Το οξειδωτικό στρες, ο δυσλειτουργικός ενεργειακός μεταβολισμός και οι αποσταθεροποιητικοί νευροδιαβιβαστές άλλαξαν το εγκεφαλικό μεταβολικό προφίλ σε ένα μοντέλο αρουραίου με προσομοίωση κορεσμού Heliox σε 4.0 MPa Ⅱ.

Διαδικασία εξαγωγής ιστού

Η διαδικασία εξαγωγής πολικών μεταβολιτών από δείγματα ιστών ήταν μια μικρή τροποποίηση όπως αναφέρθηκε [18]. Τα προζυγισμένα κατεψυγμένα δείγματα ιστών αποψύχθηκαν σε πάγο και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μηχανική ομογενοποίηση σε ένα παγωμένο σύστημα διαλύτη μεθανόλης-χλωροφόρμιου-νερού ποιότητας HPLC (400 μL, 400 μL και 285 μL, αντίστοιχα, ανά 100 mg εγκεφαλικού ιστού) με χρήση ομογενοποιητή ιστών (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Γαλλία). Τα ομογενοποιήματα που προέκυψαν διατηρήθηκαν σε πάγο για μια περίοδο 30 λεπτών και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στους 12,000 xg για μια περίοδο 10 λεπτών στους 4°C. Το υπερκείμενο κάθε δείγματος στη συνέχεια αφαιρέθηκε και λυοφιλοποιήθηκε για να ληφθεί μια σκόνη που περιέχει πολικούς μεταβολίτες σε ξηραντήρα ψύξης (FD-1A-80, BIOCOOL, China). Κάθε δείγμα σκόνης στη συνέχεια ανασυστάθηκε με 550 μL ρυθμιστικού διαλύματος PBS με 0,1 τοις εκατό TSP και όλα τα δείγματα στη συνέχεια αναμίχθηκαν επιμελώς και φυγοκεντρήθηκαν στα 12,000 xg για μια περίοδο 20 λεπτών στους 4˚C. Ένα κλάσμα 500 μL υπερκειμένου μεταφέρθηκε στη συνέχεια σε σωλήνα NMR διαμέτρου 5,0 mm (Norrel, UK). Η αρχή της εκχύλισης της πρωτεΐνης στο δείγμα του φλοιού ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως χωρίς τροποποιήσεις. Η ακριβής ποσότητα δειγμάτων φλοιού χύθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 τοις εκατό Triton X-100, απροτινίνη, πεπστατίνη Α και λευπεπτίνη 10 ug/ml το καθένα) και ομογενοποιούνται χειροκίνητα σε παγόλουτρο. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στο 1,000 xg για μια περίοδο 10 λεπτών στους 4°C και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για τις ποσοτικοποιημένες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Bradford.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε την αντιοξειδωτική λειτουργία Cistanche

Βιοχημική ανάλυση

Εφαρμόστηκε μια ευαίσθητη, ανταγωνιστική, συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) με κιτ προσδιορισμού για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταβολικών ενζύμων Na-KATPase και AChE και των νευροδιαβιβαστών DA, E, NE, 5HT και GABA. Η ELISA προσδιόρισε επίσης τα επίπεδα SOD, MDA και GPx στον φλοιώδη ιστό με κιτ ανάλυσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μέτρηση NMR

