Περίληψη

Cistanche tubulosaείναι ένα πολύτιμο τονωτικό βότανο που εφαρμόζεται ευρέως στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες που αντιπροσωπεύονται από την εχινακοσίδη και την ακτεοσίδη είναι οι βασικές βιοδραστικές ουσίες του. Αυτή η έρευνα στοχεύει στη βελτιστοποίηση των σύγχρονων παραμέτρων επεξεργασίας γιαCistanche tubulosaκομμάτια αφεψήματος για τη βελτίωση της απόδοσης της εχινακοσίδης και της ακτεοσίδης και για περαιτέρω διερεύνηση του αντιοξειδωτικού στρες και του αντιφλεγμονώδους μηχανισμού σε κυτταρικό επίπεδο.

Διεξήχθησαν πειράματα ενός παράγοντα και ακολούθησε βελτιστοποίηση επιφάνειας απόκρισης Box-Behnken με το πάχος κοπής, τον χρόνο ατμού και τη θερμοκρασία στεγνώματος ως παράγοντες που επηρεάζουν. Υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία (HPLC) υιοθετήθηκε για την ανίχνευση της περιεκτικότητας δύο ενώσεων δεικτών. Το μοντέλο τραυματισμού μακροφάγων RAW264.7 που προκαλείται από LPS κατασκευάστηκε για να αξιολογήσει τις φαρμακολογικές δραστηριότητες. Προσδιορίστηκαν τα δραστικά είδη οξυγόνου (ROS), το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), η μηλονοδιαλδεΰδη (MDA), οι δραστηριότητες των αντιοξειδωτικών ενζύμων συμπεριλαμβανομένων των περιεκτικότητας SOD, CAT, LDH και γλουταθειόνης (GSH). Χρησιμοποιήθηκε ELISA για τον έλεγχο του επιπέδου έκκρισης των προφλεγμονωδών κυτοκινών TNF‑, IL‑1 και IL‑6. Η δοκιμασία Western blot πραγματοποιήθηκε για να αναλυθεί η κατάσταση φωσφορυλίωσης των βασικών πρωτεϊνών στο μονοπάτι σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF-κB.

Οι βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας ήταν πάχος φέτας 0,6 cm, χρόνος ατμού 6 λεπτά και θερμοκρασία στεγνώματος 57 βαθμούς. Υπό αυτές τις συνθήκες, η περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη έφτασε το 7,25 % και η εχινακοσίδη έφτασε το 31,62 %. Τα εκχυλίσματα από βελτιστοποιημένα κομμάτια αφεψήματος θα μπορούσαν να μειώσουν σημαντικά την υπερπαραγωγή ενδοκυτταρικών ROS, NO και MDA σε κύτταρα RAW264.7 που διεγείρονται με LPS. Ενίσχυσε τις δραστηριότητες των SOD, CAT, LDH και αύξησε το ενδοκυτταρικό επίπεδο GSH, εν τω μεταξύ ανέστειλε σημαντικά την απελευθέρωση των TNF-, IL-1 και IL-6. Τα αποτελέσματα Western-blot έδειξαν ότι η αναλογία φωσφορυλίωσης των p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK και p‑NF‑κB/NF‑κB, ρυθμίστηκε προς τα κάτω από το εκχύλισμα.

Η βελτιστοποιημένη τεχνολογία επεξεργασίας στον ατμό-ξήρανση μπορεί να αυξήσει αποτελεσματικά τον ρυθμό ανάκτησης των κύριων φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίωνCistanche tubulosa. Τα τεμάχια αφεψήματος ασκούν αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση κατά της κυτταρικής βλάβης που προκαλείται από το LPS μέσω της αναστολής της σηματοδοτικής οδού p38/AKT/JNK/NF-κB. Αυτή η μελέτη παρέχει πρακτικές τεχνικές παραμέτρους για την τυποποιημένη βιομηχανική επεξεργασία τουCistanche tubulosa, και προσφέρει πειραματικά στοιχεία για την ανάπτυξη λειτουργικών τροφίμων και διατροφικών προϊόντων που προέρχονται από αυτόν τον φυτικό πόρο.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche tubulosa; τεχνολογία επεξεργασίας τεμαχίων αφεψήματος. ακτεοσίδη; εχινακοσίδη; αντιοξειδωτικό στρες· RAW264.7 μακροφάγοι; μονοπάτι p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Εισαγωγή

