Μέρος 1: Η εχινακοσίδη αναστέλλει την απελευθέρωση γλουταμινικού άλατος καταστέλλοντας το εξαρτώμενο από τάση Ca2 συν την είσοδο και την κινάση πρωτεΐνης C στα άκρα των εγκεφαλοφλοιωδών νεύρων αρουραίου
Mar 05, 2022
Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 και Su Jane Wang 3,*
Αφηρημένη:
Το γλουταμινεργικό σύστημα μπορεί να εμπλέκεται στα αποτελέσματα των νευροπροστατευτικών θεραπειών.Εχινακοσίδη, ένα φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που εξάγεται από το φαρμακευτικό κινέζικο βότανοHerba Cistanche, έχει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα. Αυτή η μελέτη διερεύνησε τις επιπτώσεις τουεχινακοσίδησχετικά με την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη σε τερματικά εγκεφαλοφλοιώδη νεύρα αρουραίου (συναπτοσώματα). Η εχινακοσίδη ανέστειλε την εξαρτώμενη από το Ca2 συν, αλλά όχι την ανεξάρτητη από το Ca2 συν, 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση. Η εχινακοσίδη μείωσε επίσης την 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη αύξηση στη συγκέντρωση του ελεύθερου κυτταροπλασματικού Ca2 συν, αλλά δεν άλλαξε το δυναμικό της συναπτοσωμικής μεμβράνης. Η ανασταλτική επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{12}αμινοπυριδίνη αποτράπηκε από την ο-κωνοτοξίνη MVIIC, έναν αποκλειστή ευρέως φάσματος των καναλιών Cav2.2 (τύπου N) και Cav2.1 (τύπου P/Q) , αλλά δεν είχε ευαισθησία στους ενδοκυτταρικούς αναστολείς απελευθέρωσης Ca2 συν δαντρολένιο και 7-χλωρο-5-(2-χλωροφαινυλ)-1,5-διυδρο-4 ,1-βενζοδιαζεπίνη-2(3Η)-όνη (CGP37157). Επιπλέον, η εχινακοσίδη μείωσε την 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης C και οι αναστολείς της πρωτεϊνικής κινάσης C κατάργησαν την επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, προτείνουμε ότι η ανασταλτική επίδραση της εχινακοσίδης στην προκαλούμενη απελευθέρωση γλουταμικού σχετίζεται με μειωμένη εξαρτώμενη από την τάση είσοδο Ca2 συν και επακόλουθη καταστολή της δραστηριότητας της πρωτεϊνικής κινάσης C.
Λέξεις-κλειδιά:εχινακοσίδη; απελευθέρωση γλουταμικού? εγκεφαλοφλοιώδη νευρικά τερματικά? εξαρτώμενα από την τάση κανάλια Ca2 plus. πρωτεϊνική κινάση C
1. Εισαγωγή
Εχινακοσίδηείναι ένα κύριο φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο που υπάρχει σεHerbaCistanche, μια πολύ γνωστή παραδοσιακή κινεζική ιατρική που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της λήθης, της ανικανότητας και της χρόνιας δυσκοιλιότητας [1].Εχινακοσίδηέχει διάφορες βιοδραστηριότητες όπως αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης, αντικαρκινική, ηπατοπροστασία και ανοσολογική ρύθμιση [2-4]. Συγκεκριμένα, η εχινακοσίδη έχει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα. για παράδειγμα, μπορεί να προστατεύσει από τη νευροτοξικότητα που προκαλείται από οξειδωτικό στρες ή νευροτοξίνες σε πρωτογενείς φλοιώδεις νευρώνες αρουραίου, κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος SH-SY5Y και κύτταρα φαιοχρωμοκυτώματος (PC12) [5-8]. Επιπλέον, η εχινακοσίδη μετριάζει την εγκεφαλική βλάβη και βελτιώνει τη γνωστική λειτουργία σε ζωικά μοντέλα της νόσου του Πάρκινσον, της νόσου του Αλτσχάιμερ και της απόφραξης της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας [9-12]. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίουεχινακοσίδηπροκαλεί νευροπροστασία δεν είναι πλήρως κατανοητή.
