Εκχύλισμα φύλλων ελιάς (OLE) Διακίνηση ακουαπορίνης-2 που προκαλείται από αγγειοπιεσίνη, μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα που ανιχνεύει το ασβέστιο

Για περισσότερες πληροφορίες. Επικοινωνία:tina.xiang@wecistanche.com

Η βαζοπρεσσίνη (AVP) αυξάνει τη διαπερατότητα του νερού στονεφρώναγωγού συλλογής μέσω της ρύθμισης της διακίνησης ακουαπορίνης-2 (AQP2). Αρκετές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένης της υπέρτασης και της ακατάλληλης έκκρισης αντιδιουρητικής ορμόνης (SIADH), σχετίζονται με ανωμαλίες στην ομοιόσταση του νερού. Έχει αποδειχθεί ότι ορισμένες φυτοενώσεις είναι ευεργετικές για την ανθρώπινη υγεία. Εδώ, τα αποτελέσματα του Εκχυλίσματος Φύλλων Ελιάς (OLE) έχουν αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας μοντέλα in vitro και in vivo. Συνεστιακές μελέτες έδειξαν ότι το OLE αποτρέπει τη μετατόπιση του AQP2 που προκαλείται από την αγγειοπιεσίνη στην πλασματική μεμβράνη στα κύτταρα MCD4 και στον αρουραίονεφρά. Η επώαση με OLE μειώνει την εξαρτώμενη από την AVP αύξηση του συντελεστή οσμωτικής διαπερατότητας νερού (Pf). Για να διευκρινιστούν οι πιθανοί τελεστές της OLE, αξιολογήθηκε το ενδοκυτταρικό ασβέστιο. Το OLE αυξάνει το ενδοκυτταρικό ασβέστιο μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα ανίχνευσης ασβεστίου (CaSR). NPS2143 , ένας εκλεκτικός αναστολέας CaSR, κατάργησε την ανασταλτική επίδραση του OLE στην εξαρτώμενη από την AVP διαπερατότητα νερού. Πειράματα in vivo αποκάλυψαν ότι η θεραπεία με OLE αυξάνει την έκφραση του CaSR mRNA και μειώνει το mRNA του AQP2 παράλληλα με μια αύξηση του AQP2-miRNA στόχευσης-137. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το OLE ανταγωνίζεται τη δράση της αγγειοπιεσίνης μέσω της διέγερσης του CaSR, υποδεικνύοντας ότι αυτό το εκχύλισμα μπορεί να είναι ευεργετικό για την άμβλυνση των διαταραχών που χαρακτηρίζονται από μη φυσιολογική σηματοδότηση του CaSR και επηρεάζει την νεφρική επαναρρόφηση νερού.

