Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katharina Artinger', Alexander H. Kirsch', Agnes A. Mooslechner', Daniel J. Cooper23, Ida Aringer', Max Schuller', Corinna SchabhüttI', Konstantin A. Klötzer', Kerstin Schweighofer', Philipp Eller, Hideo Yagita', Anna L. Illert', Alexander R. Rosenkranz', Peter J. Lane2 και Kathrin Eller

Το Cistanche μπορεί να βοηθήσει στη λειτουργία των νεφρών πολύ καλά

«Κλινικό Τμήμα Νεφρολογίας, Τμήμα Εσωτερικής Ιατρικής, Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Γκρατς, Γκρατς, Αυστρία; Κέντρο Ιατρικού Ερευνητικού Συμβουλίου για την Ανοσολογική Ρύθμιση, Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Έρευνας, Πανεπιστήμιο του Μπέρμιγχαμ, Μπέρμιγχαμ, Η.Β. Division of Global and Tropical Health, Menzies School of Health Research και Charles Darwin University, Darwin, Northern Territory, Αυστραλία. Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, Τμήμα Εσωτερικής Ιατρικής, Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Γκρατς, Γκρατς Αυστρία: «Τμήμα Ανοσολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Juntendo, Τόκιο, Ιαπωνία; και πτυχίο Τμήμα Ιατρικής l, Medical Center-University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany

Η συνδιέγερση αποτελεί προϋπόθεση για την παθογόνο δράση σε ασθένειες που προκαλούνται από Τ κύτταρα και έχει αποδειχθεί ότι επιτυγχάνει ανοχή στην ειδική για τα όργανα αυτοάνοση ως θεραπευτικός στόχος. Εδώ, αξιολογήσαμε τη συμμετοχή των μελών της οικογένειας του παράγοντα νέκρωσης όγκου CD30 και OX40 σε μεσολάβηση ανοσοσυμπλέγματοςνεφρό νόσος. Διέγερση και πολλαπλασιασμός in vitro, πραγματοποιήθηκαν μελέτες με κύτταρα CD4 plus από άγριου τύπου και CD30/OX40 double knock-out (CD30OX40) ποντίκια. Πραγματοποιήθηκαν in vivo μελέτες με επαγωγή νεφροτοξικής νεφρίτιδας ορού σε ποντίκια άγριου τύπου, CD30OX40, CD30', OX40, ανασυσταθέντα Rag1~ και C57Bl/6J ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντισώματα CD30L aOX40L. Τα CD30, OX40 και οι συνδέτες τους ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε διάφορα λευκοκύτταρα στη νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού. Τα ποντίκια CD30OX40, αλλά όχι τα ποντίκια CD30/ή OX40 προστατεύτηκαν από νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού. Παρόμοια προστασία βρέθηκε σε Rag1 ποντίκια στα οποία έγινε ένεση CD4 plus Tcells από ποντίκια CD30OX40' σε σύγκριση με Rag1" ποντίκια στα οποία έγινε ένεση CD4Tcells από ποντίκια άγριου τύπου. Επιπλέον, CD4 plus T κύτταρα με έλλειψη CD30OX40/εμφάνισαν μειωμένη έκφραση του CCR6X4 CD30 in vivo. ήταν πλήρως ικανοί

διαφοροποιώντας σε υποσύνολα Τ βοηθητικών κυττάρων που μεσολαβούν στη νόσο, αλλά παρουσίασαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα πολλαπλασιασμού in vivo και in vitro σε σύγκριση με κύτταρα άγριου τύπου. Ο αποκλεισμός των αντισωμάτων έναντι των CD30L και OX40L βελτίωσε τη νεφροτοξική νεφρίτιδα του ορού χωρίς να επηρεάζει τους πληθυσμούς Τ κυττάρων παν-ενεργών ή μνήμης. Έτσι, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν την προώθηση της νόσου μέσω της σηματοδότησης CD30 και OX40 λόγω της διευκόλυνσης του υπερβολικού πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων και της μετανάστευσης των Τ βοηθητικών κυττάρων 17 σε νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού. Ως εκ τούτου, ο αποκλεισμός συνδιέγερσης που στοχεύει τα μονοπάτια σηματοδότησης CD30 και X40 μπορεί να παρέχει μια νέα θεραπευτική στρατηγική στα αυτοάνοσαΝεφρική Νόσος.