Η νευροπροστασία είναι μια πολύπλοκη διαδικασία διατήρησης της νευρωνικής δομής και λειτουργίας σε τοξικές προσβολές. Η μείωση της διεγερτοτοξικότητας του γλουταμικού θεωρείται ένας πιθανός μηχανισμός που εμπλέκεται στη νευροπροστασία του εγκεφάλου. Το γλουταμικό, ένας διεγερτικός νευροδιαβιβαστής αμινοξέων, έχει κρίσιμο ρόλο σε αρκετές εγκεφαλικές λειτουργίες [13]. Ωστόσο, η υπερενεργοποίηση των υποδοχέων γλουταμικού κάτω από υψηλές συγκεντρώσεις γλουταμικού προκαλεί ενδοκυτταρικό Ca2 συν υπερφόρτωση, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, παραγωγή ελεύθερων ριζών και νευρωνικό θάνατο [14,15]. Αυτή η παθολογική διαδικασία εμπλέκεται σε πολυάριθμες εγκεφαλικές διαταραχές, όπως η εγκεφαλική ισχαιμία, η τραυματική εγκεφαλική βλάβη, η επιληψία και η νευροεκφυλιστική νόσος [16,17]. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς που εμποδίζουν την παθοφυσιολογική γλουταμινεργική μετάδοση θεωρούνται πιθανά νευροπροστατευτικά φάρμακα. Αξιοσημείωτα παραδείγματα αυτών είναι οι ανταγωνιστές υποδοχέα γλουταμικού [18,19]. Ωστόσο, οι κλινικές δοκιμές για αυτά τα φάρμακα απέτυχαν λόγω μικρότερης αποτελεσματικότητας και ανεπιθύμητων ή ακόμα και κυτταροτοξικών παρενεργειών [20,21]. Εκτός από τον άμεσο αποκλεισμό των υποδοχέων γλουταμικού, η αναστολή απελευθέρωσης γλουταμικού μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για νευροπροστασία. Αρκετά νευροπροστατευτικά (π.χ. μεμαντίνη και ριλουζόλη) μπορούν να μειώσουν την απελευθέρωση γλουταμικού στους ιστούς του εγκεφάλου του αρουραίου [22-24].
Λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο του γλουταμικού στην διεγερτική τοξικότητα και το νευροπροστατευτικό προφίλ της εχινακοσίδης, η παρούσα μελέτη χρησιμοποίησε απομονωμένα νευρικά τερματικά (συναπτοσώματα) που καθαρίστηκαν από τον εγκεφαλικό φλοιό του αρουραίου για να διερευνήσει την επίδραση του εχινακοσίδη στην απελευθέρωση γλουταμικού και διερεύνησε περαιτέρω πιθανούς μηχανισμούς. Το παρασκεύασμα απομονωμένου τερματικού νεύρου είναι ένα καθιερωμένο μοντέλο για τη μελέτη της προσυναπτικής ρύθμισης της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών από τα φάρμακα απουσία οποιωνδήποτε μετασυναπτικών επιδράσεων [25]. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, αξιολογήσαμε την επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού, το δυναμικό της μεμβράνης, την προσυναπτική εισροή Ca2 συν και τη δραστηριότητα πρωτεϊνικής κινάσης C. Σύμφωνα με την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που τεκμηριώνει τον μηχανισμό μέσω του οποίου η εχινακοσίδη αναστέλλει την ενδογενή απελευθέρωση γλουταμικού σε προσυναπτικό επίπεδο.
