για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2

Yasaman Alaghbanda, b,c, Janine L. Kwapisa, b,d, Alberto J. Lópeza, b,c, André O. Whitea, b,c,3, Osasumwen V. Aimiuwua, b,c,1, Amni Al- Kachaka,b,c,2, Kasuni K. Bodinayakea,b,c,

Nicole C. Oparaugoa, b,c, Richard Danga, b,d, Mariam Astarabadia, b,c,4, Dina P. Matheosa, b, και Marcelo A. Wooda, b,c,d

a301 Qureshey Research Lab, Τμήμα Νευροβιολογίας και Συμπεριφοράς, Κέντρο για το

Νευροβιολογία της Μάθησης καιΜνήμη, University of California, Irvine, Irvine, California, 92697 κέντρα για τη Νευροβιολογία της Μάθησης καιΜνήμη(CNLM), Irvine, Καλιφόρνια, 92697 c

Irvine Center for Addiction Neuroscience (ICAN), University of California, Irvine, California, 92697d Institute forΜνήμηΒλάβες και Νευρολογικές Διαταραχές, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Irvine,

Κάντε κλικ στοΟφέλη και παρενέργειες του Cistanche tubulosa για τη βελτίωση της μνήμης

Αφηρημένη

Οι αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs) είναι ένζυμα που τροποποιούν τη χρωματίνη που έχουν εμπλακεί ως ισχυροί αρνητικοί ρυθμιστές τηςμνήμηδιαδικασίες. Το HDAC3 έχει αποδειχθεί ότι παίζει καθοριστικό ρόλο στη μακροπρόθεσμη μνήμη για τον εντοπισμό αντικειμένων καθώς και στην εξαφάνιση της κοκαΐνηςμνήμη, αλλά δεν είναι σαφές εάν αυτή η λειτουργία εξαρτάται από την περιοχή αποακετυλάσης τουHDAC3. Εδώ, δοκιμάσαμε εάν ο τομέας αποακετυλάσης τουHDAC3 έχει κάποιο ρόλο στη θέση του αντικειμένουμνήμηο σχηματισμός καθώς και ο σχηματισμός και η εξαφάνιση αναμνήσεων που σχετίζονται με την κοκαΐνη. Χρησιμοποιώντας ένα μετάλλαγμα νεκρού σημείου αποακετυλάσης του HDAC3, διαπιστώσαμε ότι ο επιλεκτικός αποκλεισμός της δραστηριότητας της αποακετυλάσης HDAC3 στον ραχιαίο ιππόκαμπο ενίσχυσε τη μακροπρόθεσμη μνήμη για την τοποθεσία του αντικειμένου, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στον σχηματισμό μνήμης που σχετίζεται με την κοκαΐνη. Όταν αυτός ο μεταλλαγμένος ιός του ίδιου σημείου HDAC3 εγχύθηκε στον προκαταρκτικό φλοιό, απέτυχε να επηρεάσει τον συνδεδεμένο με την κοκαΐνημνήμησχηματισμός. Σε ό,τι αφορά την εξαφάνιση, η εξασθένιση της περιοχής αποακετυλάσης HDAC3 στον υποκείμενο φλοιό δεν είχε καμία επίδραση στην εξαφάνιση, αλλά παρατηρήθηκε ένα διευκολυνόμενο αποτέλεσμα εξαφάνισης όταν ο σημειακός μεταλλαγμένος ιός απελευθερώθηκε στον ραχιαίο ιππόκαμπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο τομέας αποακετυλάσης του HDAC3 παίζει έναν επιλεκτικό ρόλο σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου που υποκρύπτονται μακροπρόθεσμαμνήμησχηματισμός θέσης αντικειμένου καθώς και που σχετίζεται με την κοκαΐνημνήμησχηματισμός και εξαφάνιση.