Ο αποτελεσματικός ποσοτικός προσδιορισμός των μεταβολιτών των ιστών επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια αναλυτική πλατφόρμα που βασίζεται σε υγρό φασματόμετρο NMR υψηλής ανάλυσης Bruker Avance-III εξοπλισμένο με κρυογονικό ανιχνευτή υψηλής ευαισθησίας που λειτουργεί σε συχνότητα 600. 17 MHz για παρατήρηση 1 Η στους 298 Κ. Εφαρμόστηκε μια μονοδιάστατη ακολουθία παλμών 1 H ZGPR (TOPSPIN έκδοση 3.0, Bruker Biospin) κατασταλμένη από νερό (RD{12}}˚-ACQ) σε λήψη δεδομένων NMR για κάθε δείγμα. Τέσσερις εικονικές σαρώσεις και 128 μεταβατικές καταστάσεις καταγράφηκαν σε ένα χρονικό πεδίο σημείων δεδομένων 32 K χρησιμοποιώντας φασματικό πλάτος 20 ppm με καθυστέρηση χαλάρωσης 10,0 s και χρόνο απόκτησης 2,73 s. Μια εκθετική συνάρτηση διεύρυνσης γραμμής 0,3 Hz και μηδενική πλήρωση στα 64 K σημεία δεδομένων εφαρμόστηκαν σε όλες τις ελεύθερες επαγωγικές διασπάσεις (FIDs) πριν από τον μετασχηματισμό Fourier. Επιπρόσθετες δισδιάστατες τεχνικές NMR με φασματοσκοπία συσχέτισης κλίσης παλμικού πεδίου (gCOSY) και φασματοσκοπία 2D ομοπυρηνικής ολικής συσχέτισης (TOCSY) χρησιμοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τυπικά προγράμματα παλμών σε επιλεγμένα δείγματα για να επιβεβαιωθούν οι εκχωρήσεις χημικής μετατόπισης. Ένας αυτοματοποιημένος εναλλάκτης δειγμάτων για συνεχή παράδοση δείγματος χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση όλων των φασμάτων.

Αναγνώριση και επιβεβαίωση μεταβολίτη

Τα σήματα NMR με βάση τη θέση των μεμονωμένων συντονισμών στα φάσματα ταυτοποιήθηκαν στο πακέτο λογισμικού Chenomx NMR Suite v. 8.4 (έκδοση αξιολόγησης). Οι επιβεβαιώσεις ορισμένων εκχωρήσεων μεταβολιτών πραγματοποιήθηκαν λαμβάνοντας υπόψη τις χημικές μετατοπίσεις, τις σταθερές σύζευξης και τα μοτίβα πολλαπλότητας των μεταβολιτών ως πληροφορίες για βαθμωτές συζεύξεις που εξάγονται από 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, δημόσιες βάσεις δεδομένων NMR όπως COLMAR και Human Metabolome Βάση δεδομένων (HMDB) και βιβλιογραφία [18, 19].

Πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση

Το πρωτόκολλο προεπεξεργασίας που χρησιμοποιήθηκε για την προεπεξεργασία κάθε φάσματος 1D 1 H NMR ήταν το ίδιο με αυτό που περιγράφηκε στην προηγούμενη εργασία μας [20]. Τα φάσματα 1H NMR υποβλήθηκαν σε φάση και διορθώθηκαν στη γραμμή βάσης χρησιμοποιώντας MestReNova (Mestrelab Research, SL, Ισπανία) και η φασματική περιοχή κάθε μεταβολίτη ενσωματώθηκε σε έναν κάδο. Οι συντονισμοί του σήματος οργανικού διαλύτη και της υπολειπόμενης περιοχής σήματος H2O/HOD αφαιρέθηκαν σε όλα τα φάσματα 1D1H NMR. A 0.{{30}}Η διαδικασία κάδου 03 Hz και η κανονικοποίηση στο άθροισμα της φασματικής έντασης πολλαπλασιαζόμενη επί 10000 εφαρμόστηκαν σε όλα τα φάσματα. Μόνο οι μεγαλύτερες τιμές κάδου σε μία κορυφή επιλέχθηκαν για την ανάλυση του επόμενου βήματος για να αποφευχθεί η παρερμηνεία των διακρινόμενων μεταβολιτών λόγω αλληλεπικαλυπτόμενων σημάτων. Στη συνέχεια, εκχυλίστηκαν ενσωματωμένοι κάδοι 47 μεταβολιτών και υποβλήθηκαν σε μονομεταβλητή και πολυμεταβλητή ανάλυση δεδομένων. Η ανάλυση αδιάκρισης με ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) και η ανάλυση διάκρισης με μερική ανάλυση ελάχιστων τετραγώνων-διάκρισης (PLS-DA) και ορθογώνιες προβολές σε λανθάνουσες δομές, ανάλυση διάκρισης (OPLS-DA) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics , Umeå, Σουηδία) σε κλίμακα δεδομένων διακύμανσης μονάδας. Τα διαγράμματα βαθμολογίας PCA και PLS-DA απεικονίστηκαν με την πρώτη και τη δεύτερη κύρια συνιστώσα (t[1], t[2]), ενώ η γραφική παράσταση βαθμολογίας OPLS-DA χρησιμοποίησε t[1] και την ορθογώνια συνιστώσα (σε [1 ]). Οι παράμετροι Q2 (cum), R2Y (cum) και R2X (cum) υπολογίστηκαν για να δοκιμαστεί η ευρωστία των μοντέλων διάκρισης έναντι της υπερπροσαρμογής [21]. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, μια τιμή αξιολόγησης ποιότητας Q2 £ 0,4 θεωρείται αξιόπιστο μοντέλο. Η επταπλή στρατηγική διασταυρούμενης επικύρωσης και η δοκιμή μετάθεσης 200 φορές με το πρώτο εξάρτημα εφαρμόστηκαν για προστασία από την υπερβολική προσαρμογή του μοντέλου και περαιτέρω επικύρωση της αξιοπιστίας και της αξιοπιστίας των μοντέλων. Εάν η γραμμή παλινδρόμησης Q2 είχε αρνητική τομή και οι τιμές Q2 που τοποθετήθηκαν στο αριστερό σημείο ήταν μεγαλύτερες από όλες τις τιμές Q2 των δεξιών σημείων στη μετάθεση δοκιμής, το καθιερωμένο μοντέλο OPLS-DA ήταν ισχυρό [22]. Η προεπιλεγμένη 10-στρατηγική πολλαπλής επικύρωσης εφαρμόστηκε για προστασία από την υπερβολική προσαρμογή του μοντέλου. Γενικά, μια στατιστική αξιολόγησης ποιότητας (Q2) � 0,4 θεωρείται αξιόπιστο μοντέλο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι συντελεστές συσχέτισης (r) και οι τιμές VIP που εξήχθησαν από τα μοντέλα OPLS-DA χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό μεταβολιτών που συνέβαλαν σημαντικά στον διαχωρισμό μεταξύ των δύο ομάδων. Επιπρόσθετα, οι αναδιπλούμενες αλλαγές των μεταβολιτών μεταξύ των ομάδων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μια συνάρτηση. ΙΑ/ΙΒ, όπου τα ΙΑ και ΙΒ αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές για το ολοκλήρωμα μεταβολίτη στις ομάδες Α και Β, αντίστοιχα. Οι χάρτες θερμότητας και τα διαγράμματα κουτιών σχεδιάστηκαν για να διευκολυνθεί η κατανόηση των παραλλαγών του μεταβολίτη μεταξύ των ομάδων.

Μονομεταβλητές στατιστικές των ολοκληρωμάτων μεταβολιτών

Ο μέσος όρος των μεταβολιτών σε κάθε ομάδα εκφράζεται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Διεξήχθη επίσης μονομεταβλητή ανάλυση χρησιμοποιώντας ANOVA (ανάλυση διακύμανσης). Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν με ένα μη ζευγαρωμένο t-test δύο ουρών μετά από μετατροπή λογαριασμών στο λογισμικό GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Στατιστικά σημαντικές διαφορές ορίστηκαν από τις τιμές του p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Συστημική στατιστική ανάλυση μεταβολικής συσχέτισης και ιεραρχική ανάλυση συστάδων

