Τα ωμέγα-3 λιπαρά οξέα ρυθμίζουν προς τα πάνω το SIRT1/3, ενεργοποιούν το PGC-1 μέσω αποακετυλίωσης και προκαλούν παραγωγή Nrf1 στο μοντέλο νεφρεκτομής 5/6 αρουραίων
Mar 10, 2022
Εισαγωγή
Νεφράεμπλέκονται στη ρύθμιση πολλών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων μεταβολικών οδών, της ισορροπίας νερού και ηλεκτρολυτών, του ελέγχου της αρτηριακής πίεσης και της παραγωγής αρκετών ορμονών. Καθώς αυτές οι λειτουργίες καταναλώνουν τεράστια ενέργεια,νεφράείναι πλούσια σε μιτοχόνδρια [1]. Τα μιτοχόνδρια μπορούν να προσαρμοστούν σε διαφορετικές μεταβολικές συνθήκες μέσω της ρύθμισης των μηχανιστικών στόχων της ραπαμυκίνης (mTOR) και των διαμεσολαβούμενων από AMP-ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK) οδών αίσθησης θρεπτικών ουσιών για τη διατήρηση ενός υγιούς μιτοχονδριακού πληθυσμού [2]. Μεταξύ των μελετών για τα μιτοχόνδρια, μέχρι σήμερα, υπάρχουν μόνο λίγες μελέτες για τη μιτοχονδριακή βιογένεση. Οι περισσότερες μελέτες που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση βασίζονται σε μηνεφρώνιστού [3,4], και μελέτες γιανεφράσχετίζονται κυρίως με την οξείανεφρική βλάβη(AKI) ζωικά μοντέλα, εγγύς σωληναριακά κύτταρα και διαβητική νεφροπάθεια [5-7]. Αν και η μιτοχονδριακή βιογένεση μπορεί να συνδέεται με την παθογένεση της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας σε μη διαβητικούς χρόνιουςΝεφρική Νόσος (ΧΝΝ), η έρευνα για αυτό το θέμα είναι επίσης πολύ περιορισμένη. Η ΧΝΝ και η μιτοχονδριακή βιογένεση σχετίζονται με την καρδιαγγειακή νόσο [8,9]. Η βελτίωση της μιτοχονδριακής βιογένεσης μπορεί να είναι ευεργετική για την καρδιοπροστασία στη ΧΝΝ. Μια μελέτη που δείχνει ότι τα ωμέγα-3 λιπαρά οξέα (FAs) διευκολύνουν τη βιογένεση των μιτοχονδρίων διεξήχθη χρησιμοποιώντας μηνεφρόιστούς [3,10]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε έναν πολλά υποσχόμενο ρόλο των ωμέγα-3 FA στη μιτοχονδριακή βιογένεση σε ζωικά μοντέλα με καρδιαγγειακές και νευροεκφυλιστικές ασθένειες [11]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, στοχεύσαμε να διερευνήσουμε τη μιτοχονδριακή βιογένεση σενεφράαρουραίων 5/6 νεφρεκτομής (Nx). Επιπλέον, αξιολογήσαμε την επίδραση των ωμέγα-3 FA στη μιτοχονδριακή βιογένεση χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο.
Λέξεις-κλειδιά:πυρηνικός αναπνευστικός παράγοντας 1; πυρηνικός παράγοντας ερυθροειδές 2-σχετιζόμενος παράγοντας 2. sirtuin 1; sirtuin 3; ωμέγα-3 λιπαρό οξύ. νεφρός, νεφρός
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ
2. Αποτελέσματα
2.1. Αλλαγές στη νεφρική λειτουργία και ιστολογικά ευρήματα
Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, τα επίπεδα αζώτου ουρίας αίματος (BUN) στις ομάδες Nx και Nx που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ωμέγα{{{{0}} ομάδες FA ήταν σημαντικά αυξημένα (ομάδα ελέγχου 17,7 ± 1,5, ομάδα Nx 77,7 土 28,4 και tit με ωμέγα-3 ομάδα FA 63,9 έως 17.0 mg/dL, p = 0.{{20}}07). Αν και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων Nx και Nx που έλαβαν ωμέγα-3 FA, τα επίπεδα BUN ήταν αριθμητικά χαμηλότερα στην ομάδα Nx που έλαβαν ωμέγα{-3 FA. Το επίπεδο κρεατινίνης ορού (sCr) μεταξύ των τριών ομάδων ήταν παρόμοιο με αυτό της BUN (ομάδα ελέγχου, 0.4η 0.U· ομάδα Nx, 1.3 έως 0.6· ωμέγα-3 FA, 1.0 ± 0,3 mg/dL, y=0,008). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, σοβαρή σωληναριακή διάταση και ατροφία παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας χρώση PAS στην ομάδα Nx (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομάδα Nx που έλαβε αγωγή με ωμέγα-3 FA εμφάνισε λιγότερες σωληναρισιακές αλλαγές από την ομάδα Nx. ονεφρική λειτουργίακαι ιστολογικές αλλαγές στις τρεις ομάδες έχουν ήδη αναφερθεί σε προηγούμενη μελέτη [12].