Τα φύλλα της ελιάς έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως παραδοσιακές θεραπείες για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, ειδικά στις μεσογειακές χώρες. Τα φύλλα καταναλώνονται συνήθως στην ανθρώπινη διατροφή ως εκχύλισμα ή σκόνη για την παρασκευή αφεψημάτων ή τσαγιού από βότανα. Η ανάλυση χημικού χαρακτηρισμού αποκάλυψε ότι τα φύλλα της ελιάς περιέχουν διάφορες βιοδραστικές ενώσεις που μπορεί να ασκούν ευεργετικές επιδράσεις σε ορισμένες νοσηρότητες όπως το μεταβολικό σύνδρομο, η δυσλιπιδαιμία και η υπέρταση. Πολλές πολυφαινόλες όπως η ελευρωπαΐνη, η υδροξυτυροσόλη και η τυροσόλη έχουν βρεθεί εμπλουτισμένες σε εκχύλισμα πράσινων φύλλων ελιάς (OLE)5 και είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην πρόληψη ορισμένων ασθενειών που χαρακτηρίζονται από οξειδωτικό στρες. Ως εκ τούτου, τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον για τη διερεύνηση των πιθανών ευεργετικών επιδράσεων του εκχυλίσματος φύλλων ελιάς αυξάνεται μεταξύ των επιστημόνων σε διαφορετικά πεδία έρευνας. Το OIE επέδειξε σημαντική αντιπολλαπλασιαστική δράση στα κακοήθη κύτταρα μεσοθηλιώματος αλλάζοντας τη δυναμική του ενδοκυττάριου ασβεστίου, πιθανώς στοχεύοντας στην Τ- τύπου Ca2 plus κανάλια. Είναι ενδιαφέρον ότι το OLE βρέθηκε να ασκεί αντιυπερτασικά αποτελέσματα στη γενετική υπέρταση σε αυθόρμητα υπερτασικούς αρουραίους (SHR), που σχετίζονται με τη βελτίωση της αγγειακής λειτουργίας*. Η υπερβολική επαναρρόφηση νερού παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της αυξημένης αρτηριακής πίεσης. Σε υπερτασικούς ασθενείς, που έλαβαν θεραπεία με εκχύλισμα φύλλων ελιάς, βρέθηκε σημαντική μείωση αρκετών φλεγμονωδών παραγόντων που σχετίζονται με μείωση της αρτηριακής πίεσης. Επιπλέον, η υπερβολική κατακράτηση νερού χαρακτηρίζει αρκετές διαταραχές όπως η κίρρωση του ήπατος, η καρδιακή ανεπάρκεια και η ακατάλληλη έκκριση αντιδιουρητικής ορμόνης (SIADH). Η ομοιόσταση του σωματικού νερού ελέγχεται αυστηρά από την αντιδιουρητική ορμόνη βαζοπρεσίνη (AVP) που απελευθερώνεται υπό την αφυδάτωση. Το AVP δεσμεύει τον συγγενή του υποδοχέα V2R που εντοπίζεται στη βασεοπλευρική μεμβράνη τουνεφρώντα κύρια κύτταρα ενεργοποιώντας έτσι την οδό σήματος cAMP που έχει ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση των κυστιδίων που φέρουν ακουαπορίνη-2(AQP2) από μια ενδοκυτταρική δεξαμενή στην κορυφαία πλασματική μεμβράνη όπου λαμβάνει χώρα επαναρρόφηση νερού. Σε μοριακό επίπεδο, διάφοροι παράγοντες μπορεί να ρυθμίσουν το νεφρικό υδατικό ισοζύγιο. Ένα αυξημένο επίπεδο ασβεστίου του αυλού μείωσε τη βραχυπρόθεσμη διακίνηση AOP2 που εξαρτάται από την αγγειοπιεσίνη μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα που ανιχνεύει το ασβέστιο (CaSR)1,12. Από την άλλη πλευρά, η ενεργοποίηση του CaSR σε υπό όρους απαθανατισμένα νεφρικά εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα, που απομονώθηκαν από τα ανθρώπινα ούρα, προκάλεσε σημαντική αύξηση στο κυτταροπλασματικό ασβέστιο και μείωσε σημαντικά την αύξηση του cAMP που προκαλείται από τη φορσκολίνη (FK), έναν άμεσο ενεργοποιητή της αδενυλικής cvclase3 Επιπλέον , σε κύτταρα MCD4 νεφρικού αγωγού συλλογής, που εκφράζουν σταθερά το κανάλι νερού AOP2, η διέγερση του CaSR εξασθένησε την εξαρτώμενη από το cAMP αύξηση της φωσφορυλίωσης AQP2 στη σερίνη 256 που είναι ένα σημαντικό γεγονός στον καταρράκτη μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται από την αγγειοπιεσίνη και που τελικά αύξησε τη διαπερατότητα νερού4 ,15 Επιπλέον, σενεφρόφέτες από τον εσωτερικό νεφρό του μυελού ποντικιού, η ενεργοποίηση του CaSR με το ασβεστιμιμητικό NPS-R568 προκάλεσε σημαντική αύξηση στο AQP2-στοχευόμενο miRNA-137, επιβεβαιώνοντας μια στενή αλληλεπίδραση μεταξύ της οδού σήματος CaSR και του AQP{ {4}}εξαρτώμενη υδατοπερατότητα αρουραίους που έλαβαν ένεση με το εκχύλισμα. Παρέχουμε στοιχεία ότι η θεραπεία με OLE εξουδετερώνει την ανταπόκριση της βαζοπρεσίνης στα νεφρικά κύτταρα, γεγονός που μπορεί εν μέρει να εξηγεί τη διουρητική της δράση. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτό το αποτέλεσμα φαίνεται να σχετίζεται με την επαγόμενη από OLE ενεργοποίηση του CaSR, ενός υποδοχέα που είναι γνωστό ότι έχει αρνητική αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα βαζοπρεσίνης2.

Μάθετε περισσότερα για τις επιπτώσεις του cistanche στα νεφρά

Αποτελέσματα

Επιδράσεις του OLE στην επαγόμενη από αγγειοπιεσίνη λειτουργία AQP2 σε κύτταρα MCD4. Για τη διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής του OLE στην εξαρτώμενη από την αγγειοπιεσίνη λειτουργία AQP2,νεφρώνΩς πειραματικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα MCD4 αγωγού συλλογής, που εκφράζουν σταθερά τον υποδοχέα βαζοπρεσίνης 2(V2R) και το ανθρώπινο AQP218. Συγκεντρωτικές μελέτες (Εικ. 1Α) αποκάλυψαν ότι, σε σύγκριση με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με dDAVP, στα οποία η χρώση AQP2 εντοπίστηκε στην κορυφαία πλασματική μεμβράνη, η θεραπεία με OLE απέτρεψε τον εντοπισμό της μεμβράνης του AOP2 που προκλήθηκε από διέγερση με dDAVP. Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, η θεραπεία OLE μείωσε την επαγόμενη από το dDAVP αύξηση της χρονικής οσμωτικής απόκρισης (που υποδεικνύεται ως 1/t στο Σχήμα 1Β) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 τοις εκατό , n=292 κελιά έναντι dDAVP=206.8±5,49 τοις εκατό ,n=186 κελιά;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Επιδράσεις του OLE στους νεφρούς αρουραίων στους οποίους έγινε ένεση OLE.