Ο υπολογισμός του συντελεστή συσχέτισης Pearson και η ιεραρχική ανάλυση συστάδων πραγματοποιήθηκαν με βάση τα σχετικά ολοκληρώματα μεταβολιτών στο R Studio (έκδοση 1.4.1717) με μικρά σενάρια. Για κάθε ζεύγος ομάδας, ο πίνακας συσχέτισης απεικονίστηκε σε έναν χάρτη pixel όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία [21]. Εν συντομία, για κάθε μεταβλητή σε μία ομάδα, συσχετίσεις με τιμές p μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές στατιστικές συσχετίσεις και διατηρήθηκαν για την κατασκευή του τελικού δικτύου συσχέτισης για να απεικονιστούν οι λανθάνουσες σχέσεις των μεταβολιτών εντός του ομάδα και τις διαταραγμένες μεταβολικές σχέσεις μεταξύ των ομάδων. Τα πιο κόκκινα τετράγωνα δείχνουν μια πιο σημαντική θετική συσχέτιση. Τα πιο μπλε τετράγωνα δείχνουν μια πιο σημαντική θετική συσχέτιση. Τα λευκά τετράγωνα δείχνουν τη συσχέτιση χωρίς σημασία. Η ανάλυση των πιο σχετικών εγκεφαλικών μεταβολικών μονοπατιών και δικτύων που επικαλέστηκαν ως ανταποκριθέντες στο HSD πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο MetaboAnalyst 3.0. Για την ανάλυση τοπολογίας μονοπατιού που πραγματοποιήθηκε, επιλέχθηκε η βιβλιοθήκη οδών θηλαστικών Rattus norvegicus (αρουραίος). Αυτή η προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε επίσης για να παρέχει εκτιμήσεις του αντίκτυπου της διαδρομής, του ποσοστού ψευδούς ανακάλυψης (FDR) και των τιμών p.

Αποτελέσματα Βιοχημικοί δείκτες φλοιού από τις ομάδες HSD και CON

Για την επικύρωση των επιδράσεων μεταβολικής μεταβολής της HSD στους ιστούς του εγκεφάλου, βιοχημικών παραμέτρων, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολικών ενζυματικών δραστηριοτήτων που σχετίζονται με τον ενεργειακό μεταβολισμό των Na-KATP, AChE και LDH, των νευροδιαβιβαστών των DA, E, NE, 5HT και GABA, και οπρωτεΐνες που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρεςτουΧΛΟΟΤΑΠΗΤΑΣ, ΜΔΠ, και Gpx στους ομόπλευρους ιστούς φλοιού των αρουραίων HSD και CON προσδιορίστηκαν επίσης (Πίνακας 1). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τα επίπεδα των DA, E, NE και MDA αυξήθηκαν σημαντικά, ενώ τα περιεχόμενα των Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD και Gpx μειώθηκαν στο μοντέλο HSD. Το όριο ανίχνευσης των κιτ ανάλυσης που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία παρατίθεται στον Πίνακα S3 στο αρχείο συμπληρωματικών υλικών.

Πίνακας 1. Η ποσοτικοποίηση των βιοχημικών παραμέτρων μετρήθηκε σε ζώα CON και HSD ιστού φλοιού με ELISA με τα κιτ ανάλυσης. (μέσος όρος ± SD). δείχνει στατιστική σημασία.