22 Αλλαγές σε Παράγοντες που σχετίζονται με τη Μιτοχονδριακή Βιογένεση
2.2.1. Έκφραση Nrf1 και Nrf2.Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η ομάδα Nx έδειξε σημαντικά μειωμένο επίπεδο έκφρασης του πυρηνικού αναπνευστικού παράγοντα 1 (Nefl) και του παράγοντα 2 που σχετίζεται με τον ερυθροειδές 2-πυρηνικό παράγοντα (Nrf2). Ωστόσο, στην ομάδα Nx που έλαβε θεραπεία με ωμέγα-3 FA, το επίπεδο έκφρασης των Nrf1 και Nrf2 ήταν σημαντικά αυξημένο σε σύγκριση με την ομάδα Nx, αλλά δεν έφτασε στο επίπεδο της ομάδας ελέγχου (Oigure P, Συμπληρωματικό Σχήμα St) . Αυτά τα αποτελέσματα βρέθηκαν επίσης cn Nrf1 mRNA ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο (Συμπληρωματικό Σχήμα S3).
2.2.3. Έκφραση παραγόντων που σχετίζονται με PGC-1 Δραστηριότητα: pAMPK, SIRT1/3.Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, οι ομάδες Nx και Nx που έλαβαν θεραπεία με ωμέγα-3 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα φωσφορυλιωμένης AMPK (η αναλογία κολοκύθας προς AMPK) (Εικόνα 3Α). Επιπλέον, η ομάδα Nx εμφάνισε σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης sirtuin 1 (SIRT1) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 3Β, Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Ωστόσο, μετά την προσθήκη ωμέγα-3 FA, η έκφραση SIRT1 ήταν σχετικά αυξημένη, αλλά αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Αυτά τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο SIRT1 mRNA (Συμπληρωματικό Σχήμα S7). Αντίθετα, η έκφραση της sirtuin 3 (SIRT3) μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα Nx σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η οποία διασώθηκε σημαντικά στην ομάδα Nx που έλαβε αγωγή με την ομάδα ωμέγα-3 FA (Εικόνα 3C).
2.2.4. Έκφραση Keap1, mTOR, FoxO1 και FoxO3, Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η έκφραση της πρωτεΐνης 1 (Keap1) που σχετίζεται με EC H παρόμοια με Kelch και των πρωτεϊνών O1 και O3 Forkhead box (FoxO1/3) αυξήθηκε σημαντικά στην ομάδα Nx . Στην ομάδα Nx που έλαβε αγωγή με την ομάδα ωμέγα-3 FA, το επίπεδο έκφρασης των Keap1 και FoxO1/3 μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα Nx (Εικόνα 4C,E,F). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η έκφραση του mTOR ήταν σημαντικά μειωμένη στην ομάδα Nx. Ωστόσο, στην ομάδα Nx που έλαβε αγωγή με ωμέγα-3 FA, η έκφραση mTOR διασώθηκε αλλά δεν έφτασε στο επίπεδο στην ομάδα ελέγχου (Εικόνα 4Β)
2.2.5. Περιεκτικότητα σε μιτοχονδριακό DNA (mtDNA), Σημαντική μείωση του mtDNA παρατηρήθηκε στην ομάδα Nx σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, η ποσότητα μείωσης του mtDNA ανακτήθηκε σημαντικά στην ομάδα ωμέγα-3 Nx που υποβλήθηκε σε θεραπεία με Nx (Συμπληρωματικό Σχήμα S9).
