ΜΕΡΟΣ 1 Η ακτεοσίδη καταστέλλει την οστεοκλαστογένεση που προκαλείται από το RANKL αναστέλλοντας την επαγωγή του C-Fos και την οδό NF-KB και εξασθενίζοντας την παραγωγή ROS
Mar 07, 2022
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Σουνγκ-Χο Κουκ2, Jeong-Chae Lee2,3*
1 Research Institute of Clinical Medicine of Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, Νότια Κορέα, 2 Department of Orthodontics, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Νότια Κορέα, 3 Τμήμα Επιστημών Βιοδραστικών Υλικών, Ερευνητικό Κέντρο Βιοδραστικών Υλικών, Εθνικό Πανεπιστήμιο Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Νότια Κορέα
Αφηρημένη
Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι οι φλεγμονώδεις κυτοκίνες είναι σημαντικοί μεσολαβητές για την οστεοκλαστογένεση, προκαλώντας έτσι υπερβολική οστική απορρόφηση και οστεοπόρωση.Ακτεοσίδη, η κύρια δραστική ένωση τουΡεχμαννία glutinosa, που χρησιμοποιείται ευρέως στην παραδοσιακή ανατολίτικη ιατρική, έχει αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές δυνατότητες. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότιακτεοσίδηανέστειλε σημαντικά τη διαφοροποίηση και το σχηματισμό οστεοκλαστών από μακροφάγους μυελού των οστών (BMMs) και μακροφάγους RAW264.7 που διεγείρονται από τον ενεργοποιητή υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα-kappaB (NF-kB) (RANKL). Η προκαταρκτική αγωγή με ακτεοσίδη απέτρεψε επίσης την οστική απορρόφηση από τους ώριμους οστεοκλάστες με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.Ακτεοσίδη(10 mM) εξασθένησε την διεγειρόμενη από RANKL ενεργοποίηση της ρ38 κινάσης, των εξωκυτταρικών κινασών που ρυθμίζονται με σήμα και της N-τερματικής κινάσης c-Jun, και επίσης κατέστειλε την ενεργοποίηση NF-kB αναστέλλοντας τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας p65 και του αναστολέα kBa. Επιπλέον, με τη μεσολάβηση RANKL αυξήσεις στην έκφραση του c-Fos και του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων, του κυτταροπλασματικού 1 (NFATc1) και στην παραγωγή του παράγοντα νέκρωσης όγκου-a, της ιντερλευκίνης (IL)-1b , και η IL-6 προφανώς αναστάλθηκαν από την προεπεξεργασία με ακτεοσίδη. Περαιτέρω, προφορικήακτεοσίδημειωμένη οστική απώλεια που προκαλείται από ωοθηκεκτομή και παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκινών για τον έλεγχο των επιπέδων. Τα στοιχεία μας το δείχνουνακτεοσίδηαναστέλλει τη διαφοροποίηση και την ωρίμανση των οστεοκλαστών από τους πρόδρομους οστεοκλαστικούς παράγοντες καταστέλλοντας την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών που ενεργοποιούνται από μιτογόνο και παραγόντων μεταγραφής όπως NF-kB, c-Fos και NFATc1. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότιακτεοσίδημπορεί να δράσει ως αντι-απορροφητικός παράγοντας για τη μείωση της οστικής απώλειας εμποδίζοντας την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών.
Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:emily.li@wecistanche.com
Εισαγωγή
Το οστό αναδιαμορφώνεται συνεχώς από την ισορροπημένη δραστηριότητα οστεοκλαστών και οστεοβλαστών [1]. Οι οστεοκλάστες προέρχονται από αιμοποιητικά πρόδρομα κύτταρα της σειράς μονοκυττάρων/μακροφάγων, ενώ οι οστεοβλάστες είναι της μεσεγχυματικής γραμμής [2]. Η ενεργοποίηση των μη φυσιολογικών οστεοκλαστών ή η μειωμένη οστεοβλαστογένεση μπορεί να διαταράξει την ομοιόσταση των οστών, προκαλώντας τελικά ασθένειες όπως η οστεοπόρωση, η αρθρίτιδα και ο καρκίνος των οστών [3,4]. Η οστεοπόρωση είναι μια κοινή ασθένεια των οστών που οδηγεί σε αυξημένο κίνδυνο κατάγματος. Η πιο κοινή μορφή οστεοπόρωσης προκαλείται από ανεπάρκεια οιστρογόνων στις γυναίκες που βρίσκονται στην εμμηνόπαυση. Φάρμακα όπως τα κορτικοστεροειδή και τα αντιεπιληπτικά μπορεί επίσης να προκαλέσουν ανισορροπία μεταξύ της οστικής απορρόφησης και του σχηματισμού, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε οστεοπόρωση [5]. Πολλοί αντι-απορροφητικοί αναστολείς συμπεριλαμβανομένων των διφωσφονικών, της καλσιτονίνης, των οιστρογόνων και των εκλεκτικών ρυθμιστών των υποδοχέων οιστρογόνων έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης. Αυτοί οι αναστολείς διατηρούν την οστική μάζα αναστέλλοντας τη λειτουργία των οστεοκλαστών [6]. Η θεραπεία υποκατάστασης οιστρογόνων είναι η πιο δημοφιλής θεραπεία για την πρόληψη και τη θεραπεία της μετεμμηνοπαυσιακής