Μεταφραστική δήλωση

Αυτό το άρθρο περιγράφει τη δυνατότητα εφαρμογής των μονοπατιών σηματοδότησης CD30 και OX40 ως μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους σε σπειραματική νόσο που προκαλείται από ανοσοσύμπλεγμα χρησιμοποιώντας το μοντέλο ποντικού της νεφροτοξικής νεφρίτιδας ορού. Ο συνδυασμένος αποκλεισμός των συνδιεγερτικών οδών CD30 και OX40 είναι ένας τρόπος για την επίτευξη περιφερειακής ανοχής στην αυτοανοσία με τη μείωση του παθογόνου υπερπολλαπλασιασμού στα δευτερογενή λεμφικά όργανα και τη μετανάστευση των παθογόνων Τ βοηθητικών κυττάρων 17 στανεφρό. Δεδομένου ότι οι παραδοσιακές θεραπευτικές επιλογές συνοδεύονταν από σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες, ο συνδυασμένος αποκλεισμός CD30 και OX40 θα οδηγούσε πιθανώς σε λιγότερες απειλητικές για τη ζωή λοιμώξεις σε σύγκριση με τις παραδοσιακές ανοσοκατασταλτικές θεραπείες.

Η συνδιεγερτική σηματοδότηση είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων, τη διαφοροποίηση, τη λειτουργία του τελεστή και την επιβίωση. Η συνδιέγερση αποκλεισμού έχει αναγνωριστεί ως στρατηγική για την επίτευξη ανοσολογικής ανοχής. Παράλληλα με την υπεροικογένεια Ig, συμπεριλαμβανομένων των CD28 και B7, τα «πιο συνδιεγερτικά μόρια είναι μέλη της εξελικτικά αρχαίας και εξαιρετικά διατηρημένης υπεροικογένειας παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF).» Τα CD30 και OX40 είναι προφλεγμονώδη μέλη της υπεροικογένειας TNF που όχι μόνο μοιράζονται κοινές οδούς σηματοδότησης, αλλά Οι παράγοντες που σχετίζονται με τον υποδοχέα TNF αλληλεπιδρούν με τις περιοχές του ενδοκυτταρικού υποδοχέα και προάγουν την κυτταρική επιβίωση μέσω της σηματοδότησης παράγοντα-KB ​​nu-dear και στις δύο περιπτώσεις. Β κύτταρα, και σε μια ποικιλία κυττάρων που παρουσιάζουν αντιγόνο.

Το CD30 παίζει κρίσιμο προφλεγμονώδες ρόλο στον αυτοάνοσο διαβήτη, την κολίτιδα και την εγκεφαλομυελίτιδα ποντικών.-1 Η έρευνα σε πειραματικά μοντέλα έχει βρει παθογόνους ρόλους για το OX40 στην αυτοάνοση ραγοειδίτιδα, την αρθρίτιδα και την αλλεργική φλεγμονή,12-1 ενώ μια πρόσφατη αναφορά πρότεινε το μονοπάτι OX40/OX40L για προστασία από τη σπειραματονεφρίτιδα μισοφέγγαρου διεγείροντας τον ρυθμιστικό πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων. Ωστόσο, και τα δύο μόρια έχουν συνδεθεί ανεξάρτητα με την παθογένεση του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (ΣΕΛ). Το διαλυτό CD30 είναι ένας δείκτης της δραστηριότητας της νόσου στο SLEl6,17 a και ένας απλότυπος OX40L σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης της νόσου.8 Επιπλέον, τα Τ βοηθητικά κύτταρα 17(Th17) εκφράζουν αυξημένα επίπεδα OX40 σε ασθενείς με ΣΕΛ και Η έκφραση OX40 είναι ανιχνεύσιμη σε περιαγγειακά λευκοκύτταρα στη νεφρίτιδα του λύκου.

Οι αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές για τη θεραπεία της σπειραματονεφρίτιδας συνδέονται με αυξημένη νοσηρότητα και υψηλό κίνδυνο ανεπιθύμητων ενεργειών1. Συνεπώς, είναι απαραίτητη πιο συγκεκριμένα στοχευμένη θεραπεία. Μια αυξανόμενη προσέγγιση στη στόχευση των ανοσολογικών αποκρίσεων είναι η πρόκληση ανοχής.]Οι θεραπευτικές επιλογές για την επίτευξη περιφερικής ανοχής περιλαμβάνουν την κλωνική διαγραφή, την άγνοια, τη ρύθμιση του ανοσοποιητικού και, τέλος, την ενέργεια, η οποία είχε ήδη αποδειχθεί πολύτιμη ανοσοκατασταλτική στρατηγική όταν τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα- εισήχθησαν σχετιζόμενες πρωτεΐνες 4-συντηγμένες πρωτεΐνες Lg.

