Μέρος 1: Επίδραση της ακτεοσίδης ως προστατευτικού κυττάρων για την παραγωγή ενός κλωνοποιημένου σκύλου

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Division of Animal & Dairy Science, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Δημοκρατία της Κορέας,

2 Τμήμα Βιολογίας Εκπαίδευσης, Κολλέγιο Εκπαίδευσης,Εθνικό Πανεπιστήμιο Chonnam, Gwangju, Δημοκρατία της Κορέας

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

Αφηρημένη

Η πυρηνική μεταφορά σωματικών κυττάρων (SCNT) είναι μια πολύ γνωστή εργαστηριακή τεχνική. Η αρχή του SCNT περιλαμβάνει τον επαναπρογραμματισμό ενός σωματικού πυρήνα με έγχυση ενός σωματικού κυττάρου σε ένα ωοκύτταρο δέκτη του οποίου ο πυρήνας έχει αφαιρεθεί. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα δότες πυρήνα θεωρούνται κρίσιμος παράγοντας στο SCNT. Ο συγχρονισμός του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων δότη πυρήνα στο στάδιο G0/G1 μπορεί να προκληθεί με αναστολή επαφής ή λιμοκτονία στον ορό. Σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ,ακτεοσίδη, μια ένωση φαινυλοπροπανοειδούς γλυκοσιδίου, διερευνήθηκε για να προσδιοριστεί εάν είναι εφαρμόσιμη για την επαγωγή συγχρονισμού κυτταρικού κύκλου, κυτταροπροστασία και βελτίωση της αποτελεσματικότητας SCNT σε ινοβλάστες εμβρύου σκύλου. Οι πρωτογενείς εμβρυϊκοί ινοβλάστες σκύλου υποβλήθηκαν σε θεραπεία μεακτεοσίδη(10, 30, 50 μM) για διάφορες χρονικές περιόδους (24, 48 και 72 ώρες). Ο συγχρονισμός του κυτταρικού κύκλου στο στάδιο G0/G1 δεν διέφερε σημαντικά με τη μέθοδο επαγωγής:ακτεοσίδηθεραπεία, αναστολή επαφής ή λιμοκτονία ορού. Ωστόσο, από αυτές τις τρεις θεραπείες, η ασιτία στον ορό είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά αυξημένο επίπεδο ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) (99,5 ± 0,3 τοις εκατό) και απόπτωση. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν επίσης ότιακτεοσίδημειωμένες διεργασίες ROS και απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης της νέκρωσης σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες σκύλου και βελτιωμένη κυτταρική επιβίωση. Ινοβλάστες εμβρύου σκύλου που υποβάλλονται σε θεραπεία μεακτεοσίδησυνελήφθησαν με επιτυχία στο στάδιο G0/G1. Επιπλέον, τα ανακατασκευασμένα έμβρυα χρησιμοποιώντας κύτταρα δότη πυρήνων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ακτεοσίδη παρήγαγαν έναν υγιή κλωνοποιημένο σκύλο, αλλά όχι τα έμβρυα που παρήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα δότη πυρήνων που υποβλήθηκαν σε αναστολή επαφής. Συμπερασματικά,ακτεοσίδηΟ επαγόμενος συγχρονισμός του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων δότη πυρήνα θα ήταν μια εναλλακτική μέθοδος για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας του SCNT σκύλου λόγω των κυτταροπροστατευτικών του επιδράσεων.