3. Συζήτηση
Το PGC-1, το οποίο ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης και αποακετυλίωσης, είναι ο κύριος ρυθμιστής της μιτοχονδριακής βιογένεσης και της παραγωγής ενέργειας. Βρήκαμε μείωση στην έκφραση και την αποακετυλίωση του PGC-1 στο μοντέλο ΧΝΝ. Είναι αξιοσημείωτο ότι η μειωμένη αποακετυλίωση PGC-1 είναι ο κύριος μηχανισμός που συμβάλλει στη δυσλειτουργική μιτοχονδριακή βιογένεση και στη μειωμένη παραγωγή ενέργειας στη ΧΝΝ. Το AMPK ενεργοποιεί την PGC-1 μέσω της φωσφορυλίωσης των υπολειμμάτων θρεονίνης ή σερίνης [13,14]. Η AMPK ενεργοποιείται επίσης κατά τη φωσφορυλίωση όταν η αναλογία AMP/ATP είναι υψηλή. Ωστόσο, η AMPK είναι γνωστό ότι αδρανοποιείται στη ΧΝΝ λόγω της μειωμένης αίσθησης υψηλών επιπέδων AMP [15,16]. Παρόμοια με προηγούμενες μελέτες, δείξαμε ότι η φωσφορυλίωση ΑΜΡΚ μειώθηκε σημαντικά στονεφρόιστός της ομάδας Nx. Αν και το pPGC-1/PGC-1 φαίνεται να είναι αυξημένο σε κάποιο βαθμό στην ομάδα Nx, είναι απίθανο το επίπεδο της φωσφορυλίωσης PGC-1 να αυξηθεί λόγω μειωμένης PGC{{3 }} έκφραση. Επιπλέον, το Nx που υποβλήθηκε σε αγωγή με την ομάδα ωμέγα-3 FA έδειξε επίσης παρόμοια αποτελέσματα με αυτά της ομάδας Nx, γεγονός που υποδεικνύει ότι η χορήγηση ωμέγα-3 FA δεν επηρέασε τη φωσφορυλίωση της AMPK και της PGC{{6} } . Η αποακετυλίωση μπορεί να συμβεί σε ολόκληρη την αλληλουχία της PGC-1 και τα SIRT1 και 3 παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αποακετυλίωσης [13,14]. Μετά τη χορήγηση ωμέγα-3 FA, το επίπεδο έκφρασης των PGC-1 , SIRT1 και 3 αυξήθηκε, με αποτέλεσμα τη διάσωση της αποακετυλιωμένης PGC-1 στο ίδιο επίπεδο με αυτό της κανονικής ομάδας ελέγχου . Η διάσωση στο επίπεδο έκφρασης των Nrf1 και Nrf2, η οποία αποδεικνύεται στην ομάδα Nx που έχει υποστεί αγωγή με ωμέγα-3 FA, σχετίζεται άμεσα με την αύξηση των επιπέδων έκφρασης SIRT1 και 3, η οποία οδήγησε περαιτέρω στην αποακετυλίωση της PGC {22}} .
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ
Πρόσφατες μελέτες για τα μιτοχόνδρια στοΝεφρική Νόσοςέχουν δείξει ότι η αύξηση του επιπέδου έκφρασης PGC- 1 ή SIRT μέσω γενετικών ή φαρμακολογικών παρεμβάσεων βελτιώθηκενεφρική βλάβησε ζωικά μοντέλα AKI [5-7,17,18]. Ο υποκείμενος μηχανισμός περιλαμβάνει την επίδραση της βελτίωσης της οξείδωσης των FA ή της αντιοξειδωτικής απόκρισης. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι η χορήγηση ωμέγα-3 FA βελτίωσε τη βήτα-οξείδωση του μιτοχονδριακού FA και παρουσίασε αντιοξειδωτικά αποτελέσματα σε ένα μοντέλο αρουραίου 5/6 Nx [19]. Υπάρχουν επίσης αναφορές που υποδηλώνουν ότι το ωμέγα-3 FA αυξάνει την έκφραση των PGC-1, Nrf1 και SIRT1 σε μυϊκά κύτταρα, μακροφάγα και νευρικά κύτταρα [3,10,11]. Καθώς οι επιδράσεις των ωμέγα-3 FA στα μιτοχόνδρια σε ένα μοντέλο ΧΝΝ δεν έχουν ακόμη αναφερθεί, δείξαμε ότι το ωμέγα-3 FA είναι αποτελεσματικό στην ανάκτηση μορίων και mtDNA που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο CKD σε αυτό μελέτη.