οστεοπόρωσης. Ωστόσο, η μακροχρόνια θεραπεία υποκατάστασης οιστρογόνων μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο καρκίνου του ενδομητρίου και του μαστού. Ως εκ τούτου, πολλοί ερευνητές έχουν επικεντρώσει τις προσπάθειές τους στην ανάπτυξη ενός νέου αντι-απορροφητικού παράγοντα που δεν έχει παρενέργειες [7-10]. Επειδή οι οστεοκλάστες λειτουργούν στην οστική απορρόφηση, η συγκεκριμένη αναστολή των οστεοκλαστών θεωρείται ο κύριος στόχος σε πολυάριθμες μελέτες. Οι οστεοκλάστες είναι πολυπύρηνα γιγαντιαία κύτταρα που σχηματίζονται από μονοπύρηνες πρόγονους της οικογένειας μονοκυττάρων/μακροφάγων μέσω του διαδοχικού πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και σύντηξης αιμοποιητικών πρόδρομων κυττάρων [11]. Ο παράγοντας διέγερσης αποικιών μακροφάγων (M-CSF) και ο ενεργοποιητής υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντα (NF)-kB (RANK) (RANKL) είναι βασικοί παράγοντες για τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών[12]. Επιπλέον, αρκετές φλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF) και η ιντερλευκίνη (IL)-1b, συμβάλλουν στην οστεοκλαστογένεση ρυθμίζοντας την επαγωγή του RANKL, της οστεοπρωτεγερίνης και του M-CSF [7,13]. Η δέσμευση RANKL στον υποδοχέα RANK κυτταρικής επιφάνειας έχει ως αποτέλεσμα RANKL/RANK/TNFR
Συμπλέγματα σχετικών παραγόντων (TRAF) που ενεργοποιούν διαδοχικά NFkB και ενεργοποιημένες από μιτογόνο πρωτεϊνικές κινάσες (MAPKs), συμπεριλαμβανομένης της N-τερματικής κινάσης cJun (JNK), της κινάσης p38 και της κινάσης που σχετίζεται με το εξωκυτταρικό σήμα (ERK) [14]. Αυτή η ενεργοποίηση παίζει βασικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της διαφοροποίησης, της ενεργοποίησης και της επιβίωσης των οστεοκλαστών. Το RANKL ενεργοποιεί επίσης την έκφραση μεταγραφικών παραγόντων όπως ο πυρηνικός παράγοντας των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων, το κυτταροπλασματικό 1 (NFATc1) και το-Fos, που είναι απαραίτητοι για την ανάπτυξη οστεοκλαστών. 7,9]. Επομένως, η σηματοδότηση RANKL θεωρείται ο κύριος στόχος των αντι-απορροφητικών παραγόντων που καταστέλλουν την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών και είναι χωρίς κόκαλα.Ακτεοσίδηείναι η κύρια δραστική ένωση του Rehmannia glutinosa, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως στην παραδοσιακή ανατολική ιατρική [15,16].Ακτεοσίδηείναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό και έχει αντι-ηπατοτοξικές, αντιφλεγμονώδεις και αντι-ερεθιστικές δράσεις [17-20]. Το διαπιστώσαμε προηγουμένωςακτεοσίδημειώνει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης και τη βιοσύνθεση μελανίνης ρυθμίζοντας τη σηματοδότηση ERK [21], προστατεύει από τη μεσολάβηση των ουλικών βλαβών που προκαλούνται από τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)[22] και καταστέλλει την κυτταρική βλάβη που προκαλείται από τη μυκοτοξίνη [23]. Αυτές οι επιπτώσεις σχετίζονται στενά μεακτεοσίδητην ικανότητα του να αφαιρεί το ROS και να ρυθμίζει τη σηματοδότηση μέσω MAPK. Ειδικότερα, τα ROS προτείνονται για τη μεσολάβηση των οδών σηματοδότησης που προκαλούνται από το RANKL και των κυτταρικών συμβάντων στους οστεοκλάστες. Η προκαταρκτική θεραπεία με αντιοξειδωτικά ανέστειλε την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση των NF-kB, ERK και IkBa, καταστέλλοντας έτσι την οστεοκλαστογένεση [24]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν έντονα ότι, εκτός από την αντιφλεγμονώδη δράση, και η αντιοξειδωτική δράση είναι ζωτικής σημασίας για έναν αντι-απορροφητικό παράγοντα, επομένωςακτεοσίδημπορεί να καταστείλει την επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστογένεση. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε ανακτεοσίδηέχει θεραπευτική επίδραση στην οστική απώλεια. Εξετάσαμε τις επιπτώσεις τουακτεοσίδησχετικά με τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και την οστική απορρόφηση και τους σχετικούς κυτταρικούς μηχανισμούς χρησιμοποιώντας πειραματικά συστήματα in vitro και in vivo.
Υλικά και μέθοδοι
Δήλωση Δεοντολογίας
Οι πρακτικές φροντίδας και χρήσης των ζώων εγκρίθηκαν από την επιτροπή του Εθνικού Πανεπιστημίου Chonbuk για τη δεοντολογία στη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων (Αρ. άδειας CBU 2010-0007). Όλα τα πειράματα σε αυτή τη μελέτη διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου.