Cistanche tubulosa(Schenk) Το Wight ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae και το φαρμακευτικό του μέρος είναι ο αποξηραμένος σαρκώδης μίσχος με φύλλα λέπια. Στην Κίνα, αυτό το φυτό φυτεύεται κυρίως σε άνυδρες περιοχές στα βορειοδυτικά, με τη μεγαλύτερη περιοχή φύτευσης στο νότιο Xinjiang. Ως γνωστό τονωτικό φυτικό φάρμακο, λειτουργεί για να τονώνει το νεφρό-yang, να αναπληρώνει την ουσία και το αίμα και να υγραίνει τα έντερα για την ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα. Κλινικά, χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της ανεπάρκειας των νεφρών-yang, της ανεπάρκειας του αιθέριου αίματος, της υπογονιμότητας, του πόνου και της αδυναμίας της μέσης και των γονάτων, καθώς και για τη δυσκοιλιότητα της εντερικής ξηρότητας.

Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, κυρίως η εχινακοσίδη και η ακτεοσίδη, είναι τα κύρια δραστικά συστατικά τουCistanche tubulosa. Σύμφωνα με τις απαιτήσεις της Κινεζικής Φαρμακοποιίας, η συνολική περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη σε ειδικευμένες πρώτες φαρμακευτικές ύλες δεν πρέπει να είναι μικρότερη από 1,50 %, το οποίο χρησιμεύει ως κρίσιμος δείκτης αξιολόγησης ποιότητας. Παραδοσιακές προσεγγίσεις επεξεργασίας γιαCistanche tubulosaυιοθετούν ως επί το πλείστον μεθόδους εμποτισμού-ύγρανσης, τεμαχισμού-ξήρανσης ή ατμού κρασιού. Πολλές μελέτες επικεντρώνονται στη βελτίωση της απόδοσης ενεργών συστατικών, ενώ οι έρευνες που συνδυάζουν τη βελτιστοποίηση της τεχνολογίας επεξεργασίας με την επαλήθευση βιολογικής δραστηριότητας παραμένουν ανεπαρκείς.

Το οξειδωτικό στρες δρα ως η κοινή παθολογική βάση για πολλαπλές μεταβολικές και φλεγμονώδεις ασθένειες. Οι υπάρχουσες έρευνες έχουν αποδείξει ότι οι συνολικές γλυκοσίδες εξάγονται απόCistanche tubulosaμπορεί να καταστείλει τη φλεγμονώδη απόκριση και να ενεργοποιήσει την οδό Nrf2/HO-1 για την ανακούφιση της ηπατικής βλάβης σε ζώα με σήψη. Τα κλάσματα γλυκοζίτη λιγνάνης από αυτό το βότανο μπορούν να μετριάσουν τη φλεγμονή των μακροφάγων ρυθμίζοντας τη σηματοδότηση PI3K/AKT. Ωστόσο, η φαρμακολογική ιδιότητα των σύγχρονων επεξεργασμένων τεμαχίων αφεψήματος και ο υποκείμενος μοριακός μηχανισμός του απαιτούν ακόμη περαιτέρω διερεύνηση.

Σε αυτήν τη μελέτη, ο σχεδιασμός επιφάνειας απόκρισης Box-Behnken εφαρμόστηκε με βάση δοκιμές ενός παράγοντα, λαμβάνοντας το πάχος της τομής, τον χρόνο ατμού και τη θερμοκρασία στεγνώματος ως μεταβλητές για τη βελτιστοποίηση της ροής εργασιών επεξεργασίας. Μετά τη λήψη των βέλτιστων τεχνικών παραμέτρων, δημιουργήθηκε μοντέλο κυττάρων οξειδωτικής βλάβης RAW264.7 που προκαλείται από LPS για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας και της αντιφλεγμονώδους ικανότητας και την ανατομή του σχετικού μηχανισμού σηματοδότησης. Αυτή η εργασία σκοπεύει να παράσχει σταθερές και λειτουργικές παραμέτρους επεξεργασίας για παραγωγή πιλοτικής κλίμακας και να θέσει πειραματικά θεμέλια για την ολοκληρωμένη χρήση τουCistanche tubulosaπόροι.