Λέξεις-κλειδιά

μακροπρόθεσμη μνήμη? επιγενετική; χρωματίνη; θέση αντικειμένου. Προτίμηση εξαρτημένης θέσης· ραχιαίος ιππόκαμπος

Εισαγωγή

Η ακετυλίωση ιστόνης είναι ένας καλά μελετημένος μηχανισμός τροποποίησης της χρωματίνης που εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης που απαιτείται γιαμνήμη. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η ακετυλίωση ιστόνης εμπλέκεται μακροπρόθεσμαμνήμησχηματισμός (επισκόπηση στο Levenson and Sweatt, 2006; McQuown and Wood, 2011; Gräffand Tsai, 2013; Peixoto and Abel, 2013; Penney and Tsai 2014). Η ακετυλίωση ιστόνης πραγματοποιείται από ακετυλοτρανσφεράσες ιστόνης και αποακετυλάσες ιστόνης (HDACs), οι οποίες γενικά διευκολύνουν και καταστέλλουν την έκφραση γονιδίων, αντίστοιχα (Jenuwein and Allis 2001· Kouzarides, 2007). Η αποακετυλάση ιστόνης 3 (HDAC3) είναι η πιο εκφρασμένη HDAC Κατηγορίας Ι στον εγκέφαλο και αυτή η συγκεκριμένη HDAC είναι ένας ισχυρός αρνητικός ρυθμιστής των διαδικασιών μάθησης και μνήμης (Kwapis et al., 2017; Malvaez et al., 2013; McQuown et al. ., 2011· Rogge et al., 2013). Το εργαστήριό μας έχει δείξει ότι το HDAC3 παίζει κρίσιμο ρόλο στη θέση των αντικειμένων και στο σχηματισμό μνήμης που σχετίζεται με το φόβο (McQuown et al., 2011; Kwapis et al., 2017) χρησιμοποιώντας χειρισμούς HDAC3 ειδικούς στον ιππόκαμπο και την αμυγδαλή. Έχουμε επίσης δείξει ότι η αναστολή HDAC3 διευκολύνει την εξάλειψη της συμπεριφοράς αναζήτησης ναρκωτικών με τρόπο που εμποδίζει την αποκατάσταση (Malvaez et al., 2013). Τα πειράματα εξαφάνισης στο Malvaez et al (2013) χρησιμοποίησαν έναν εκλεκτικό αναστολέα HDAC3 που χορηγήθηκε συστηματικά, επομένως δεν μπορέσαμε να προσδιορίσουμε ποιες περιοχές του εγκεφάλου είναι πιο σημαντικές για την εξαρτώμενη από HDAC{23}}διαμόρφωση της εξαφάνισης.

Το ίδιο το HDAC3 έχει ισχυρή δράση αποακετυλάσης (Guenther et al., 2002; Lahm et al., 2007; Zhang et al., 2002) και συνδέεται με το HDAC4/HDAC5 μέσω αλληλεπιδράσεων με τον συν-κατασταλτικό πυρηνικό υποδοχέα corepressor (NCoR) σχηματίζουν ένα λειτουργικό σύμπλεγμα καταστολέα πολλαπλών πρωτεϊνών (Guenther et al., 2001; Fischle et al., 2002; Alenghat et al., 2008). Μια ιδέα είναι ότι αυτά τα σύμπλοκα πολλαπλών πρωτεϊνών μπορεί να απαιτούνται για την αποακετυλίωση επειδή το HDAC4 έχει μικρή έως καθόλου καταλυτική δράση σε κανονικά υποστρώματα ακετυλ-λυσίνης (Lahm et al., 2007). Το HDAC4 έχει αποδειχθεί ότι διαμορφώνειμνήμηανεξάρτητα από τον τομέα της αποακετυλάσης (Sando et al., 2012). Έξω από το πεδίο της μάθησης καιμνήμη, Η διαμεσολαβούμενη από την HDAC έκφραση γονιδίου σε άλλους ιστούς δεν απαιτεί απαραίτητα την ενζυματική λειτουργία HDAC3 (Sun et al., 2013), γεγονός που υποδηλώνει ότι ίσως η δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 μπορεί να μην απαιτείται για το σχηματισμό μνήμης. Μέχρι πρόσφατα, η δράση της αποακετυλάσης του HDAC3 στο σχηματισμό μνήμης δεν είχε δοκιμαστεί άμεσα. Ο Kwapis και οι συνεργάτες του (2017) απέδειξαν ότι πράγματι η ενζυματική δραστηριότητα του HDAC3 απαιτείται για μορφές που εξαρτώνται από την αμυγδαλήμνήμησχηματισμός.

Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει ότι η συστηματική χορήγηση ενός αναστολέα HDAC3 θα μπορούσε να διευκολύνει τόσο τον σχηματισμό της θέσης του αντικειμένουμνήμη(OLM) καθώς και η εξάλειψη της κοκαΐνης που σχετίζεται με το πλαίσιομνήμη(Malvaez et al., 2013). Ωστόσο, εάν η δραστικότητα αποακετυλάσης του HDAC3 απαιτείται για τον εντοπισμό του αντικειμένουμνήμηΤο OLM στον ιππόκαμπο και η εξάλειψη της μνήμης που σχετίζεται με το πλαίσιο της κοκαΐνης στον υπολιμβικό φλοιό παραμένει ασαφής. Στην τρέχουσα μελέτη, στοχεύσαμε συγκεκριμένα τη δραστηριότητα της αποακετυλάσης του HDAC3 στον εξαρτώμενο από τον ιππόκαμπο σχηματισμό μνήμης καθώς και στον ραχιαίο ιππόκαμπο (DH), τον προκαταρκτικό φλοιό (PrL) και τον υπομελιθικό φλοιό (IL) σε σχέση με την απόκτηση και την εξαφάνιση του Προτίμηση μέρους που εξαρτάται από την κοκαΐνη ή που σχετίζεται με το πλαίσιο της κοκαΐνηςμνήμηδιαδικασίες.

Υλικά και μέθοδοι

μαθήματα

Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας Ζώων και Χρήσης του Irvine και ήταν σε συμμόρφωση με τις οδηγίες των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Τα ποντίκια ήταν 8-12 εβδομάδων και είχαν πρόσβαση σε τροφή και νερό κατά βούληση στα κλουβιά του σπιτιού τους με τα φώτα να διατηρούνται σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος συμπεριφοράς κατά τη διάρκεια του φωτεινού τμήματος του κύκλου. Τα άτομα ήταν ενήλικα αρσενικά ποντίκια C57BL/6J για τα πειράματα AAV-HDAC3(Y298H)-v5. Για το πείραμα διαγραφής HDAC3 flox, τα ποντίκια Hdac3flox/flox και άγριου τύπου Hdac3 plus / plus διατηρήθηκαν σε φόντο C57BL/6J (Mullican et al., 2011). Εν συντομία, αυτά τα ποντίκια δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο του Dr. Mitch Lazar στο Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια (Philadelphia, PA) με θέσεις loxP που πλευρίζουν το εξόνιο 4 έως το εξόνιο 7 του γονιδίου Hdac3, μια περιοχή που απαιτείται για την καταλυτική δραστηριότητα του ενζύμου (Mullican et. al., 2011).

Φάρμακα

Η κοκαΐνη-HCl αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (Σεντ Λούις, Μιζούρι, ΗΠΑ) και διαλύθηκε σε αλατούχο διάλυμα (0,9 τοις εκατό NaCl). Η κοκαΐνη-HCl εκφράζεται ως το βάρος του άλατος. Για την εκπαίδευση κοκαΐνης-CPP στα πειράματα απόκτησης, η κοκαΐνη-HCl διαλύθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,5 mg/ml και χορηγήθηκε σε όγκο 10 ml/kg σωματικού βάρους, με αποτέλεσμα μια τελική δόση 5 mg/kg. Για την εκπαίδευση κοκαΐνης-CPP στο πείραμα εξάλειψης, η κοκαΐνη-HCl διαλύθηκε σε τελική συγκέντρωση 2 mg/ml και χορηγήθηκε σε όγκο 10 ml/kg σωματικού βάρους, καταλήγοντας σε μια τελική δόση 20 mg/kg. Η κοκαΐνη-HCl και ο φυσιολογικός ορός χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (IP).

