ΜΕΡΟΣ 1 Ο πολυσακχαρίτης Cistanche Deserticola αναστέλλει την οστική απώλεια που προκαλείται από OVX σε ποντίκια και την οστεοκλασγογένεση που προκαλείται από RANKL
Mar 02, 2022
Εισαγωγή
Η οστεοπόρωση — μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα, μη φυσιολογική μικροδομή οστικού ιστού, αυξημένη ευθραυστότητα των οστών και κάταγμα (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, &ginaldi, 2006) — επηρεάζει σήμερα περισσότερους από 200 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως και παρουσιάζει σημαντική ιατρική και κοινωνικοοικονομική επιβάρυνση στη σύγχρονη κοινωνία (Strom et al., 2011). Η κλινική θεραπεία της οστεοπόρωσης επικεντρώνεται κυρίως στην ορμονική υποκατάσταση, τα διφωσφονικά ή τη θεραπεία με δενοσουμάμπη. Αυτές οι μέθοδοι είναι αποτελεσματικές, αλλά θέτουν μακροπρόθεσμες παρενέργειες όπως ο πιθανός κίνδυνος καρκίνου του μαστού και άτυπων καταγμάτων του μηριαίου οστού (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, && Rosen, 2012; Ραχνέρ, Χόσλα, &Χοφ-Μπάουερ, 2011). Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να διερευνηθούν φάρμακα που μπορούν όχι μόνο να εμποδίσουνοστεοπόρωσηαλλά έχουν επίσης λιγότερες ανεπιθύμητες παρενέργειες.
Cistanche deserticola(CD), ένα τονωτικό και φαρμακευτικό τρόφιμο που χρησιμοποιείται ευρέως στην Κίνα, γνωστό ως "desert ginseng", είναι το αποξηραμένο χυμώδες στέλεχος με φύλλο κλίμακαςC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) και έχει ποικίλες και αποτελεσματικέςΦαρμακολογικήΔραστηριότητες, όπως η ανοσολογική ρύθμιση, η αντι-οξείδωση και η αντι-οστεοπόρωσηιδιότητες (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Ζανγκ κ.ά., 2014). Προηγούμενες μελέτες σχετικά με τις δραστικές ουσίες του CD για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης επικεντρώθηκαν κυρίως στηνφαινυλαιθανοειδέςΓλυκοσίδες(Λι, Τζιάνγκ, &γκου, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, &ma, 2017). Ωστόσο, το CD περιέχει επίσης άλλα αποτελεσματικά συστατικά όπως ιριδοειδή, λιγνάνες,πολυσακχαρίτες(Γουάνγκ, Ζανγκ, &Ξι, 2012). Η κλινική εφαρμογή της παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής (TCM) είναι κυρίως η αποσυμφόρηση του νερού.Πολυσακχαρίτεςείναι υδατοδιαλυτά συστατικά και είναι πιθανότερο να είναι τα κύρια φαρμακοδυναμικά συστατικά του TCM. Οι πολυσακχαρίτες που εξήχθησαν από το TCM αναφέρθηκαν άγρια ότι έχουν αντι-οστεοπόρωσηκαι μερικές ανεπιθύμητες παρενέργειες, οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί γενικά σε κλινικές (π.χ. πολυσακχαρίτες που εξάγονται από το Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, &&wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, &Yan, 2018) και Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότιCistanche deserticolaΠολυσακχαρίτης(CDP) που εξάγεται από CD μπορεί να είναι ένα δυνητικά ασφαλές φάρμακο για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης.