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Φυτικό Υλικό, Αντιδραστήρια και Όργανα

Νωποί σαρκώδεις μίσχοιCistanche tubulosaσυγκομίστηκαν το φθινόπωρο από το Hotan της Xinjiang. Τα κύτταρα λευχαιμίας μονοκυττάρων-μακροφάγων ποντικού RAW264.7 αγοράστηκαν από την Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Κίνα).

Το ακετονιτρίλιο και η μεθανόλη ποιότητας HPLC ελήφθησαν από την εταιρεία Merck. Τα πρότυπα αναφοράς εχινακοσίδης (Μεγαλύτερη ή ίση με 98 %) και ακτεοσίδης (Μεγαλύτερη από ή ίση με 98 %) παρέχονται από το Beijing North Weiye Metrology Institute. Το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich. Μέσο υψηλής γλυκόζης DMEM, ορός εμβρύου βοοειδούς (FBS), διάλυμα διπλού αντισώματος πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης, κιτ ποσοτικοποίησης πρωτεΐνης BCA, κιτ ανάλυσης για NO, MDA, SOD, CAT, GSH και LDH, λιποπολυσακχαρίτης (LPS), αντιδραστήρια MTT για φλεγμονώδη προϊόντα του εμπορίου και όλα τα προϊόντα ELISA.

Τα πειραματικά όργανα περιελάμβαναν υγρό χρωματογράφο Shimadzu υψηλής απόδοσης, περιστροφικό εξατμιστή, κονιοποιητή κινέζικων βοτάνων, θερμοστατικό φούρνο ξήρανσης, ατμομάγειρα, συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πλήρους μήκους κύματος, ηλεκτρονική αναλυτική ζυγαριά, φυγοκεντρητή ψύξης, μικροσκοπική μικροσκοπική οπή και μικροσκοπείο.

2.2 Πείραμα επεξεργασίας ενός παράγοντα

ΦρέσκοCistanche tubulosaΟι σαρκώδεις μίσχοι κόπηκαν σε φέτες με πάχος 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm και 1,2 cm. Οι φέτες μαγειρεύτηκαν στον ατμό για 3 λεπτά, 6 λεπτά, 9 λεπτά, 12 λεπτά, 15 λεπτά, 18 λεπτά και 21 λεπτά αντίστοιχα, και ξηράνθηκαν κάτω από διαφορετικές διαβαθμίσεις θερμοκρασίας συμπεριλαμβανομένης της θερμοκρασίας δωματίου (25 βαθμοί), 40 βαθμών, 50 βαθμών, 60 βαθμών, 70 βαθμών και 80 βαθμών. Δείγματα αποξηραμένων τεμαχίων αφεψήματος συνθλίβονται και κοσκινίζονται μέσω κόσκινου 40 mesh για μετέπειτα ανίχνευση. Η σύνθετη φόρμουλα βαθμολόγησης υιοθετήθηκε για ολοκληρωμένη αξιολόγηση: Σύνθετη βαθμολογία=περιεκτικότητα εχινακοσίδης × 50 % + περιεκτικότητα ακτεοσίδης × 50 %.

2.3 Προσδιορισμός Ακτεοσίδης και Εχινακοσίδης με HPLC

Προετοιμασία διαλύματος δείγματος: ζυγίστε με ακρίβεια 1,0 g δείγματος σκόνης, προσθέστε 100 mL διαλύματος μεθανόλης 50%. Μετά από εμποτισμό 30 λεπτών, πραγματοποιήθηκε εξαγωγή με υπερήχους για 40 λεπτά. Η απώλεια βάρους συμπληρώθηκε με 50% μεθανόλη μετά την ψύξη. Το υπερκείμενο διηθήθηκε με μικροπορώδη μεμβράνη 0,22 μm πριν από την έγχυση HPLC.

Μικτό πρότυπο διάλυμα αναφοράς ακτεοσίδης και εχινακοσίδης παρασκευάστηκε με 50 % μεθανόλη και αραιώθηκε σε σειριακές συγκεντρώσεις για γραφική παράσταση τυπικής καμπύλης. Χρωματογραφικές συνθήκες: COSMOSIL C18 χρωματογραφική στήλη. Το σύστημα κινητής φάσης αποτελούνταν από υδατικό διάλυμα φωσφορικού οξέος 0,1 % (Α) και ακετονιτρίλιο (Β). Το μήκος κύματος ανίχνευσης ορίστηκε ως 330 nm. θερμοκρασία στήλης 35 βαθμοί ; ταχύτητα ροής 1 mL/min. Χρησιμοποιήθηκε μέθοδος εξωτερικού προτύπου για τον ποσοτικό υπολογισμό των ενώσεων-στόχων.