Χειρουργική επέμβαση

Τα ποντίκια προκλήθηκαν με 4 τοις εκατό ισοφλουράνιο σε οξυγόνο και διατηρήθηκαν στο 1,5-2,0 τοις εκατό για τη διάρκεια της επέμβασης. Στα ζώα έγινε ένεση είτε με AAV-HDAC3(Y298H)-v5 είτε με AAV-EV (Empty Vector) (Kwapis et al., 2017). Για τα πειράματα DH, 1 μlofvirus εγχύθηκε διμερώς. Για τα προκαταρκτικά και υπολιμβικά πειράματα, 0.3 μl ιού εγχύθηκαν διμερώς. Χρησιμοποιήθηκε ανοσοφθορισμός για να επιβεβαιωθεί η έκφραση του HDAC3(Y298H). Οι βελόνες έγχυσης κατέβηκαν στις επιθυμητές συντεταγμένες με ρυθμό 0,2 mm/15s. {{20}}λεπτά μετά την επίτευξη του στοχευόμενου βάθους, ο ιός εγχύθηκε με ρυθμό 6 μl/ώρα. Μετά την έγχυση, οι βελόνες ένεσης αφέθηκαν στη θέση τους για 2-λεπτά για να επιτραπεί η διάχυση του ιού. Στη συνέχεια, οι εγχυτήρες ανυψώθηκαν 0,1 mm και αφέθηκαν να καθίσουν για άλλο ένα λεπτό πριν αφαιρεθούν αργά (0.1 mm/ 15 δευτερόλεπτα). Η τομή συρράφτηκε και αφέθηκαν 2 εβδομάδες για πλήρη ιική έκφραση πριν από τη συμπεριφορά. Οι ιοί εγχύθηκαν με διπλούς εγχυτήρες 28 gauge (DH: 3mm από κέντρο προς κέντρο, PrL/IL: 0.8 mm από κέντρο προς κέντρο) συνδεδεμένο με σωλήνα PE50 και συνδεδεμένο με σύριγγες Hamilton τοποθετείται σε αντλίες έγχυσης. Οι συντεταγμένες για το DH ήταν: AP, −2,0mm. ML, ±1,5 mm; DV, −1,5mm σε σχέση με το Bregma. Οι συντεταγμένες για το PrL ήταν: AP, συν 1,9 mm. ML, ±0,4 mm; DV, −2,2mm σε σχέση με το Bregma. Οι συντεταγμένες για το IL ήταν: AP, συν 1,5; ML, ±0,4 mm; DV, −3,2mm σε σχέση με το Bregma.

Παραγωγή AAV

Το HDAC3 άγριου τύπου ενισχύθηκε από cDNA του ιππόκαμπου ποντικού και κλωνοποιήθηκε σε ένα τροποποιημένο pAAV-IRES-hrGFP (Agilent), υπό τον έλεγχο του προαγωγέα CMV και του εσωνίου -σφαιρίνης. Για να δημιουργηθεί η σημειακή μετάλλαξη, δημιουργήθηκε μια απλή υποκατάσταση νουκλεοτιδίου στο εξόνιο 11 για την άμεση παραγωγή ενός υπολείμματος ιστιδίνης στη θέση της τυροσίνης στο αμινοξύ 298 (πλασμίδιο MW92). Για τον έλεγχο κενού φορέα, η κωδικοποιητική αλληλουχία HDAC3 δεν υπήρχε, αλλά όλα τα άλλα στοιχεία παραμένουν (πλασμίδιο MW87). Ο αδενο-σχετιζόμενος ιός (AAV) κατασκευάστηκε από τον Penn Vector Core (Πανεπιστήμιο της Pennsylvania) από τα παραπάνω περιγραφέντα πλασμίδια και οροθετήθηκε με AAV 2.1. Ο τελικός τίτλος του AAV-HDAC3(Y298H) ήταν 6,48 × 1012 GC/mL και ο τελικός τίτλος του AAV-EV ήταν 1,35 × 1013 GC/mL.

Ανοσοφθορισμός

Σε πειράματα συμπεριφοράς που φαίνονται στα σχήματα 2-7, κάθε ζώο που συμπεριλήφθηκε στις αναλύσεις συμπεριφοράς είχε ιική έγχυση επιβεβαιωμένη με ανοσοϊστοχημεία. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας και οι εγκέφαλοί τους αφαιρέθηκαν και καταψύχθηκαν αμέσως σε παγωμένο ισοπεντάνιο. Φέτες 2 0μm συλλέχθηκαν σε όλο το IL/PrL ή DH, τοποθετήθηκαν με απόψυξη σε διαφάνειες και αποθηκεύτηκαν στους -80 βαθμούς μέχρι τη χρήση. Για ανάλυση ανοσοφθορισμού, τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και διαπερατήθηκαν σε 0,01 τοις εκατό Triton X-100 σε 0,1 Μ PBS για 15 λεπτά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε 8 τοις εκατό φυσιολογικό ορό κατσίκας (Jackson) και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς σε πρωτεύον αντίσωμα (HDAC3 κλώνος Υ415 αντίσωμα: 1:250, Abcam). Την επόμενη ημέρα, οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με κατσικίσιο αντι-κουνελιού Alexa 488 (1:1{30}} αραίωση, Invitrogen) στο σκοτάδι, ακολουθούμενη από επώαση DAPI 15- λεπτών (1: 10.000, Invitrogen, DH). Για τα πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκε κόκκινη φθορίζουσα χρώση nissl NeuroTrace (1:50 NeuroTrace 530/615; Life Technologies), οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν για 50 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθησαν δύο πλύσεις σε 0,01 τοις εκατό Triton-X-100 για 5 λεπτά και μετά δύο πλύσεις σε PBS για 5 λεπτά. Οι αντικειμενοφόροι γλιστρήθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν με ένα Olympus Scanner VS110 με αποχρωματικό αντικειμενικό φακό 20× (αριθμητικό διάφραγμα 0,75) με λογισμικό σαρωτή VS110. Όλες οι ομάδες θεραπείας αντιπροσωπεύτηκαν σε κάθε διαφάνεια και όλες οι εικόνες σε μια διαφάνεια καταγράφηκαν με τον ίδιο χρόνο έκθεσης. Η ένταση ανοσοσήμανσης ποσοτικοποιήθηκε με ImageJ με δειγματοληψία της οπτικής πυκνότητας στο κυτταρικό στρώμα του CA1 κανονικοποιημένο στο φόντο.