Ποντίκια, Χημικά και Εργαστηριακά Είδη
Θηλυκά ποντίκια ICR ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων αγοράστηκαν από την OrientBio Inc. (Σεούλ, Κορέα) και στεγάστηκαν στους 2261°C και 5565 τοις εκατό υγρασία σε κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Ακτεοσίδη (3,4-διυδροξυ-β-φαιναιθυλο-Οα-ραμνοπυρανόζη συλ-(1R3)-4-Ο-καφεοϋλ-bD-γλυκοπυρανοσίδη· C29H36O15) (Εικ. S1) απομονώθηκε από τα φύλλα της Rehmannia glutinosa. Η ακτεοσίδη διαλύθηκε σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) πριν από τη χρήση. Τα RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 και M-CSF αγοράστηκαν από συστήματα Ε & Α (Minneapolis, MN, ΗΠΑ). Αντισώματα ειδικά για c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa και β-ακτίνη ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Αντισώματα για ρ-ρ38 και ρ38 αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα κιτ CalciumAssay και Osteocalcin (OC) EIA αγοράστηκαν από την BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) και τη Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), αντίστοιχα, για τον προσδιορισμό των βιοχημικών παραμέτρων ορού. Κιτ δοκιμασίας ανθεκτικής στην τρυγική όξινη φωσφατάση (TRAP) ποντικού (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) χρησιμοποιήθηκε επίσης για τη μέτρηση του επιπέδου TRAP5b στον ορό. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, επιπρόσθετα χημικά ελήφθησαν από τη Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) και τα εργαστηριακά προϊόντα ήταν από την SPL Life Sciences (Pochun, Νότια Κορέα).
Κυτταρικές Καλλιέργειες
Κύτταρα μυελού των οστών ελήφθησαν από τις κνήμες και τους μηρούς θηλυκών ποντικών ICR ηλικίας 6 εβδομάδων σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [25]. Το εναιώρημα μυελού των οστών επωάστηκε σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας 100-mm παρουσία 50 ng/ml M-CSF. Μετά από 3 ημέρες, τα προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μακροφάγα μυελού των οστών (BMMs) για να προκαλέσουν οστεοκλαστική διαφοροποίηση. Μερικά κύτταρα μυελού των οστών επωάστηκαν επίσης για 48 ώρες χωρίς M-CSF και τα προσκολλημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο διαφοροποίησης των οστεοβλαστών, όπως περιγράφεται αλλού [25]. Κύτταρα μακροφάγων RAW264.7 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 2 mM L γλουταμίνης και αντιβιοτικά. Αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αντίστοιχη κυτταρική σειρά για BMM για τη διερεύνηση της επίδρασης της ακτεοσίδης στην οστεοκλαστογένεση.
Οστεοκλαστική διαφοροποίηση και χρώση TRAP
Τα BMM υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (0-50 mM) ακτεοσίδης για 2 ώρες πριν από τη διέγερση με 100 ng/ml RANKL. Τα μέσα καλλιέργειας αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα τις ημέρες 2 και 5. Μετά από 7 ημέρες επώασης, οι καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό ρυθμισμένο με PBS παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με TRAP χρησιμοποιώντας κιτ sigma Aldrich σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα θετικά σε TRAP κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο και τα κύτταρα που περιείχαν 3 ή περισσότερους πυρήνες θεωρήθηκαν οστεοκλάστες. Τα κύτταρα RAW 264,7 εκτέθηκαν επίσης σε 100 ng/ml RANKL μετά από προεπεξεργασία με ακτεοσίδη για 2 ώρες και μετά από 7 ημέρες επώασης. τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση TRAP.
Μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων
Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου (WST)-8. Εν συντομία, κύτταρα BMM ή RAW264.7 που καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιείχε 10 τοις εκατό FBS και αντιβιοτικά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM ακτεοσίδη ή φαινολικές ενώσεις όπως κερκετίνη, λουτεολίνη, απιγενίνη ή επιγαλλοκατεχίνη-3-γαλλική (EGCG). Το αντιδραστήριο WST-8 προστέθηκε στις καλλιέργειες μετά από 48 ώρες επώασης. Μετά από επώαση για επιπλέον 4 ώρες, η ειδική απορρόφηση WST{10}}μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, ΗΠΑ).
Δοκιμασία Οστικής Απορρόφησης
Τα BMM (16105 κύτταρα/ml) εναιωρήθηκαν σε a-MEM που περιείχε 50 ng/ml M-CSF και 100 ng/ml RANKL, και στη συνέχεια διαιρέθηκαν σε μια24-πλάκα επικαλυμμένη με νανοκρυστάλλους φωσφορικού ασβεστίου (OAAS{{6} }· Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Νότια Κορέα) σε πυκνότητα 26104 κύτταρα/cm2 με και χωρίς ακτεοσίδη. Μετά από επώαση για 7 ημέρες, τα κύτταρα αφαιρέθηκαν από τις πλάκες με 5 τοις εκατό υποχλωριώδες νάτριο και ο σχηματισμός κοιλωμάτων παρατηρήθηκε κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο. Η απορροφούμενη περιοχή μετρήθηκε επίσης με έναν αναλυτή εικόνας και εκφράστηκε ως ποσοστό της τιμής ελέγχου.