2.4 Πειραματικός σχεδιασμός επιφάνειας απόκρισης Box-Behnken

Σύμφωνα με πειραματικά αποτελέσματα μονού παράγοντα, το πάχος τομής (X1), ο χρόνος ατμού (X2) και η θερμοκρασία στεγνώματος (X3) επιλέχθηκαν ως ανεξάρτητες μεταβλητές. Η περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη (Υ1, %) και η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη (Υ2, %) χρησίμευσαν ως τιμές απόκρισης. Το λογισμικό Design-Expert 13.0 χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία πειραματικού σχήματος τριών παραγόντων Box-Behnken τριών παραγόντων με συνολικά 17 ομάδες δοκιμών. Η προσαρμογή του μοντέλου, η ανάλυση διακύμανσης και η πρόβλεψη παραμέτρων ολοκληρώθηκαν από λογισμικό. Πραγματικά πειράματα επαλήθευσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν μετά την προσαρμογή των θεωρητικών βέλτιστων παραμέτρων ώστε να ταιριάζουν στην πραγματική λειτουργία παραγωγής.

2.5 Κυτταρική καλλιέργεια και προετοιμασία δειγμάτων

Το δείγμα τεμαχίου αφεψήματος που ελήφθη υπό βελτιστοποιημένες συνθήκες επεξεργασίας παρασκευάστηκε σε σκόνη εκχυλίσματος. Η σκόνη διαλύθηκε σε DMSO και αραιώθηκε περαιτέρω με πλήρες μέσο DMEM που περιείχε 10 % FBS και 1 % πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη για πειράματα κυττάρων. Τα κύτταρα RAW264.7 καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 βαθμούς με 5% CO2.

2.6 Δοκιμασία MTT για τη βιωσιμότητα των κυττάρων

Το κυτταρικό εναιώρημα εμβολιάστηκε σε πλάκες 96 φρεατίων σε κυτταρική πυκνότητα 8 χ 104 κύτταρα/mL. Οι ομάδες ορίστηκαν ως ομάδα ελέγχου διαλύτη (0,1 % DMSO), ομάδα μοντέλου LPS (1 ug/mL LPS) και ομάδες πολλαπλών συγκεντρώσεωνCistanche tubulosaεκχύλισμα (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Μετά από 2 ώρες προεπώασης των δειγμάτων, προστέθηκε LPS με τελική συγκέντρωση 1 ug/mL εκτός από φρεάτια ελέγχου διαλύτη και επωάστηκε για άλλες 24 ώρες. Προστέθηκε διάλυμα ΜΤΤ (5 mg/mL) για αντίδραση 4 ωρών. Μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου, προστέθηκε DMSO για να διαλυθεί ο κρύσταλλος φορμαζάνης. Η τιμή απορρόφησης στα 490 nm ανιχνεύθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών για τον υπολογισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων. Το εύρος ασφαλούς συγκέντρωσης επιλέχθηκε για λειτουργικές δοκιμές παρακολούθησης.

2.7 Ενδοκυτταρική μέτρηση ROS

Τα κύτταρα RAW264.7 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 4 χ 105 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά την προσκόλληση στο τοίχωμα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με βαθμιδωτή συγκέντρωσηCistanche tubulosaεκχύλισμα (12,5, 25, 50, 100 ug/mL) για 2 ώρες, στη συνέχεια διεγείρεται με 1 ug/mL LPS για 24 ώρες. Το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS ανιχνεύθηκε με κιτ αντιδραστηρίου ανιχνευτή φθορισμού. Η ένταση φθορισμού καταγράφηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και μήκος κύματος εκπομπής 525 nm.