Ο αποκλεισμός OX40L βρίσκεται επί του παρόντος υπό κλινική αξιολόγηση. Ωστόσο, η συνδυασμένη στόχευση των CD30 και OX40 δεν έχει διερευνηθεί διεξοδικά μέχρι στιγμής. Η εξαρτώμενη από CD{3}}αυτοανοσία εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την αλληλεπίδραση και των δύο ζευγών υποδοχέα-συνδέτη, που αποδεικνύεται από την αναγκαιότητα συνδυασμένης κατάργησης της σηματοδότησης CD30 και OX40 για την προστασία των ποντικών με έλλειψη P3(FoxP3) από την ανάπτυξη πρώιμων θανατηφόρων αυτοάνοσο νόσημα. Η νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού (NTS) είναι ένα μοντέλο σπειραματονεφρίτιδας ανοσοσυμπλεγμάτων ποντικού που έχει αποδειχθεί ότι εξαρτάται αυστηρά από Τ κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των Τ βοηθητικών κυττάρων 1(Th1) και Th17. Η παρουσίαση αντιγόνου σε αυτό το μοντέλο λαμβάνει χώρα κυρίως σε δευτερογενή λεμφοειδή όργανα, αλλά και τοπικά εντός τουνεφρό. Έτσι, υποθέσαμε ότι η ενεργοποίηση των συνδιεγερτικών μονοπατιών CD30 και OX40 πιθανώς προάγει το NTS.

ΜΕΘΟΔΟΙ Ζώα

Τα ποντίκια με διπλά νοκ-άουτ CD30OX407 με έλλειψη CD30 και OX40 δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως.' Τα χειριστήρια CD30OX40-και CD30OX40 plus /littermate, καθώς και CD30~ και OX40~, αναπαράχθηκαν εσωτερικά. Τα ποντίκια CD30√ δόθηκαν επίσης από τον Dr. alert, Freiburg, Γερμανία. Ποντίκια C57BL/6J ελήφθησαν από Charles River Laboratories (Sulzfeld, Γερμανία). Τα ποντίκια Ragland B6.Thyl.1 ελήφθησαν από το Jackson Laboratory (Bar Harbor, ΜΕ). Όλα τα ποντίκια ήταν σε φόντο C57BL/6J.

Μοντέλο NTS

Το NTS προκλήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, τα ποντίκια προανοσοποιήθηκαν με 2 mg/ml κουνελιού lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) διαλυμένο σε ατελές ανοσοενισχυτικό Freund (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) με αποξηραμένο, μη βιώσιμο Mycobacterium Tuberculosis. Detroit, MI) 3 ημέρες πριν από τη χορήγηση νεφροτοξικού ορού κουνελιού κατά ποντικού. Η αξιολόγηση έγινε μετά από 4 ή 14 ημέρες μετά την ένεση του ορού NTS, όπως υποδεικνύεται.

Μεταφορά κυττάρων σε Rag1-/ποντίκια

Σε ποντίκια Rag{0}}ενέθηκε με 1,5×10 μοίρες CD4 συν Τ κύτταρα από σπλήνες είτε άγριου τύπου (WT) είτε CD30OX40--ποντικών ή κυττάρων CD90.1 WT, και κύτταρα CD90.2 νοκ-άουτ μεταφέρονται θετικά σε αναλογία 1:1. Μία ημέρα μετά τη μεταβίβαση υιοθεσίας, το NTS προκλήθηκε και αξιολογήθηκε μετά από 4 ή 14 ημέρες. Τα CD4 συν Τ κύτταρα απομονώθηκαν από σπλήνες χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης κυττάρων CD4 συν ποντικού (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία).

Πειράματα αποκλεισμού αντισωμάτων

Νεφρικά ποντίκια C57BL/6 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντισώματα αποκλεισμού κατά ποντικού OX40L (κλώνος RM134L) και CD30L (κλώνος RM153) είτε σε συνδυασμό είτε μόνα τους ξεκινώντας την ημέρα της ανοσοποίησης ή 3 ημέρες μετά NTSεπαγωγή. Στα ποντίκια χορηγήθηκε ενδοφλέβια ένεση είτε με 0,5 mg x-OX40L και/ή 0,5 mg a-CD30L μονοκλωνικών αντισωμάτων ή 1 mg IgG ελέγχου (Sigma-Aldrich) 3 φορές την εβδομάδα.