Για την περαιτέρω διερεύνηση των δράσεων του OLE, έχουν πραγματοποιηθεί in vivo μελέτες. Συγκεκριμένα, σε αρουραίους έχει γίνει ένεση με OLE (250 mg/kg/ημέρα) μία φορά την ημέρα για τρεις ημέρες. Εναλλακτικά, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε συν-θεραπεία με OLE, για 3 ημέρες, και dDAVP, για 30 λεπτά. Η αξιολόγηση του CaSR mRNA που απομονώθηκε από τον νεφρικό αγωγό συλλογής αρουραίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για PCR σε πραγματικό χρόνο (Εικ. 6) αποκάλυψε σημαντική αύξηση στο mRNA του CaSR στο OLE(OLE=1.87±0.29, n{{{ 10}} αρουραίοι έναντι CTR=1.02±0.17, n=5 αρουραίοι· p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">νεφρόΠραγματοποιήθηκαν ανάλυση western blotting και συνεστιακές μελέτες (Εικ. 9). Σε αρουραίους στους οποίους έγινε ένεση OLE/dDAVP, η φωσφορυλίωση του AQP2 στη σερίνη 256 ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους νεφρικούς ιστούς ζώων που έλαβαν dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 αρουραίοι έναντι dDAVP=2.16±0.25,n=5 αρουραίοι· p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Συζήτηση

Το ασβέστιο είναι ένας σημαντικός ενδοκυτταρικός αγγελιοφόρος που ρυθμίζει μια πληθώρα κυτταρικών λειτουργιών2. Η μη φυσιολογική σηματοδότηση ασβεστίου μπορεί να οδηγήσει σε διάφορες ασθένειες, όπως καρδιακή ανεπάρκεια, καρκίνο και υπέρταση23. Ο ειδικός έλεγχος της έκφρασης και της δραστηριότητας των πρωτεϊνών που ελέγχουν πολλαπλά ενδοκυτταρικά σήματα ασβεστίου έχει αποδειχθεί επιτυχής στην αντιμετώπιση πολυάριθμων διαταραχών και επομένως είναι ελκυστικός για την ανάπτυξη φαρμάκων. Αυτή η μελέτη παρέχει νέες γνώσεις για τον μηχανισμό δράσης του OLE δείχνοντας την ικανότητά του να ρυθμίζει την ενδοκυτταρική σηματοδότηση ασβεστίου μέσω της διέγερσης του CaSR που εμπλέκεται στη ρύθμιση της διακίνησης και έκφρασης του AQP2 που προκαλείται από την αγγειοπιεσίνη. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το AQP2 παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ομοιόστασης του νερού του σώματος25. Η διέγερση του ενδοκυτταρικού μηχανισμού, που οδηγεί στον εντοπισμό του AQP2 στην κορυφαία πλασματική μεμβράνη, οδηγεί σε μη φυσιολογική κατακράτηση νερού και επακόλουθη υπονατριαιμία όπως στο σύνδρομο ακατάλληλης έκκρισης αντιδιουρητικής ορμόνης (SIADH), κίρρωση του ήπατος και συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια. μοντέλο SIADH, που σχετίζεται με απλοανεπάρκεια πολυκυστικής νεφρικής νόσου 1, το βασικό ενδοκυτταρικό επίπεδο ασβεστίου μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με το επίπεδο που μετρήθηκε στους αγωγούς συλλογής ποντικών άγριου τύπου. Το χαμηλό ενδοκυτταρικό ασβέστιο μείωσε τη δραστηριότητα ορισμένων ενζύμων συμπεριλαμβανομένης της πρωτεϊνικής φωσφατάσης PP2A με αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση της φωσφορυλίωσης AOP2 στη σερίνη 2561. Αντίθετα. Η ενεργοποίηση του CaSR με το ασβεστιμιμητικό NPS-R568 αύξησε την ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου και μείωσε το επίπεδο cAMP σε κύτταρα με έλλειψη PKD1. Είναι σημαντικό ότι το κυτοσολικό ασβέστιο μπορεί να μειώσει την ανασταλτική από το ασβέστιο αδενυλιωμένη κυκλάση3, ρυθμίζοντας έτσι το ενδοκυτταρικό επίπεδο του cAMP. Στα κύτταρα MCD4, πράγματι, η διέγερση του CaSR με το NPS-R568 μείωσε την AQP{23}}pS256 μέσω της κυκλάση4.Σε αυτή τη μελέτη, η θεραπεία με OLE απέτρεψε την εξαρτώμενη από την αγγειοπιεσίνη αύξηση του cAMP και του AOP2-pS256, πιθανώς δευτερογενής σε αύξηση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ασβεστίου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκθεση σε μια εξωτερική πηγή cAMP χρησιμοποιώντας διαπερατό 8-Br-cAMP, εξουδετέρωσε σημαντικά την ανασταλτική επίδραση του OLE στην οδό V2R.