Η ακτεοσίδη Cistanche μπορεί να ενισχύσει την ανοσία

Εισαγωγή

Η τεχνική SCNT έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή γενετικά ανώτερων ή χειραγωγούμενων ζώων για γεωργικούς σκοπούς και ως βιοϊατρικούς πόρους. Με την αυξανόμενη ανάγκη για ζωικά μοντέλα ασθενειών, διάσωση ζώων που κινδυνεύουν με εξαφάνιση, βλαστοκύτταρα για αναγεννητική ιατρική, μεταμόσχευση οργάνων κ.λπ., το ενδιαφέρον για κλωνοποίηση ζώων με χρήση SCNT έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια [1-5]. Παρόλο που η παραγωγή κλωνοποιημένων ζώων ήταν επιτυχής, η αποτελεσματικότητα του SCNT εξακολουθεί να είναι πολύ χαμηλή [6]. Τα αίτια της χαμηλής αναπτυξιακής ικανότητας του εμβρύου SCNT περιλαμβάνουν πολλούς παράγοντες που σχετίζονται με την ποιότητα των ωοκυττάρων-λήπτες, την ποιότητα των κυττάρων δότων πυρήνα και την κατάσταση της παρένθετης μητέρας [7-10].

Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και η απόπτωση είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε γυναικείες αναπαραγωγικές διαδικασίες συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης ωαρίων in vivo και in vitro [11-14]. Τα ROS διακόπτουν την ανάπτυξη των εμβρύων προκαλώντας κυτταροπλασματική συμπύκνωση, βλάβη του DNA και απόπτωση στα έμβρυα. Υποστηρικτικές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η μείωση του ROS βελτιώνει την ικανότητα ανάπτυξης εμβρύων SCNT κατά τη διάρκεια καλλιέργειας in vitro [15-17]. Η απόπτωση είναι μια φυσιολογική διαδικασία που συμβαίνει αυθόρμητα κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής προεμφυτευτικής ανάπτυξης εμβρύου για τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης αφαιρώντας κύτταρα που έχουν υποστεί βλάβη/δυσλειτουργία του DNA. Το ROS προκαλεί κατακερματισμό του DNA και αυξάνει τα αποπτωτικά βλαστομερή που διαταράσσουν την ανάπτυξη του εμβρύου. Το συμβάν ROS και απόπτωσης παρατηρείται πιο συχνά μετά από SCNT παρά μετά από εξωσωματική γονιμοποίηση [18, 19]. Πολλές μελέτες ανέφεραν ότι η ικανότητα ανάπτυξης εμβρύων SCNT διασώζεται με τη μείωση των επιπέδων του ROS και της απόπτωσης με τη χρήση αντιοξειδωτικών όπως το σελήνιο [20], η ινσουλίνη-τρανσφερίνη-σελήνιο [17, 21], η μελατονίνη [22] και η γλουταθειόνη [23].

Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι η χρήση κυττάρων δότη που διακόπηκαν στο στάδιο G{{0}}/G1 βελτίωσε την αποτελεσματικότητα του SCNT [7, 9, 24-28]. Η χρωματίνη στα κύτταρα δότες στο στάδιο G0/G1 έχει θεωρηθεί η πιο αποτελεσματική για την ικανότητα ανάπτυξης εμβρύων SCNT. Για τον συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου του δότη, έχουν χρησιμοποιηθεί συχνά η αναστολή επαφής, η πείνα στον ορό και οι χημικές θεραπείες [7, 25, 29, 30]. Ωστόσο, η πείνα στον ορό μείωσε την κυτταρική επιβίωση και αυξάνει τον κατακερματισμό του DNA, γεγονός που οδηγεί σε απόπτωση [31]. Η χημική αναστολή είναι μια άλλη στρατηγική για τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο στάδιο G0/G1 χρησιμοποιώντας αναστολείς όπως η ροσκοβιτίνη [29, 32], το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) [33] και το κυκλοεξιμίδιο (CHX) [34]. Η αποτελεσματικότητα της μεθόδου που χρησιμοποιείται για το συγχρονισμό επηρεάζεται από τους τύπους και τα είδη των κυττάρων δότη. Για βέλτιστο συγχρονισμό κυττάρων δότη, πρέπει να αξιολογηθούν προσεκτικά διάφορες πτυχές των μεθόδων που χρησιμοποιούνται.