Ανάλυση Western Blot
Τα προϊόντα λύσης ολόκληρων πρωτεϊνών παρασκευάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης όπως περιγράφεται αλλού [26]. Οι κυτοσολικές και πυρηνικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Ίσες ποσότητες εκχυλίσματος πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 12-15 τοις εκατό SDS-PAGE και στυπώθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλίου. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4uC πριν από την επώαση με δευτερεύον αντίσωμα σε ρυθμιστικό αποκλεισμού για 1 ώρα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Eastman-Kodak Co., Rochester, ΝΥ, ΗΠΑ).
Δοκιμασία δραστηριότητας MAPK
Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με ακτεοσίδη για 2 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με RANKL για ένα επιπλέον-30 λεπτό. Οι δραστηριότητες MAPK προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανοσομετρικής ανάλυσης, όπως το κιτ προσδιορισμού p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), κιτ ενζύμου p-ERK (Assay Designs) και κιτ ELISA σάντουιτς p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, MA, ΗΠΑ). Όλες οι διαδικασίες ακολουθούσαν τις οδηγίες του κατασκευαστή και η απορρόφηση μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.
Ηλεκτροφορητική ανάλυση μετατόπισης κινητικότητας (EMSA)
Οι αντιδράσεις δέσμευσης DNA-πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με 10–15 mg πρωτεΐνης σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 ml που περιείχε 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml πολυ (dI-dC), 5 τοις εκατό γλυκερίνη ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM [a-32P] σημασμένων με dCTP ολιγονουκλεοτιδίων και το θραύσμα Klenow της DNA πολυμεράσης. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 6 τοις εκατό, τα οποία ξηράνθηκαν και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Eastman Kodak Co.) για 12-24 ώρες στους 270uC. Οι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες εκκινητών ειδικών για το NF ήταν 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 και 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.
Δοκιμασία λουσιφεράσης NF-kB
Τα μακροφάγα RAW264.7 σε 24-πλάκες φρεατίων επιμολύνθηκαν με 0,8 mg kB-λουσιφεράσης φορέα αναφοράς χρησιμοποιώντας 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με RANKL παρουσία και απουσίαακτεοσίδηγια 24 ώρες. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 ml ρυθμιστικού λύσης αναφοράς (Promega, Madison, WI, USA). Ίσες ποσότητες δειγμάτων πρωτεΐνης τοποθετήθηκαν σε μικροπλάκες 96-πηγαδιού και αναμίχθηκαν με υπόστρωμα λουσιφεράσης. Η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο μικροπλάκας (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Γερμανία). Σε αυτό το πείραμα, ένα διαπερατό πεπτίδιο αναστολέα NF-B (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός αναστολέας kB.
Μέτρηση Κυτοκινών
Τα BMMs ή τα κύτταρα RAW264.7 διεγέρθηκαν με RANKL παρουσία ακτεοζίτη σε 24-πλάκες καλλιέργειας φρεατίων. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας συλλέχθηκαν και αξιολογήθηκαν με ELISA χρησιμοποιώντας ειδικά κιτ OptEIATM για TNF-a-, IL{-1b- και IL{-6- σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR)
Η έκφραση mRNA οστεοκλαστικών δεικτών, όπως c-Fos, NFATc1 και TNF-a, προσδιορίστηκε με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από μακροφάγα με Trizolreagent σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Το cDNA συντέθηκε με 1 mg ολικού RNA χρησιμοποιώντας SuperScriptReverse Transcriptase II και εκκινητές (Invitrogen). Το Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντος PCR κατά τη διάρκεια της ανακύκλωσης με το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ABI 7500 (AppliedBiosystems). Μετά από μετουσίωση στους 95uC για 10 λεπτά, έγινε PCR
Μέτρηση Ενδοκυτταρικού ROS
Ένα μητρικό διάλυμα 29,79-διχλωροδιϋδροφθοροσκεΐνης-διοξεικής (DCFH-DA) (50 mM· Calbiochem, Darmstadt, Γερμανία) παρασκευάστηκε σε DMSO και αποθηκεύτηκε στους 220 uC στο σκοτάδι. Εν συντομία, τα BMM (106 κύτταρα/ml σε 6-πλάκες φρεατίων) καλλιεργήθηκαν με 50 ng/MLM-CSF για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις (0-10 mM) ακτεοσίδης 2 ώρες πριν από τη διέγερση με 100 ng/mlRANKL. Μετά από 1 ώρα συνεπώασης, αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 25 mM DCFH-DA για 30 λεπτά. Ο πράσινος φθορισμός της 29,79-διχλωροφλουορεσκεΐνης (DCF) καταγράφηκε στα 515 nm (FL 1) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) και 10,000 συμβάντα μετρήθηκαν ανά δείγμα.