2. Αποτελέσματα
2.1. ΕχινακοσίδηΑναστέλλει την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την αμινοπυριδίνη από τα εγκεφαλοφλοιώδη νευρικά άκρα αρουραίου μειώνοντας την φυσαλιδώδη εξωκυττάρωση
Το Σχήμα 1 απεικονίζει την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{2}αμινοπυριδίνη από καθαρισμένα συναπτοσωμάτια εγκεφαλοφλοιώδους αρουραίου. Σε συναπτοσώματα που επωάστηκαν με 1 mM CaCl2, 1 mM 4-αμινοπυριδίνης προκάλεσε απελευθέρωση γλουταμικού 7,4 ± {{1{{20}}}}.1 nmol/mg/5 min, η οποία μειώθηκε κατά 1, 5, 10, 30 και 50 uM εχινακοσίδη σε 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,
4.1 ± 0.1 ή 2.3 ± 0.4 nmol/mg/5 min, αντίστοιχα (F(5,24)=67.1, p=0. 000). Η τιμή IC50 για την προκαλούμενη από εχινακοσίδη αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη, που προέρχεται από μια καμπύλη δόσης-απόκρισης, ήταν 24 μΜ. Επιπλέον, η απελευθέρωση γλουταμικού προκαλείται από 1 mM 4-αμινοπυριδίνης σε ένα εξωκυτταρικό διάλυμα χωρίς Ca2 συν που περιέχει 300 μΜ αιθυλενογλυκόλης δις(-αμινοαιθυλαιθέρας)-Ν,Ν,Ν/,Ν/-τετραοξικό οξύ (EGTA) ήταν 2.1 0.2 nmol/mg/5 λεπτά (F(2,12)=310.65, p=0.000),
και αυτό το ανεξάρτητο από Ca2 συν συστατικό της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη δεν επηρεάστηκε από 20 uM εχινακοσίδη (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 λεπτά· p {{1 0}}.58· Εικόνα 1). Σε συναπτοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0 5 λεπτά, F (2,12)=249.518, p=0.000). Παρουσία βαφιλομυκίνης Α1, 20 uM εχινακοσίδη απέτυχε να αναστείλει σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min· p=0,94· Εικόνα 1). Αντίθετα, 10 μΜ DL-θρεο-βήτα-βενζυλ-οξυασπαρτικό (DL-TBOA, ένας αναστολέας επαναπρόσληψης γλουταμικού) [27], αύξησε την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{47}αμινοπυριδίνη σε 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, p=0.000). Ακόμη και παρουσία DL-TBOA, η εχινακοσίδη 20 μΜ ανέστειλε την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την αμινοπυριδίνη σημαντικά (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min, F(2,12)=87.23, p=0.000· Εικόνα 1).
2.2 Η εχινακοσίδη Μειώνει τη Συγκέντρωση του Κυτοσολικού Ca2, αλλά δεν αλλάζει το Δυναμικό της Συναπτοσωμικής Μεμβράνης
Η εκπόλωση των συναπτοσωμάτων που προκαλείται από 1 mM 4-αμινοπυριδίνη αύξησε τη συγκέντρωση Ca2 συν (ρ=0.000· Πίνακας 1). Η εφαρμογή εχινακοσίδης 20 μΜ δεν επηρέασε σημαντικά τη βασική συγκέντρωση Ca2 συν (t(8)=0.06, p=0.95) αλλά μείωσε σημαντικά την αύξηση που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη σε Ca2 συν συγκέντρωση (t(10)=6.16, p=0.000). Επιπλέον, 1 mM 4-αμινοπυριδίνης αυξήθηκε σε φθορισμό ιωδιούχου 3',3',3'-διπροπυλθειαδικαρβοκυανίνης [DiSC3(5)] (ρ=0.000). Η προσθήκη 20 μΜ εχινακοσίδης δεν άλλαξε το δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης (t(8)=0.976, p=0.36) ούτε άλλαξε σημαντικά την αύξηση που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη στο DiSC3 (5) φθορισμός (t(8)=-0.014, p=0.99· Πίνακας 1).