2.8 Ανίχνευση NO, MDA, SOD, CAT, LDH και GSH

Το υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκε για να ανιχνευθεί περιεχόμενο ΝΟ μέσω της μεθόδου Griess. Τα κύτταρα πλύθηκαν με προψυγμένο PBS και λύθηκαν σε πάγο. Το κυτταρόλυμα φυγοκεντρήθηκε στις 10 000 rpm κάτω από 4 βαθμούς για 5 λεπτά για να αποκτήσει ενδοκυτταρικό υπερκείμενο. Η περιεκτικότητα σε MDA, οι ενζυμικές δραστηριότητες των επιπέδων SOD, CAT, LDH και GSH μετρήθηκαν αυστηρά σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κιτ. Η μέθοδος BCA εφαρμόστηκε για κανονικοποίηση της ολικής πρωτεΐνης.

2.9 ELISA Ανίχνευση Προφλεγμονωδών Κυτοκινών

Τα κύτταρα RAW264.7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δείγμα και LPS για 16 ώρες. Το υπερκείμενο καλλιέργειας συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε στις 10 000 rpm για 10 λεπτά. Οι συγκεντρώσεις έκκρισης των TNF-, IL-1 και IL-6 ποσοτικοποιήθηκαν με κιτ ELISA.

2.10 Ανάλυση Western Blot

Μετά από παρέμβαση 45 λεπτών δειγμάτων και LPS, η ολική κυτταρική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με κιτ BCA. Ίση ποσότητα δείγματος πρωτεΐνης (50 ug για κάθε λωρίδα) μετουσιώθηκε, διαχωρίστηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη αποκλείστηκε με διάλυμα TBST 5% αποβουτυρωμένου γάλακτος για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκε με πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Μετά από επανειλημμένη πλύση με TBST, το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι ζώνες πρωτεϊνών στόχου οπτικοποιήθηκαν με αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας ECL. Διεξήχθη ανάλυση κλίμακας γκρι ζώνης για τον υπολογισμό της αναλογίας φωσφορυλίωσης-πρωτεΐνης/ολικής πρωτεΐνης.

2.11 Στατιστική Ανάλυση

Το λογισμικό GraphPad Prism 8.0.2 χρησιμοποιήθηκε για γραφική παράσταση και στατιστική ανάλυση. Η μονόδρομη ANOVA και το t-test υιοθετήθηκαν για σύγκριση δεδομένων.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Αποτελέσματα

3.1 Πειραματικά αποτελέσματα ενός παράγοντα

Το πάχος της φέτας άσκησε σημαντική επίδραση στην περιεκτικότητα του στόχου σε γλυκοσίδη. Φέτες πάχους 0,2 cm ήταν εύκολο να μαγειρευτούν στον ατμό, γεγονός που προκάλεσε θερμική αποσύνθεση των δραστικών συστατικών. Οι υπερβολικά παχιές φέτες εμπόδιζαν την απελευθέρωση εσωτερικών δραστικών ουσιών. Όταν ο χρόνος ατμού καθορίστηκε στα 10 λεπτά και η θερμοκρασία στεγνώματος στους 60 βαθμούς, τα 0,4 cm ήταν η βέλτιστη παράμετρος πάχους φέτας στον έλεγχο ενός παράγοντα.

Ο ανεπαρκής χρόνος στον ατμό δεν μπορούσε να καταστρέψει πλήρως τη δομή των φυτικών κυττάρων και οδήγησε σε χαμηλή απόδοση γλυκοσιδίων. Όταν ο χρόνος ατμού ξεπέρασε τα 6 λεπτά, προέκυψε αποσύνθεση ιστού και αποικοδομήθηκε η εχινακοσίδη καθώς και η ακτεοσίδη. Κάτω από σταθερό πάχος φέτας 0,4 cm και θερμοκρασία στεγνώματος 60 βαθμών, τα 6 λεπτά ήταν η καλύτερη συνθήκη στον ατμό.

Εντός ενός ορισμένου εύρους, η περιεκτικότητα σε φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες αυξήθηκε μαζί με την αύξηση της θερμοκρασίας ξήρανσης, ωστόσο η υποβάθμιση έλαβε χώρα όταν η θερμοκρασία ξεπέρασε τους 60 βαθμούς. Με πάχος φέτας 0,4 cm και χρόνο ατμού 6 λεπτά, οι 60 μοίρες παρουσίασαν την καλύτερη ολοκληρωμένη απόδοση στη διαλογή ενός παράγοντα.

