύπου, γήρανσης (18-m.o.) HDAC3+/+ ποντίκια, και τη γήρανση (18-m.o.) Hdac3flox/flox σκουπιδοτενεκέδες. Για τον εντοπισμό γονιδιακών αλλαγών έκφρασης κατά τη διάρκειαμνήμηενοποίηση, τα ζώα σε κάθε ομάδα θανατώθηκαν 60 μέτρα μετά από 10 λεπτά εκπαίδευσης OLM και σε σύγκριση με τους ελέγχους homecage (HC). Μετά τη χαρτογράφηση και την εξέταση του απλοειδούς γονιδιώματος23,24, αξιολογήθηκε η ποιότητα της αλληλούχισης (Συμπληρωματικό Σχήμα 3α, β) και εξετάστηκαν σημαντικές διαφορές στα προφίλ έκφρασης μεταξύ όλων των ζευγών δειγμάτων για p<>

Περιμέναμε ότι η γονιδιακή έκφραση που προκαλείται από την εμπειρία θα μεταβαλλόταν στον παλιό εγκέφαλο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με ένα υποσύνολο γονιδίων που αποτυγχάνουν να εκφραστούν μετά τη μάθηση. Ως εκ τούτου, επικεντρωθήκαμε σε εκείνα τα γονίδια που εκφράζονται σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα στις εκπαιδευμένες ομάδες σε σύγκριση με τους ελέγχους του homecage. Ενώ κάθε ομάδα (Young WT, Old WT, Old HDAC3flox/flox) έδειξε έναν σημαντικό αριθμό γονιδίων που προκλήθηκαν από την εκπαίδευση OLM, κάθε ομάδα έδειξε ένα μοναδικό προφίλ γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 3α, Συμπληρωματικοί Πίνακες 1–3). Παλιοί εγκέφαλοιρυθμισμένο τόσο στον νεαρό άγριο τύπο όσο και στις παλιές ομάδες HDAC3flox/flox που δεν παρουσιάζουν αυξήσεις που προκαλούνται από την εμπειρία στον παλιό ιππόκαμπο άγριου τύπου. Αυτά είναι τα γονίδια που αποτυγχάνουν να εκφραστούν κανονικά στον παλιό εγκέφαλο μετά την εκπαίδευση OLM, αλλά διασώζονται με διαγραφή HDAC3 και επομένως μπορούν να λειτουργήσουν ως μηχανισμός μέσω του οποίου η διαγραφή HDAC3 βελτιώνει τις διαταραχές μνήμης που σχετίζονται με την ηλικία. Τέσσερα γονίδια εντοπίστηκαν σε αυτή την ομάδα: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3 και Per1. Όλα αυτά τα γονίδια έχουν εμπλακεί ευρέως στο σχηματισμό μνήμης6,26,27, αν και αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει ότι η έκφραση αυτών των γονιδίων που προκαλείται από την εμπειρία είναι μειωμένη με την ηλικία και διασώζεται με διαγραφή HDAC3.

Η διαγραφή του HDAC3 βελτιώνει τα ελλείμματα που σχετίζονται με την ηλικία στο Per1. Από τα γονίδια που εντοπίστηκαν μέσω του RNA-seq μας, το Period1 (Per1) ήταν το πιο έντονα επαγόμενο από την εκπαίδευση OLM στην ομάδα HDAC3flox/flox (Εικ. 3c). Αυτός ο στόχος είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον, καθώς το Per1 μελετάται συνήθως στο πλαίσιο των κιρκάδιων ρυθμών, αλλά έχει επίσης εμπλακεί στον ιππόκαμπομνήμησχηματισμός6,28,29. Καθώς η γήρανση είναι γνωστό ότι συνοδεύεται από βλάβες στους κιρκάδιους ρυθμούς5 και η μνήμη συνδέεται με την ώρα της ημέρας2,30, αυτός ο στόχος του HDAC3 μπορεί να αντιπροσωπεύει μια κρίσιμη και υποεξερεύνητη διεπαφή μεταξύ της γήρανσης, της τροποποίησης της χρωματίνης και του κιρκάδιου ρολογιού.