Ακτεοσίδη(επίσης γνωστό ως βερμπασκοσίδη) [{{0}}(3, 4-διυδροξυ φαινυλαιθυλ)-1-OaL-ραμνοπυρανοσυλ-(1 / 3)-bD-({{13} Το }Ο-καφεοϋλο)-γλυκοπυρανοσίδιο] απομονώνεται από τα βιολετί άνθη του Syringa vulgaris. Τα φυτά που περιέχουν ακτεοσίδη είναι γνωστό ότι έχουν αντιμικροβιακή και αντιμυκητιακή δράση [35-37] και αποτρέπουν τη φλεγμονή. Πράγματι, η ακτεοσίδη εμφανίζει διάφορες βιολογικές δραστηριότητες in vitro και in vivo, όπως αντιοξειδωτική δράση, αντι-αποπτωτική δράση, κυτταροτοξικότητα έναντι διαφόρων καρκινικών κυττάρων και συγχρονισμό κυτταρικού κύκλου στο στάδιο G0/G1 ως εξαρτώμενο από κυκλίνη αναστολέας κινάσης (CDK) [38]. Για παράδειγμα οι Lee et al.[38] ανέφερε ότι η θεραπεία με ακτεοσίδη μπορεί να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων προμυελοκυτταρικών HL-60 κυττάρων λευχαιμίας προκαλώντας τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο στάδιο G0/G1. Ωστόσο, η επίδραση των κυττάρων δότη που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ακτεοσίδη στην αποτελεσματικότητα του SCNT σκύλου δεν έχει ακόμη μελετηθεί.

Σε αυτή τη μελέτη, οι επιπτώσεις τουακτεοσίδησχετικά με τον συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου, το ROS καιαπόπτωσησε εμβρυϊκούς ινοβλάστες σκύλου διερευνήθηκαν. Η ανάλυση του συγχρονισμού του κυτταρικού κύκλου, του ROS και της απόπτωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας ταξινόμηση κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό (FACS). Για να αποδειχθεί η αποτελεσματικότητα των κυττάρων δότη που υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ακτεοσίδη, τα έμβρυα SCNT καλλιεργήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε σκύλο λήπτη και παρήγαγαν με επιτυχία έναν υγιή κλωνοποιημένο σκύλο.

κιστανάκιμπορεί να θεραπεύσεινεφρόβελτίωση της νόσουνεφρώνλειτουργία

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση ηθικής

Σε αυτή τη μελέτη, 44 θηλυκά σκυλιά μιγάδες (ηλικίας 1-6 ετών) χρησιμοποιήθηκαν ως δότες ωαρίων και υποκατάστατα μεταφοράς εμβρύου και ένα θηλυκό λαγωνικό (ηλικίας 2 ετών) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία κυτταρικών σειρών εμβρυϊκών ινοβλαστών. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC) του Εθνικού Πανεπιστημίου Chungnam (Αριθμός έγκρισης: CNU-00487) και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τον "Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων" που δημοσιεύτηκε από το IACUC του Εθνικού Πανεπιστημίου Chungnam. Τα σκυλιά ανατράφηκαν σε εσωτερικούς χώρους σε χωριστά κλουβιά με σύστημα ελέγχου θερμοκρασίας και αερισμού. Οι σκύλοι τρέφονταν με εμπορική δίαιτα μία φορά την ημέρα και τους παρείχαν νερό κατά βούληση. Σε όλα τα πειράματα σε ζώα, οι σκύλοι αναισθητοποιήθηκαν με 6 mg/kg κεταμίνης και ξυλαζίνης αρχικά και διατηρήθηκαν σε αναισθητοποιημένη κατάσταση με 2 τοις εκατό ισοφλουράνιο. Στο τέλος του χειρουργείου, χορηγήθηκαν αντιβιοτικά (Προκαΐνη πενικιλλίνη G, βενζαθίνη πενικιλλίνη G και θειική διυδροστρεπτομυκίνη) για την πρόληψη οποιασδήποτε μόλυνσης. Μετά το χειρουργείο, τα σκυλιά μεταφέρθηκαν στα δικά τους κλουβιά με γλυκό νερό, παρακολουθήθηκαν και παρείχαν ειδική φροντίδα από τον υπεύθυνο κτηνίατρο, ώστε να μπορούν να χορηγηθούν οι απαραίτητες θεραπείες εάν τα ζώα το χρειάζονταν.