Μεταβολίτες που ταυτοποιήθηκαν σε φάσματα 1Η NMR δειγμάτων εγκεφαλικού ιστού

Το Σχήμα 3 εμφανίζει τρία αντιπροσωπευτικά φάσματα 1H NMR από τον φλοιό (Εικ. 3Α), τον ιππόκαμπο (Εικ. 3Β) και το ραβδωτό σώμα (Εικ. 3C) ενός αρουραίου HSD. Ένα ευρύ φάσμα σημαντικών μεταβολιτών αναγνωρίστηκε σύμφωνα με τα δεδομένα 1H NMR δειγμάτων εγκεφαλικού ιστού και είναι ανιόντα οργανικού οξέος (γαλακτικό (Lac), μηλονικό (Maln), ηλεκτρικό (Suc), μηλικό (Mal), φουμαρικό (FMA). ), 2-υδροξυβουτυρικό (2-HB), οξικό (Ace), μυρμηκικό (For), ταυρίνη (Tau), ασκορβικό (Asc), 2-υδροξυβουτυρικό (2HIB)), αμινοξέα (λευκίνη (Leu), ισολευκίνη (Ile), βαλίνη (Val), αλανίνη (Ala), γλυκίνη (Gly), τυροσίνη (Tyr), φαινυλαλανίνη (Phe), ασπαρτικό (Asp), γλουταμίνη (Gln), γλουταμικό (Glu) , θρεονίνη (Thr), σερίνη (Ser), λυσίνη (Lys), ασπαραγίνη (Asn)), νευροδιαβιβαστές (-αμινοβουτυρικό (GABA)), μεταβολίτες που σχετίζονται με την ενέργεια (κρεατίνη (Cre), τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP), μονοφωσφορική αδενοσίνη ( AMP)), μεταβολίτες που σχετίζονται με φωσφολιπίδια (Οφωσφοαιθανολαμίνη (PEA), Ο-φωσφοχολίνη (Pcho), sn-γλυκερό-3-φωσφοχολίνη (GPC)) και άλλοι (μυο-ινοσιτόλη (MI), δινουκλεοτίδιο νικοτιναμίδης αδενίνης (NAD plus ), νικοτινουρικό οξύ (Nic), Ν-ακετυλασπαρτικό (NAA), φωσφορικό νικοτιναμίδιο-αδενίνη-δινουκλεοτίδιο (NADP συν), UDP-N-γαλακτόζη (UDPGa), ουριδίνη (Uri), ουρακίλη (Ura), κυστιδίνη (Cyt) , ουριδίνη 5'-μονοφωσφορική (UMP), 5'-μονοφωσφορική ινοσίνη (IMP), ινοσίνη (Ino), χολίνη (Cho), car nitine (Car), γλουταθειόνη (GSH). Ο Πίνακας S1 δείχνει λεπτομερείς πληροφορίες για την κατανομή μεταβολιτών.

Μεταβολές του μεταβολικού προφίλ που αποκαλύφθηκαν με μεταβολική ανάλυση

Το PCA, μια διερευνητική και αμερόληπτη προσέγγιση ανάλυσης των φασμάτων 1H NMR από όλα τα εκχυλίσματα του εγκεφάλου σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου, έγινε για πρώτη φορά για να αποκαλύψει τις κύριες μεταβολικές τάσεις που οφείλονται στην υπερβαρική έκθεση σε 400 msw περιβάλλον κορεσμού heliox. Ένα διάγραμμα σκέδασης PC1 έναντι PC2 που ελήφθη από PCA (Σχήμα S1A-S1C) δεδομένων ενσωματωμένου κάδου αποκάλυψε μια ορισμένη διάκριση με κάποια επικάλυψη μεταξύ των δύο ταξινομήσεων. Οι εποπτευόμενες έρευνες των μοντέλων PLS-DA (S1A'–S1C' Fig) και OPLS-DA (Εικ. 4A-4C) έδειξαν σαφείς ταξινομικές διακρίσεις των μεταβολικών προφίλ μεταξύ των ομάδων. Το Σχήμα 4 δείχνει τα διαγράμματα βαθμολογίας του μοντέλου OPLS-DA για την περιοχή του φλοιού (Α), την περιοχή του ιππόκαμπου (Β) και την περιοχή του ραβδωτού σώματος (C), δείχνοντας σαφή διάκριση μεταξύ των ομάδων HSD και των μαρτύρων. Η υψηλή επεξηγημένη διακύμανση και η καλή απόδοση της πρόβλεψης που αντικατοπτρίζεται από τις τιμές των R2X και Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig 4A–4C) και τα διαγράμματα δοκιμής μετάθεσης (Εικ. 4'-4C'A) έδειξαν ευρωστία των δημιουργούμενων εποπτευόμενων μοντέλων. Ο συντελεστής συσχέτισης (r) που εξήχθη από τα διαγράμματα της γραμμής S, η μεταβλητή σημασία στην προβολή (VIP) και η τιμή p από τις μη παραμετρικές μονομεταβλητές δοκιμές συλλέχθηκαν για να αξιολογηθούν οι σημαντικοί μεταβολίτες που είναι υπεύθυνοι για τα μοτίβα διάκρισης κατηγορίας. Επομένως, ικανοποιώντας οποιοδήποτε από τα τρία κριτήρια (η απόλυτη τιμή του r μεγαλύτερη από 0.50, η τιμή του VIP μεγαλύτερη από 1,0, μαζί με την τιμή p μικρότερη από 0,05), επιλέξαμε μια ομάδα στατιστικά σημαντικών μεταβολιτών (Πίνακας 1) υπεύθυνος για το διαχωρισμό μεταξύ των ομάδων CON και HSD. Στον Πίνακα 1, οι τιμές αλλαγής αναδίπλωσης μεγαλύτερες από 1 υποδεικνύουν αυξημένο επίπεδο στην ομάδα HSD, ενώ οι τιμές αναδίπλωσης μικρότερες από 1 υποδεικνύουν μειωμένο επίπεδο στην ομάδα HSD. Οι μέσες τιμές SD των διακριτικών μεταβολιτών παρατίθενται στον Πίνακα S2. Χρησιμοποιώντας την ιεραρχική ανάλυση συστάδων μεταβολιτών και τη μέθοδο μέσης σύνδεσης, ο παραγόμενος χάρτης θερμότητας (Εικ. 5A-5C) με δενδρογράμματα επιτρέπει την καλύτερη απεικόνιση τριών μεταβολικών αλλαγών στην περιοχή του εγκεφάλου που προκαλούνται από υπερβαρική έκθεση σε περιβάλλον κορεσμένο με οξυγόνο ήλιο.