3.2 Δοκιμή βελτιστοποίησης και επαλήθευσης επιφάνειας απόκρισης

Η ανάλυση διακύμανσης έδειξε ότι τα μοντέλα παλινδρόμησης για την περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη και εχινακοσίδη ήταν σημαντικά (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), υποδεικνύοντας καλό βαθμό προσαρμογής μοντέλου. Ο συντελεστής προσδιορισμού R2 ήταν κοντά στο 1, γεγονός που απέδειξε υψηλή συσχέτιση μεταξύ της προβλεπόμενης τιμής και των πραγματικών πειραματικών δεδομένων.

Η σειρά των παραγόντων που επηρεάζουν την περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη ήταν το πάχος της φέτας > η θερμοκρασία στεγνώματος > ο χρόνος ατμού. Για την περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη, η παραγγελία ήταν χρόνος ατμού > θερμοκρασία στεγνώματος > πάχος φέτας.

Οι θεωρητικές βέλτιστες παράμετροι που υπολογίστηκαν από το λογισμικό ήταν πάχος τομής 0,600 cm, χρόνος ατμού 5,685 λεπτά και θερμοκρασία στεγνώματος 57,009 βαθμούς. Λαμβάνοντας υπόψη τις πρακτικές συνθήκες παραγωγής, οι παράμετροι προσαρμόστηκαν σε πάχος φέτας 0,6 cm, χρόνο ατμού 6 λεπτά και θερμοκρασία στεγνώματος 57 βαθμούς. Τρεις ομάδες πειραμάτων παράλληλης επαλήθευσης έλαβαν περιεκτικότητα σε ακτεοσίδη 7,25 % και περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη 31,62 %. Η απόκλιση μεταξύ της πρακτικής τιμής και της θεωρητικής προβλεπόμενης τιμής ήταν 3,89 % και 4,92 % αντίστοιχα, γεγονός που απέδειξε την αξιοπιστία αυτού του μοντέλου επιφάνειας απόκρισης.

3.3 Αποτέλεσμα ελέγχου βιωσιμότητας κυττάρων

Εντός εύρους συγκεντρώσεων 0-100 ug/mL,Cistanche tubulosaΤο εκχύλισμα τεμαχίου αφεψήματος δεν είχε εμφανή κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα RAW264.7 και επέδειξε ελαφρά δράση προαγωγής του πολλαπλασιασμού. Όταν η συγκέντρωση έφτασε τα 200 ug/mL και άνω, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά. Ως εκ τούτου, επιλέχθηκαν 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL και 100 ug/mL ως συγκεντρώσεις εργασίας για τα επόμενα κυτταρικά πειράματα.

3.4 Επίδραση στο ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου διαλύτη, η ομάδα μοντέλων LPS εμφάνισε αξιοσημείωτα αυξημένη ένταση φθορισμού ενδοκυτταρικού ROS (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Cistanche tubulosaεξαγωγή μείωσε την υπερβολική συσσώρευση ROS με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (P < 0.001 versus model group).

3.5 Κανονισμός για NO, MDA και δείκτες που σχετίζονται με αντιοξειδωτικά

Η διέγερση LPS προκάλεσε απότομη αύξηση της περιεκτικότητας σε NO και MDA στα κύτταρα RAW264.7. Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων LPS, η παρέμβαση εκχυλίσματος μείωσε σημαντικά το επίπεδο NO με δοσοεξαρτώμενη τάση. 12.5 ug/mL εκχύλισμα δεν είχε εμφανή επίδραση στην περιεκτικότητα σε MDA, ενώ 25-100 ug/mL εκχύλισμα μείωσε αισθητά τη συγκέντρωση MDA (P < 0.001).

Μετά τη θεραπεία με LPS, οι δραστηριότητες της περιεκτικότητας σε SOD, CAT, LDH και ενδοκυτταρικής GSH μειώθηκαν σημαντικά. 12.5 ug/mL εκχυλίσματος θα μπορούσαν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα SOD χωρίς να βελτιώσουν τις δραστηριότητες CAT και LDH. Το εκχύλισμα σε συγκέντρωση 25-100 ug/mL αύξησε σημαντικά τις ενζυμικές δραστηριότητες SOD, CAT, LDH και την περιεκτικότητα σε GSH με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση.