Τόσο το mTOR όσο και το AMPK εμπλέκονται στη μιτοχονδριακή βιογένεση, αλλά ο ρόλος τους ποικίλλει ανάλογα με τη διατροφική κατάσταση. Το mTOR, ένας στόχος του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1 (mTOC1), μπορεί να ενεργοποιηθεί μέσω ενεργειακών ερεθισμάτων, όπως το αμινοξύ ή η γλυκόζη, και μπορεί να προκαλέσει μονοπάτια που οδηγούν σε αναβολικές διεργασίες και μιτοχονδριακή βιογένεση. Αντίθετα, η AMPK μπορεί να ενεργοποιηθεί μέσω της υποξίας και των διατροφικών ελλειμμάτων, γεγονός που οδηγεί στην ενεργοποίηση της καταβολικής διαδικασίας και της μιτοχονδριακής βιογένεσης και αναστέλλει την κατανάλωση ενέργειας μέσω του mTOC1 [2]. Σε αυτή τη μελέτη, όχι μόνο δείξαμε μείωση του pAMPK/AMPK, αλλά και μείωση του mTOR στο μοντέλο ΧΝΝ. Επιπλέον, η χορήγηση ωμέγα-3 FA οδήγησε σε σχεδόν ανάκτηση της έκφρασης mTOR αλλά όχι ανάκτηση της μείωσης του pAMPK/AMPK. Επομένως, τα ωμέγα-3 FA μπορεί να ανακουφίσουν τη μειωμένη μιτοχονδριακή βιογένεση αυξάνοντας την έκφραση mTOR στονεφράενός μοντέλου ζώου ΧΝΝ. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί εάν το mTOR είναι μειωμένο σε ασθενείς με ΧΝΝ και πώς η αύξηση της έκφρασης του mTOR μέσω της θεραπείας με ωμέγα-3 FA θα επηρεάσει τη μιτοχονδριακή υγεία και την εξέλιξη της ΧΝΝ.
Το FoxO1 και το 3 συνδέονται με τον προαγωγέα PGC-1 και ενισχύουν τη μεταγραφή του [20,21]. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, το FoxO1 και το 3 βρέθηκαν να είναι αυξημένα στην ομάδα Nx και μειώθηκαν στην ομάδα ελέγχου και το Nx που έλαβαν θεραπεία με ωμέγα-3 ομάδες FA. Επομένως, θεωρείται ότι η έκφραση των FoxO1 και 3 είναι σχετική για την αντισταθμιστική απόκριση στη μείωση της PGC-1 στη ΧΝΝ ή στην αύξηση της PGC-1 μέσω της χορήγησης ωμέγα-3 FA. Το Nrf2 παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική οξειδοαναγωγική ομοιόσταση και στη μιτοχονδριακή βιογένεση. Υπάρχουν τρία συστήματα λιγάσης ουβικιτίνης που σχετίζονται με την αποδόμηση του Nrf2 (Keap1, πρωτεΐνη που περιέχει επαναλήψεις -transducin, και αρθρική λιγάση ουβικιτίνης E3) [22]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε σημαντική μείωση στο Nrf2 και σημαντική αύξηση στο Keap1 στην ομάδα Nx σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.d Ωστόσο, στην ομάδα Nx που έλαβε θεραπεία με ωμέγα-3 FA, βρέθηκε η έκφραση του Keap1 να μειωθεί και το Nrf2 αυξήθηκε. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η βελτιωμένη αντιοξειδωτική δράση της χορήγησης ωμέγα-3 FA στο μοντέλο αρουραίου ΧΝΝ μπορεί να σχετίζεται με τη μείωση της έκφρασης Keap1 και την αποικοδόμηση του Nrf2, η οποία μπορεί να ενισχύσει τη βιογένεση των μιτοχονδρίων. Με βάση τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε αυτήν τη μελέτη, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να αποσαφηνιστεί η αιτιώδης σχέση μεταξύ του FoxO1/3 και του Nrf2 στο περιβάλλον ΧΝΝ και της επίδρασης της χορήγησης ωμέγα-3 FA.