2.3 Μειωμένη εισροή Ca2 συν εισροή μέσω των καναλιών Cav2.2 (N-Type) και Cav2.1 (P/Q-Type) μπορεί να συσχετιστεί με την αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη από την Echinacoside
Το Σχήμα 2 δείχνει ότι 2 μΜ ο-κωνοτοξίνης MVIIC, ένας αναστολέας διαύλων Ca2 συν τύπου N- και P/Q, μείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη από 7,4 ± {{10}}. 2 έως 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 λεπτά (t(9)=25.35, p=0.000). Παρουσία ο-κωνοτοξίνης MVIIC, η επίδραση 20 μΜ εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{24}αμινοπυριδίνη ήταν μη σημαντική (1.8 2± συν 0,2 nmol/mg/5 λεπτά· t(8)=1.06,p=0.32). Dantrolene (10 uM), ένας αναστολέας της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης Ca από το ενδοπλασματικό
δίκτυο [28], μειωμένη 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 λεπτά· F(2,14) {{10}}. 95, σ=0.000). Ωστόσο, παρουσία δαντρολενίου, η εχινακοσίδη 20 μΜ θα μπορούσε ακόμα να αναστείλει σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 λεπτά, p=0.000). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας 100 uM 7-χλωρο-5-(2-χλωροφαινυλ)-1,5-διυδρο-4,1-βενζοθειαζεπίνη -2(3Η)-όνη (CGP37157), ένας διαπερατός από τη μεμβράνη αναστολέας της ανταλλαγής μιτοχονδριακού Na συν /Ca2 συν. Στα πέντε συναπτοσωμικά σκευάσματα που εξετάστηκαν, 20 μΜ εχινακοσίδης σε συνδυασμό με 100 μΜ CGP37157 μείωσαν την απελευθέρωση γλουταμικού που προκάλεσε 4-αμινοπυριδίνη κατά 48,3 τοις εκατό ± 5,2 τοις εκατό (F(2,13) {{47} {{79,79, 49}}.000), παρόμοια με την αναστολή μόνο με εχινακοσίδη (46,2 τοις εκατό ± 2,3 τοις εκατό, ρ=0,89· Εικόνα 2).
2.4 ΕχινακοσίδηΑναστέλλει την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την αμινοπυριδίνη μέσω σηματοδότησης μέσω της πρωτεϊνικής κινάσης C
Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 3, 10 uM 2-[1-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)ινδολ-3-υλ]-3-(ινδολ-3-υλ) μαλεϊμίδιο (GF109203X), ένας γενικός αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης C [29], μείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την {{10}αμινοπυριδίνη (F(2,13) = 19.46, p=0.{{17} }}). Στα συναπτοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με GF109203X, η εχινακοσίδη 20 μΜ μείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού 4-που προκαλείται από αμινοπυριδίνη μόνο κατά 5,5 τοις εκατό ± 1,8 τοις εκατό (ρ=0,89), λιγότερο από αυτό μόνο από την εχινακοσίδη (42,4 τοις εκατό ± 2). τοις εκατό ; p=0.000). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με 5,6,7,13-τετραϋδρο-13-μεθυλ-5-οξο-12Η-ινδολο[2,3-a]πυρρολο[3 ,4-c]καρβαζόλη-12-προπανιτρίλιο (Go6976), ένα εκλεκτικό για ισόμορφες εξαρτώμενες από Ca2 συν πρωτεϊνική κινάση C (, I, II, y) [29]. Παρουσία 3 μΜ Go6976, 20 μΜ εχινακοσίδης μείωσε την απελευθέρωση γλουταμικού κατά 11,9 τοις εκατό ± 2,9 τοις εκατό (ρ=0 .59), που σημαίνει σημαντική μείωση σε σύγκριση με αυτήν μόνο από την εχινακοσίδη (42,4 τοις εκατό 2,3 τοις εκατό, p {{{ 65}}.000· Εικόνα 3). Αντίθετα, 3 μΜ ροττερίνης, ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης C6 ανεξάρτητος από Ca2 συν [30], δεν άλλαξε σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την 4-αμινοπυριδίνη (1 mM) (ρ=0.45). Παρόλα αυτά, παρουσία ροττερίνης, 20 μΜ εχινακοσίδης προκάλεσε αποτελεσματικά μια μέση αναστολή 37,1 τοις εκατό ± 5,6 τοις εκατό της απελευθέρωσης (F(2,13) = 19.72, p=0.{{88 }}), παρόμοιο με αυτό μόνο από την εχινακοσίδη (ρ=0.41· Εικόνα 3). Επιπλέον, ο ενεργοποιημένος από μιτογόνο αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης 2-(2-αμινο-3-μεθοξυφαινυλ)-4H-1-βενζοπυράνη-4-one) (PD98059 ) (50 μΜ) και ο αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης Α Ν-[2-(ρ-βρωμοκινναμυλαμινο)αιθυλ]-5-ισοκινολινοσουλφοναμίδιο (Η89) (100 μΜ) μείωσαν την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την αμινοπυριδίνη (σ=0.000). Ακόμη και παρουσία του PD98059 ή του H89, 20 μΜ εχινακοσίδης μείωσε αποτελεσματικά την απελευθέρωση (F(2,13) = 52.3, p=0.000· Εικόνα 3).