Συνήθως, η οστική απορρόφηση και ο σχηματισμός οστού διατηρούν μια δυναμική ισορροπία κατά τη διάρκεια της οστικής αναδιαμόρφωσης σε συντονισμό με διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των οστεοκλαστών, των οστεοβλαστών, των κυττάρων επένδυσης των οστών και των οστεοκυττάρων (Kular, Tickner, Chim, && Xu, 2012). Μια θραύση αυτής της ισορροπίας μπορεί να οδηγήσει σε μια ποικιλία μεταβολικών ασθενειών των οστών, όπωςοστεοπόρωση(Zhu et al., 2018) και οστεοσκλήρυνση (Ihde et al., 2011). Οι οστεοκλάστες, ως τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα που προέρχονται από τη μονοπύρηνη/μακροφάγο γενεαλογία, είναι τα μόνα κύτταρα με λειτουργία οστικής απορρόφησης (Teitelbaum, 2000). Υπάρχουν δύο βασικές κυτοκίνες που συμμετέχουν στη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των οστεοκλαστών (Koga et al., 2004): ο παράγοντας διέγερσης αποικιών μακροφάγων (M-CSF) και ο ενεργοποιητής υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα κB (NF-κB) συνδέτη (RANKL). Το M-CSF μεσολαβεί στη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σε προγόνους οστεοκλαστών και προάγει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών ρυθμίζοντας την έκφραση του υποδοχέα RANK (Takayanagi, 2007). Η σύνδεση των RANKL και RANK στην κυτταρική επιφάνεια των οστεοκλαστών έχει ως αποτέλεσμα τα ακόλουθα: (1) πρόσληψη μορίων προσαρμογέα σηματοδότησης όπως ο παράγοντας 6 που σχετίζεται με τους υποδοχείς TNF (TRAF6)· (2) ενεργοποίηση πολλαπλών κατάντη στόχων, συμπεριλαμβανομένων των NF-κB και των κινασών πρωτεϊνών που ενεργοποιούνται με μιτογόνα (MAPK)· και (3) ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων, κυτταροπλασματικών 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Η ενεργοποίηση αυτών των οδών σηματοδότησης ρυθμίζει άμεσα την έκφραση των γονιδίων των οστεοκλαστών, συμπεριλαμβανομένης της όξινης φωσφατάσης 5 (Acp5) [κωδικοποίηση της ανθεκτικής στα τρυγικά όξινης φωσφατάσης (TRAcP)], της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 9 (MMP9) και της καθεψίνης Κ (CTSK) (Boyle, Simonet, &&Lacey, 2003). Ως εκ τούτου, η αναστολή των οδών σηματοδότησης που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών που προκαλούνται από RANKL είναι μια πιθανή θεραπευτική μέθοδος για την οστεοπόρωση.
Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύαμε να προσδιορίσουμε τις επιδράσεις της θεραπείας με CDP στην προκαλούμενη από ωοθηκεκτομή (OVX)οστεοπόρωσημοντέλο ποντικού in vivo και σε δραστηριότητα οστεοκλαστών που προκαλείται από RANKL in vitro, με έμφαση στην έκφραση γονιδίων ειδικών οστεοκλαστών και στην ενεργοποίηση των NFATc1 και των οδών σηματοδότησης NF-κB και MAPKs. Τα ευρήματά μας μπορεί να παρέχουν νέες πληροφορίες σχετικά με τις δυνατότητες του CDP ως ασφαλούς και αποτελεσματικού φαρμάκου για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης.
Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Χημικές ουσίες και συλλογή δειγμάτων
CD (αρ. 180801) αγοράστηκε από Anhui Jishun Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική Co, Ε.Π.Ε. (Anhui, Κίνα) και αναγνωρίστηκε από τον καθηγητή Haibo Huang από τη Σχολή Φαρμακευτικών Επιστημών, Guangzhou Πανεπιστήμιο της Κινεζικής Ιατρικής, Guangzhou, Κίνα. Τα δισκία βαλερικής οιστραδιόλης αγοράστηκαν από την Bayer (Λεβερκούζεν, Βόρεια Ρηνανία-Βεστφαλία, Γερμανία). Άλφα-τροποποιημένο ελάχιστο βασικό μέσο