3.6 Ανασταλτική επίδραση στην Προφλεγμονώδη Έκκριση Κυτοκίνης

Η διέγερση LPS πυροδότησε μαζική απελευθέρωση TNF-, IL-1 και IL-6 σε μακροφάγους RAW264.7.Cistanche tubulosaΗ προεπεξεργασία με εκχύλισμα με αφέψημα κατέστειλε αξιοσημείωτα την έκκριση των προαναφερόμενων τριών προφλεγμονωδών κυτοκινών (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Διαμόρφωση στο μονοπάτι σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF‑κB

Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου διαλύτη, η παρέμβαση LPS αύξησε την αναλογία φωσφορυλίωσης των p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK και p‑NF‑κB/NF‑κB. Οι ομάδες εκχυλίσματος μεσαίας και υψηλής δόσης μείωσαν σημαντικά την αναλογία p‑p38/p38 και p‑JNK/JNK. Όλες οι ομάδες συγκέντρωσης ρυθμίστηκαν προς τα κάτω επίπεδα p-AKT/AKT και p-NF-κB/NF-κB (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Cistanche tubulosaΤο εκχύλισμα κομματιού αφέψημα περιόρισε την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF-κB αναστέλλοντας τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης.

4. Συζήτηση

Τρέχουσες απαιτήσεις επεξεργασίας γιαCistanche tubulosaπου καταγράφονται στην Κινεζική Φαρμακοποιία περιγράφουν μόνο ποιοτικά βήματα λειτουργίας χωρίς ακριβείς ποσοτικές παραμέτρους. Προηγούμενες έρευνες έδειξαν ότι διαφορετικές μέθοδοι επεξεργασίας θα προκαλούσαν μεγάλες διαφορές στη χημική σύνθεση και τη φαρμακολογική δραστηριότητα μεταξύ ακατέργαστου και επεξεργασμένουCistanche tubulosaδείγματα. Τα επεξεργασμένα προϊόντα παρουσιάζουν καλύτερη αντιοξειδωτική και ανοσορυθμιστική απόδοση σε σύγκριση με τις πρώτες ύλες.

Σε αυτήν την έρευνα, η σύγχρονη επεξεργασία στον ατμό-ξήρανση που βελτιστοποιήθηκε μέσω της μεθοδολογίας απόκρισης-επιφάνειας έλαβε πολύ υψηλότερη απόδοση σε εχινακοσίδη και ακτεοσίδη από πολλές παραδοσιακές τεχνικές επεξεργασίας. Υποδηλώνει ότι ο ακριβής έλεγχος του πάχους της φέτας, της διάρκειας ατμού και της θερμοκρασίας στεγνώματος μπορεί να διατηρήσει αποτελεσματικά και να βελτιώσει την περιεκτικότητα σε φαινυλαιθανοειδή-γλυκοσίδηCistanche tubulosa.

Το οξειδωτικό στρες και η φλεγμονή είναι στενά συνδεδεμένες παθολογικές διεργασίες. Το υπερβολικό ROS προκαλεί υπεροξείδωση λιπιδίων και συσσώρευση MDA. Εν τω μεταξύ, ενεργοποιεί κατάντη φλεγμονώδεις καταρράκτες και προάγει τη δημιουργία ΝΟ και πολλαπλών προφλεγμονωδών κυτοκινών. Οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές επιταχύνουν περαιτέρω την παραγωγή ROS και σχηματίζουν έναν φαύλο παθολογικό κύκλο. Τα κυτταρικά πειραματικά μας αποτελέσματα έδειξαν ότι βελτιστοποιήθηκεCistanche tubulosaΤο εκχύλισμα αφεψήματος θα μπορούσε να εξαλείψει τα περιττά ROS, να μειώσει τους δείκτες οξειδωτικής βλάβης NO και MDA, να αποκαταστήσει τη δραστηριότητα του αντιοξειδωτικού συστήματος ενζύμων που αντιπροσωπεύεται από SOD, CAT, LDH και να αναπληρώσει την ενδοκυτταρική GSH, καθώς και να αναστείλει την απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών με εμφανή σχέση δόσης-αποτελέσματος.

