Περίληψη

Cistanche deserticola, γνωστό και ως τζίνσενγκ της ερήμου, είναι ένα ευρέως γνωστό ομόλογο φυτικό υλικό τροφίμων-φαρμάκων που χρησιμοποιείται ευρέως σε παραδοσιακά τονωτικά σκευάσματα Ανατολικής Ασίας. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες που αντιπροσωπεύονται από την εχινακοσίδη χρησιμεύουν ως υπογεγραμμένες φαρμακολογικά ενεργές ενώσεις της, ασκώντας αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και νευροπροστατευτικές βιολειτουργίες. Ωστόσο, η κακή βιοδιαθεσιμότητα από το στόμα που προέρχεται από χαμηλή υδατική διαλυτότητα και γαστρεντερική μεταβολική αποικοδόμηση περιορίζει σοβαρά την πρακτική αποτελεσματικότητα εφαρμογής του ακατέργαστουCistanche deserticolaσκόνη. Η μικροβιακή προβιοτική ζύμωση αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική βιομετατροπής για τη διάσπαση των δομών του κυτταρικού τοιχώματος των φυτών, τον μετασχηματισμό μακρομοριακών υποστρωμάτων, τον εμπλουτισμό των φυτοχημικών στόχων και την τροποποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων της σκόνης, όπως το πορώδες και τα χαρακτηριστικά της επιφάνειας. Σε αυτή την έρευνα, εξετάσαμε κατάλληλα στελέχη ζύμωσης και βελτιστοποιήσαμε τις παραμέτρους βυθισμένης ζύμωσης γιαCistanche deserticolaσκόνη, λαμβάνοντας τη συγκέντρωση εχινακοσίδης ως κύριο δείκτη αξιολόγησης. Επιπλέον, διεξήχθη in-vitro δοκιμή διάλυσης για τον χαρακτηρισμό της συμπεριφοράς διάλυσης προϊόντων που έχουν υποστεί ζύμωση φυτικής σκόνης. Τα πειραματικά αποτελέσματα το έδειξανLactobacillus plantarumήταν ικανό να αυξήσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη στη ζυμωμένη μήτρα. Τόσο ο ρυθμός διάλυσης όσο και ο αθροιστικός βαθμός διάλυσης του εχινακοσίδη από δείγματα σκόνης που έχουν υποστεί ζύμωση ήταν αξιοσημείωτα ανώτεροι σε σύγκριση με την μη ζυμωμένη πρώτη ύλη. Μια σταθερή και κλιμακούμενη ροή εργασιών ζύμωσης καθιερώθηκε με επιτυχία για τον κατευθυντικό εμπλουτισμό των βασικών βιοενεργών συστατικών και τη βελτίωση της απόδοσης διάλυσης τουCistanche deserticolaσκόνη. Αυτή η μελέτη παρέχει κρίσιμη τεχνική υποστήριξη για την επέκταση της αξίας εφαρμογής τουCistanche deserticolaστις σύγχρονες αγορές λειτουργικών τροφίμων και συμπληρωμάτων διατροφής.

Λέξεις-κλειδιά: Cistanche deserticola; εχινακοσίδη;Lactobacillus plantarum; μικροβιακή ζύμωση; βελτιστοποίηση διαδικασίας? βιοδιαθεσιμότητα; in-vitro διάλυση· φυτική σκόνη

1. Εισαγωγή

Η αυξανόμενη παγκόσμια ζήτηση των καταναλωτών για φυσικά φυτικά φυτικά προϊόντα έχει ωθήσει συνεχώς την έρευνα για ομόλογες φυτικές πρώτες ύλες τροφίμων-φαρμάκων που προέρχονται από συστήματα παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής.Cistanche deserticola, ένα υποχρεωτικό ολοπαρασιτικό φυτό που αναπτύσσεται σε περιοχές της ερήμου της βορειοδυτικής Κίνας, έχει τεκμηριωθεί στην κλασική βιβλιογραφία για τα βότανα για τα τονωτικά του αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένης της τονωτικής νεφρικής-γιανγκ και της αναπλήρωσης του ουσιώδους αίματος. Οι σύγχρονες φαρμακολογικές έρευνες έχουν επικυρώσει πολλαπλές βιοδραστηριότητες που προάγουν την υγεία των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών του, ιδιαίτερα των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών (PhG). Εχινακοσίδη και ακτεοσίδη (βερμπασκοσίδη), δύο κυρίαρχες ενώσεις PhG που απομονώθηκαν απόCistanche deserticola, έχουν καλά τεκμηριωμένα αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη, νευροπροστατευτικά και αναπαραγωγικά ρυθμιστικά αποτελέσματα σε πειραματικά μοντέλα κυττάρων και ζώων.