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ
Το μοριακό βάρος του Nrf2 βρέθηκε σε περιοχή 68 kilodaltons (kDa) σε αυτή τη μελέτη και σε άλλες πρόσφατες μελέτες [23,24]. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ένα βιολογικά σχετικό μοριακό βάρος του Nrf2 είναι 95-110 kDa με στοιχεία [25,26]. Βρήκαμε επίσης ζώνες που ήταν ύποπτες ως βιολογικά σχετικές Nrf2 (Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να βρεθεί το μοριακό βάρος του βιολογικά σημαντικού Nrf2. Σε προηγούμενες μελέτες, οι αλλαγές στα μιτοχόνδρια την 28η ημέρα μετά από 5/6 Nx έχουν αναφερθεί, οι οποίες έδειξαν μείωση στην έκφραση γονιδίου ή πρωτεΐνης που σχετίζεται με βήτα-οξείδωση, οξειδωτική φωσφορυλίωση και δομική πρωτεΐνη της εσωτερικής μεμβράνης, αλλά δεν υπήρξε αποτέλεσμα που σχετίζεται με την έκφραση PGC-1 [27,28]. Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαιώσαμε ότι τα μόρια που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση και η μιτοχονδριακή βιογένεση που αντανακλούν το mtDNA διαμορφώθηκαν κατά τη διάρκεια του χρόνιου σταδίου, καθώς οι αλλαγές παρατηρήθηκαν την 45η ημέρα μετά από 5/6 Nx σε αρουραίους. Παρά τις ιστολογικές και βιολογικές βελτιώσεις, η θεραπεία με ωμέγα{-3 FA δεν οδήγησε σε λειτουργική αποκατάστασηνεφράσε σύγκριση με το μοντέλο Nx. Επομένως, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να προσδιοριστεί εάν τα ωμέγα-3 FA είναι αποτελεσματικά στην αποκατάστασηνεφρική λειτουργίαμε την πρόκληση επιδράσεων που μπορεί να βελτιώσουν τη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Πρώτον, δεν αξιολογήσαμε τη δραστηριότητα της κιτρικής συνθάσης και το σχηματισμό υπεροξειδίου στη μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα. Δεύτερον, δεν πειραματιστήκαμε με ποια συστατικά FA του Omacor επηρεάζονται κυρίως σε μόρια που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση. Τρίτον, δεν επιδείξαμε σαφή μηχανισμό για τη βελτίωση των μορίων που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση. Απλώς προτείνουμε ότι η αντιφλεγμονώδης δράση, η μείωση του οξειδωτικού στρες και του ίδιου του ωμέγα-3 λιπαρού οξέος ως μεταβολικών ενώσεων, μπορεί να σχετίζεται με τον μηχανισμό.
4. Υλικά και Μέθοδοι Μιτοχονδριακή Βιογένεση
4.1. Ζώα και Πειραματικός ΣχεδιασμόςΔιεξήχθησαν μελέτες σε αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley (9-εβδομάδων) που αγοράστηκαν από την Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Ιαπωνία). Όλοι οι αρουραίοι υποβλήθηκαν είτε σε εικονικό έλεγχο είτε σε 5/6 Nx. Όλες οι διαδικασίες που αφορούσαν ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την έγκριση της Επιτροπής Ιδρυματικής Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου Dong-A (DIACUC-14-4). Οι αρουραίοι διατηρήθηκαν υπό τυπικές συνθήκες και επέτρεψαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό βρύσης και μια τυπική δίαιτα. Όλοι οι αρουραίοι κατατάχθηκαν στις ακόλουθες ομάδες: ομάδα 1 (ψευδής έλεγχος, n=6), αρουραίοι ελέγχου που διατηρήθηκαν σε φυσιολογικό ορό (1 mL/kg/ημέρα με πλύση στομάχου). ομάδα 2 (ομάδα Nx, n=6), αρουραίοι Nx που διατηρήθηκαν σε φυσιολογικό ορό (1 mL/kg/ημέρα με πλύση