Το Σχήμα 4 δείχνει ότι 1 mM 4-αμινοπυριδίνης αύξησε τη φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης C σε συναπτοσώματα (t(4)=-6.871, p=0.002). Όταν τα συναπτοσώματα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 20 uM εχινακοσίδη για 10 λεπτά πριν από την προσθήκη 4-αμινοπυριδίνης, η φωσφορυλίωση της πρωτεϊνικής κινάσης C που προκάλεσε η 4-αμινοπυριδίνη μειώθηκε σημαντικά (F(2,6)=29.202 , σ=0.001).
2.5 Αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμινικού οξέος με τη μεσολάβηση εχινακοσίδης δεν περιλαμβάνει υποδοχέα γάμμα-αμινοβουτυρικού οξέος τύπου Α (GABAA)
Στο Σχήμα 5, συγκρίθηκε η επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{1}αμινοπυριδίνη απουσία ή παρουσία του SR95531 (ανταγωνιστή του υποδοχέα GABAA). Επιπλέον, 100 uM SR95531 δεν άλλαξε σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη (1 mM). Στα συναπτοσώματα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με SR95531-, η εφαρμογή 20 μΜ εχινακοσίδης είχε ως αποτέλεσμα 43 τοις εκατό αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από την 4-αμινοπυριδίνη (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), η οποία δεν διέφερε σημαντικά από την αναστολή που παράγεται μόνο από την εχινακοσίδη (40 τοις εκατό, p=0.000). Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα λήφθηκε με έναν άλλο ανταγωνιστή υποδοχέα GABAA, τη μπικουκουλίνη (50 μΜ). Η απελευθέρωση που μετρήθηκε παρουσία μπικουκουλίνης και εχινακοσίδης ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη που ελήφθη παρουσία μόνο δικουκουλίνης (ρ=0.000).
3. Συζήτηση
Σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ,εχινακοσίδη, μια δραστική ένωση στο HerbaCistanche, ανέστειλε 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού στα άκρα των νεύρων του εγκεφαλικού φλοιού αρουραίου. Οι πιθανοί υποκείμενοι μηχανισμοί για τηνεχινακοσίδη- η μεσολαβούμενη αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού διερευνάται περαιτέρω και συζητείται εδώ.