Επαγωγή οστεοπόρωσης που προκαλείται από ωοθηκεκτομή
Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια ICR (ηλικίας 6 εβδομάδων). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε εικονική επέμβαση (Sham, n=10) ή χειρουργική ωοθηκεκτομή (OVX, n=20) υπό αναισθησία. Μία εβδομάδα μετά την επέμβαση, τα ποντίκια OVX χωρίστηκαν τυχαία σε 2 ομάδες των 10 ποντικών η καθεμία: αμφοτερόπλευρη OVX και αμφοτερόπλευρη OVX συμπληρωμένη με 200 ml PBS που περιείχε 1 mM ακτεοσίδη από το στόμα (ομάδα AC). Από το στόμαακτεοσίδηχορηγήθηκε μία φορά κάθε 3 ημέρες για 8 εβδομάδες μετά την επέμβαση και η ίδια ποσότητα PBS χορηγήθηκε στις ομάδες Sham και OVX. Μετά από 1 ημέρα της τελευταίας χορήγησης, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και στη συνέχεια αναλύθηκαν οι βιοχημικές παράμετροι στον ορό και η 3-διαστατική δομή των οστών.
Προσδιορισμός Βιοχημικών Παραμέτρων Ορού
Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος μέσω καρδιακής παρακέντησης και ο ορός συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση. Τα δείγματα ορού αποθηκεύτηκαν στους 280uC για αναλύσεις βιοχημικών παραμέτρων. Τα επίπεδα ορού της IL-1b και της IL-6 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ELISA όπως περιγράφεται παραπάνω, ενώ η δραστηριότητα της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) προσδιορίστηκε με τη χρήση βιοχημικής χρωματομετρικής ανάλυσης που μετρά την ποσότητα του p -νιτροφαινόλη που παράγεται από ένα υπόστρωμα φωσφορικής π-νιτροφαινόλης, όπως περιγράφεται αλλού [27]. Για την εκτίμηση των βιοδεικτών του σχηματισμού και της απορρόφησης των οστών, τα επίπεδα OC, ασβεστίου και TRAP5b ορού προσδιορίστηκαν επίσης σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών.
Αναλύσεις Οστικής Δομής και Μορφομετρικών Παραμέτρων
Το μηρό των ποντικών (ομάδες Sham, OVX και AC) αποκόπηκε και γεμίστηκε με φυσιολογικό ορό για μηχανικό έλεγχο. Η μηχανική αντοχή του μηριαίου οστού μετρήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [28]. Το φορτίο κατάγματος καταγράφηκε ως η μέγιστη δύναμη σε Newton στο σημείο που ο μεσαίος άξονας του δεξιού μηριαίου οστού έσπασε. Επιπλέον, το ελαφρύ μηριαίο οστό κάθε ζώου αναλύθηκε ιστομορφομετρικά χρησιμοποιώντας σύστημα τομογραφίας μικροϋπολογιστή (micro-CT) (SkyScan 1076 microfocus ray system, Kontich, Βέλγιο). Εν συντομία, τα οστά σε αποθήκευση 4 τοις εκατό φορμαλδεΰδης ξηράνθηκαν επιφανειακά σε χαρτί πριν τυλιχτούν σε πλαστικό «φιλμ προσκόλλησης» ή σε παραφίλμ, για να αποφευχθεί η ξήρανση κατά τη σάρωση. Κάθε τυλιγμένο με πλαστικό οστό τοποθετήθηκε σε σωλήνες από πλαστικό/αφρώδη πολυστυρένιο που τοποθετήθηκαν κάθετα οριζόντια στον θάλαμο δείγματος του σαρωτή 1076 για απεικόνιση μικρο-CT. Η σάρωση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τάση πηγής 100 kV και ρεύμα πηγής 140 mA με ανάλυση 35 mm. Τρισδιάστατα μοντέλα των δοκιδωτών οστών του μηριαίου οστού ανακατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας SkyScan CT Analyzer έκδοση 1.11. Οι δομικές παράμετροι όπως η δοκιδωτή οστική πυκνότητα (BMD, g/cm3), τοις εκατό όγκος οστού (όγκος οστού (BV)/ όγκος ιστού (TV), τοις εκατό), το πάχος (Tb.Th, mm), ο διαχωρισμός (Tb.Sp , mm) και ο αριθμός (Tb.N, 1/mm) στη συνέχεια μετρήθηκαν.
Δοκιμασία Οστεογονικής Διαφοροποίησης και Μεταλλοποίησης
Κύτταρα μυελού των οστών που καλλιεργήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας {{{{10}}}}φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DAG (10 ηΜ δεξαμεθαζόνη, 50 mM ασκορβικό οξύ και 20 mM β-γλυκεροφωσφορικό) παρουσία 10 mM ακτεοσίδης. Μετά από 2 εβδομάδες διαφοροποίησης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη 70 τοις εκατό (όγκος/όγκος) αιθανόλη για 1 ώρα και χρωματίστηκαν με 0,2 τοις εκατό alizarin red Sin απεσταγμένο νερό για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού τα κύτταρα αποχρωματίστηκαν και ξηράνθηκαν στον αέρα, οι πλάκες κυτταροκαλλιέργειας αξιολογήθηκαν με μικροσκόπιο φωτός χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon TS100, Ιαπωνία). Για να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα της κόκκινης βαφής, η χρώση εκλούστηκε με 10 τοις εκατό χλωριούχο ακετυλοπυριδίνιο με ανακίνηση για 20 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 560 nm. Η ποσότητα ασβεστίου που εναποτέθηκε στις κυτταρικές στοιβάδες μετρήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας κιτ ασβεστίου (Wako Chemical Inc. Osaka, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επιπλέον, η έκφραση των ειδικών για τα οστά δεικτών mRNA, όπως ο μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται με το τρύπημα-2(Runx2), το osterix, η σιαλοπρωτεΐνη των οστών (BSP) και το OC προσδιορίστηκε με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές αυτών των δεικτών σχεδιάστηκαν με μεγέθη προϊόντων μικρότερα από 200 bp χρησιμοποιώντας PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) όπως περιγράφεται αλλού[27].