Μεταβολικές διαταραχές που παρατηρήθηκαν σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου αρουραίων HSD

Η προαναφερθείσα πολυμεταβλητή ανάλυση και η μονομεταβλητή ανάλυση χρησιμοποιώντας το ύψος του κάδου των μεταβολιτών στις διάφορες ομάδες παρείχαν έναν εξαιρετικό σωλήνα εργασίας για τον εντοπισμό διακριτικών μεταβολιτών που αποκαλύπτουν τις πιθανές νευρολογικές μεταβολικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με συμβάντα HSD. Αυξημένα AMP, FMA, Nic και Phe και μείωση των Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura και Uri βρέθηκαν στον ιστό του φλοιού του HSD ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα CON (Σχήμα 5Α, Πίνακας 1). Εν τω μεταξύ, στον ιππόκαμπο, τα Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr και Ura επίσης μειώθηκαν και η AMP αυξήθηκε στην ομάδα HSD, όπως και στον φλοιό. Επιπλέον, τα ρυθμισμένα προς τα πάνω Thr και μειωμένα Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc και DMA εκφράστηκαν σε εκχυλίσματα ιππόκαμπου της ομάδας HSD σε σχέση με τους μάρτυρες (Σχήμα 5Β, 5D, Πίνακας 1). Σε σύγκριση με την ομάδα CONS, τα περιεχόμενα των Cyt, GABA, Ura, Cho και Thr επίσης μειώθηκαν όπως και στον φλοιό και τον ιππόκαμπο. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (BCAAs, συμπεριλαμβανομένων των Leu, Ile, Val) και Lys και μειωμένα επίπεδα Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, μιας σειράς μεταβολιτών ATP, Tau, IMP, και το Suc, το οποίο επίσης μειώθηκε στον ιππόκαμπο, και άλλοι δύο μεταβολίτες, ο Ino και ο Pcho, που επίσης μειώθηκαν στον φλοιό, παρατηρήθηκαν στους ιστούς του ραβδωτού σώματος των αρουραίων της ομάδας HSD (Εικ. 5C, 5D, Πίνακας 1). Τέτοιοι πολλοί μεταβολίτες υποδεικνύουν πάντα εμπλεκόμενες μοριακές οδούς με πολυπλοκότητα και ποικιλομορφία. Οι ενσωματωμένες τιμές του κάδου των διακριτών μεταβολιτών ποσοτικοποιήθηκαν και οι στατιστικά σημαντικές πολλαπλές αλλαγές των συγκεντρώσεών τους μεταξύ των ομάδων που εκτέθηκαν σε έλιοξ-κορεσμό-υπερβαρικό και ελέγχου συνοψίζονται στον Πίνακα S2 και στον Πίνακα 2 για τις τρεις περιοχές του εγκεφάλου.