Μέτρηση λευκωματίνης ούρων, κρεατινίνης και κυτοκίνης υπερκειμένου

Για τον προσδιορισμό της απέκκρισης λευκωματίνης στα ούρα, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (εύρος ανίχνευσης,0.781-200 ng/ml) χρησιμοποιήθηκε μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία διπλού σάντουιτς (Abcam, Cambridge, MA). Η κρεατινίνη ούρων αξιολογήθηκε φωτομετρικά χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ με βάση το πικρινικό οξύ (Sigma-Aldrich). Η ανίχνευση κυτοκίνης στα υπερκείμενα πραγματοποιήθηκε όπως υποδεικνύεται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Εκτίμηση της απόκρισης αυτόλογων αντισωμάτων

Οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύχτα με 100 ug/ml IgG κουνελιού (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Στη συνέχεια, ο ορός επωάστηκε σε σειριακές διπλασιαζόμενες αραιώσεις για την ανίχνευση της κυκλοφορούσας Ig αντι-κουνελιού ποντικού. Χρησιμοποιώντας συζευγμένη με υπεροξειδάση χρένου αντι-ποντικού IgG κατσίκας (Jackson ImmunoResearch Laboratories), ανιχνεύθηκε IgG ποντικού κατά κουνελιού.

Αζωτο ουρίας αίματος

Αζωτο ουρίας αίματος

Τα επίπεδα (BUN) στον ορό ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ χρωματομετρικής ανίχνευσης BUN (Invitrogen).

Αξιολόγηση ιστοπαθολογίας και ανοσοπαθολογίας

Αξιολόγηση χρώσης με περιοδικό οξύ-Schiff (PAS).νεφρόοι ενότητες έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως1,2 και στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Χρησιμοποιήθηκε μια τεχνική χρώσης με 3-στρώσεις ανοσοϋπεροξειδάσης για την αξιολόγηση των κυττάρων που διεισδύουν στον ιστό (Συμπληρωματικές Μέθοδοι).

Ανοσοφθορισμός και ομοεστιακή μικροσκοπία

Τα κατεψυγμένα δείγματα ιστού χρωματίστηκαν με σημασμένα με φθορισμό αντισώματα (Συμπληρωματικές Μέθοδοι) και αξιολογήθηκαν σε LSM510 meta (Zeiss, Oberkochen, Γερμανία).

Εικόνα 1| Ο συνδέτης CD30, OX40, ο συνδέτης CD30 (CD30L) και ο συνδέτης OX40 (OX40L) εκφράζονται διαφορικά στα λευκοκύτταρα του σπλήνα σε νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού (NTS). Έκφραση CD30, OX40, CD30L και OX40L σε CD4 συν Τ κύτταρα σε υγιή και νεφρικά ποντίκια C57Bl/6J μετά από 12 ώρες. 24 ώρες, 72 ώρες, 7 ημέρες και 14 ημέρες NTS(n =5 ποντίκια/ ομάδα). Η έκφραση των αντίστοιχων υποδοχέων και προσδεμάτων αξιολογήθηκε σε (α) CD4 συν Τ κύτταρα, (β) CD8T κύτταρα, (γ) Β κύτταρα, (δ) CD11cδενδριτικά κύτταρα, (ε) CD11bLv6G συν ουδετερόφιλα SSChi, (f）CD11btLy6GCD115 συν Ly6C συν κλασικά μονοκύτταρα και (ζ) CD11btLy6G-CD115 συν Ly6C μη κλασικά μονοκύτταρα. Όλα τα δεδομένα δείχνουν εύρη διάμεσων και διατεταρτημορίων. Παρέχονται στατιστικές σημαντικές σε σύγκριση με υγιή ποντίκια.*P<><><0.001,><>

Κυτταρομετρία ροής

Η λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων με χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος λύσης 1 × RBC (eBioscience) πραγματοποιήθηκε με δείγματα αίματος προτού ληφθεί ένα εναιώρημα μονοκυττάρου από αίμα, σπλήνα και λεμφαδένες χρησιμοποιώντας στελέχη κυττάρων 70-um. Απομόνωση κυττάρων απόνεφράδιεξήχθη χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας Percoll μετά από πέψη του λεπτού κιμάνεφράσε μέσο Roswell Park Memorial Institute 1640 (Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με κολλαγενάση D και DNAse Ι στους 37 βαθμούς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Οι χρώσεις και οι αξιολογήσεις με κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού CD4 συν Τ-κυττάρων

Τα CD4 συν Τ κύτταρα επωάστηκαν με Celltrace Violet (CellTrace Violet Cell Proliferation Kit; Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και σπάρθηκαν στα 2,5 × 10/ml για επώαση είτε με 5 ug/ml κονκαναβαλίνη-Α (Sigma-Aldrich) είτε 5 ug/ml φυτοαιμοσυγκολλητίνης (Sigma-Aldrich). Μετά από 7 ημέρες, χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής για την αξιολόγηση της έντασης του Celltrace Violet σε αυτά τα κύτταρα.