Στατιστική ανάλυση
Εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά, όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση 6 τυπική απόκλιση (SD) 3 ή περισσότερων ανεξάρτητων πειραμάτων. Χρησιμοποιήθηκε μια μονόδρομη ANOVA για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS έκδοσης 12.{4}}. Μια τιμή p ,0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.
Αποτελέσματα
Το Acteoside αναστέλλει το σχηματισμό οστεοκλαστών από μακροφάγους με τρόπο δοσοεξαρτώμενο
Για να επαληθευτεί η επίδραση της ακτεοσίδης στη διαφοροποίηση της ΒΜΜ σε οστεοκλάστες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις ({0}}-20 mM) ακτεοσίδης για 7 ημέρες παρουσία 50 ng/ml Μ CSF και 100 ng/ml RANKL . Η ακτεοσίδη μείωσε τον αριθμό των οστεοκλαστών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 10 mM ακτεοσίδη για 2 ώρες, ο αριθμός οστεοκλαστών μειώθηκε κατά 43 τοις εκατό σε σύγκριση με κύτταρα που συμπληρώθηκαν με M-CSFand RANKL (Εικ. 1Α). Το Σχ. 1Β δείχνει τη διαφοροποίηση οστεοκλαστών που προκαλείται από RANKL και την αναστολή της με συνδυασμένη θεραπεία με ακτεοσίδη. Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, η προεπεξεργασία με ακτεοσίδη μείωσε τη διεγειρόμενη από RANKL διαφοροποίηση των κυττάρων RAW264.7 και τον σχηματισμό οστεοκλαστών (Εικ. 1C και D). Όταν το αντιοστεοκλαστικό δυναμικό της ακτεοσίδης σε ΒΜΜ συγκρίθηκε με το δυναμικό κατά των οστεοκλαστών πολλών φαινολικών ενώσεων στην ίδια συγκέντρωση (10 mM), η λουτεολίνη έδειξε την υψηλότερη δραστικότητα (Εικ. 2Α). Ωστόσο, η ίδια η λουτεολίνη, η κερκετίνη ή η απιγενίνη μείωσαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 2Β). Όλες οι ενώσεις ανέστειλαν την οστεοκλαστική διαφοροποίηση από τα μακροφάγα RAW264.7 με τις ακόλουθες σχετικές δραστηριότητες: λουτεολίνη. κερκετίνη=απιγενίνη .EGCG=ακτεοσίδη (Εικ. 2C). Η λουτεολίνη, η κερκετίνη ή η ίδια η απιγενίνη έδειξαν επίσης τη μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 2D). Αντίθετα, η θεραπεία με κερσετίνη προκάλεσε μόνο σημαντική μείωση της βιωσιμότητας τόσο στα κύτταρα BMM όσο και στα κύτταρα RAW264.7, όταν αυτά τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 mM κάθε ένωσης για 2 ημέρες με 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, ή και τα δύο (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Όταν η συγκέντρωση αυτών των ενώσεων απαιτείται για την αναστολή του 50 τοις εκατό των
Ο σχηματισμός οστεοκλαστών σε ΒΜΜ (IC50) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας καμπύλες συγκέντρωσης-δραστικότητας, η IC50 ακτεοσίδης, κερκετίνης, λουτεολίνης, απιγενίνης και EGCG ήταν 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 και 6,6 mM, αντίστοιχα (Εικ. 2Ε). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο με την περίπτωση που εξετάστηκαν τα μακροφάγα RAW264.7. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η λουτεολίνη και η κερκετίνη είχαν αντικλαστογονικές δράσεις υψηλότερες από την ακτεοσίδη. Αντίθετα, η κερσετίνη στο IC50 είχε επίσης μια ήπια τοξική επίδραση στα κύτταρα (τα δεδομένα δεν φαίνονται).