(α-MEM) και ο εμβρυϊκός ορός βοοειδών (FBS) ελήφθησαν από την Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Η πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη και το κιτ χρώσης TRAcP αποκτήθηκαν από τη Solarbio (Πεκίνο, Κίνα). Το ανασυνδυασμένο ποντίκι M-CSF και το ανασυνδυασμένο ποντίκι RANKL προ- θεραπεύτηκαν από συστήματα Ε & Α (Μινεάπολις, MN, ΗΠΑ). Οι πλάκες με επικάλυψη υδροξυαπατίτη αγοράστηκαν από την Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ΗΠΑ). Τα κύρια αντισώματα για NFATc1 και CTSK (Βιοτεχνολογία Σάντα Κρουζ, Σάντα Κρουζ, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK και P-JNK (Τεχνολογία Κυτταρικής Σηματοδότησης, Dan- vers, MA, ΗΠΑ). και β-ακτίνη (CWBIO, Πεκίνο, Κίνα) αποκτήθηκε επίσης. Τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας και το νερό καθαρίστηκε από το σύστημα καθαρισμού νερού Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
2.2. Εξαγωγή CDP
Το CD αλέθεται σε μια λεπτή σκόνη και αναμιγνύεται με πετρελαϊκό αιθέρα τρεις φορές για να το νικήσει. Το στερεό υπόλειμμα συλλέχθηκε με διήθηση και στη συνέχεια στέγνωσε σε θερμοκρασία δωματίου. Οπολυσακχαρίτεςεκχυλίστηκαν από τα προεπεξεργασμένα δείγματα τρεις φορές με νερό για 2 ώρες, συμπυκνώθηκαν, κατακρημνίστηκαν με την προσθήκη άνυδρης αιθανόλης σε τελική συγκέντρωση 80% (v/v) και αποθηκεύτηκαν στους 4 ◦C για 24 ώρες. Τα ιζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 3000 σ.α.λ. για 20 λεπτά, διαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και καθαρίστηκαν (απομάκρυνση ελεύθερων πρωτεϊνών) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Sevag (Zhao et al., 2019). Η ανακτηθείσαπολυσακχαρίτεςυποβλήθηκαν σε αιμοκάθαρση, αποξήρανση και αποθηκεύτηκαν μέχρι την περαιτέρω χρήση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της χημικής σύνθεσης έδειξαν ότι η περιεκτικότητα του CDP σε σάκχαρα, ουρονικό οξύ, θειικό άλας και πρωτεΐνες ήταν 67,63 0,98%, 21,05 0,49%, 1,90 0,24% και 8,81 0,36%.
Η σύνθεση του μονοσακχαρίτη και η υπέρυθρη ανάλυση μετασχηματισμού Fourier του CDP παρουσιάστηκαν στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1 και 2.
2.3. Μοντέλο ποντικού οστεοπόρωσης που προκαλείται από OVX
Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής guangzhou (εγκρίθηκε το SYXK 2019-0202). Τριάντα θηλυκά ποντίκια C57BL/6 ηλικίας 6 εβδομάδων προμηθεύτηκαν από το Πειραματικό Κέντρο Ζώων του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής της Γκουανγκζού. Μετά τον εγκλιματισμό για 1 εβδομάδα, σε μία ομάδα ποντικών δόθηκε εικονική επέμβαση (ομάδα Sham), ενώ τα υπόλοιπα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επέμβαση ωοθηκεκτομής (ομάδα OVX). Μετά τη χειρουργική επέμβαση, τα ποντίκια είχαν τη δυνατότητα να αναρρώσουν για 1 εβδομάδα. Στη συνέχεια, τα ποντίκια που μοντελοποιήθηκαν με επιτυχία χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες, με 6 ποντίκια ανά ομάδα:
(1) Ομάδα εικονικής θεραπείας: επεξεργασμένη με απεσταγμένο νερό, (2) ομάδα OVX: επεξεργασμένη με απεσταγμένο νερό, (3) ομάδα OVX E2 (E2): επεξεργασμένη με 0,13 mg/kg δισκίων βαλερικής οιστραδιόλης, (4) ομάδα χαμηλής δόσης OVX CDP (CDP-L): επεξεργασμένη με 300 mg/kg CDP, (5) ομάδα υψηλής δόσης OVX CDP (CDP-H): επεξεργασμένη με 600 mg/kg CDP. Το απεσταγμένο νερό, το Ε2 ή το CDP χορηγήθηκε με καθετήρα μία φορά την ημέρα. Όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά την περίοδο θεραπείας των 12 εβδομάδων (Εικ. 1Α). Οι μήτρες συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν και οι αριστερές κνήμες συλλέχθηκαν για επακόλουθες εξετάσεις. Συλλέχθηκαν δείγματα ολικού αίματος και φυγοκεντρήθηκαν στις 5000 σ.α.λ. για
15 λεπτά στους 4 ◦C. Τα υπερκείμενα του ορού αναρροφήθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε
—80 ◦C μέχρι νεωτέρας ανάλυσης.