Για να εξετάσουμε περαιτέρω την έκφραση του Per1 σε παλιά hdac3 +/+ και παλιά ζώα HDAC3flox / flox, χρησιμοποιήσαμε RT-qPCR και ChIP- qPCR. Διαπιστώσαμε ότι η εκπαίδευση OLM απέτυχε να προκαλέσει αύξηση της ρύθμισης του Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο των 18-m.o. HDAC3+/+ ποντικών, αλλά ελλείψει του HDAC3 (HDAC3flox/flox), η εκπαίδευση OLM προκάλεσε σημαντική αύξηση του Per1 mRNA (Εικ. 3f). Μετρήσαμε επίσης την έκφραση δύο επιπλέον γονιδίων που παίζουν καλά τεκμηριωμένο ρόλο μακροπρόθεσμαμνήμησχηματισμός: Τόξο και cFos31. Η έκφραση του Arc που προκλήθηκε από την εμπειρία ήταν άθικτη στον γηράσκοντα εγκέφαλο άγριου τύπου και δεν επηρεάστηκε από τη διαγραφή hdac3 (συμπληρωματικό σχήμα 3γ). η έκφραση cFos, από την άλλη πλευρά, απέτυχε να προκληθεί από την εκπαίδευση OLM στον παλιό ιππόκαμπο HDAC3+/+, αλλά η διαγραφή του HDAC3 δεν ήταν αρκετή για την αποκατάσταση αυτής της αποτυχημένης επαγωγής (Συμπληρωματικό Σχ.3d). Επομένως, η διαγραφή του HDAC3 αποκαθιστά μόνο την έκφραση ενός υποσυνόλου γονιδίων που προκαλούνται από την εμπειρία στον γηράσκοντα εγκέφαλο, συμπεριλαμβανομένου του Per1.

Για να προσδιορίσουμε εάν η διαγραφή του HDAC3 αποκαθιστά την έκφραση του Per1 προωθώντας την ακετυλίωση ιστόνης μαζί με τον υποκινητή του, μετρήσαμε στη συνέχεια την ακετυλίωση της ιστόνης 4, της λυσίνης 8 (H4K8Ac) στη θέση του υποκινητή Per1 CRE χρησιμοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης (ChIP-qPCR). Το H4K8Ac είναι ένας δείκτης μεταγραφικής ενεργοποίησης32 και πιστεύεται ότι είναι στόχος του HDAC311,12. Η εκπαίδευση OLM δεν άλλαξε τα επίπεδα H4K8Ac στον υποκινητή Per1 στον παλιό εγκέφαλο wildtype, αλλά ελλείψει HDAC3, τα επίπεδα H4K8Ac στον υποκινητή Per1 αυξήθηκαν σημαντικά ως απόκριση στην προπόνηση OLM (Εικ. 3g). Για το Arc και το cFos, δεν είδαμε καμία αλλαγή στην πληρότητα του H4K8Ac σε όλες τις ομάδες (Συμπληρωματικό Σχήμα 3e, f). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η διαγραφή του HDAC3 αυξάνει την ακετυλίωση στον υποκινητή Per1 και την έκφραση τουPer1 mRNA ως απάντηση στη μάθηση.