Παρόλο που η εχινακοσίδη παρουσιάζει εξαιρετικό φαρμακολογικό δυναμικό σε εργαστηριακούς προσδιορισμούς, η από του στόματος εφαρμογή της συναντά εμφανή σημεία συμφόρησης βιοδιαθεσιμότητας. Τα υπάρχοντα φαρμακοκινητικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η εχινακοσίδη πάσχει από χαμηλή υδατική διαλυτότητα και είναι ευάλωτη σε υδρολυτική αποσύνθεση υπό το γαστρεντερικό pH και τον εντερικό μικροβιακό μεταβολικό μετασχηματισμό. Η αναφερόμενη τιμή βιοδιαθεσιμότητας της εχινακοσίδης από το στόμα παραμένει κάτω από 1,3 % σε μοντέλα τρωκτικών, γεγονός που αποδυναμώνει σημαντικά την in vivo φαρμακολογική ισχύ του από του στόματος χορηγούμενου ακατέργαστουCistanche deserticolaυλικά. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη εφικτών τεχνολογιών επεξεργασίας για τη βελτίωση του αποτελεσματικού περιεχομένου συστατικών καθώς και η ιδιότητα διάλυσης γίνεται μια κρίσιμη πρόκληση για τη βιομηχανική ανάπτυξη τουCistanche deserticolaΛειτουργικά συμπληρώματα με βάση.

Η μικρονοποίηση σε σκόνη βοτάνων είναι μια συμβατική τεχνική φυσικής τροποποίησης για κινεζικές φυτικές πρώτες ύλες. Με τη μείωση της διάστασης των σωματιδίων και τη διεύρυνση της ειδικής επιφάνειας, η επεξεργασία κονιοποίησης μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα διάλυσης των ενσωματωμένων βιοδραστικών συστατικών σε περιορισμένο βαθμό. Ωστόσο, η φυσική άλεση από μόνη της δεν μπορεί να σπάσει εντελώς το άκαμπτο κυτταρικό τοίχωμα των φυτών ή να πραγματοποιήσει κατευθυντικό βιομετασχηματισμό δεσμευμένων φυτοχημικών ουσιών που έχουν παγιδευτεί μέσα σε μήτρες κυτταρικού τοιχώματος.

Η μικροβιακή ζύμωση, ειδικά η βιοεπεξεργασία με τη βοήθεια βακτηρίων γαλακτικού οξέος, προσελκύει εκτεταμένη προσοχή στη σύγχρονη έρευνα επεξεργασίας βοτάνων τα τελευταία χρόνια. Η προβιοτική ζύμωση μπορεί να εκκρίνει σύνθετα εξωκυτταρικά κοκτέιλ ενζύμων, συμπεριλαμβανομένων της κυτταράσης, της ημικυτταρινάσης και της πηκτινάσης, τα οποία αποικοδομούν εν μέρει τα πολυμερικά συστατικά του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Αυτή η βιολογική αποικοδόμηση απελευθερώνει φυτοχημικά που αρχικά δεσμεύονταν στα δίκτυα κυτταρικού τοιχώματος. Εν τω μεταξύ, οι μικροβιακές μεταβολικές δραστηριότητες μπορούν να μεταμορφώσουν μακρομοριακούς πρόδρομους, να τροποποιήσουν τη μορφολογία της επιφάνειας της σκόνης, το πορώδες και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της επιφάνειας των σωματιδίων, τα οποία επηρεάζουν περαιτέρω τη διάλυση και την απελευθέρωση των φυτικών λειτουργικών συστατικών. Πολυάριθμες δημοσιευμένες εργασίες έχουν αποδείξει ότι η ζύμωση βακτηρίων γαλακτικού οξέος μπορεί να αυξήσει τη συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικά, φλαβονοειδή ή γλυκοσίδια διαφορετικών φυτικών υποστρωμάτων, να βελτιώσει τη διαλυτότητα των ενώσεων και ακόμη και να μειώσει τους αντιθρεπτικούς παράγοντες ή τα ήπια τοξικά συστατικά στις φυτικές μήτρες.

ΓιαCistanche deserticolaυλικό, οι περισσότερες υπάρχουσες μελέτες εξακολουθούν να επικεντρώνονται στη βελτιστοποίηση της διαδικασίας εξόρυξης, στην ταυτοποίηση συστατικών ή στην αξιολόγηση βιολογικής δραστηριότητας ακατέργαστων εκχυλισμάτων. Συστηματική διερεύνηση κατευθυντικής μικροβιακής ζύμωσης τουCistanche deserticolaη σκόνη είναι ακόμα ανεπαρκής. Παραμένει ασαφές πώς οι βασικές παράμετροι ζύμωσης επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα εμπλουτισμού της ένωσης σήμανσης υπογραφής εχινακοσίδης και εάν η ζυμωτική τροποποίηση θα μπορούσε να βελτιώσει την απόδοση διάλυσης in-vitro, η οποία συσχετίζεται στενά με την πιθανή βιοδιαθεσιμότητα από το στόμα.