Σχήμα 4. Ορθογώνια ανάλυση μερικών ελαχίστων τετραγώνων διάκρισης (OPLS-DA) γραφικές παραστάσεις βαθμολογίας και γραφικές παραστάσεις δοκιμής μετάθεσης που διακρίνουν την επίδραση της έκθεσης κορεσμού έλιοξ 400 msw σε φάσματα 1Η NMR από ομάδες ελέγχου στον φλοιό (CONC, n=8, HSDC, n=8, A και A') (R2X=0.38; Q2=0.46), ιππόκαμπος (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B και B') (R2X=0.37; Q2=0.43) και ραβδωτό σώμα (CONS, n=8, HSDS, n=8, C και C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Οι τιμές της παραμέτρου Q2 στις γραφικές παραστάσεις βαθμολογίας OPLS-DA, οι οποίες ήταν ίσες ή μεγαλύτερες από 0,40, σε συνδυασμό με τις τιμές Q2 του αριστερού σημείου στα μεταθεμένα μοντέλα ήταν μεγαλύτερες από όλες τις προσαρμοσμένες τιμές Q2 των δεξιών σημείων (μετάθεση δοκιμή 80 φορές), υποδεικνύοντας ότι τα καθιερωμένα μοντέλα OPLS-DA ήταν έγκυρα.

Το Pcho, το οποίο επίσης μειώθηκε στον φλοιό, παρατηρήθηκε στους ιστούς του ραβδωτού σώματος των αρουραίων της ομάδας HSD (Εικ. 5C, 5D, Πίνακας 1). Τέτοιοι πολλοί μεταβολίτες υποδεικνύουν πάντα εμπλεκόμενες μοριακές οδούς με πολυπλοκότητα και ποικιλομορφία. Οι ενσωματωμένες τιμές του κάδου των διακριτών μεταβολιτών ποσοτικοποιήθηκαν και οι στατιστικά σημαντικές πολλαπλές αλλαγές των συγκεντρώσεών τους μεταξύ των ομάδων που εκτέθηκαν σε έλιοξ-κορεσμό-υπερβαρικό και ελέγχου συνοψίζονται στον Πίνακα S2 και στον Πίνακα 2 για τις τρεις περιοχές του εγκεφάλου.

Σχήμα 5. Χάρτης θερμότητας και γραφικές παραστάσεις στατιστικής συσχέτισης που προέρχονται από τις τιμές κάδου των μεταβολιτών που διακρίνουν από τον φλοιό (Α, Α', δείγματα HSDC βρίσκονται στο άνω πλαίσιο και CONC βρίσκονται στο κάτω πλαίσιο), ιππόκαμπος (Β, Β', HSDH η ομάδα βρίσκεται στο άνω πλαίσιο και το CONH βρίσκεται στο κάτω πλαίσιο) και το ραβδωτό σώμα (δείγματα C, C', HSDS βρίσκονται στο άνω πλαίσιο και το CONS βρίσκονται στο κάτω πλαίσιο) ιστοί HSD και CON αρουραίων. Οι μεταβολίτες στον θερμικό χάρτη οργανώνονται με ιεραρχική ομαδοποίηση με βάση τη συνολική ομοιότητα στα πρότυπα επιπέδων. Το διάγραμμα Venn (D) που απεικονίζει την επικάλυψη μεταβολιτών μεταξύ των συγκρίσεων HSDC-CONC, HSDH-CONH και HSDS-CONS.