Ποσοτική RT-PCR

Πραγματοποιήθηκε ποσοτική RT-PCR σε πραγματικό χρόνο για να επαληθευτεί η έκφραση V5 και η ανοδική ρύθμιση της έκφρασης Hdac3mRNA άγριου τύπου μετά από έγχυση AAV-HDAC3(Y298H) (πείραμα 1) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (López et al., 2016; White et al., 2016). Για το πείραμα 1, διατρήσεις 1 mm στο DH συλλέχθηκαν από φέτες 500 μm στην περιοχή έκφρασης του ιού (ή ισοδύναμη περιοχή σε ποντικούς EV) όπως επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό. Όλος ο ιστός αποθηκεύτηκε στους -80 βαθμούς μέχρι την επεξεργασία.

Το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Minikit (Qiagen) και το cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA First Strand Transcriptor (Roche Applied Science). Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές, που προέρχονται από τη Roche Universal ProbeLibrary: Hdac3right primer, 5'- ttcaacgtgggtgatgactg-3'; Hdac3left primer, 5'- ttagctgtgttgctccttgc-3'; ανιχνευτής, ctgctccc; Hdac3-v5right primer, 5'-tggagattctcgagggtaagc-3'; Hdac3-v5left primer, 5'- atgccacccgtagatctgg-3'; ανιχνευτής, ctctcctc. Καθένας από τους ανιχνευτές για αυτά τα γονίδια στόχους συζεύχθηκε με τη χρωστική FAM. Η γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφορική αφυδρογονάση (Gapd) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς για όλους τους προσδιορισμούς RT-qPCR. Για το Gapd, χρησιμοποιήσαμε τα ακόλουθα primers: left primer, 5'atggtgaaggtcggtgtga-3'; δεξιό εκκινητή, 5-aatctccactttgccactgc-3'; ανιχνευτής, tggcggtattgg. Το Gapdprobe συζεύχθηκε με το LightCycler Yellow 555. Οι μη επικαλυπτόμενες βαφές και ο σβηστήρας στο γονίδιο αναφοράς επιτρέπουν την πολυπλεξία στις μηχανές Roche LightCycle 480 II (Roche Applied Sciences). Όλες οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης Gapd. Η ανάλυση και οι στατιστικές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τους ιδιόκτητους αλγόριθμους της Roche και το λογισμικό REST 2009 με βάση τη μέθοδο Pfaffl (Pfaffl 2001; Pfaffl et al., 2002).