Διέγερση σπληνοκυττάρων

Σπληνοκύτταρα από νεφρικά ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ισότυπο αντίσωμα ή αντισώματα xCD30LxOX40L συλλέχθηκαν μετά από 14 ημέρες NTS. Τα σπληνοκύτταρα σπάρθηκαν σε 2 χ 10 τοις εκατό /ml σε φρεάτια επικαλυμμένα με IgG κουνελιού και επαναδιεγέρθηκαν για 24 ώρες πριν από την κυτταρομετρία ροής. Σπληνοκύτταρα από νεφρικά ποντίκια WTand CD30OX40~ (ημέρα 14) σπάρθηκαν σε 2×1097 ml και διεγέρθηκαν με xCD3 (5 ug/ml) και xCD28 (1 ug/ml) (και τα δύο από το eBioscience) για 3 ημέρες πριν από την αξιολόγηση του υπερκειμένου κυτταροκαλλιέργειας .

Πειράματα πόλωσης CD4 συν Τ-κυττάρων

CD4 συν CD62L συν Τ κύτταρα απομονώθηκαν από σπλήνες χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης CD4 συν CD62L συν II (Miltenyi Biotec) και διεγέρθηκαν όπως υποδεικνύεται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.

Αντίστροφη μεταγραφή σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Ολικό RNA εξήχθη από λεμφαδένες καινεφράχρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRI (Sigma-Aldrich) και στη συνέχεια, συντέθηκε cDNA με χρήση κιτ μεταγραφής Superscript II (Invitrogen) και τυχαίων εκκινητών (Invitrogen) για αντίστροφη μεταγραφή 2 ug ολικού RNA. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκε εις διπλούν σε ένα σύστημα πραγματικού χρόνου CFX96 (BioRad, Hercules, CA). Γονίδιο TaqMan

Εικόνα 2| Τα ποντίκια CD30OX40- προστατεύονται από νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού (NTS). CD30OX40-/-ποντίκια, CD30 ποντίκια μονήρης νοκ άουτ και OX40 ποντίκια μεμονωμένα νοκ άουτ, καθώς και άγριου τύπου (WT), μάρτυρες (n =5-6 ποντίκια ανά ομάδα) υποβλήθηκαν σε 14 ημέρες NTS , (α) Η λευκωματουρία και (β) τα επίπεδα αζώτου (BUN) της ουρίας αίματος στον ορό αξιολογήθηκαν. (ce) Αντιπροσωπευτικό περιοδικό οξύ-Schiff (PAS)-χρωματισμένονεφρά, καθώς και οι βαθμολογίες PAS, (στ) η βαθμολογία ημισελήνου, (ζ) η βαθμολογία των ενδομυϊκών θρόμβων, (η) ο σχηματισμός σωληναριακού γύψου και (i) η βαθμολογία οξείας σωληναριακής βλάβης. ()Παρέχονται νεφρικά διηθητικά CD68 συν Τ κύτταρα, (k) ουδετερόφιλα, () κύτταρα CD4T και (m) CD8 συν Τ κύτταρα. Ο συνολικός αριθμός κυττάρων και ο αριθμός των CD45 συν CD4 Τ κυττάρων σε (n) λεμφαδένες και (ο) τη σπλήνα των ποντικών WT και CD30OX40-/- αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (p) Συνολικός αριθμός νεφρικών λευκοκυττάρων που αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής και (g) ποσοστά CD4 συν Τ κύτταρα, CD8 συν Τ κύτταρα, Ly6G συν ουδετερόφιλα SSchi, Ly6C συν μονοκύτταρα και Ly6C μονοκύτταρα σενεφράποντικών CD30OX40 και W. (r) Αξιολογήθηκε το lgG ποντικού έναντι κουνελιού (n=10 ποντίκια/ομάδα). (δ) Εμφανίζεται ο συνολικός αριθμός CD4 συν CD28 συν κύτταρα/λεμφαδένας νεφρικών ποντικών WT (n=7 ποντικών) και CD30OX40-/ (n =5 ποντικών). Αρχική μεγέθυνση ×40. Τα δεδομένα δείχνουν (a,b,r,s) μέσος όρος ± SEM. (c,fg) οι διάμεσοι υποδεικνύονται με μια οριζόντια γραμμή. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά 4 ανεξάρτητων πειραμάτων. Παρέχονται στατιστικές σημαντικές σε σύγκριση με ποντίκια WT.*P<><0.01,><0.001,and>< 0.0001.hpf,="" high-power="" field;="" od,="" optical="" density.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

Χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασίες έκφρασης (Applied Biosystems, Foster City, CA) και SYBR green (BioRad) (Συμπληρωματικές Μέθοδοι).