Ένα αυξημένο επίπεδο κυτοσολικού ασβεστίου μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο και απόπτωση. Ωστόσο, μια παρατεταμένη αύξηση στο ενδοκυτταρικό ασβέστιο από 250 nM σε μεγαλύτερη από 600 nM προήγαγε τη νευρωνική επιβίωση4. Στα κύτταρα MCD4, η θεραπεία με OLE στα 0,1 mg/ml δεν εμφανίζεται κυτταροτοξική δράση. Σε αυτή τη συγκέντρωση, το OLE (0,1 mg/ml) αύξησε ελαφρώς το ενδοκυτταρικό επίπεδο ασβεστίου. Η απεικόνιση ασβεστίου αποκάλυψε ότι η οξεία διέγερση με OLE προκάλεσε μια παροδική αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου μέσω της ενεργοποίησης του CaSR που καταργείται όταν τα κύτταρα προεπωάστηκαν με τον εκλεκτικό ανταγωνιστή CaSR NPS2143. μείωσε την παραγωγή ROS μειώνοντας έτσι το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες που προκάλεσε την απόπτωση των κυττάρων356. Επιπλέον, η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση των παραλλαγών κέρδους λειτουργίας του CaSR μείωσε την απελευθέρωση ROS και τη S-γλουταθειονυλίωση του AQP237. Η επώαση με OLE μείωσε τη δημιουργία ROS στα κύτταρα MCD435 δείχνοντας την αντιοξειδωτική του ικανότητα. Ωστόσο, αυτή τη στιγμή δεν είναι σαφές εάν το OLE επηρεάζει την AOP2-S-γλουταθειονυλίωση. Πολυάριθμες μελέτες αποκάλυψαν ότι το OLE ή η ελευρωπαΐνη, που είναι το κύριο συστατικό του OLE, μπορεί να έχει προστατευτικούς ρόλους αναστέλλοντας τους κυτταρικούς θανάτους,39 Ωστόσο, έχουν περιγραφεί δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις σε αρουραίους που λαμβάνουν OLE. Ευεργετικές αποκρίσεις ελήφθησαν σε δόσεις 250 και 500 mg/kg. Αντίθετα, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, η θεραπεία με OLE μπορεί να έχει επιβλαβείς επιπτώσεις πιθανώς λόγω των προοξειδωτικών δράσεων πολλών φυτοενώσεων. Σε αυτή τη μελέτη, οι αρουραίοι ενέθηκαν με OLE σε δόση 250 mg/kg για τρεις ημέρες, δείχνοντας ανοδική ρύθμιση του CaSR. Το επίπεδο έκφρασης του CaSR αυξάνεται από ορισμένες ενώσεις που δρουν ως αλλοστερικοί ενεργοποιητές του υποδοχέα. Τα ασβεστομιμητικά, πράγματι, μείωσαν τις αγγειακές ασβεστοποιήσεις αυξάνοντας τη βιοσύνθεση του CaSR στα ανθρώπινα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα0. Σε αυτόν τον διαγωνισμό, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ορισμένες ενώσεις στο OLE να λειτουργούν ως αλλοστερικοί ρυθμιστές του CaSR. Από την άλλη πλευρά, η διέγερση με βαζοπρεσίνη μπορεί να οδηγήσει σε απελευθέρωση IL-6 που μπορεί να συμβάλει στην αύξηση του επιπέδου έκφρασης του CaSR42.

Στο νεφρό, η διέγερση της σηματοδότησης CaSR σχετίζεται με μια μείωση της έκφρασης του AQP2 πιθανώς μέσω της γενιάς miR-137. Τα miRNA είναι βασικοί μεταμεταγραφικοί ρυθμιστές. Έχουν επίσης περιγραφεί αρκετά εξαρτώμενα από αγγειοπιεσίνη miRNAs που στοχεύουν την έκφραση AQP243. Η επιμόλυνση με miR-32 και miR-137 μείωσε σημαντικά το επίπεδο έκφρασης του AOP2 στα κύτταρα mpkCCDc14. Είναι ενδιαφέρον ότι το OLE μπορεί να εξασθενίσει τα φλεγμονώδη σήματα και να ασκήσει προστατευτικά αποτελέσματα διαμορφώνοντας το επίπεδο έκφρασης πολλών miRNAs". Ειδικότερα, στα πολύμορφα κύτταρα γλοιοβλαστώματος, το OLE προώθησε την έκφραση διαφορετικών miRNA συμπεριλαμβανομένου του miR-13745 που εμπλέκεται στην υπορρύθμιση του η οδός σηματοδότησης Akt/mTOR 46. Αξίζει να σημειωθεί ότι η θεραπεία με ελευρωπαΐνη αποτρέπει τη σηματοδότηση Akt/mTOR μέσω της ενεργοποίησης των CAMK και AMPK που προκαλούνται από ασβέστιο». Η ενεργοποίηση του CaSR με το NPS-R568 ενεργοποιεί την AMPK και μειώνει τη δραστηριότητα mTOR στα ανθρώπινα εγγύς σωληναριακά κύτταρα3. Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, η επώαση με OLE αυξάνει το κυτοσολικό ασβέστιο, μειώνει τη δραστηριότητα της PKA και μειώνει το μέγεθος της κύστης σε ένα μοντέλο τρισδιάστατης κυτταρικής καλλιέργειας48. Μαζί αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το OLE μπορεί να είναι χρήσιμο στη θεραπεία διαταραχών που χαρακτηρίζονται από απορύθμιση της δυναμικής του ενδοκυτταρικού ασβεστίου που σχετίζεται με την καθοδική ρύθμιση της σηματοδότησης CaSR.