Εργασίες OLM και ORM

Για OLM και αναγνώριση νέων αντικειμένωνμνήμη(ORM), δεδομένα εξοικείωσης (απόσταση που διανύθηκε κατά τη διάρκεια μεμονωμένων συνεδριών εξοικείωσης), βίντεο εκπαίδευσης και δοκιμών συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης συμπεριφοράς ANY-maze. Η εκπαίδευση και οι δοκιμές για OLM και ORM πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Vogel-Ciernia et al., 2013; Vogel-Ciernia and Wood, 2014). Πριν από την εκπαίδευση, τα ποντίκια χειρίστηκαν 1-2 λεπτά για 4 ημέρες και εξοικειώθηκαν στην πειραματική συσκευή 5 λεπτά στον θάλαμο OLM για 6 συνεχόμενες ημέρες απουσία αντικειμένων. Κατά τη διάρκεια της εκπαιδευτικής δοκιμής, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν στην πειραματική συσκευή με δύο πανομοιότυπα αντικείμενα (OLM: ποτήρια ζέσεως 100 ml, διάμετρος 2,5 cm, ύψος 4 cm· ORM: δοχεία μπαχαρικών και γυάλινες θήκες κεριών) και τους αφέθηκαν να εξερευνήσουν αυτά τα αντικείμενα για 3 λεπτά , το οποίο δεν έχει ως αποτέλεσμα βραχυπρόθεσμα ή μακροπρόθεσμαμνήμη. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι μια περίοδος εκπαίδευσης 3 λεπτών είναι ανεπαρκής για τη δημιουργία LTM που δοκιμάστηκε στις 24 ώρες (Haettig et al., 2011, 2013; López et al., 2016; McQuown et al., 2011; Stefanko et al., 2009) . Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, η κατακράτηση των ζώων δοκιμάστηκε για 5 λεπτά. Για το OLM, ένα αντίγραφο του οικείου αντικειμένου τοποθετήθηκε στην ίδια θέση όπως κατά τη διάρκεια της δοκιμής εκπαίδευσης και ένα αντίγραφο του οικείου αντικειμένου τοποθετήθηκε στη μέση του κουτιού. Για το ORM, ένα αντίγραφο του οικείου αντικειμένου και ένα νέο αντικείμενο τοποθετήθηκαν στην ίδια θέση όπως κατά τη διάρκεια της δοκιμής εκπαίδευσης. Όλες οι δοκιμές εκπαίδευσης και δοκιμών καταγράφηκαν σε βίντεο και βαθμολογήθηκαν με το χέρι από άτομα τυφλά για θεραπείες σε ζώα. Τα βίντεο αναλύθηκαν για συνολική εξερεύνηση αντικειμένων επιπλέον του δείκτη διάκρισης (DI) [(χρόνος που δαπανάται για την εξερεύνηση του νέου στόχου που ξοδεύεται στην εξερεύνηση οικείου αντικειμένου)/(συνολικός χρόνος εξερεύνησης και των δύο αντικειμένων) × 100 τοις εκατό ]. Όλοι οι συνδυασμοί και οι θέσεις των αντικειμένων χρησιμοποιήθηκαν με ισορροπημένο τρόπο για τη μείωση των πιθανών προκαταλήψεων που αποδίδονται σε μια προτίμηση για συγκεκριμένες τοποθεσίες ή αντικείμενα.