Η εχινακοσίδη επιλέχθηκε ως βασική ένωση δείκτη στόχου στην παρούσα εργασία μας, για το λόγο ότι είναι το πιο αντιπροσωπευτικό συστατικό φαινυλαιθανοειδούς γλυκοσίδης που ευθύνεται για πολλαπλά οφέλη για την υγεία τουCistanche deserticola. Τρεις κύριοι ερευνητικοί στόχοι ορίστηκαν σε αυτό το έγγραφο: πρώτον, η εξέταση μικροβιακών στελεχών υψηλής απόδοσης ικανά να εμπλουτίσουν την εχινακοσίδη σεCistanche deserticolaμήτρα σκόνης? Δεύτερον, για τη συστηματική βελτιστοποίηση κρίσιμων τεχνολογικών μεταβλητών (όγκος εμβολιασμού, αναλογία στερεού-υγρού, διάρκεια ζύμωσης, υπό σταθερή θερμοκρασία επώασης 37 βαθμών) και κατασκευή σταθερού, επαναλαμβανόμενου συστήματος βυθισμένης ζύμωσης. τρίτον, να αξιολογήσει in-vitro τα προφίλ διάλυσης του συστατικού στόχου μετά από επεξεργασία ζύμωσης, έτσι ώστε να επαληθευτεί έμμεσα η δυνατότητα της τεχνολογίας ζύμωσης για την προώθηση της βιοδιαθεσιμότητας των ζυμωμένων από το στόμαCistanche deserticolaσκόνη. Τα πειραματικά αποτελέσματα από αυτό το έργο αναμένεται να παρέχουν καινοτόμες τεχνικές διαδρομές και θεμελιώδη εργαστηριακά στοιχεία για την ανάπτυξη υψηλής αποτελεσματικότητας εμπορικών συμπληρωμάτων διατροφής σε μορφή σκόνης που κατασκευάζονται απόCistanche deserticola.
 

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Πρώτες φυτικές ύλες, μικροβιακά στελέχη και χημικά αντιδραστήρια

Αποξηραμένες φέτες από βόταναCistanche deserticolaελήφθησαν από την Shandong Hongjie Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., αριθμός παρτίδας C397233281. Οι φέτες βοτάνων κονιοποιήθηκαν περαιτέρω σε λεπτή σκόνη πριν από τα πειράματα ζύμωσης. Το στέλεχος δοκιμήςLactobacillus plantarumπροηγουμένως είχε απομονωθεί και διατηρηθεί στο εργαστήριο του Κολλεγίου Βιολογικής Επιστήμης και Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου του Τζινάν. Το μέσο βακτηριακής καλλιέργειας De‑Man‑Rogosa‑Sharpe (MRS) αγοράστηκε από την AoBoxing Biotechnology Co., Ltd., Πεκίνο, Κίνα. Το πρότυπο αναφοράς εχινακοσίδης (καθαρότητα HPLC μεγαλύτερη από ή ίση με 98 %) προέρχεται από την Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Σαγκάη, Κίνα. Το ακετονιτρίλιο χρωματογραφικής ποιότητας, το φωσφορικό οξύ αναλυτικής ποιότητας και άλλοι ανόργανοι χημικοί παράγοντες παρέχονται από τη Sinopharm Chemical Reagent Group Co., Ltd. Το εξαιρετικά καθαρό νερό που παράγεται από εργαστηριακό όργανο καθαρισμού νερού υιοθετήθηκε για όλες τις εργασίες παρασκευής διαλύματος.

2.2 Βακτηριακή ενεργοποίηση και προετοιμασία τουLactobacillus plantarumεναιώρημα

Ενιαία βακτηριακή αποικία διατηρημένηLactobacillus plantarumσυλλέχθηκε από στερεό τρυβλίο άγαρ MRS και εμβολιάστηκε σε στείρο υγρό μέσο MRS. Η υγρή βακτηριακή καλλιέργεια επωάστηκε σε επωαστήρα θερμοστατικής ανακίνησης κάτω από 37 βαθμούς, ταχύτητα ανακίνησης 160 r/min για 24 ώρες. Μετά την καλλιέργεια, η πυκνότητα των βακτηριακών εναιωρημάτων έφτασε περίπου τα \\(10^{8}\\) CFU/mL (μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά χιλιοστόλιτρο). Το παρασκευασμένο βακτηριακό εναιώρημα αποθηκεύτηκε προσωρινά σε συνθήκες ψυγείου 4 μοιρών για επακόλουθες εργασίες εμβολιασμού ζύμωσης.

2.3 Δημιουργία συστήματος βυθισμένης ζύμωσης γιαCistanche deserticolaσκόνη

80 γρCistanche deserticolaΗ πρώτη ύλη σε σκόνη ζυγίστηκε και μεταφέρθηκε σε φιάλη Erlenmeyer του ενός λίτρου, αναμειγνύεται με καθαρό νερό με αναλογία μάζας προς όγκο 1 : 5 (g/mL). Ο αναμεμειγμένος πολτός αποστειρώθηκε υπό συνθήκες ατμού υψηλής πίεσης στους 121 βαθμούς για 25 λεπτά. Μετά την αποστείρωση σε αυτόκλειστο, τα υποστρώματα ζύμωσης ψύχθηκαν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 6 mL προπαρασκευασμέναLactobacillus plantarumβακτηριακό εναιώρημα προστέθηκε στην πειραματική ομάδα ζύμωσης. Η τυφλή ομάδα ελέγχου έλαβε ισοδύναμο όγκο αποστειρωμένου απιονισμένου νερού αντί βακτηριακού εμβολίου. Η επώαση της ζύμωσης προχώρησε σε σταθερό περιβάλλον 37 μοιρών. Δείγματα δειγμάτων συλλέχθηκαν την ημέρα 3, ημέρα 4, ημέρα 5 και ημέρα 6 σε όλη την πρόοδο της ζύμωσης. Τα συλλεχθέντα υγρά δείγματα ζύμωσης φυγοκεντρήθηκαν σε 12 000 r/min για 10 λεπτά και τα υπερκείμενα κλάσματα συλλέχθηκαν και διατηρήθηκαν για μετέπειτα ποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης εχινακοσίδης με HPLC.