p38, το JNK που ανήκει στην οικογένεια MAPK και ο άξονας AKT-NF-κB είναι κεντρικοί κόμβοι μεταγωγής σήματος που μεσολαβούν στην οξειδωτική-φλεγμονώδη απόκριση των μακροφάγων. Η διέγερση LPS προάγει τη φωσφορυλίωση των p38, JNK και AKT, ενεργοποιεί περαιτέρω το NF-κB και επάγει τη μεταγραφή πολλών προφλεγμονωδών γονιδίων. Τα δεδομένα Western-blot το αποκάλυψαν αυτόCistanche tubulosaΤο εκχύλισμα αφεψήματος εμπόδισε την ενεργοποίηση φωσφορυλίωσης των p38, JNK, AKT και NF-κB. Συμπεραίνεται ότι η υψηλής περιεκτικότητας εχινακοσίδη και ακτεοσίδη από βελτιστοποιημένη επεξεργασία συμβάλλουν από κοινού στην καταστολή του καταρράκτη σηματοδότησης p38/AKT/JNK/NF‑κB, έτσι ώστε να ανακουφιστεί το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το LPS και ο φλεγμονώδης τραυματισμός σε μακροφάρματα RAW264.7.

Εξακολουθούν να υπάρχουν περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι φαρμακολογικές αξιολογήσεις ολοκληρώθηκαν σε κυτταρικό μοντέλο in-vitro. Απαιτούνται περαιτέρω πειράματα σε επίπεδο ζώων για την επαλήθευση της in vivo αποτελεσματικότητας και των μεταβολικών χαρακτηριστικών του επεξεργασμένουCistanche tubulosaκομμάτια αφέψημα.

Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη καθιέρωσε ποσοτικά και επεκτάσιμη σύγχρονη τεχνολογία επεξεργασίας γιαCistanche tubulosaκομμάτια αφέψημα. Κάτω από παραμέτρους επεξεργασίας πάχους φέτας 0,6 cm, χρόνου ατμίσματος 6 λεπτά και θερμοκρασίας στεγνώματος 57 βαθμών, η περιεκτικότητα των κύριων φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων βελτιώνεται σημαντικά. Τα επεξεργασμένα κομμάτια αφεψήματος μπορούν να ανακουφίσουν το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονώδη βλάβη σε μακροφάγα RAW264.7 που διεγείρονται από LPS αναστέλλοντας τη σηματοδοτική οδό p38/AKT/JNK/NF-κB. Αυτή η έρευνα παρέχει πρακτική τεχνική αναφορά για τη βιομηχανοποιημένη παραγωγή και προσφέρει πειραματική βάση για την ανάπτυξη λειτουργικών προϊόντων διατροφής και συμπληρωμάτων διατροφής προέλευσης XinjiangCistanche tubulosa.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Youth Science and Technology Backbone Innovation Capacity Cultivation Project της Xinjiang Academy of Agricultural Sciences (xjnkq‑2022022) και το Xinjiang "Tianchi Doctor Program" (2021).

Αναφορές

[1] Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Εκχύλιση εχινακοσίδης απόCistanche tubulosaκαι διερεύνηση της προστατευτικής του επίδρασης στην ηπατική βλάβη σε αρουραίους με σήψη.Επιστήμη και Τεχνολογία Τροφίμων. 2023;43:e010523.

[2] Guo J, Tang S, Miao Y, et al. Οι αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις των γλυκοζιτών λιγνάνης απόCistanche tubulosaστελέχη σε κύτταρα μακροφάγων RAW264.7 που προκαλούνται από LPS/IFN μέσω της οδού PI3K/AKT.Τρέχουσα Φαρμακευτική Βιοτεχνολογία. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Οξειδωτικό στρες και μεταβολικές διαταραχές: Παθογένεση και θεραπευτικές στρατηγικές.Επιστήμες της Ζωής. 2016;148:183‑193.

[4] Martínez-de-Toda I, Ceprián N, Díaz-de-Castro E. Ο ρόλος της γήρανσης της οξείδωσης στην παθοφυσιολογία του ανθρώπου.Κύτταρα. 2021;10(11):2974.

[5] Chung YC, Song SJ, Lee A, et al. Η ισοβαβαχίνη ανακουφίζει τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από λιποπολυσακχαρίτες σε μακροφάγα και ζέβρα, καταστέλλοντας τις οδούς σηματοδότησης MAPK και NF-κB.Περιοδικό Εθνοφαρμακολογίας. 2024;321:117501.