ΑκτεοσίδηΑναστέλλει την απορρόφηση των οστών από μακροφάγα Η ακτεοσίδη εμπόδισε επίσης την οστική απορρόφηση που προκαλείται από το RANKL με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, όπως μετρήθηκε από ένα σύστημα μοντέλου in vitro (Εικ. 3Α). Η οστική απορρόφηση ανεστάλη σημαντικά όταν τα BMM επωάστηκαν με 1 mM ακτεοσίδη (Εικ. 3Β). Μια επεξεργασία 10 mM ακτεοσίδης εξασθένησε σχεδόν πλήρως το σχηματισμό κοιλωμάτων που προκλήθηκε από RANKL από BMM. Ομοίως, η ακτεοσίδη μείωσε την οστική απορρόφηση σε κύτταρα RAW264.7 που διεγείρονται από RANKL (Εικ. S2A και B). Η ικανότητα τουακτεοσίδηγια την αναστολή της οστικής απορρόφησης εξαρτιόταν από το χρόνο της θεραπείας σε σχέση με τη διέγερση RANKL. Η ακτεοσίδη (10 mM) που προστέθηκε 4 ημέρες μετά τη διέγερση RANKL δεν μείωσε τον σχηματισμό κοιλωμάτων στα ΒΜΜ, ενώ κατέστειλε τον αριθμό των οστεοκλαστών που σχηματίστηκαν (Εικ. 3C). Αυτό το διαφορετικό αποτέλεσμα οφειλόταν εν μέρει στην περιοχή του λάκκου που είχε ήδη σχηματιστεί μετά από 4 ημέρες σχηματισμού διέγερσης RANKL (Εικ. 3D).
ΑκτεοσίδηΡυθμίζει προς τα κάτω τα Early RANKL Signaling Pathways
Το RANKL επάγει την ενεργοποίηση 3 γνωστών MAPK και NF-kB σε πρόδρομους οστεοκλάστες και αυτή η ενεργοποίηση απαιτείται για την πρώιμη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Για να κατανοήσουμε τους πιθανούς μηχανισμούς με τους οποίους η ακτεοσίδη αναστέλλει την οστεοκλαστογένεση, διερευνήσαμε την επίδραση της ακτεοσίδης στα MAPKs και την ενεργοποίηση του NF-B σε μακροφάγους. Τα κύτταρα BMM και RAW264.7 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 10 mM ακτεοσίδη για 2 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 100 ng/ml RANKL για 30 λεπτά. Η φωσφορυλίωση ΜΑΡΚ εξετάστηκε με στύπωμα Western και ανοσομετρική ανάλυση. Η RANKL προκάλεσε φωσφορυλίωση των ρ38, ERK και JNK σε ΒΜΜ (Εικ. 4Α) και RAW264.7 κυττάρων (Εικ. 4Β). Το Acteoside απέτρεψε αυτές τις επαγόμενες από το RANKL αυξήσεις στα p-p38, p-ERK και p-JNK. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίχθηκε από ανοσομετρική ανάλυση, η οποία αυτή η προεπεξεργασία με 10 mM ακτεοσίδη ανέστειλε σημαντικά τα επίπεδα φωσφορυλιωμένων MAPK σε αυτά τα μακροφάγα (Εικ. 4C). Η θεραπεία με RANKL αύξησε τη δέσμευση DNA του NF-kB, ενώ η ακτεοσίδη ανέστειλε την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση της σύνδεσης NF-kB-DNA (Εικ. 5Α). Αυτή η αναστολή ήταν πιο εμφανής στα BMM παρά στα κύτταρα RAW264.7. Η ακτεοσίδη μείωσε επίσης τη διεγερμένη από RANKL φωσφορυλίωση p65 και IkBa σε κύτταρα ΒΜΜ και RAW264.7 (Εικ. 5Β και C). Η προσθήκη 10 mMacteoside ανέστειλε σχεδόν πλήρως τόσο την αποικοδόμηση όσο και την ενεργοποίηση του IkBa σε BMM (Εικ. 5Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι η ενεργοποίηση NF kB εμπλέκεται στη δράση της ακτεοσίδης, τα κατασκευάσματα προαγωγέα kB-λουσιφεράσης επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα RAW264.7. Τα κύτταρα που επωάστηκαν με 100 ng/ml RANKL είχαν 3- φορές υψηλότερη δραστικότητα προαγωγέα kB, η οποία εξασθενούσε σημαντικά από 10 mM ακτεοσίδη (Εικ. 5D).
Το Acteoside καταστέλλει την παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκινών και την έκφραση των TNF-a, c-Fos και NFATc1 σε RANKL-διεγερμένα μακροφάγα
Οι TNF-a, IL-1b και IL-6 είναι σημαντικοί στον σχηματισμό και τη λειτουργία οστεοκλαστών, η οποία διαμεσολαβείται από τη σηματοδότηση NF-kB σε μακροφάγους που διεγείρονται από τοRANKL. Το RANKL διέγειρε την παραγωγή αυτών των κυτοκινών και αυτή η παραγωγή μειώθηκε σημαντικά κατά 10 mM προεπεξεργασία με ακτεοσίδη σε ΒΜΜ (Εικ. 6Α). Ομοίως, η ακτεοσίδη εξασθένησε την επαγόμενη από το RANKL παραγωγή κυτοκινών, εκτός από την IL-6, σε μακροφάγους RAW264.7 (Εικ. S3). Για να κατανοήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς της δράσης της ακτεοσίδης στην οστεοκλαστογένεση, εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της ακτεοσίδης στην έκφραση των TNF-a, c-Fos και NFATc1. Το RANKL ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση mRNA αυτών των παραγόντων σε κύτταρα BMM και RAW264.7 (Εικ. 6Β και C). Η προεπεξεργασία με 10 mM ακτεοσίδη ανέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από το RANKL έκφραση αυτών των παραγόντων και στα δύο
BMM και κελιά RAW264.7. Η προεπεξεργασία με ακτεοσίδη μείωσε επίσης έντονα τα επίπεδα πρωτεΐνης του c-Fos και του NFATc1 σε διεγερμένα από RANKL BMMs (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότιακτεοσίδηρυθμίζει προς τα κάτω τους μεσολαβητές του σχηματισμού οστεοκλαστών που επάγουν RANKL σε επίπεδα γονιδίων και πρωτεϊνών.