2.4 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) ποσοτικοποίηση της εχινακοσίδης

Το σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης Agilent 1260 (Agilent Technologies, Waldbronn, Γερμανία) εξοπλισμένο με χρωματογραφική στήλη YMC-Pack ODS-A (μέγεθος σωματιδίων 5 μm, διάσταση στήλης 4,6 mm × 100 mm) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτική πλευρική ανάλυση του echina. Το σύστημα κινητής φάσης αποτελούνταν από διαλύτη Α: 0,2 % υδατικό διάλυμα φωσφορικού οξέος. διαλύτης Β: ακετονιτρίλιο χρωματογραφικής ποιότητας. Η διαδικασία έκλουσης βαθμίδας κινητής φάσης ορίστηκε ως εξής: 0 λεπτά-15 λεπτά: διατήρηση 95 % κινητής φάσης Α. 15 λεπτά-28 λεπτά: μετατόπιση γραμμικής κλίσης από 95 % Α προς τα κάτω στο 85 % Α. 28 λεπτά-45 λεπτά: μετατόπιση γραμμικής κλίσης από 85 % Α προς τα κάτω στο 80 % Α. 45 λεπτά-45,01 λεπτά: μετατόπιση γραμμικής κλίσης από 80 % Α προς τα κάτω στο 77 % Α. 45,01 λεπτά-55 λεπτά: μετατόπιση γραμμικής κλίσης από 77 % A πίσω στο 95 % Α.

Η ταχύτητα ροής κινητής φάσης ελεγχόταν στο 1,0 mL/min. Η θερμοκρασία του φούρνου στήλης σταθεροποιήθηκε στους 30 βαθμούς. ανίχνευση υπεριώδους μήκους κύματος καθορίστηκε στα 280 nm. Ο όγκος ένεσης δείγματος για κάθε δοκιμή ήταν 30 μL. Εφαρμόστηκε μέθοδος εξωτερικής τυπικής καμπύλης βαθμονόμησης για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης εχινακοσίδης σε δείγματα υπερκειμένου ζύμωσης.

2.5 Πειραματική βελτιστοποίηση παραμέτρων ζύμωσης ενός παράγοντα

Εφαρμόστηκε πειραματικός σχεδιασμός μεταβλητής εναλλαγής ενός παράγοντα, με την περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη που μετρήθηκε από το υπερκείμενο ζύμωσης που επιλέχθηκε ως κύριος δείκτης απόκρισης. Όλες οι επωάσεις ζύμωσης διατήρησαν σταθερή θερμοκρασία στους 37 βαθμούς.

Δοκιμή διαβάθμισης όγκου εμβολιασμού: η αναλογία στερεού-υγρού καθορίστηκε ως 1:5 (g/mL), η διάρκεια επώασης ζύμωσης καθορίστηκε σε 4 ημέρες. Η διαβάθμιση όγκου εμβολιασμού ορίστηκε: 1 mL, 3 mL, 5 mL, 7 mL, 9 mL παρασκευασμένου βακτηριακού εναιωρήματος \\(10^{8}\\) CFU/mL, για να αξιολογηθεί η επίδραση του όγκου του εμβολιασμού στη συσσώρευση της ένωσης στόχου.

Δοκιμή βαθμίδωσης αναλογίας στερεού-υγρού: ο όγκος εμβολιασμού καθορίστηκε στα 3 mL, η διάρκεια της ζύμωσης ορίστηκε σε 4 ημέρες. Οι διαβαθμίσεις αναλογίας στερεού-υγρού περιελάμβαναν 1 : 3, 1 : 5, 1 : 8, 1 : 10, 1 : 12 (g/mL), για τη διερεύνηση των επιπτώσεων της αναλογίας υποστρώματος-νερού.

Δοκιμή βαθμίδωσης χρόνου ζύμωσης: όγκος εμβολιασμού σταθερός ως 3 mL, υιοθετήθηκε η βέλτιστη αναλογία στερεού-υγρού 1 : 5 (g/mL) που ελήφθη από προηγούμενες δοκιμές. Η βαθμίδα χρόνου ζύμωσης κάλυψε 2 d, 3 d, 4 d, 5 d, 6 d για τη διερεύνηση της τάσης δυναμικής συσσώρευσης της εχινακοσίδης παράλληλα με την επέκταση του χρόνου επώασης.

Μετά το τέλος κάθε δοκιμής ζύμωσης, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν, το υπερκείμενο υγρό συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε ποσοτική μέτρηση HPLC της συγκέντρωσης εχινακοσίδης. Κάθε πειραματική επεξεργασία πραγματοποιήθηκε σε βιολογικό τριπλό.