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αξιολογήσεις (Συμπληρωματικές Μέθοδοι) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 6.0 για Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Δήλωση ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Πειραμάτων σε Ζώα του Υπουργείου της Αυστρίας (BMWFW-66.010/0054-WF/V/3b/2015).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η έκφραση των CD30 και OX40 και των προσδεμάτων τους αλλάζει κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας του NTS σε κύτταρα έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας Η έκφραση CD30 και OX40 αυξήθηκε σε σπληνικά CD4 συν Τ κύτταρα κατά τη διάρκεια του NTS (Εικόνα la). Τόσο τα επίπεδα έκφρασης CD30L όσο και OX40L αυξήθηκαν σημαντικά σε σπληνικά CD4 συν Τ κύτταρα νεφρικών ποντικών μετά από 7 και 14 ημέρες (Εικόνα la). Στα CD4*CD25Foxp3 συν ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs), βρέθηκε παρόμοια αύξηση της έκφρασης CD30, CD30L και OX40 με την πάροδο του χρόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα S1A). Τα CD30, OX40 και OX40L αυξήθηκαν σημαντικά στα κύτταρα Th17 (Συμπληρωματικό Σχήμα S1D) μετά από 14 ημέρες NTS σε σύγκριση με υγιή ποντίκια. Επίσης, τα CD30 και OX40 αυξήθηκαν σημαντικά στα CD8 Τ κύτταρα ξεκινώντας 12 ώρες μετά την επαγωγή του NTS σε σύγκριση με υγιή ποντίκια (Εικόνα 1β). Τα Β κύτταρα έδειξαν παρόμοιο προφίλ έκφρασης με τα CD4 συν Τ κύτταρα (Εικόνα 1c). Το OX40L ρυθμίστηκε προς τα κάτω ήδη μετά από 12 ώρες NTS και παρέμεινε μειωμένο στη συνέχεια στα δενδριτικά κύτταρα (Εικόνα 1δ). Ομοίως, τα CD30L και OX40L ήταν down-CD11b συν Ly6G συν SSChineutrophils, ρυθμισμένα σε Ly6G-CD115 συν Ly6Ct και Ly6G-CD115Ly6C μονοκύτταρα κατά τη διάρκεια του NTS (Σχήμα σκέλους). Στα ουδετερόφιλα, τα δενδριτικά κύτταρα και τα μονοκύτταρα CD30 και OX40 έτειναν να αυξάνονται στο NTS (Εικόνα ld-g). Το CD30L εκφράστηκε όλο και περισσότερο σε εγγενή λεμφοειδή κύτταρα τύπου 2 12 ώρες μετά την επαγωγή του NTS και τα CD30L και OX40L αυξήθηκαν επίσης μετά από 14 ημέρες NTS (Συμπληρωματικό Σχήμα S1B). Ο αριθμός των λευκοκυττάρων που εκφράζουν CD30, CD30L, OX40 και OX40L αυξήθηκε στο NTS, κάτι που ήταν σύμφωνο με τα ευρήματα στα σπληνικά κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα SIE-G). Η έκφραση mRNA Cd30 και Ox40l δεν ήταν ανιχνεύσιμη σενεφράμετά από 7 και 14 ημέρες NTS (Συμπληρωματικό Σχήμα S1H). Ωστόσο, το mRNA Cd30l αυξήθηκε μετά από 7 και 14 ημέρες NTS, ενώ η έκφραση του Ox40 mRNA παρέμεινε αμετάβλητη μετά από 14 ημέρες NTS σενεφρά(Συμπληρωματικό Σχήμα S1H).

Απαιτείται αμοιβαία σηματοδότηση CD30 και OX40 για την ανάπτυξη του φαινοτύπου NTS