Ανάλυση συσχέτισης μεταβολιτών

Η σχέση μεταξύ ή μεταξύ των μεταβολιτών ήταν τόσο πολύπλοκη στο Σχήμα 5A'-5C'. Για τους ενεργειακούς μεταβολίτες, οι θετικές συσχετίσεις για Lac vs Ala στο HSDC, AMP vs IMP στο HSDH, ATP vs Pcho στο HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA στο HSDS και οι αρνητικές συσχετίσεις για Lac vs Thr και GSH vs Το Suc στο HSDH, το Suc έναντι του Val στο HSDS ήταν παρόν στα διαγράμματα συσχέτισης μεταβολιτών. Για τους νευροδιαβιβαστές, οι θετικές συσχετίσεις για GABA vs Car στο HSDC, GABA vs Cho στο CONH και GABA vs Suc/Ino/Gln στο HSDS ήταν παρόντες στα διαγράμματα συσχέτισης μεταβολιτών. Οι αρνητικές συσχετίσεις για GABA vs FMA στο CONC και GABA vs NAA/ Ura/NADP συν στο CONS ήταν παρούσες στα διαγράμματα συσχέτισης μεταβολιτών. Για τους μεταβολίτες που σχετίζονται μεοξειδωτικό στρες, οθετικές συσχετίσειςγια GSH vs Asn στο HSDC και το CONC, Tau vs Lac στο HSDH, Tau vs Suc/Ala στο CONH, οι αρνητικές συσχετίσεις για GSH vs Suc στο HSDH, Tau vs Thr στο HSDH ήταν παρόντες στη συσχέτιση μεταβολιτών οικόπεδα.

Ανάλυση μεταβολικής οδού

Η ποσοτική ανάλυση μονοπατιού που αποτελείται από ανάλυση εμπλουτισμού μονοπατιού και αντίκτυπο μονοπατιού από την τοπολογία μονοπατιού αποκάλυψε πολύ στατιστικά σημαντικές τροποποιήσεις που προκαλούνται από την HSD σε μια σειρά μεταβολικών οδών. Οι βαθμολογίες επιπτώσεων της διαδρομής, μαζί με τις τιμές ψευδούς ποσοστού ανακάλυψης (FDR) και p, περιγράφονται στο Σχήμα 6. Οι διαδρομές θεωρήθηκαν σημαντικά εμπλουτισμένες εάν οι τιμές p ήταν χαμηλότερες από 0.05; οι διαμορφωμένοι μεταβολίτες (επιτυχίες) σε σχέση με τους συνολικούς μεταβολίτες της οδού (κατάσταση αντιστοίχισης) ήταν υψηλότεροι από 1. και οι βαθμολογίες επιπτώσεων (που υποδεικνύουν την επίδραση των μεταβολιτών που επηρεάζονται σημαντικά στο μονοπάτι με βάση τη μέτρηση της τοπολογίας του δικτύου της σχετικής μεταξύ κεντρικότητας) ήταν υψηλότερες από 0. Οι οδοί στον φλοιό (Εικ. 6Α) με τη μεγαλύτερη τιμή μεταβολικής επίδρασης ήτανφαινυλαλανίνη, τυροσίνη, καιβιοσύνθεση τρυπτοφάνης>μεταβολισμό της φαινυλαλανίνης> μεταβολισμός πυριμιδίνης > μεταβολισμός αλανίνης, ασπαρτικού και γλουταμικού. Οι οδοί στον ιππόκαμπο (Εικ. 6Β) με τη μεγαλύτερη μεταβολική επίδραση ήταν η βιοσύνθεση φαινυλαλανίνης, τυροσίνης και τρυπτοφάνης > μεταβολισμός γλουταθειόνης > μεταβολισμός γλυκίνης, σερίνης και θρεονίνης > μεταβολισμός πουρίνης > μεταβολισμός πυριμιδίνης > μεταβολισμός αλανίνης, ασπαρτικού και > αλλανίνης . Οι οδοί στο ραβδωτό σώμα (Εικ. 6C) με τη μεγαλύτερη μεταβολική επίδραση ήταν ο μεταβολισμός της αλανίνης, του ασπαρτικού και του γλουταμικού > μεταβολισμός νικοτινικού και νικοτιναμιδίου > μεταβολισμός πουρίνης.

Ζήτα περισσότερα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: συν 86 15292862950