2.6 Αξιολόγηση in-vitro διάλυσης

Κάτω από ελεγμένες βέλτιστες τεχνολογικές παραμέτρους ζύμωσης, ζύμωσηCistanche deserticolaπαρασκευάστηκε δείγμα σκόνης. Η μη ζυμωμένη ακατέργαστη φυτική σκόνη χρησίμευσε ως δείγμα αρνητικού ελέγχου. Πραγματοποιήθηκε δοκιμή διάλυσης in-vitro για να συγκριθεί ο ρυθμός διάλυσης και ο αθροιστικός βαθμός διάλυσης της εχινακοσίδης μεταξύ του ζυμωμένου προϊόντος και της αρχικής πρώτης ύλης σε σκόνη. Τα χρονικά σημεία δειγματοληψίας του μέσου διάλυσης διευθετήθηκαν για την καταγραφή της συμπεριφοράς δυναμικής απελευθέρωσης της ένωσης δείκτη. Η ανάλυση HPLC υιοθετήθηκε για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης εχινακοσίδης στο μέσο διάλυσης σε κάθε χρονικό σημείο, για τον υπολογισμό του ρυθμού διάλυσης και του σωρευτικού ποσοστού διάλυσης.

2.7 Στατιστική ανάλυση

Τα πειραματικά σύνολα δεδομένων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χρήση στατιστικού λογισμικού SPSS 22.0. Διεξήχθη μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) για σύγκριση σημαντικότητας μεταξύ διαφορετικών πειραματικών ομάδων.P < 0.05 was defined as statistically significant difference, and P < 0.01 represented extremely significant difference condition. Origin 2018 software was used for plotting experimental trend graphs. All numerical data were presented as mean value ± standard deviation.

3. Αποτελέσματα

3.1 Σύγκριση προκαταρκτικής ζύμωσης μεταξύ πειραματικής ομάδας και τυφλού ομάδας ελέγχου

Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα δοκιμών βυθισμένης ζύμωσης έδειξαν ότι η πειραματική ομάδα εμβολιάστηκε μεLactobacillus plantarumπέτυχε αξιοσημείωτα υψηλότερη συγκέντρωση εχινακοσίδης σε σύγκριση με την μη εμβολιασμένη ομάδα ελέγχου τυφλού σε όλα τα χρονικά σημεία δειγματοληψίας. Η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη του δείγματος που έχει υποστεί ζύμωση με βακτήρια έφτασε σε σημαντική στατιστική διαφορά σε σχέση με τον τυφλό μάρτυρα ξεκινώντας από τη δεύτερη ημέρα επώασης (P < 0.05). The blank control group only exhibited slight spontaneous fluctuation of echinacoside concentration, without obvious enrichment phenomenon, which verified that metabolic activity of inoculated Lactobacillus plantarumσυνέβαλε στον κατευθυντικό εμπλουτισμό της εχινακοσίδης στο εσωτερικόCistanche deserticolaμήτρα ζύμωσης σκόνης.

3.2 Επίδραση του όγκου εμβολιασμού στη συσσώρευση εχινακοσίδης

Εντός του πειράματος μονού παράγοντα εμβολιασμού-όγκου, η συγκέντρωση εχινακοσίδης αυξήθηκε γρήγορα όταν ο όγκος εμβολιασμού αυξήθηκε από 1 mL σε 3 mL, φτάνοντας τη μέγιστη τιμή \\(43,64\\pm0,15\\) mg/mL κάτω από τη δόση εμβολιασμού 3 mL. Όταν ο όγκος εμβολιασμού συνέχιζε να αυξάνεται πάνω από 3 mL, η ανιχνευόμενη συγκέντρωση εχινακοσίδης εμφάνισε σταδιακή φθίνουσα τάση. Η υπερβολικά υψηλή δόση εμβολιασμού θα προκαλούσε έντονο ανταγωνισμό για περιορισμένους πόρους διατροφής εντός του συστήματος ζύμωσης, διαταράσσοντας τη μεταβολική ισορροπία και περιορίζοντας την αποτελεσματικότητα εμπλουτισμού του συστατικού στόχου. Επομένως, 3 mL όγκου εμβολιασμού (βακτηριακή πυκνότητα περίπου \\(10^{8}\\) CFU ανά γραμμάριο μήτρας υποστρώματος) επιλέχθηκε ως η βέλτιστη παράμετρος όγκου εμβολιασμού για τα επόμενα πειράματα.

3.3 Επίδραση της αναλογίας στερεού-υγρού στη συσσώρευση εχινακοσίδης

Η δοκιμή ενός παράγοντα αναλογίας στερεού-υγρού έδειξε ότι η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη έφτασε στη μέγιστη τιμή \\(40,42\\pm0,15\\) mg/mL σε αναλογία στερεού-υγρού 1 : 5 (g/mL). Εάν η αναλογία στερεού-υγρού ήταν πολύ υψηλή (ανεπαρκές υγρό μέσο), ο πολτός του υποστρώματος εμφάνιζε υπερβολικά υψηλό ιξώδες, το οποίο παρεμπόδιζε τη μεταφορά μάζας, τον πολλαπλασιασμό των βακτηρίων και τις αντιδράσεις μετασχηματισμού ουσίας. Όταν η αναλογία υγρών έγινε υπερβολικά μεγάλη (χαμηλή αναλογία στερεού προς υγρό), η συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών στο υπόστρωμα αραιώθηκε υπερβολικά, γεγονός που μείωσε επίσης το τελικό επίπεδο εμπλουτισμού της εχινακοσίδης. Ως εκ τούτου, η αναλογία στερεού-υγρού 1 : 5 (g/mL) επιβεβαιώθηκε ως η καταλληλότερη συνθήκη αναλογίας υποστρώματος-νερού.