Το εκχύλισμα φύλλων ελιάς αποτελείται από διάφορα βιοενεργά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων πολυφαινολών, ινών και μετάλλων49. Προς το παρόν, δεν είναι σαφές εάν μία ένωση ή ένας συνεργικός συνδυασμός φυτοενώσεων στο OLE μπορεί να είναι ωφέλιμος στη ρύθμιση των ενδοκυτταρικών αποκρίσεων. Το εκχύλισμα που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη έχει εφαρμοστεί ως πιθανό πρόσθετο τροφίμων και επομένως είναι σημαντικό να καθοριστεί η φυσιολογική επίδραση του ίδιου του εκχυλίσματος λαμβάνοντας υπόψη ότι αρκετές φαινόλες, συμπεριλαμβανομένης της υδροξυτυροσόλης, μπορούν να φιλτραριστούν από τα νεφρά και να ανακτηθούν στα ούρα50. Περαιτέρω μελέτες θα παράσχουν την αποτελεσματικότητα συγκεκριμένων συστατικών που μπορεί να ρυθμίζουν ενεργά την ενδοκυτταρική σηματοδότηση του ασβεστίου μέσω του CaSR. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη παρέχει στοιχεία ότι το OLE μπορεί να θεωρηθεί ένα νέο δυνητικό ανοσοενισχυτικό χρήσιμο για τον μετριασμό διαταραχών που χαρακτηρίζονται από μείωση της έκφρασης του CaSR καθώς και από τη σηματοδότηση και την επίδραση της νεφρικής διαπερατότητας του νερού.

Υλικά και μέθοδοι

Χημικά και αντισώματα.Όλα τα χημικά και τα αντιβιοτικά αγοράστηκαν από τη Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία). Calcein-AM, Fura-2-AM, μέσα κυτταροκαλλιέργειας, εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) και Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Aquaporin{ {2}} (AQP2) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα (C-tail Ab) που αναπτύχθηκαν έναντι ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα τελευταία 15 C-τερματικά αμινοξέα του ανθρώπινου AQP2!. Τα αντισώματα AQP2-pS256 δόθηκαν ευγενικά από τον καθηγητή Peter Deen. Δευτερεύοντα αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου ελήφθησαν από τη Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία). Ένα δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας-αντι-κουνελιού συζευγμένο με Alexa-488 αγοράστηκε από την Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ).

Παραγωγή εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινολικά και χημικός χαρακτηρισμός.Η παραγωγή ενός πλούσιου σε φαινολικά εκχυλίσματος από φύλλα ελιάς πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρεται στους Ranieri et al.35. Μετά από άλεση με μπλέντερ (Waring-Commercial, Torrington, CT, ΗΠΑ), προστέθηκε νερό ddH2O (αναλογία 1/2{10}}, w/y) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε υπερήχους (CEIA, Viciomaggio, Ιταλία) τρεις φορές , για 30 λεπτά στους 35±5 βαθμούς κάθε φορά. Τέλος, τα εκχυλίσματα διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού, λυοφιλοποιήθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε -20 βαθμό C. Τα ληφθέντα εκχυλίσματα διηθήθηκαν με νάιλον φίλτρα των 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) και χρησιμοποιήθηκαν για χημικό χαρακτηρισμό. Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη, η αντιοξειδωτική δράση και η ταυτοποίηση μεμονωμένων φαινολικών ενώσεων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους Difonzo et al.. Το OLE έδειξε μια περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες, που προσδιορίστηκε από το Folin-Ciocalteu, ίση με 195 mg. ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) και αντιοξειδωτική δράση, που προσδιορίζεται από το ABTS (2,2'-αζινο-δις(3-αιθυλοβενζοθειαζολίνη-6-άλας διαμμωνίου σουλφονικού οξέος), που αντιστοιχεί σε 750 μmol TE (ισοδύναμα Trolox) .

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες.Ως πειραματικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα MCD4 αγωγού συλλογής φλοιού ποντικού, που εκφράζουν σταθερά το ανθρώπινο AQP2 και το χιμαιρικό V2R-Rluc18. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ένα μίγμα 1:1 τροποποιημένου μέσου Dalbec-cos Eagle's και F-12 συμπληρωμένου με 5 τοις εκατό (ετ/ετ) εμβρυϊκό βόειο ορό. 1 τοις εκατό (y/y) L-γλουταμίνη και 1 τοις εκατό πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη, 5 μM δεξαμεθαζόνη, 400 ug/ml G418 (για αντοχή στο AQP2) και 1 ug/ml πουρομυκίνη (για αντίσταση V2R-Rluc) , σε υγρή ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO, στους 37 βαθμούς. Τα κύτταρα MCD4 αφέθηκαν υπό βασική κατάσταση (CTR) ή υποβλήθηκαν σε μακροχρόνια θεραπεία με OLE σε 0,1 mg/ml O/N, dDAVP στα 100 nM για 30 λεπτά ή συνεπεξεργάστηκαν με OLE και dDAVP ή NPS2143 σε l μM O/N .Εναλλακτικά, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 8-Br-cAMP στα 500 μΜ για 45 λεπτά, βραχυπρόθεσμα πειράματα διεξήχθησαν με OLE σε 1 mg/ml για 5 λεπτά και NPS2143 στα 10 μΜ για 15 λεπτά. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν 3-5 ανεξάρτητους χρόνους χρησιμοποιώντας κελιά από διαφορετικά αποσπάσματα.