Συσκευή Προτίμησης Προετοιμασμένης Θέσης

Η ρύθμιση της προτίμησης θέσης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως στις μελέτες μας (Malvaez et al., 2011; Rogge et al., 2013; White et al., 2016). Εν συντομία, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε χειρισμό για 1 λεπτό κάθε μέρα για 3 ημέρες πριν από την έναρξη του πειράματος (ημέρες 1-3). Η διαδικασία CPP για όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αμερόληπτο, αντισταθμισμένο πρωτόκολλο. Οι βασικές προτιμήσεις για κάθε ένα από τα πειράματα αξιολογήθηκαν τοποθετώντας τα ζώα στο κεντρικό διαμέρισμα της συσκευής προτίμησης θέσης και επιτρέποντας την ελεύθερη πρόσβαση σε όλα τα διαμερίσματα για 15 λεπτά (προ-δοκιμή, ημέρα 4). Το προπονητικό στάδιο ξεκίνησε μια μέρα μετά την προκαταρκτική δοκιμή. Η προετοιμασία πραγματοποιήθηκε τις επόμενες 4 ημέρες με τις πόρτες γκιλοτίνας κλειστές, περιορίζοντας έτσι τα ζώα σε ένα από τα δύο εξωτερικά διαμερίσματα της συσκευής CPP για 30 λεπτά (ημέρες 5-8). Χρησιμοποιήθηκε ένα αμερόληπτο σχέδιο έτσι ώστε στα μισά από τα ζώα χορηγήθηκε κοκαΐνη πριν από την τοποθέτησή τους στο καρό διαμέρισμα και τα μισά έλαβαν κοκαΐνη πριν από την τοποθέτηση σε ένα λευκό διαμέρισμα την ημέρα εκπαίδευσης 1 (CS συν ). Την επόμενη ημέρα, η θεραπεία και το διαμέρισμα αντιστράφηκαν για κάθε ζώο (ημέρα εκπαίδευσης 2), τα ποντίκια εγχύθηκαν με φυσιολογικό ορό πριν από την τοποθέτηση στο εναλλακτικό διαμέρισμα (CS−). Οι ενέσεις άλλαξαν για τις επόμενες συνεδρίες προετοιμασίας. Για τα πειράματα απόκτησης που φαίνονται στα Σχ. 3–5, τα ζώα έλαβαν συνολικά δύο 30-λεπτά ζευγαρώματα με κοκαΐνη στο ένα διαμέρισμα και δύο 30-λεπτά ζεύγη με φυσιολογικό ορό στο άλλο. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την τελευταία συνεδρία προετοιμασίας, η προτίμηση (15 λεπτά, μετά τη δοκιμή 1, ημέρα 10) αξιολογήθηκε σε όλα τα ζώα όπως περιγράφεται παραπάνω σε κατάσταση χωρίς φάρμακο. Για τα πειράματα εξαφάνισης που φαίνονται στα Σχ. 6–7, τα ζώα υποβλήθηκαν σε προετοιμασία που ακολουθήθηκε από μετα-δοκιμή 1 48 ώρες μετά την τελευταία συνεδρία προετοιμασίας όπως περιγράφεται παραπάνω. Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση του ιού στο DH ή IL, τα ζώα υποβλήθηκαν σε επαναλαμβανόμενες δοκιμές προτίμησης χωρίς φάρμακο καθημερινά (15 λεπτά, μετά τις δοκιμές 2-5, ημέρες 25-28). Η βαθμολογία CPP υπολογίστηκε ως χρόνος (οι) που δαπανήθηκαν σε διαμερίσματα με ζεύγη κοκαΐνης (CS συν ) μείον ζεύγη φυσιολογικού ορού (CS−). Ο χρόνος που δαπανήθηκε σε κάθε ένα από τα μεγάλα εξωτερικά διαμερίσματα αναλύθηκε με αυτοματοποιημένο λογισμικό από βίντεο MPEG χρησιμοποιώντας λογισμικό EthoVision 3.1 (Noldus Technology, βλέπε Malvaez et al., 2011).

Στατιστική ανάλυση

Το Graphpad Prism 7.02 (GraphPad Software) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις.

Η εξοικείωση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια αμφίδρομη ANOVA για να συγκριθεί η συνολική απόσταση που διανύθηκε στις συνεδρίες εξοικείωσης. Τα δεδομένα εκπαίδευσης και δοκιμών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Student's t-test για να συγκριθεί είτε η εξερεύνηση είτε η DI μεταξύ των ζώων ελέγχου και των πειραματόζωων. Τα δεδομένα των δοκιμών αναλύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα τεστ t μιας ουράς που συγκρίνει τις τιμές DI με το μηδέν για να προσδιοριστεί εάν παρατηρήθηκε ή όχι σημαντική διάκριση. Τα πειράματα CPP αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVAs) ακολουθούμενα από Bonferroni'sposthoctestsμε Βαθμολογία Προτίμησης (PS) σε δοκιμές ως μεταβλητές εντός των υποκειμένων και ομάδα/γονότυπο (Empty Vector έναντι Y298H point mutant, Hdac3 plus / plus vs. Hdac3flox/flox). Αυτό το στατιστικό τεστ χρησιμοποιήθηκε για να γίνουν συγκεκριμένες συγκρίσεις όταν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις ή/και κύρια ομαδικά αποτελέσματα. Τα δεδομένα της δοκιμής αναλύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα τεστ t μιας ουράς που συγκρίνει τις τιμές PS με το μηδέν για να προσδιοριστεί εάν παρατηρήθηκε ή όχι σημαντική προτίμηση. Για πειράματα εξαφάνισης, διεξήχθησαν πρώτα οι δοκιμές t Student για να προσδιοριστεί εάν τα ζώα σχημάτιζαν σημαντική προτίμηση στο post-test 1 πριν από την έγχυση του ιού. Οι τιμές RT-qPCR ελήφθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι διαφορές στις τιμές RT-qPCR αξιολογήθηκαν με τις δοκιμές t Student. Για όλες τις αναλύσεις, απαιτείται μια τιμή 0,05 για τη σημασία.