Βρήκαμε μειωμένη λευκωματουρία και BUN σε νεφρικά ποντίκια CD30OX40-/ σε σύγκριση με μάρτυρες WT (Εικόνα 2α και β), ενώ η λευκωματουρία σε ποντίκια CD30- και OX40- ήταν συγκρίσιμη με ποντίκια ελέγχου WT (Εικόνα 2α). Σημαντική μείωση παρατηρήθηκε επίσης σενεφρόΘετικότητα PAS, σχηματισμός ημισελήνου, βαθμολογία ενδοαυλικών θρόμβων, σχηματισμός σωληνοειδούς γύψου και βαθμολογία οξείας σωληναριακής βλάβης σε ποντίκια CD30OX40-/ σε σύγκριση με ποντίκια WT (Εικόνα 2c-i). Όλα αυτά τα ιστολογικά χαρακτηριστικά δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά σε μεμονωμένα ποντίκια νοκ-άουτ σε σύγκριση με τους ελέγχους WT (Εικόνα 2c και fi). Βρήκαμε σημαντικά χαμηλότερους αριθμούς μακροφάγων CD68 σε νεφρά ποντικών CD30OX40-- σε σύγκριση με μάρτυρες WT (Εικόνα 2j). Υπήρχε μια τάση προς μείωση του αριθμού τωννεφρό-διηθώντας CD68 συν μακροφάγα σε CD30- και OX40-/- μεμονωμένα ποντίκια νοκ-άουτ (Εικόνα 2j). Τα ουδετερόφιλα και τα CD8 Τ κύτταρα βρέθηκαν σε σημαντικά μειωμένους αριθμούς σενεφράτων ποντικών CD30OX40-σε σύγκριση με τους νεφρικούς ελέγχους WT και των ποντικών CD30-- καθώς και των ποντικών OX40- εμφάνισαν χαμηλότερους αριθμούς ουδετερόφιλων και C8 συν Τ κύτταρα που διεισδύουν στους νεφρούς (Εικόνα 2k και m). Τα CD4 συν Τ κύτταρα βρέθηκαν σε σημαντικά μικρότερους αριθμούς στα νεφρικάνεφράτου CD30OX40--(Εικόνα 2l). Η κυτταρομετρία ροής των νεφρών αποκάλυψε παρόμοια αποτελέσματα μειωμένου αριθμού διεισδυτικών κυττάρων (Εικόνα 2p και q). Αξίζει να σημειωθεί, ότι τα αφελή ποντίκια απλού και διπλού νοκ-άουτ δεν εμφάνισαν διαφορές στη σύνθεση των λευκοκυττάρων του σπλήνα σε σύγκριση με υγιή ποντίκια WT, όταν αξιολογήθηκαν CD4 plus και CD8 plus Τ κύτταρα, ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Η έκφραση των Icos και Gitr μειώθηκενεφράνεφρικών ποντικών CD30OX40-(Συμπληρωματικό Σχήμα S3B). Οι αποκρίσεις των Β-κυττάρων, όπως μετρήθηκαν με IgG αντι-κουνελιού ποντικού, μειώθηκαν σε ποντίκια CD30OX40- σε σύγκριση με μάρτυρες WT (Εικόνα 2r).

Οι αριθμοί CD4 συν Τ-κυττάρων δεν μειώνονται στους λεμφαδένες του CD30OX40-/-ποντίκια

Η κυτταρομετρία ροής δεν αποκάλυψε διαφορά στην ολική κυτταρικότητα των λεμφαδένων και του σπλήνα (Εικόνα 2n και o) ή στον αριθμό των κυττάρων CD4 συν. Είναι ενδιαφέρον ότι επίσης δεν εντοπίσαμε διαφορές στα Tregs μεταξύ ποντικών WT και CD30OX40- (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι κυτοκίνες (TNF-d, ιντερλευκίνη-6, ιντερφερόνη-Υ, ιντερλευκίνη-17, ιντερλευκίνη-4 και ιντερλευκίνη-10) μετρήθηκαν σε υπερκείμενα υγρών επαναδιεγερμένων σπληνοκυττάρων που απομονώθηκαν από Τα ποντίκια WT και CD30OX40-14 ημέρες μετά το NTS δεν παρουσίασαν διαφορά (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).