Ζωικό μοντέλο και θεραπείες.Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε συμφωνία με τις εθνικές κατευθυντήριες οδηγίες της Δανίας για τη φροντίδα και το χειρισμό των πειραματόζωων και τις δημοσιευμένες οδηγίες των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Τα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από το Ινστιτούτο Κλινικής Ιατρικής. Πανεπιστήμιο Aarhus, σύμφωνα με τις άδειες για τη χρήση πειραματόζωων που εκδόθηκαν από το Υπουργείο Δικαιοσύνης της Δανίας (αριθμός έγκρισης 2015-15-0201-00658). Πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ενήλικους αρσενικούς αρουραίους Wistar με αρχικό βάρος 200-225 g. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε μια τυπική δίαιτα τρωκτικών (Altromin, Lage, Γερμανία) και είχαν ελεύθερη πρόσβαση στο νερό της βρύσης. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, οι αρουραίοι στεγάστηκαν σε ομάδες των δύο ανά κλουβί, με κύκλο φωτός-σκότους 12:12 ωρών, θερμοκρασία 21±2 βαθμούς C και υγρασία 55±2 τοις εκατό. Πέντε επίμυες υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδόρια ένεση 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Δανία) σε 200 μΙ αλατούχου ορού/ζώο και πέντε αρουραίοι που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Μετά από 30 λεπτά, οι αρουραίοι θανατώθηκαν και οι νεφροί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παρακάτω.

Κύτταρα και προϊόντα λύσης IMCD.Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε δίσκους {{0}}mm και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 220 mM μαννιτόλη, 70 mM σακχαρόζη, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 παρουσία πρωτεασών (1 mM PMSF, 2 mg/ml λευπεπτίνη και 2 mg/ml πεπστατίνη Α) και φωσφατάσης (10 mM NaF και 1 mM αναστολείς ορθοβαναδικού νατρίου. Εναλλακτικά, τομές νεφρού περίπου 0,5 mm παρασκευάστηκαν και εξισορροπήθηκαν για 10 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM γλυκόζη, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaClM, MSO4. 1,8 mM KH2PO4 (ρΗ 7,4). Οι νεφρικές θηλές κομματιάστηκαν με ψαλίδι στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα παρουσία πρωτεασών (1 mM PMSF, 2 mg/ml πεψατίνη Α, και 2 mg/ml πεπτατίνη Α) και φωσφατάσης (10 mM NaF και 1 mM νατρίου orthovanadate) αναστολείς. Μετά την υπερήχηση (60 kHz για 5 δευτερόλεπτα), τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στους 12,000×g για 10 λεπτά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες ανοσοστύπωσης'8.

Συνεστιακή μικροσκοπία.Οι συνεστιακές μελέτες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως1. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ένθετα PET κυτταροκαλλιέργειας και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Εναλλακτικά, τομές νεφρού που ελήφθησαν από αρουραίους ελέγχου, OLE, dDAVP και OLE με αγωγή με dDAVP υποβλήθηκαν σε πειράματα ανοσοφθορισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι εικόνες ελήφθησαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού σάρωσης λέιζερ Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Ελβετία). Ηλεκτροφόρηση γέλης και ανοσοστύπωμα. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 12 τοις εκατό χωρίς λεκέδες (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) υπό αναγωγικές συνθήκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως=5,52. Εν συντομία, οι ζώνες πρωτεΐνης μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) και ανοσοστυπώθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) και αντι-AQP2-pS256 αντισώματα. Τα ανοσοαντιδραστικά σήματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates with Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Οι ζώνες κανονικοποιήθηκαν σε ολική πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας τεχνολογία χωρίς λεκέδες (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Η ανάλυση πυκνομετρίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Δοκιμασία υδατοπερατότητας.Η οσμωτική διαπερατότητα νερού μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως43. Εν συντομία, κύτταρα MCD4 αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες 40-mm. Μετά τις θεραπείες, τα κύτταρα φορτώθηκαν με 10 μΜ διαπερατή από μεμβράνη Calcein-AM για 45 λεπτά σε 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO, σε DMEM/F-12. Τα καλύμματα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο διάχυσης (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο TE2000-S (μικροσκόπιο Nikon Eclipse, Τόκιο, Ιαπωνία) εξοπλισμένο για μετρήσεις φθορισμού μονοκυττάρου και απεικονιστική ανάλυση. Τα φορτωμένα με Calcein-AM δείγματα διεγέρθηκαν στα 490 nm. Μετρήσεις φθορισμού, μετά από ισοσμωτικό (140 mM NaCl. 5 mM KCl, 1 mM MgCl.. 1 mM CaCl., 10 mM Hepes σουλφονικό οξύ, 5 mM Γλυκόζη, pH 7,4) ή υπερωσμωτικό (ισωσμωτικό διάλυμα που προστέθηκε με 135 mM διάλυμα μαννιτόλης) . πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Τορόντο, Καναδάς). Καταγράφηκαν δεδομένα φθορισμού χρονικής πορείας μετά την έγχυση των κυττάρων με ισο- και υπερωσμωτικά διαλύματα. Η χρονική πορεία της συρρίκνωσης του κυττάρου μετρήθηκε ως η χρονική σταθερά (Ki, εκφρασμένη ως 1/r, sec), μια παράμετρος που συσχετίζεται με τη διαπερατότητα του νερού, που λήφθηκε με την προσαρμογή δεδομένων με μια εκθετική συνάρτηση που αναλύθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, ΗΠΑ).