3.1 Μηχανισμοί που υποκρύπτουν την αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμινικού οξέος με τη μεσολάβηση της εχινακοσίδης
Η απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από την 4-αμινοπυριδίνη περιλαμβάνει δύο συστατικά: ένα φυσιολογικά σχετικό συστατικό που εξαρτάται από το Ca2 συν, το οποίο παράγεται μέσω εξωκυττάρωσης συναπτικών κυστιδίων που περιέχουν γλουταμικό. και ένα συστατικό ανεξάρτητο από το Ca2 plus, το οποίο προέρχεται από παρατεταμένη εκπόλωση που προκαλεί μια μετατόπιση της σταθερής κατάστασης του μεταφορέα γλουταμικού που προκαλείται από το δυναμικό της μεμβράνης προς την έξω κατεύθυνση, επηρεάζοντας έτσι την εκροή γλουταμικού κυτταροζολίου [31]. Εδώ, παρατηρήσαμε ότι η εχινακοσίδη δεν ανέστειλε σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{8}αμινοπυριδίνη παρουσία ενός μέσου ελεύθερου Ca2 συν (απελευθέρωση ανεξάρτητη από Ca2 συν). Επιπλέον, η παρατηρούμενη αναστολή της προκαλούμενης από {{15}αμινοπυριδίνη απελευθέρωση γλουταμικού παρεμποδίστηκε αποτελεσματικά από τη βαφιλομυκίνη Α1 (η οποία εξαντλεί την περιεκτικότητα σε γλουταμικό στα συναπτικά κυστίδια), αλλά όχι από το DL-TBOA (το οποίο είναι μη εκλεκτικά αμινοξύ υποτύποι μεταφορέων). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η εχινακοσίδη επηρεάζει την εξαρτώμενη από το Ca2 συν εξωκυττάρωση της απελευθέρωσης γλουταμικού χωρίς να επηρεάζει την ανεξάρτητη από το Ca2 συν κυτοσολική εκροή γλουταμικού μέσω της αναστροφής του μεταφορέα γλουταμικού μεμβράνης του νεύρου. Στα συναπτικά τερματικά, η αναστολή του καναλιού Na + ή η ενεργοποίηση του καναλιού K + σταθεροποιεί τη διεγερσιμότητα της μεμβράνης και κατά συνέπεια μείωσε την προκληθείσα είσοδο Ca2 συν και την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστή [32,33]. Επομένως, ο δυνητικός μηχανισμός που βασίζεται στην αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού με μεσολάβηση εχινακοσίδης περιλαμβάνει μείωση της συναπτοσωμικής διεγερσιμότητας. Ωστόσο, αυτή η πιθανότητα είναι αβάσιμη με βάση δύο παρατηρήσεις: (1) 4-αποπόλωση δυναμικού μεμβράνης που προκαλείται από αμινοπυριδίνη, που μετρήθηκε με την ευαίσθητη στο δυναμικό της μεμβράνης βαφή DiSC3(5) δεν επηρεάστηκε από την προσθήκη εχινακοσίδης. και (2) η εχινακοσίδη δεν επηρέασε την 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη απελευθέρωση Ca2 συν το γλουταμινικό, ένα συστατικό απελευθέρωσης που εξαρτάται μόνο από το δυναμικό της μεμβράνης [31]. Εάν το αποτέλεσμα δεν προκαλείται από καταστολή της συναπτοσωμικής διεγερσιμότητας, μπορεί να εκδηλωθεί μέσω μείωσης της δραστηριότητας των καναλιών Cav2.2 (τύπου N) και Cav2.1 (τύπου P/Q) Ca2 plus σε συνδυασμό με εξωκυττάρωση γλουταμικού στην νευρικά τερματικά [34-36]. Χρησιμοποιώντας fura-2, αποδεικνύουμε ότι η εχινακοσίδη μειώνει σημαντικά την 4-προκαλούμενη από την αμινοπυριδίνη αύξηση στη συγκέντρωση Ca2 συν. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ανασταλτική επίδραση της εχινακοσίδης στην απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από {{51}αμινοπυριδίνη μειώθηκε από 42,4 τοις εκατό 2,3 τοις εκατό σε 12,1 τοις εκατό 3,9 τοις εκατό μετά την έκθεση σε έναν αναστολέα του Cav2.2 (τύπου Ν) και του Cav2 .1 (τύπου P/Q) κανάλια Ca2 plus. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η εχινακοσίδη συνέχισε να αναστέλλει σημαντικά την απελευθέρωση γλουταμικού που προκαλείται από 4-αμινοπυριδίνη παρουσία ενδοκυτταρικών αναστολέων απελευθέρωσης Ca2 συν. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ταυτόχρονη καταστολή της δραστηριότητας του καναλιού Cav2.2 (τύπου Ν) και Cav2.1 (τύπου P/Q) Ca2 συν είναι ο δυνητικός μηχανισμός που βασίζεται στην αναστολή απελευθέρωσης γλουταμικού που προκαλείται από εχινακοσίδη. Ωστόσο, η συνδυασμένη ενεργοποίηση του Cav2.2 (τύπου Ν) και του Cav2.1 (τύπου P/Q) Ca2 συν δραστηριότητα καναλιού δεν μπόρεσε να εμποδίσει πλήρως τη δράση της εχινακοσίδης. Ως εκ τούτου, άλλοι μη ταυτοποιημένοι τύποι διαύλων Ca2 plus ή άλλα προσυναπτικά μονοπάτια μπορεί να εμπλέκονται στην αναστολή. Για παράδειγμα, οι υποδοχείς GABAA είναι παρόντες σε προσυναπτικό επίπεδο και η ενεργοποίησή τους έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την εισροή Ca2 συν και την απελευθέρωση γλουταμικού [37]. Στην παρούσα μελέτη, οι ανταγωνιστές του υποδοχέα GABAA SR95531 και η μπικουκουλίνη δεν εμπόδισαν την αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού με μεσολάβηση εχινακοσίδης, υποδηλώνοντας ότι οι υποδοχείς GABAA δεν εμπλέκονται στη μείωση της εξαρτώμενης από την τάση δραστηριότητας διαύλου Ca2 συν και στην επακόλουθη αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού. Η είσοδος Ca2 plus μέσω εξαρτώμενων από την τάση καναλιών Ca2 plus ενεργοποιεί αρκετές πρωτεϊνικές κινάσες που σχετίζονται με την απελευθέρωση γλουταμικού στα νευρικά τερματικά, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης, της πρωτεΐνης κινάσης C και της πρωτεϊνικής κινάσης Α. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι οι αναστολείς πρωτεϊνικής κινάσης C ανταγωνίζονται αποτελεσματικά την εχινακοσίδη -διαμεσολαβούμενη αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού. Ωστόσο, ο ενεργοποιημένος από μιτογόνο αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης PD98059 ή ο αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης Α Η89 ήταν αναποτελεσματικός. Επιπλέον, η 4-προκαλούμενη από αμινοπυριδίνη φωσφορυλίωση της κινάσης πρωτεΐνης C μειώθηκε στα συναπτοσώματα μετά από προεπεξεργασία με εχινακοσίδη σε συγκέντρωση αποτελεσματική για την αναστολή της απελευθέρωσης γλουταμικού. Επομένως, η οδός σηματοδότησης της αναστολής απελευθέρωσης γλουταμικού με τη μεσολάβηση της εχινακοσίδης μπορεί να περιλαμβάνει πρωτεϊνική κινάση C. Η πρωτεϊνική κινάση C είναι ένα σημαντικό ενδοκυτταρικό σύστημα σηματοδότησης που υπάρχει σε προσυναπτικό επίπεδο και έχει κρίσιμο ρόλο στην εξωκυττάρωση νευροδιαβιβαστών. Για παράδειγμα, αρκετές συναπτικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διακίνηση συναπτικών κυστιδίων ή στη στρατολόγηση και στην εξωκυττάρωση, όπως το μυριστοϋλιωμένο υπόστρωμα C κινάσης πλούσιο σε αλανίνη, φωσφορυλιώνονται από την πρωτεϊνική κινάση C [38,39]. Αυτή η διαδικασία φωσφορυλίωσης μπορεί να αυξηθεί με διεγερμένη από την αποπόλωση είσοδο Ca2 συν, η οποία διευκολύνει την απελευθέρωση γλουταμικού [40]. Ως εκ τούτου, μπορούμε εύλογα να υποθέσουμε ότι η ανασταλτική επίδραση της εχινακοσίδης στην είσοδο Ca2 συν που παρατηρείται εδώ μπορεί να μειώσει τη δραστηριότητα της πρωτεϊνικής κινάσης C και κατά συνέπεια την απελευθέρωση γλουταμικού.