στομάχου). ομάδα 3 (ομάδα ωμέγα-3 FA), αρουραίοι Nx που έλαβαν θεραπεία με ωμέγα-3 FA. Η δόση και η οδός χορήγησης των ωμέγα-3 FAs (Omacor, 300 mg/kg/ημέρα με γαστρικό καθετήρα, Pronova Biocare, Sandefjord, Νορβηγία) καθορίστηκαν με βάση προηγούμενες μελέτες [19]. Το Omacor είναι ωμέγα-3 FA θαλάσσιας προέλευσης και αποτελείται από 460 mg εικοσαπεντανοϊκού οξέος (EPA) και 380 mg εικοσιδυαεξανοϊκού οξέος (DHA) σε 1 g Omacor. Το Omacor συνήθως συνταγογραφείται για δευτερογενή πρόληψη μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου και θεραπεία υπερτριγλυκεριδαιμίας [29]. Δύο ωμέγα-3 FAs (EPA συν DHA) είναι κύρια (84 τοις εκατό ) και ενεργά συστατικά του Omacor, τα οποία παρασκευάζονται φαρμακευτικά
συνθέσεις που ξεπερνούν τα δευτερεύοντα συστατικά (16 τοις εκατό ). Επιλέξαμε το Omacor για συμπλήρωμα ωμέγα-3 FA με αντιφλεγμονώδη και μείωση του οξειδωτικού στρες επειδή μείωσε τον κίνδυνο καρδιαγγειακής νόσου στις κλινικές μελέτες [30]. Οι αρουραίοι τρέφονταν ομοιόμορφα και το βάρος τους παρατηρούνταν καθημερινά. Επιτράπηκε στους αρουραίους ελεύθερη πρόσβαση στο νερό της βρύσης για 15 εβδομάδες μετά το χειρουργείο και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ευθανασία υπό αναισθησία με διαιθυλαιθέρα. Στο θάνατο, συλλέχθηκε δείγμα αίματος αορτής και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm για 10 λεπτά. Για τον εντοπισμό αλλαγών σενεφρική λειτουργίαΤα επίπεδα , BUN και sCr μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αυτόματο αναλυτή (Roche, Γερμανία).
4.2. Ιστοπαθολογική Εξέταση.Διορθώθηκε με φορμαλίνηνεφρόΟι ιστοί ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, κόπηκαν σε φέτες (4 μm) και χρωματίστηκαν με περιοδικό οξύ-Schiff. Ιστοπαθολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν με το Aperio ScanScope (Aperio Technologies, Vista, CA, USA).
4.3. Απομόνωση RNA και Ποσοτική Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο.Ολικό RNA εκχυλίστηκε απόνεφρόιστούς που χρησιμοποιούν αντιδραστήριο TRIzol. Στη συνέχεια, 1 μg ολικού RNA μετατράπηκε σε μονόκλωνο cDNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA M-MLV (Enzynomics, Daejeon, Κορέα). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν από αντίστοιχες αλληλουχίες γονιδίων χρησιμοποιώντας λογισμικό Primer3 και mfold. Για ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο, το cDNA υποβλήθηκε σε ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς για γονίδιο εκκινητές: αρουραίος PGC1 50- CCG AGA ATT CAT GGA GCA AT-30(sense), 50- GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-30(antisense); αρουραίος Nrf1 50- GTT TCA TGG ACC CAA GCA TT-30(sense), 50- GGT GGC CTG AGT TTG TGT CT-30(antisense); αρουραίος SIRT3, 50- GAG ACT TGG TGG GGT CCT TT -30(sense), 50- ATC CTG CAG CTC TTG TGT CC -30(antisense); αρουραίος SIRT1, 50- CAG GTT GCA GGA ATC CAA AG -30(sense), 50- CTC CAC GAA CAG CTT CAC AA -30(αντινόημα); rat -actin, 50- GCG CAA GTA CTC TGT GTG GA -30(sense), 50- CAT CGT ACT CCT GCT TGC TG -30 (antisense). Η PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) με ένα όργανο ABI 7500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, ΗΠΑ).