Μετρήσεις μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού.Για να αξιολογηθούν οι ενδοκυτταρικές αλλαγές cAMP, εφαρμόστηκε η τεχνολογία μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET). Για τα πειράματα FRET, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί τον αισθητήρα Η96 που περιέχει το συναινετικό μοτίβο δέσμευσης cAMP του EPAC1 ενσωματωμένο μεταξύ της κυανής φθορίζουσας πρωτεΐνης (CFP) και της cp173Venus-Venus όπως παρουσιάστηκε προηγουμένως32.33.54. Το πλασμίδιο που κωδικοποιεί τον ανιχνευτή Η96 ήταν δώρο από τον Dr.K. Jalink. Η οπτικοποίηση των κυττάρων που εκφράζουν ECFP και/ή EYFP και η ανίχνευση του FRET πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο TE2000-S (μικροσκόπιο Nikon Eclipse, Τόκιο, Ιαπωνία). Κάθε εικόνα διορθώθηκε και αναλύθηκε όπως παρουσιάστηκε προηγουμένως55.

Ενδοκυτταρικές μετρήσεις ασβεστίου. Οι ενδοκυτταρικές μετρήσεις ασβεστίου πραγματοποιήθηκαν όπως δείχθηκε προηγουμένως56. Εν συντομία, τα κύτταρα MCD4 φορτώθηκαν με 4 μM Fura-2 AM για 15 λεπτά στους 37 βαθμούς σε DMEM/F-12. Το διάλυμα Ringer χρησιμοποιήθηκε για την έγχυση κυττάρων κατά τη διάρκεια του πειράματος που περιείχε 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM γλυκόζη, 1,8 mM CaCl, ρΗ 7,4. Σε μετρήσεις φθορισμού, οι καλυπτρίδες με υπερφορτωμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θάλαμο έγχυσης (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο TE2000-S (μικροσκόπιο Nikon Eclipse, Τόκιο. Ιαπωνία). Ο λόγος των εντάσεων φθορισμού στα 340 και 380 nm σχεδιάστηκε και υπολογίστηκε ως η αλλαγή στον φθορισμό. Συγκεκριμένα, η διέγερση με OLE (1 mg/ml) ή NPS2143 (10 μM) συγκρίθηκε στον ίδιο κυτταρικό τύπο με αυτά που ελήφθησαν μετά από διέγερση με μια μέγιστη δόση του αγωνιστή με τη μεσολάβηση ασβεστίου ATP (100 μM) που χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος (100 τοις εκατό).

Το ενδοκυτταρικό επίπεδο ασβεστίου μετρήθηκε σε σταθερή κατάσταση και βαθμονομήθηκε όπως περιγράφεται από τον Grynkiewicz57. Το OLE και το NPS2143 χρησιμοποιήθηκαν μακροπρόθεσμα σε 0.1 mg/ml και l uM, αντίστοιχα, και κάθε δείγμα βαθμονομήθηκε με την προσθήκη 5 μΜ ιονομυκίνης παρουσία 1 mM EGTA (Rm.) και ακολούθησε 5 μΜ. μΜ ιονομυκίνη σε 5 mM CaCl, (RMA).

Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο του mRNA AQP2 και CaSR σε αρουραίους ελέγχου και υπό θεραπεία.Πραγματοποιήθηκαν πειράματα PCR σε πραγματικό χρόνο για τη μέτρηση της σχετικής έκφρασης του mRNA στον αγωγό συλλογής εσωτερικού μυελού (IMCD) που απομονώθηκε από θηλώματα νεφρού μάρτυρα και υπό θεραπεία αρουραίου. Φέτες νεφρού περίπου 0,5 mm κατασκευάστηκαν και εξισορροπήθηκαν για 10 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM γλυκόζη, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2,1,8. mM MgS04, και 1,8 mM KH2PO4 (ρΗ 7,4). Η νεφρική θηλή απομονώθηκε με στερεομικροσκόπιο. Δείγματα από αρουραίους ελέγχου και που υποβλήθηκαν σε αγωγή στη συνέχεια κομματιάστηκαν με ένα ψαλίδι απευθείας σε Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκε αντίστροφη μεταγραφή σε 2,5 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ), σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή (25 C για 10 λεπτά, 42 C για 60 λεπτά, 85 C για 5 λεπτά). Πραγματοποιήθηκε ενίσχυση PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας TagMan Fast Advanced Master Mix με προσδιορισμούς CaSR, AOP2 και GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) στο StepOne Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), ρυθμίζοντας τις συνθήκες θερμικού κύκλου όπως καθορίζονται από τον κατασκευαστή (95 βαθμοί C για 20 δευτερόλεπτα, 40 κύκλοι εναλλακτικά στους 95·C για 1 δευτερόλεπτο και 60 βαθμοί C για 20 δευτερόλεπτα). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως 2- τιμές (σχετικός ποσοτικός προσδιορισμός) με △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) επεξεργασμένο-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