Χημικά

Όλα τα χημικά αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Το Acteoside ελήφθη από την Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. στην Κίνα.

Απομόνωση ινοβλαστών εμβρύου σκύλου

Οι ινοβλάστες εμβρύου σκύλου ελήφθησαν από {{0}}έμβρυα ημέρας. Εν συντομία, ένα θηλυκό λαγωνικό γονιμοποιήθηκε τεχνητά με το σπέρμα ενός αρσενικού λαγωνικού. Μετά από 28 ημέρες, επιβεβαιώθηκε η εγκυμοσύνη στο θηλυκό λαγωνικό και ελήφθησαν 5 έμβρυα με κοιλιοϋστερεκτομή. Τα έμβρυα πλύθηκαν τρεις φορές σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Το κεφάλι, τα εσωτερικά όργανα και τα άκρα των εμβρύων αφαιρέθηκαν με μια χειρουργική λεπίδα και τα υπόλοιπα μέρη του σώματος κομματιάστηκαν σε PBS. Τα τεμάχια των εμβρύων πλύθηκαν δύο φορές με φυγοκέντρηση στα 400 × για 5 λεπτά και καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco) συμπληρωμένο με 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (προϊόν Νο. P4458) και 20 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). στους 39 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 και 95 τοις εκατό αέρα. Όταν τα κύτταρα έφτασαν σε συρροή μετά από 5-7 ημέρες, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,25 τοις εκατό τρυψίνη-EDTA (Gibco) για 2 λεπτά και συλλέχθηκαν. Δημιουργήθηκαν δύο κυτταρικές σειρές εμβρυϊκών ινοβλαστών σκύλου από δύο μεμονωμένα έμβρυα. Τα κύτταρα καταψύχθηκαν σε 10 τοις εκατό DMSO σε FBS και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο σε -196 βαθμό μέχρι να χρησιμοποιηθούν.

Κυτταρική θεραπεία

Οι κατεψυγμένοι ινοβλάστες σκύλου αποψύχθηκαν και καλλιεργήθηκαν μέχρι 8{10}} τοις εκατό συρροής. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ανακαλύφθηκαν 4 έως 7 φορές για μετέπειτα πειράματα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε συγκέντρωση 106/mL σε δίσκους καλλιέργειας 60 mm. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε (1) DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη για πέντε ημέρες (αναστολή επαφής), (2) DMEM συμπληρωμένο με 0,5 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη για πέντε ημέρες (ασιτία ορού) , ή (3) DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη που περιέχει ακτεοσίδη στα 10 μΜ, 30 μΜ ή 50 μΜ για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες (θεραπεία με ακτεοσίδη).

Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής

Για ανάλυση των σταδίων του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας {{0}}.25 τοις εκατό τρυψίνη-EDTA και πλύθηκαν 3 φορές με PBS με φυγοκέντρηση. Μετά την τελευταία πλύση, τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 0,3 mL PBS. Για σταθεροποίηση, {{10}}.7 mL ψυχρής απόλυτης αιθανόλης προστέθηκαν στάγδην στο κυτταρικό εναιώρημα, αναμίχθηκαν με ήπιο στροβιλισμό και αποθηκεύτηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς . Τα σταθεροποιημένα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 0,25 mL PBS συμπληρωμένο με 5 μL 10 mg/mL RNase και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 βαθμούς. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 10 μL 1 mg/mL ιωδιούχου προπιδίου (PI). Ο κυτταρικός κύκλος αναλύθηκε με ποσοτικοποίηση της περιεκτικότητας σε DNA σε κυτταρικούς πληθυσμούς σε φάσεις G0/G1 (2n), S (μεταξύ 2n και 4n) και G2/M (4n) χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA , ΗΠΑ).