2.4. Ανάλυση μικρο-υπολογιστικής τομογραφίας (micro-CT) και ιστομορφομετρία οστών
Η αριστερή κνήμη σταθεροποιήθηκε με 4% παραφορμαλδεΰδη για 48 ώρες και στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε σωλήνες φυγοκέντρησης που περιείχαν φυσιολογικό ορό. Τα σταθερά δείγματα σαρώθηκαν με όργανο μικρο-αξονικής τομογραφίας Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Βέλγιο) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες ρυθμίσεις: τάση, 80 kV. ρεύμα πηγής, 100 μA. Al, φίλτρο 0,5 mm. εικονοστοιχείο
μέγεθος, 9,76 μm; και βήμα περιστροφής, 0,6◦. Διάφορες παράμετροι του
το δοκιδωτό οστό, συμπεριλαμβανομένης της οστικής πυκνότητας (BMD), του κλάσματος όγκου οστού (BV/TV), της επιφάνειας του οστού ανά συνολικό όγκο (BS/TV), του δοκιδωτού αριθμού (Tb. N) και της δοκαριακής απόστασης (Tb. Sp. Sp) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CT- Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Οι τρισδιάστατες εικόνες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CTVol (Bruker micro-CT. Σκάισκαν).
Μετά από μικρο-αξονική ανάλυση, η αριστερή κνήμη απασβεστοποιήθηκε σε 14% διάλυμα EDTA και ενσωματώθηκε σε παραφίνη για τομή. Τα δείγματα τεμαχίστηκαν σε τμήματα 5 μm χρησιμοποιώντας ένα μικρότομο πριν από τα πειράματα χρώσης αιματοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) και TRAcP. Τα χρωματισμένα τμήματα εξετάστηκαν και τεκμηριώθηκαν χρησιμοποιώντας το μικρο- πεδίο εφαρμογής Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Τόκιο, Ιαπωνία).
Σιστάντσεμπορεί να ενισχύσει την οστική πυκνότητα και να ανακουφίσει την οστεοπόρωση
2.5. Ανάλυση ορού
Οι συγκεντρώσεις ασβεστίου (Ca) και φωσφόρου (P) προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ που σχεδιάστηκαν από το Ινστιτούτο Εμβιομηχανικής Nanjing Jiancheng (Nanjing, Κίνα). Τα επίπεδα TRAcP-5b και RANKL στον ορό αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Γουχάν, Κίνα) και κιτ RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Γουχάν, Κίνα), αντίστοιχα.
2.6. In vitro δοκιμασία οστεοκλασγογένεσης
Τα BMM απομονώθηκαν από την κνήμη και το μηριαίο οστό θηλυκών C57BL/6 ποντικών ηλικίας 6 εβδομάδων. Τα απομονωμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε α-MEM θρεπτικό μέσο που περιείχε 25 ng/mL M-ΕΝΥ, 10% FBS και 1% πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη. Μόλις έφθασαν σε συρροή, τα BMM (1 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε τρυβλία 96 κοιλοτήτων και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP παρουσία 50 ng/mL RANKL. Το μέσο και το CDP αντικαταστάθηκαν κάθε 2 ημέρες. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν για την παρουσία TRAcP. Ο αριθμός των οστεοκλαστών, που ορίζεται ως TRAcP- θετικά κύτταρα με τρεις ή περισσότερους πυρήνες, μετρήθηκε και τεκμηριώθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός.
2.7. Δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού
Τα BMM (1 × 104 κύτταρα/πηγάδι) σπάρθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων και επωάστηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας. Μετά από αυτό, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 και 40 μg/mL) για 48 ώρες. Η κυτταρική συρροή ανιχνεύθηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, ΗΠΑ), ένα μακροπρόθεσμο, σε πραγματικό χρόνο δυναμικό σύστημα απεικόνισης ζωντανών κυττάρων.
2.8. Δοκιμασία απορρόφησης υδροξυαπατίτη
Τα BMM (1 104 κύτταρα/κοιλότητα) φυτεύτηκαν σε μια πλάκα επικαλυμμένη με υδροξυαπατίτη, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (0, 5 και 10 μg/mL) και καλλιεργήθηκαν σε πλήρη α-MEM που περιείχε 25 ng/mL M-CSF και 50 ng/mL RANKL. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με διάλυμα λευκαντικού 10% για να αφαιρεθούν τα συστατικά των κυττάρων. Οι εικόνες των περιοχών απορρόφησης υδροξυαπατίτη συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το IncuCyte ZOOM® και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).