Ένα σημαντικό ερώτημα είναι εάν οι παρατηρούμενες αλλαγές στο Per1 οφείλονται σε αλλαγές στον κιρκάδιο ρυθμό των ποντικών HDAC3flox / flox. Εάν η διαγραφή του HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο μεταβάλλει την κιρκαδική ρυθμικότητα, αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει τις παρατηρούμενες αλλαγές τόσο στην έκφραση Per1 όσο και μακροπρόθεσμαμνήμηδιαμόρφωση. Για να το αποκλείσουμε αυτό, αξιολογήσαμε την κιρκαδική ρυθμικότητα των νέων (3 μ.ο.) και της γήρανσης (18 μ.ο.) Ποντίκια HDAC3flox/flox και τα συμπαίκτες τους hdac3+/+ μετά από έγχυση AAV-CaMKII-Cre. Μετά από 2 εβδομάδες έλξης σε έναν κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών (LD), τα ποντίκια τέθηκαν σε σταθερό σκοτάδι (DD) για να μετρήσουν τους ενδογενείς κιρκάδιους ρυθμούς (Συμπληρωματικό Σχήμα 4α). Δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά στα κιρκάδια μοτίβα δραστηριότητας μεταξύ των HDAC3+/+ και HDAC3flox/ flox ποντικών σε καμία από τις δύο ηλικιακές ομάδες (Συμπληρωματικό Σχήμα 4b–f), υποδηλώνοντας ότι το HIPPOCAMPAL HDAC3 δεν έχει καμία επίδραση στην κιρκαδιανή ρυθμικότητα. Έτσι, οι παρατηρούμενες αλλαγές στην έκφραση Per1 και ο μακροπρόθεσμος σχηματισμός μνήμης μετά τη διαγραφή hdac3 δεν μπορούν να εξηγηθούν από αλλαγές στην κιρκαδιανή ρυθμικότητα.

Το Per1 προκαλείται από την εκπαίδευση OLM και ρυθμίζεται από το HDAC3.

Στη συνέχεια θέλαμε να καθορίσουμε εάν ο ιππόκαμπος Per1 απαιτείται για μακροχρόνιαμνήμηδιαμόρφωση. Πρώτον, αξιολογήσαμε εάν η μάθηση που εξαρτάται από τον ιππόκαμπο προκαλεί συνήθως έκφραση Per1 mRNA. Θυσιάσαμε νεαρά (3-m.o.) ποντίκια άγριου τύπου 60 m μετά την απόκτηση είτε του OLM είτε του context fear conditioning (CFC)12. Η έκφραση per1 mRNA αυξήθηκε σημαντικά σε ζώα που εκπαιδεύτηκαν είτε με OLM (Σχήμα 4α) είτε με CFC (Εικ. 4β) σε σύγκριση με τους ελέγχους του homecage, υποδεικνύοντας ότι η έκφραση Per1 mRNA προκαλείται συνήθως στον ιππόκαμπο κατά τη διάρκεια της ενοποίησης της μνήμης για πολλαπλές εργασίες.

Για να προσδιορίσουμε εάν αυτή η αύξηση του Per1 που προκαλείται από την εμπειρία θα μπορούσε να διαμεσολαβηθεί μέσω του HDAC3, χρησιμοποιήσαμε στη συνέχεια το ChIP-qPCR για να μετρήσουμε την πληρότητα του HDAC3 μετά την εκπαίδευση OLM σε διαφορετικές τοποθεσίες μαζί με τον υποκινητή Per1 στον νεαρό ιππόκαμπο (Εικ. 4c, κορυφή). Διαπιστώσαμε ότι η πληρότητα του HDAC3 στον υποκινητή Per1 μειώθηκε και στις τρεις τοποθεσίες που δοκιμάστηκαν μετά την εκπαίδευση OLM (Εικ. 4c, κάτω). Μαζί με το προηγούμενο εύρημα μας ότι η διαγραφή HDAC3 αποκαθιστά και τις δύο ακετυλώσεις σε Per1 και Per1 έκφραση mRNA (Εικ. 3), αυτό υποδηλώνει έντονα ότι το HDAC3 ρυθμίζει την έκφραση Per1 στον ραχιαίο ιππόκαμπο και η απορρύθμιση του HDAC3 μπορεί να συμβάλει σε βλάβες που σχετίζονται με την ηλικία στην έκφραση Per1 που προκαλείται από την εμπειρία. Ως εκ τούτου, το PER1 μπορεί να αποτελεί μέρος ενός βασικού μηχανισμού μέσω του οποίου η διαγραφή hdac3 βελτιώνει τις σχετιζόμενες με την ηλικία βλάβες στον ιππόκαμπο μακροπρόθεσμαμνήμηδιαμόρφωση.