Ανίχνευση ROS με κυτταρομετρία ροής

Το ROS σε ζωντανά κύτταρα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Ανίχνευσης Ειδών Αντιδραστικού Οξυγόνου Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS μετά την αφαίρεση του μέσου καλλιέργειας και προστέθηκαν 2 mL του διαλύματος εργασίας 100 μM υδροϋπεροξειδίου του τριτ-βουτυλίου (TBHP). Μετά από επώαση στους 37 βαθμούς για 1 ώρα, το διάλυμα εργασίας TBHP αφαιρέθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν απαλά 3 φορές σε θερμό αλατούχο διάλυμα Dulbecco ρυθμισμένο με φωσφορικά (DPBS, Gibco). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε διάλυμα εργασίας 25 μΜ 5-(και{{-6)-καρβοξυ-2,7-διχλωροδιϋδρο-φθοροσκεΐνης διοξικής (carboxy-H2DCFDA) στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά στο σκοτάδι . Όταν οξειδώνεται, το καρβοξυ-H2DCFDA εκπέμπει πράσινο φθορισμό, διευκολύνοντας την αξιολόγηση των ROS με κυτταρομετρία ροής. Το TBHP, το οποίο είναι ένας επαγωγέας της παραγωγής ROS, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι πυρήνες των κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. Μετά από πλύση 3 φορές με PBS, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, εναιωρήθηκαν σε PBS και χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ROS χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Ο ρυθμός σχηματισμού ROS υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των θετικών ROS κυττάρων με τον συνολικό αριθμό κυττάρων και μετατρέποντας τις τιμές σε ποσοστά.

Ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

Η ανάλυση απόπτωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ δοκιμασίας απόπτωσης Vybran1 #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκαν 2 φορές με ψυχρό PBS. Στη συνέχεια, 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης 1×, 5 μL αννεξίνης V Alexa Fluor 488 και 1 μL PI προστέθηκαν στα κύτταρα. Μετά από επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκαν 400 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης 1 × και το κυτταρικό εναιώρημα αναμίχθηκε απαλά. Η αννεξίνη V, η οποία είναι μια εξαρτώμενη από Ca2 συν πρωτεΐνη που δεσμεύει τα φωσφολιπίδια, έχει υψηλή συγγένεια για τη φωσφατιδυλοσερίνη (PS). Στα ζωντανά κύτταρα, το PS βρίσκεται στην εσωτερική κυτταροπλασματική μεμβράνη και μετατοπίζεται στην εξωτερική κυτταροπλασματική μεμβράνη στα αποπτωτικά κύτταρα. Τα αποπτωτικά κύτταρα διακρίνονται από την αννεξίνη V επισημασμένη με Alexa Fluor 488 που συνδέεται με PS στην εξωτερική μεμβράνη. Επιπλέον, το PI, το οποίο είναι μια χρωστική που δεσμεύει το νουκλεϊκό οξύ, χρωματίζει τα νεκρωτικά κύτταρα με κόκκινο φθορισμό. Επομένως, αποπτωτικά κύτταρα με πράσινο φθορισμό, νεκρωτικά κύτταρα με κόκκινο φθορισμό και ζωντανά κύτταρα με μικρό ή καθόλου φθορισμό στα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Οι ρυθμοί υπολογίστηκαν διαιρώντας τους αριθμούς κυττάρων ζωντανών, νεκρωτικών ή αποπτωτικών κυττάρων με τον συνολικό αριθμό κυττάρων και μετατρέποντας τις υπολογιζόμενες τιμές σε ποσοστά.