Το Acteoside μειώνει την ενδοκυτταρική παραγωγή ROS στα BMM με τρόπο δοσοεξαρτώμενο
Δεδομένου ότι είναι γνωστό ότι η ενδοκυτταρική παραγωγή ROS συσχετίζεται με την οστεοκλαστογένεση που διεγείρεται από το RANKL, ερευνήσαμε εάν η ακτεοσίδη αναστέλλει την παραγωγή ROS κατά τη διαφοροποίηση οστεοκλαστών με τη μεσολάβηση RANKL χρησιμοποιώντας μια διαπερατή από κύτταρα, ευαίσθητη στην οξείδωση βαφή, DCFH-DA. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι το μέσο σήμα φθορισμού που είναι ειδικό για DCF σε BMMs ήταν προφανώς μετατοπισμένο προς τα δεξιά μετά από διέγερση με RANKL, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 7Α). Αυτή η μετατόπιση ήταν παρόμοια με την περίπτωση που παρατηρήθηκαν μακροφάγα RAW264.7 μετά από διέγερση RANKL (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Η θεραπεία των ΒΜΜ με ακτεοσίδη μείωσε την ένταση του σήματος του DCF με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Η προαγωγή με 10 mM ακτεοσίδη μείωσε σχεδόν πλήρως τα επίπεδα του ενδοκυτταρικού ROS που παρήχθη κατά τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών στα επίπεδα ελέγχου που δεν είχαν υποβληθεί σε θεραπεία (Εικ. 7Β).
Η από του στόματος χορήγηση ακτεοσίδης αναστέλλει την αλλαγή των οστεοπορωτικών βιοχημικών δεικτών και την οστική απώλεια σε ποντίκια με ωοθηκεκτομή
Για να διερευνήσουμε την επίδραση της ακτεοσίδης στην οστική απώλεια, ετοιμάσαμε ένα μοντέλο οστεοπορωτικού ζώου με ωοθηκεκτομή. Δεν υπήρξε σημαντική διαφορά στο σωματικό βάρος μεταξύ OVX και Shammice κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ομάδα είχε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ορού IL-1b και IL-6 από την ομάδα Sham (Εικ. 8). Οι επαγόμενες από ωοθηκεκτομή αυξήσεις σε αυτές τις φλεγμονώδεις κυτοκίνες εξασθενήθηκαν με χορήγηση από του στόματος ακτεοσίδης (ομάδα AC). Τα επίπεδα ορού των δεικτών οστικής εναλλαγής όπως ALP, ασβέστιο, TRAP5b και OC αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα OVX. Από αυτούς τους οστεοπορωτικούς δείκτες, τα αυξημένα επίπεδα ασβεστίου, TRAP5b και OC σε ποντικούς OVX προφανώς ανεστάλησαν από τη θεραπεία με ακτεοσίδη, ενώ το επίπεδο της ALP στον ορό δεν άλλαξε από τη θεραπεία. Το μέσο μέγιστο φορτίο κατάγματος στο μέσο του δεξιού μηριαίου άξονα ήταν σημαντικά χαμηλότερο στην ομάδα OVX από ότι στην ομάδα Sham (Εικ. 9Α). Η θεραπεία με ακτεοσίδη αύξησε το μέγιστο εφεδρικό κάταγμα σε αυτό της ομάδας Sham. Όταν το φλοιώδες οστό του μηριαίου οστού αποκόπηκε και παρατηρήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο, τα οστεοπορωτικά χαρακτηριστικά που φαίνονται στην ομάδα OVX είχαν σχεδόν εξαφανιστεί εντελώς σε ποντικούς AC (Εικ. 9Β). Για να επαληθευτεί η επίδραση της ακτεοσίδης στο μοντέλο οστεοπόρωσης που προκαλείται από OVX, η BMD και οι μορφολογικές παράμετροι των οστών στην δοκιδωτή του ελαφρού εγγύς μηριαίου οστού αναλύθηκαν με μικρο-CT. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9C, μια αλλαγή της μηριαίας δοκιδωτής αρχιτεκτονικής βρέθηκε σε ποντικούς OVX, ενώ αυτή η αλλαγή μειώθηκε με θεραπεία με ακτεοσίδη. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση μικρο-CT αποκάλυψαν ότι η BMD, ένα μέτρο της αντοχής των οστών, μειώθηκε δραματικά σε OVXmice (Εικ. 9D). Σε σύγκριση με την ομάδα Sham, τα ποντίκια OVX παρουσίασαν επίσης σημαντικές αλλαγές στο BV/TV, Tb. Sp, και Tb. Ν, αλλά όχι Τβ.Θ. Η από του στόματος θεραπεία με ακτεοσίδη ποντικών OVX απέτρεψε σημαντικά την αλλαγή στην BMD καθώς και στο BV/TV και στο Tb.N.