3.4 Επίδραση του χρόνου επώασης της ζύμωσης στη συσσώρευση εχινακοσίδης

Με βάση τις παραμέτρους όγκου εμβολιασμού και αναλογίας στερεού-υγρού που προσδιορίστηκαν παραπάνω, παρακολουθήθηκε η δυναμική αλλαγή της συγκέντρωσης εχινακοσίδης κατά τη διάρκεια του χρόνου ζύμωσης. Η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη αυξανόταν συνεχώς και πέτυχε τη μέγιστη τιμή \\(43,33\\pm0,20\\) mg/mL την 5η ημέρα της επώασης με ζύμωση. Μετά την επίτευξη του χρονικού σημείου επώασης 6 ημερών, η μετρήσιμη συγκέντρωση εχινακοσίδης μειώθηκε μετρίως, γεγονός που αποδόθηκε στη μερική αποικοδόμηση των γλυκοσιδικών ενώσεων που προκαλείται από παρατεταμένη μικροβιακή μεταβολική δράση. Συνεπώς, η βέλτιστη διάρκεια επώασης ζύμωσης προσδιορίστηκε ως 5 ημέρες σε θερμοκρασία 37 βαθμών.

Συνθέτοντας όλες τις εξόδους βελτιστοποίησης ενός παράγοντα, η ολοκληρωμένη βέλτιστη τεχνολογική συνθήκη βυθισμένης ζύμωσης γιαCistanche deserticolaη σκόνη συνοψίστηκε: όγκος εμβολιασμού 3 mL (περίπου \\(10^{8}\\) CFU/g υποστρώματος), αναλογία στερεού-υγρού 1: 5 (g/mL), σταθερή θερμοκρασία επώασης στους 37 βαθμούς, διάρκεια ζύμωσης 5 ημέρες.

3.5 Πειραματική αξιολόγηση διάλυσης in-vitro

Κάτω από την προαναφερθείσα βέλτιστη ροή εργασιών ζύμωσης, ζύμωσηCistanche deserticolaΠαρήχθη δείγμα σκόνης για in-vitro αξιολόγηση της διάλυσης. Σε σύγκριση με τη μη ζυμωμένη ακατέργαστη φυτική σκόνη, το δείγμα σκόνης που έχει υποστεί ζύμωση εμφάνισε σαφώς υψηλότερο ρυθμό διάλυσης και υψηλότερη αθροιστική έκταση διάλυσης για την ένωση δείκτη εχινακοσίδη. Αυτή η παρατήρηση πρότεινε ότι η θεραπεία με προβιοτική ζύμωση τροποποίησε τις φυσικοχημικές ιδιότητες της μήτρας φυτικής σκόνης και βελτίωσε την απόδοση διάλυσης-απελευθέρωσης του βασικού βιοενεργού συστατικού εχινακοσίδης, υποδηλώνοντας τη δυνατότητά του για ενίσχυση της βιοδιαθεσιμότητας από το στόμα.

4. Συζήτηση

Στην παρούσα εργασία,Lactobacillus plantarumεπαληθεύτηκε ως αποτελεσματικό στέλεχος ζύμωσης για κατευθυντικό εμπλουτισμό της εχινακοσίδης εντόςCistanche deserticolaυπόστρωμα πούδρας. Σύμφωνα με προηγούμενη δημοσιευμένη βιβλιογραφία, η ζύμωση βακτηρίων γαλακτικού οξέος μπορεί να εκκρίνει πολλαπλά υδρολυτικά ένζυμα για την αποικοδόμηση άκαμπτων δομικών πολυμερών του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος, όπως η κυτταρίνη και η πηκτίνη, η οποία απελευθερώνει φυτοχημικά συστατικά παγιδευμένα μέσα σε δίκτυα κυτταρικού τοιχώματος. Από την άλλη πλευρά, ο μικροβιακός μεταβολικός μετασχηματισμός μπορεί να μετατρέψει τις πρόδρομες ουσίες σε προϊόντα-στόχους φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων, συμβάλλοντας από κοινού σε αυξημένη συγκέντρωση εχινακοσίδης σε ζυμωμένο υπερκείμενο PMC.

Η δοσολογία εμβολιασμού, η αναλογία στερεού-υγρού υποστρώματος-νερού και ο χρόνος επώασης ζύμωσης άσκησαν εξέχουσες επιρροές στην αποτελεσματικότητα τελικού εμπλουτισμού της εχινακοσίδης. Ο πολύ χαμηλός όγκος εμβολιασμού οδηγεί σε ανεπαρκή βιώσιμο βακτηριακό πληθυσμό, με αποτέλεσμα την ανεπαρκή ικανότητα βιομετατροπής. Η υπερβολικά υψηλή ποσότητα εμβολιασμού πυροδοτεί έντονο ανταγωνισμό θρεπτικών ουσιών εντός του είδους μέσα στο σύστημα ζύμωσης και η μαζική συσσώρευση μεταβολικών υποπροϊόντων μπορεί να επιταχύνει τη μερική αποσύνθεση των μορίων γλυκοσίδης εχινακοσίδης. Η αναλογία στερεού-υγρού ρυθμίζει άμεσα το ιξώδες του συστήματος, την απόδοση μεταφοράς μάζας και την κατάσταση συγκέντρωσης θρεπτικών συστατικών. Η παρατεταμένη επώαση ζύμωσης θα προκαλέσει δευτερογενή αποικοδόμηση της γλυκοσιδικής ένωσης στόχου, γεγονός που εξηγεί την πτώση της συγκέντρωσης της εχινακοσίδης μετά από επώαση πέντε ημερών στο πείραμά μας με χρονική διαβάθμιση. Επομένως, ο ακριβής έλεγχος αυτών των τριών βασικών παραμέτρων της διαδικασίας είναι απαραίτητος για την απόκτηση σταθερής ζύμωσης με υψηλή περιεκτικότητα σε εχινακοσίδηCistanche deserticolaπροϊόντα σε σκόνη.