Συλλογή in vivo ωριμασμένων ωοκυττάρων

Για την ανίχνευση της ωορρηξίας σε κάθε σκύλο, η συγκέντρωση της προγεστερόνης στον ορό (Ρ4) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ραδιοανοσοδοκιμασίας με επικαλυμμένο σωλήνα DSL{1}}ACTIVE προγεστερόνης (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39, 40], η ημέρα που η συγκέντρωση P4 υπερέβη τα 4 ng/mL θεωρήθηκε ως ημέρα ωορρηξίας. Στις 72 ώρες μετά την ωορρηξία, τα ωοκύτταρα ανακτήθηκαν με λαπαροτομία χρησιμοποιώντας άσηπτες χειρουργικές διαδικασίες. Οι κροσσοί του ωοαγωγού προσεγγίστηκαν μέσω της σχισμής του θυλακίου και διασωληνώθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανεστραμμένη φλάντζα χαλύβδινη βελόνα (διαμέτρου 18, 7,5 cm). Ένας ενδοφλέβιος (IV) καθετήρας 24 gauge (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Σεούλ, Κορέα) εισήχθη στον ισθμό του ωαγωγού κοντά στη μητροσωληνική συμβολή και μέσος 199 (Gibco) συμπληρωμένος με 1 τοις εκατό πενικιλλίνη-στρεπτομυ 5 τοις εκατό FBS εισήχθη στον ωαγωγό μέσω του IV καθετήρα. Τα ωάρια μεταφέρθηκαν αμέσως στο εργαστήριο. Συνολικά συλλέχθηκαν 316 ωοκύτταρα από 31 σκύλους.

Η πυρηνική μεταφορά σωματικών κυττάρων και η SCNT μεταφοράς εμβρύου πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Εν συντομία, για την απομάκρυνση των κυττάρων σωρευμένου όγκου από τα in vivo ώριμα ωοκύτταρα, τα σύμπλοκα σωρευμάτων-ωοκυττάρων (COC) μεταφέρθηκαν επανειλημμένα με πιπέτα σε 0,1 τοις εκατό υαλουρονιδάση. Το πρώτο πολικό σώμα και τα χρωμοσώματα μετάφασης-ΙΙ αφαιρέθηκαν με αναρρόφηση. Η εκπυρήνωση επιβεβαιώθηκε με χρώση με Hoechst 33342 (διςβενζιμίδιο). Οι ινοβλάστες εμβρύου σκύλου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 μΜ ακτεοσίδη για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με 0.25 τοις εκατό τρυψίνη-EDTA. Ένα μεμονωμένο κύτταρο, το οποίο έχει μια λεία κυτταρική μεμβράνη, μεταφέρθηκε στον περιβιλιτελικό χώρο κάθε εκπυρηνωμένου ωοκυττάρου. Τα δίστιχα ήταν εξισορροπημένο μέσο έγχυσης, το οποίο είναι 0.26 Μ μέσο μαννιτόλης που περιέχει 0.1 mM HEPES, 0.5 mM MgSO4 και 0,05 τοις εκατό BSA, και συντήκεται με δύο παλμούς συνεχούς ρεύματος (69–75 V για 15 μs) από μια συσκευή Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japan). Αυτά τα δίστιχα επωάστηκαν σε μέσο 199 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS για 1 ώρα και 30 λεπτά. Τα συντηγμένα έμβρυα SCNT ελέγχθηκαν και προκλήθηκε χημική ενεργοποίηση επωάζοντάς τα σε ιονοφόρο ασβεστίου 10 μM (προϊόν Νο. C7522, Sigma) για 4 λεπτά. Τα έμβρυα SCNT πλύθηκαν και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα τροποποιημένο συνθετικό ωοθηκικό υγρό μέσο (mSOF) [41] που περιείχε 1,9 mM 6-διμεθυλαμινοπουρίνης (6-DMAP) για 3 ώρες και 30 λεπτά. Τα κατασκευασμένα έμβρυα μεταφέρθηκαν χειρουργικά στους ωαγωγούς των συγχρονισμένων με οίστρο παρένθετων εντός 4 ωρών μετά την SCNT. Η εγκυμοσύνη επιβεβαιώθηκε με υπερηχογράφημα στις 26 ημέρες (το νωρίτερο) μετά την εμβρυομεταφορά.