Τα CD4 plus T κύτταρα με έλλειψη σε CD30 και OX40 αποτυγχάνουν να προάγουν το NTS Για να μελετηθεί ο ρόλος της έκφρασης CD30 και OX40 σε κύτταρα CD4 plus στο NTS, το Rag1- ενέθηκε με κύτταρα CD4 plus (Συμπληρωματικό Σχήμα S4) από σπλήνες WT ή CD30OX40-/ποντίκια. Οι συνολικές μετρήσεις CD4 σπληνικών κυττάρων συν και οι ρυθμοί νεκρών κυττάρων ήταν συγκρίσιμοι την ημέρα 4 μετά την επαγωγή NTS (Συμπληρωματικό Σχήμα S5). Αν και τα ποντίκια Rag1~ που έλαβαν κύτταρα CD4 plus από ποντίκια WT ανέπτυξαν σημαντική λευκωματουρία και BUN μετά από 14 ημέρες NTS, τα ποντίκια Rag1-/ που ανασυστάθηκαν με κύτταρα CD4 plus από ποντίκια CD30OX40 (Εικόνα 3α) δεν το έκαναν. Η ιστολογική βλάβη μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια Ragl1-που έλαβαν CD4 συν Τ κύτταρα από ποντίκια CD30OX40-- σε σύγκριση με κύτταρα WT, όπως προσδιορίστηκε από τη βαθμολογία PAS, τη βαθμολογία ημισελήνου, τη βαθμολογία ενδοαυλικών θρόμβων, τη βαθμολογία οξείας σωληναριακής βλάβης, και σωληνοειδή εκμαγεία (Εικόνα 3b-g). Κύτταρα που διεισδύουννεφράτων ποντικών Ragl, συμπεριλαμβανομένων κυττάρων CD4 plus, CD68 μακροφάγων και Ly6G συν ουδετερόφιλων, μειώθηκαν επίσης σημαντικά εάν τα μεταφερθέντα κύτταρα CD4 plus δεν εξέφραζαν CD30 και OX40 (Εικόνα 3h-k). CD4 συν Τ κύτταρα που απομονώθηκαν από ποντίκια WT που εκφράζουν CD90 Ποντίκια .1 και CD30OX40- που εκφράζουν CD90.2 μεταφέρθηκαν περαιτέρω υιοθετητικά σε Rag1-/ποντίκια σε αναλογία 1:1. Εδώ, οι απόλυτοι αριθμοί CD90.2 που εκφράζουν CD30OX40-- CD4 συν Τ κύτταρα μειώθηκαν στον σπλήνα σε σύγκριση με τα CD90.1 WT CD4 συν Τ κύτταρα (Εικόνα 4t και u), αλλά τα ποσοστά του Ifn-Y (Εικόνα 4α και β), l4 (Εικόνα 4d και e), και Il17 (Εικόνα 4g και h) κύτταρα που παράγουν ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κύτταρα νοκ-άουτ που εκφράζουν CD90.2. Ωστόσο, την ίδια στιγμή, τα μειωμένα ποσοστά των κυττάρων νοκ-άουτ CD90.2 βρέθηκαν να έχουν φαινότυπο Th17 στους νεφρούς σε σύγκριση με τα κύτταρα CD90.1 WT (Εικόνα 4i), ενώ το αντίθετο βρέθηκε για το βοηθητικό κύτταρο και το Τ κύτταρο 2 (Th2 ) κελιά μέσανεφρά(Εικόνα 4γ και στ). Ακόμα, απόλυτοι αριθμοί μεταφερθέντων CD90.2 κυττάρων νοκ-άουτ στονεφρόήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα κύτταρα CD90.1 WT (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

Η ανεπάρκεια CD30 και OX40 διαταράσσει τη μετανάστευση Th17 από τα δευτερεύοντα λεμφοειδή όργανα στους νεφρούς

Ο υποδοχέας χημειοκίνης CXC (CXCR)3 (Εικόνα 4j και k) αυξήθηκε σε κύτταρα CD90.2 CD30OX40-/- σε σύγκριση με κύτταρα CD90.1 WT, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές για την έκφραση CXCR6 (Εικόνα 4l και m) . Το πιο σημαντικό, βρήκαμε μια σημαντική μείωση του υποδοχέα χημειοκίνης CC (CCR) 6 στα CD90.2 νοκ-άουτ κύτταρα (Εικόνα 4n και ο). Στο επόμενο βήμα, τα κύτταρα CD4 συν Τ διεγέρθηκαν in vitro υπό συνθήκες διαφοροποίησης Th1 ή Th17. Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Παρατηρήσαμε μια τάση προς μεγαλύτερη πιθανότητα για διαφοροποίηση Th17 (Εικόνα 5α και) και Th1 (Εικόνα 5γ και δ) των αφελών κυττάρων CD4 συν Τ που απομονώθηκαν από ποντίκια CD30OX40-/- σε σύγκριση με ποντίκια WT in vitro. Συγκεκριμένα, τα CD4 συν Τ κύτταρα που εκφράζουν το CD28 βρέθηκαν σε σημαντικά αυξημένα

Εικόνα 3| Rag1-/ ποντίκια που λαμβάνουν CD4 συν Τ κύτταρα από CD30OX40-/προστατεύονται από νεφροτοξική νεφρίτιδα ορού (NTS). Rag1-/ποντίκια που λαμβάνουν CD4 Τ κύτταρα από οποιονδήποτε άγριου τύπου (WT ) ή ποντίκια CD30OX40-υποβλήθηκαν σε NTS και παρακολουθήθηκαν για 14 ημέρες (n =6 έως 7 ποντίκια ανά ομάδα). ε) Αντιπροσωπευτικό βαμμένο με περιοδικό οξύ-Schiff(PAS).νεφράκαθώς και (β) βαθμολογίες PAS, (C) βαθμολογία ημισελήνου, (δ) βαθμολογία θρόμβων, (t) σωληναριακά εκμαγεία και (ζ) βαθμολογία οξείας σωληναριακής βλάβης. (η) Αριθμοί CD4T κυττάρων (i) CD68 συν μακροφάγα , και (j)Ly6Gt ουδετερόφιλα καθώς και (k) αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται. Αρχική μεγέθυνση×40 (αριθμοί PAS, CD4, [συνέχεια] σε λεμφαδένες νεφρικών ποντικών CD30OX40-/ σε σύγκριση με ποντίκια WT (Εικόνα 2s).

Κάντε κλικ εδώ για το Μέρος 2