Τα αποτελέσματά μας δοκιμών διάλυσης in-vitro έδειξαν ότι η ζυμωμένη σκόνη επέδειξε ανώτερη συμπεριφορά διάλυσης-απελευθέρωσης της εχινακοσίδης σε σύγκριση με την αρχική ακατέργαστη σκόνη που δεν έχει υποστεί ζύμωση. Αυτή η βελτίωση θα μπορούσε να οφείλεται σε πολλούς λόγους: η μερική αποικοδόμηση του κυτταρικού τοιχώματος που προκαλείται από μικροβιακά ένζυμα αλλάζει τη μικρομορφολογία της σκόνης, αυξάνει το πορώδες της επιφάνειας των σωματιδίων και την ειδική επιφάνεια και μειώνει το φυσικό εμπόδιο για τη διάλυση των συστατικών. Εν τω μεταξύ, οι μικροβιακές μεταβολικές διεργασίες μπορεί να αλλάξουν τα χημικά χαρακτηριστικά της επιφάνειας της σκόνης, γεγονός που προάγει περαιτέρω τη διάλυση σε υδατική φάση των μορίων φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίου. Θα πρέπει να τονιστεί ότι το πείραμα διάλυσης in vitro παρέχει μόνο έμμεσα στοιχεία για τη βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας. Η πραγματική βιοδιαθεσιμότητα in-vivo από του στόματος εξακολουθεί να απαιτεί περαιτέρω φαρμακοκινητικές δοκιμές σε ζώα ή έρευνα ανθρώπινης παρέμβασης για σταθερή επικύρωση.

Παραμένουν αρκετοί περιορισμοί για την τρέχουσα έρευνά μας. Αυτό το έργο υιοθέτησε τη βελτιστοποίηση ενός παράγοντα αντί της ανάλυσης αλληλεπίδρασης πολλαπλών παραγόντων επιφανείας απόκρισης και τα αλληλεπιδραστικά αποτελέσματα μεταξύ διαφορετικών μεταβλητών ζύμωσης δεν έχουν αξιολογηθεί ποσοτικά. Επιπλέον, εστιάσαμε κυρίως στην ποσοτική αλλαγή της ένωσης δείκτη εχινακοσίδη. ολοκληρωμένο προφίλ μεταβολομικής για τη μετατόπιση του μεταβολικού προφίλ ολόκληρης της ζυμωμένης σκόνης δεν πραγματοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Περαιτέρω έρευνα θα μπορούσε να υιοθετήσει την τεχνολογία μη στοχευμένης μεταβολομικής LC-MS για να αποκαλύψει συστηματικά τη διακύμανση του μεταβολίτη σε πλήρη κλίμακα μετάLactobacillus plantarumζύμωση τουCistanche deserticolaσκόνη. Επιπλέον, οι εργασίες παρακολούθησης πρέπει να πραγματοποιηθούν φαρμακοκινητικά πειράματα σε ζώα για τον υπολογισμό των πραγματικών παραμέτρων βιοδιαθεσιμότητας από το στόμα των ζυμωμένωνCistanche deserticolaσκόνης και διεξαγωγή πειραμάτων επαλήθευσης φαρμακολογικών αποτελεσμάτων, όπως αξιολόγηση αντιοξειδωτικής, κατά της κόπωσης ή νευροπροστατευτικής δραστηριότητας.

Από την άποψη της βιομηχανικής εφαρμογής, αυτή η βελτιστοποιημένη διαδικασία βυθισμένης ζύμωσης παρέχει μια εφικτή τεχνική διαδρομή για αναβάθμισηCistanche deserticolaσχετιζόμενα με λειτουργικά προϊόντα πρώτων υλών τροφίμων. Για την εμπορική κατασκευή, η επακόλουθη τεχνική εξερεύνηση πρέπει να επικεντρωθεί στην επαλήθευση κλιμάκωσης της ροής εργασιών ζύμωσης, στη διερεύνηση της κατάλληλης τεχνολογίας ξήρανσης μετά τη ζύμωση (ξήρανση με κατάψυξη ή ξήρανση με ψεκασμό), στην αξιολόγηση της σταθερότητας αποθήκευσης των ζυμωμένων τελικών προϊόντων σε σκόνη, ώστε να υποστηρίζεται η βιομηχανική παραγωγή μεγάλης κλίμακας.