2.9. Απομόνωση RNA και ανάλυση αντίστροφης μεταγραφής-ποσοτικής PCR (RT-qPCR) σε πραγματικό χρόνο
Τα BMM (1 105 κύτταρα/φρεάτιο) φυτεύτηκαν σε μια πλάκα 6 κοιλοτήτων και διεγείρονται με RANKL και M-CSF παρουσία CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 5 και 10 μg/mL) για 5 ημέρες. Το ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα ή τον οστικό ιστό των ποντικών χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIzol (Sigma- Aldrich). Το συμπληρωματικό DNA συντέθηκε από 2 μg συνολικού RNA χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντίστροφης μεταγραφάσης (TransGen Biotech, Πεκίνο, Κίνα). Οι αντιδράσεις RT-qPCR προετοιμάστηκαν χρησιμοποιώντας το PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) και ανιχνεύθηκαν από το σύστημα ABI 7500 (Εφαρμοσμένο
Βιοσυστήματα, Thermo Fisher Επιστημονική, Inc., Waltham, MA, ΗΠΑ). Οι παράμετροι κύκλου για την PCR ορίστηκαν ως εξής: 95 ◦C για 5 λεπτά, ακολουθούμενες από 40 κύκλους 95 ◦C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ◦C για 30 δευτερόλεπτα. Οι συγκεκριμένοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και η ποσότητα κάθε γονιδίου-στόχου κανονικοποιήθηκε σε GAPDH (εσωτερικός έλεγχος).
2.10. Ανάλυση δυτικής κηλίδας
Τα BMM (5 105 κύτταρα/φρεάτιο) ήταν σπαρμένα σε μια πλάκα 6 φρεατίων. Για πειράματα σύντομης χρονικής διάρκειας, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις CDP (0, 5 και 10 μg/mL) για 1 ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ng/mL RANKL για 30 λεπτά. Για μεγάλο χρονικό διάστημα, τα κύτταρα διεγείρονταν με 50 ng/mL RANKL τις ημέρες 3, 5 και 7 παρουσία CDP (0, 5 και 10 μg/mL). Οι συνολικές πρωτεΐνες εξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (CWBIO). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, επωάστηκαν με πρωτογενές
αντισώματα κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ◦C, και στη συνέχεια με το αντίστοιχο δευτερεύον
αντισώματα για 1,5 ώρα. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, ΗΠΑ) και οι εικόνες τραβήχτηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης chemiluminescence Tanon 5200 (Επιστήμη και Τεχνολογία Tanon, Σαγκάη, Κίνα).
Σιστάντσεμπορεί να ενισχύσει την οστική πυκνότητα
2.11. Ανίχνευση μετατόπισης NFATc1 με χρήση δοκιμής ανοσοφθορισμού
Τα BMM σπέρθηκαν σε καλύμματα 12 κοιλοτήτων, διεγείρονται με RANKL και M-CSF και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μg/mL CDP για 5 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και διαπερατώθηκαν με 0,1% Triton X-100 για 10 λεπτά. Τα κύτταρα αναμίχθηκαν με 10% ορό κατσίκας (CWBIO) και επωάστηκαν για 2 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με το κύριο αντίσωμα κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ◦C και στη συνέχεια με δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 488 goat (Abcam, Cambridge, MA, USA) στο σκοτάδι για 1 ώρα. Τα καλύμματα πλύθηκαν με PBS, τοποθετημένα σε αντιδραστήριο παρατεταμένου χρυσού antifade με 4′, 6-διαμιδινο-2-φαινυλο in-dole (DAPI) (ηλιακή), και
επιθεωρήθηκε χρησιμοποιώντας zeiss LSM 800 με συνεστιακό μικροσκόπιο Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία).
2.12. Στατιστική ανάλυση
Όλα τα πειραματικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στατιστικό λογισμικό SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Τα δεδομένα για τις μελέτες σε ζώα και κύτταρα εκφράζονται ως μέσα ± SEM και σημαίνει ± SD, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα χρησιμοποιούν μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης ή t-test του μαθητή. Τιμές p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">
Σιστάντσεμπορεί να μειώσειαπόπτωσηκαι την ενίσχυση των οστώνπυκνότητα