ενεργό συστατικόακτεοσίδησεκιστανάκι

In vitro καλλιέργεια κλωνοποιημένων εμβρύων

Μετά το SCNT, τα κλωνοποιημένα έμβρυα καλλιεργήθηκαν σε μικροσταγόνες 40 μL ενός τροποποιημένου συνθετικού ωοθηκικού υγρού μέσου (mSOF) (10 κλωνοποιημένα έμβρυα ανά μικροσταγόνα) επικαλυμμένο με ορυκτέλαιο στους 38,5 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2 και 95 τοις εκατό αέρα. Η ανάπτυξη εμβρύου SCNT παρατηρήθηκε από την ημέρα 2 έως την ημέρα 8.

Ανάλυση μικροδορυφόρου και μιτοχονδριακού DNA ενός κλωνοποιημένου σκύλου

Το συνολικό DNA εξήχθη από τα πυρηνικά κύτταρα δότες και το δέρμα των σκύλων-δότες ωαρίων, των υποκατάστατων σκύλων και του κλωνοποιημένου σκύλου με το κιτ εξαγωγής γονιδιωματικού DNA G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Κορέα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και στη συνέχεια εκλούστηκε σε 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος ΤΕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Η ποσότητα του DNA μετρήθηκε με το φασματοφωτόμετρο BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Ιαπωνία).

Για μικροδορυφορικό γονότυπο επιλέχθηκαν τα ακόλουθα 7 ειδικά γονίδια: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 και FH2079. Η PCR πραγματοποιήθηκε με αρχική μετουσίωση για 10 λεπτά στους 95 βαθμούς, 20 κύκλους που αποτελούνταν από μετουσίωση για 30 δευτερόλεπτα στους 95 βαθμούς, 30 δευτερόλεπτα ανόπτηση στους 58 βαθμούς (-0.1 βαθμό /κύκλος), 1 λεπτό επέκταση σε 72 μοίρες και 15 ακόμη κύκλοι που αποτελούνταν από μετουσίωση για 30 δευτερόλεπτα στους 95 βαθμούς, 30 δευτερόλεπτα ανόπτηση στους 56 βαθμούς, 1 λεπτό επέκταση σε 72 μοίρες και τελική επέκταση στους 72 βαθμούς για 10 λεπτά.

Για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του μιτοχονδριακού DNA, χρησιμοποιώντας τις πλήρεις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του mtDNA σκύλου (GenBank αρ. πρόσβασης: U96639), συντέθηκαν οι ακόλουθοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές: Περιοχή κυτοχρώματος b (L14,252 -L14,631) F: ACTCCCGATTAGTGTT; Υπομονάδα II οξειδάσης κυτοχρώματος c (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Περιοχή βρόχου D (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Οι κύκλοι PCR για αυτήν την ανάλυση περιελάμβαναν: αρχικές μετουσώσεις 95 μοιρών για 5 λεπτά, 5 κύκλους μετουσίωσης για 30 δευτερόλεπτα στους 95 βαθμούς, 40 δευτερόλεπτα ανόπτησης στους 60 βαθμούς (-1 μοίρες/κύκλο), 1 λεπτό επέκτασης σε 72 μοίρες και τους επόμενους 30 κύκλους μετουσίωσης για 30 δευτερόλεπτα στους 95 βαθμούς, 40 δευτερόλεπτα ανόπτησης στους 55 βαθμούς, 1 λεπτό επέκτασης στους 72 βαθμούς και τελική επέκταση στους 72 βαθμούς για 10 λεπτά. Θραύσματα PCR από τα διάφορα πειράματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν ΑΒΙ Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., USA). Η συναρμολόγηση αλληλουχίας, οι πολλαπλές ευθυγραμμίσεις και η περικοπή ευθυγράμμισης για τις περιοχές ελέγχου πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό BioEdit (v.7.0.5.3).

ακτεοσίδησεκιστανάκιμπορεί να ενισχύσει το ανοσοποιητικό σύστημα