5. Συμπεράσματα

Το πείραμα προσυμπτωματικού ελέγχου το απέδειξε αυτόLactobacillus plantarumμπορεί να προωθήσει αποτελεσματικά τον κατευθυντικό εμπλουτισμό του βασικού βιοενεργού δείκτη εχινακοσίδης στο εσωτερικόCistanche deserticolaμήτρα ζύμωσης σκόνης.

Μέσω πειράματος βελτιστοποίησης μεταβλητής εναλλαγής ενός παράγοντα, προσδιορίστηκαν σταθερές παράμετροι βυθισμένης ζύμωσης γιαCistanche deserticolaσκόνη: όγκος εμβολιασμού 3 mL (βακτηριακή πυκνότητα \\(10^{8}\\) CFU/g υποστρώματος), αναλογία στερεού-υγρού 1 : 5 (g/mL), θερμοκρασία επώασης 37 βαθμοί, χρόνος ζύμωσης 5 ημέρες. Υπό αυτές τις βελτιστοποιημένες συνθήκες, η περιεκτικότητα σε εχινακοσίδη πέτυχε σημαντική αύξηση (P < 0.01).

Η in-vitro αξιολόγηση της διάλυσης έδειξε ότι το δείγμα σκόνης που έχει υποστεί ζύμωση διέθετε ταχύτερο ρυθμό διάλυσης και υψηλότερο βαθμό αθροιστικής διάλυσης εχινακοσίδης σε σύγκριση με μη ζυμωμένη πρώτη ύλη, δείχνοντας πολλά υποσχόμενες δυνατότητες για βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας από το στόμα.Cistanche deserticolaβιοδραστικών συστατικών.

Αυτή η μελέτη καθιερώνει μια σταθερή τεχνολογία προβιοτικής ζύμωσης γιαCistanche deserticolaσκόνη, προσφέρει νέα τεχνική λύση για την αντιμετώπιση της συμφόρησης χαμηλής βιοδιαθεσιμότητας των ακατέργαστωνCistanche deserticolaφυτική σκόνη και παρέχει πειραματική βάση εργαστηριακής κλίμακας για την ανάπτυξη υψηλής αξίας λειτουργικών τροφών και συμπληρωμάτων διατροφής που προέρχονται απόCistanche deserticola.

Ευχαριστίες

Αυτή η ερευνητική εργασία υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Shandong Provincial Technology Innovation Guidance Project (Grant No. YDZX2024111). Βασικό Πρόγραμμα Έρευνας και Ανάπτυξης της επαρχίας Shandong (Αριθμός επιχορήγησης. 2023TSGC041, 2023TSGC053).

Συγκρούσεις συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Αναφορές

[1] Επιτροπή Κινεζικής Φαρμακοποιίας. Φαρμακοποιία της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας (Τόμος Ι)[Μ]. Πεκίνο: China Medical Science Press; 2020.

[2] Wang Y. Έρευνα αποτελεσματικότητας και μηχανισμού της εχινακοσίδης για σπερματογενή δυσλειτουργία σε αρουραίους[D]. Yanji: Yanbian University; 2020.

[3] Gulinuer Mutelifu, et al. Έρευνα αντιγηραντικού μηχανισμού εχινακοσίδης[J]. Κινεζικό περιοδικό έκτακτης ανάγκης στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική, 2020, 20(3):140-143.

[4] Zhang N, Chen Z, Hui C, et al. Νευροπροστατευτικές επιδράσεις της εχινακοσίδης έναντι της επαγόμενης από MPTP νευρικής βλάβης σε ποντίκια [J]. Neuropsychiatric Disease and Treatment, 2021, 17:1779-1792.

[5] Chen H, Wang YL. Νευροπροστατευτικός μηχανισμός εχινακοσίδης για αρουραίους τραυματισμένους από νωτιαίο μυελό μέσω της οδού σηματοδότησης PI3K-Akt-eNOS[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2021, 28(10): 1721-1725.

[6] Li G, Wan B, Han L, et al. Η εχινακοσίδη ανακούφισε τη φλεγμονή του εντερικού επιθηλίου που προκλήθηκε από το LPS και την κυτταρική απόπτωση σε μοντέλο αρουραίου [J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2021,140:111622.

[7] Li W, Zhou J, Zhang Y, et al. Η εχινακοσίδη ασκεί αντικαρκινική δράση στα καρκινικά κύτταρα του ήπατος μέσω της αναστολής της οδού mTOR/STAT3[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(1): 304.

[8] Wang Y, Wang F, Ma L C. Ανάλυση χημικών συστατικών της παραδοσιακής βοτανοθεραπείας πριν και μετά τη μικροβιακή ζύμωση με βάση το LC-MS/MS[J]. Molecules, 2022,28(1).

[9] Cao G, Xu J, et al. Διαδοχή μικροβιακής κοινότητας και μετασχηματισμός αλκαλοειδούς ουσίας κατά τη ζύμωση βοτάνων απόLactobacillus plantarum[J]. Letters in Applied Microbiology, 2020,70(4):318-325.

[10] Okamoto T, Sugimoto M, Noda S, et al. Αναστολείς απελευθέρωσης ιντερλευκίνης-8 που δημιουργούνται σεArtemisia princepsεκχύλισμα παμπανίνης ζυμωμένο μεLactobacillus plantarumSN13T[J]. Frontiers in Microbiology, 2020.