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ
4.4. Western Blotting και ανοσοκαθίζηση.Το Western blotting αναλύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [10].ΝεφρόΟι ιστοί ομογενοποιήθηκαν με ρυθμιστικό λύσης (διάλυμα εκχύλισης πρωτεΐνης PRO-PREP), επωάστηκαν (30 λεπτά στους 4 ◦C) και φυγοκεντρήθηκαν (14,000 rpm για 20 λεπτά στους 4 ◦C). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με το αντιδραστήριο προσδιορισμού πρωτεΐνης Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Το ίσο δείγμα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε SDS-PAGE 7,5–15 τοις εκατό και μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, ΗΠΑ). Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες ανοσοστυπώθηκαν με κάθε αντίσωμα. Τα αντισώματα κατά PGC-1 και SIRT1 ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα κατά των AMPK, pAMPK, Nrf1, SIRT3, FoxO1, FoxO3a και mTOR αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ). Αντισώματα έναντι Nrf2, Keap1 (μονομερές) και -ακτίνης αγοράστηκαν από την Abcam (Cambridge, ΜΑ, ΗΠΑ) και τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Για την ανοσοκατακρήμνιση, επωάστηκαν συνολικά 500 μg πρωτεΐνης με αντισώματα PGC-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) και σφαιρίδια πρωτεΐνης A/G συν-αγαρόζης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ΗΠΑ), και αφέθηκε να αναμειχθεί στους 4 ◦C όλη τη νύχτα. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση SDS-PAG και ανοσοστυπώθηκαν χρησιμοποιώντας τα αντισώματα ακετυλ-λυσίνης (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, ΗΠΑ) και φωσφοσερίνης (MerckMillipore, Burlington, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα επίπεδα πρωτεΐνης τυποποιήθηκαν με -ακτίνη (ImageJ έκδοση 1.48q). Η ανάλυση Western blotting και ανοσοκαθίζησης με αντισώματα διεξήχθη χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας Super Signal West Pico (Thermo Scientific, Hudson, NH, USA) και ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας LAS-3000 Plus (Fuji Photo Film, Τόκιο, Ιαπωνία).
4.5 Μέτρηση του περιεχομένου mtDNAΗ qPCR χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του σχετικού περιεχομένου του mtDNA. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε μέσω χημείας SYBR Green χρησιμοποιώντας 3 ng ολικού DNA ως πρότυπο και τους ακόλουθους εκκινητές: mtDNA αρουραίου 5'-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3' (νοήση), 5,-TGATTAGACCCGTTACCA TCGA-3' ( antisense); π-ακτίνη αρουραίου, 5'- CCCAGCCATGTACGTAGCCA (νόημα), C- CGTCTC- CGGAGTCCATCAC f (αντινόημα). Το περιεχόμενο mtDNA σε σχέση με το πυρηνικό DNA αναφέρθηκε στο [31].
4.6 Στατιστική ΑνάλυσηΟι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 18.0 (IBM Corp., Armonk, NYP USA). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος 土 SD. Οι μέσοι όροι για τις ομάδες συγκρίθηκαν με ανάλυση διακύμανσης που ακολουθήθηκε από πολλαπλές συγκρίσεις του Tukey. p e 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.
5. Συμπεράσματα
Συμπερασματικά, σημαντικές τροποποιήσεις στην έκφραση των μεσολαβητών που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση παρατηρήθηκαν σε ένα μοντέλο CKD αρουραίου. Το ωμέγα-3 FA μπορεί να βελτιώσει τη μιτοχονδριακή βιογένεση ρυθμίζοντας προς τα πάνω τα Nrf1 και Nrf2. Αυτός ο προστατευτικός μηχανισμός μπορεί να ξεκινήσει μέσω αύξησης της έκφρασης PGC-1 και αποακετυλίωσης της PGC-1, η οποία πυροδοτήθηκε από την αυξημένη παραγωγή SIRT1/3 (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Επίδραση του ωμέγα-3 FA στη μιτοχονδριακή βιογένεση στη ΧΝΝ. Τα έντονα μαύρα βέλη υποδεικνύουν την έκφραση μεσολαβητών που σχετίζονται με τη μιτοχονδριακή βιογένεση σε ένα μοντέλο CKD αρουραίου. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν την έκφραση των μεσολαβητών μετά τη χορήγηση ωμέγα{10}} FA. Τα πάνω/κάτω βέλη υποδεικνύουν αύξηση και μείωση στην έκφραση των διαμεσολαβητών.