Αξιολόγηση miRNA-137 σε αρουραίους ελέγχου και υπό θεραπεία.Το περιεχόμενο miRNA{{0}} στον έλεγχο και στον αγωγό συλλογής εσωτερικού μυελού επίμυος που υποβλήθηκε σε θεραπεία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας προηγμένες δοκιμασίες miRNA TagMan (has-miR-137; Αναγνωριστικό προσδιορισμού;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), το οποίο επέτρεψε την εξαιρετικά ευαίσθητη και ειδική ειδοποίηση του ώριμου miRNA χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR. Κατασκευάστηκαν φέτες νεφρού περίπου 0,5 mm και εξισορροπήθηκαν για 10 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM γλυκόζη, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM και 1,8 mM Mg. KH2PO4 (pH7,4). Η νεφρική θηλή απομονώθηκε με στερεομικροσκόπιο. Δείγματα από αρουραίους ελέγχου και που υποβλήθηκαν σε αγωγή στη συνέχεια κομματιάστηκαν με ένα ψαλίδι απευθείας σε Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) για να εξαχθεί συνολικό RNA. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Κατάλογος n²∶A25576; Το Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη σύνθεσης cDNA, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή (αντίδραση ουράς Poly(A)· αντίδραση απολίνωσης· αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής· αντίδραση miR-Amp). Το συνθετικό RNA (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) με 59-φώσφορο συντέθηκε από την Thermo Fisher Scientific και χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση μιας καμπύλης βαθμονόμησης για την παρεμβολή των τιμών του δείγματος miRNA και για τη λήψη ακριβούς αξιολόγησης (σε νανογραμμάρια) του περιεχομένου miR-137 δείγματα16, χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Στατιστική ανάλυση.Όλες οι τιμές αναφέρονται ως μέσοι όροι±SEM Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων Newman-Keuls με *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Δηλώσεις, ηθική έγκριση και συναίνεση συμμετοχής.Πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε ζώα σε συμφωνία με τις εθνικές κατευθυντήριες γραμμές της Δανίας για τη φροντίδα και το χειρισμό των πειραματόζωων και τις δημοσιευμένες οδηγίες των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Η επιτροπή δεοντολογίας της φροντίδας των ζώων του Ινστιτούτου Κλινικής Ιατρικής του Πανεπιστημίου του Aarhus ενέκρινε τα πρωτόκολλα μελέτης, σύμφωνα με τις άδειες χρήσης πειραματόζωων που εκδόθηκαν από το Υπουργείο Δικαιοσύνης της Δανίας (αριθμός έγκρισης 2015-15-0201-00658). Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλες οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις σχετικές οδηγίες και κανονισμούς. Επιπλέον, οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι η μελέτη διεξήχθη σε συμμόρφωση με τις οδηγίες του ARRIVE.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. El, SN & Karakaya, S. Η ελιά (Olea europaea) αφήνει πιθανές ευεργετικές επιδράσεις στην ανθρώπινη υγεία. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Effects of olive leaf leaf on metabolic ανταπόκριση, ηπατικές και νεφρικές λειτουργίες και φλεγμονώδεις βιοδείκτες σε υπερτασικούς ασθενείς. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive πολυφαινόλες και το μεταβολικό σύνδρομο. Μόρια

4. Cherif, S. et al. Μια κλινική δοκιμή ενός τιτλοδοτημένου εκχυλίσματος Olea στη θεραπεία της ιδιοπαθούς αρτηριακής υπέρτασης. J. Pharm. Belg. 51, 69-71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Τα πράσινα εκχυλίσματα από την ποικιλία ελιάς Cortina αφήνουν αντιοξειδωτικούς χαρακτηρισμούς και βιολογική δράση. J. Λειτουργία. Τρόφιμα 31, 8.

6. Herrero, Μ. et αϊ. Νέες δυνατότητες αξιοποίησης υποπροϊόντων ελαιολάδου. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Το εμπλουτισμένο με ελευρωπεΐνη εκχύλισμα φύλλων ελιάς επηρεάζει τη δυναμική του ασβεστίου και μειώνει τη βιωσιμότητα των κακοήθων κυττάρων μεσοθηλιώματος. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, Μ. et al. Αντιυπερτασικές επιδράσεις εκχυλίσματος φύλλων ελιάς εμπλουτισμένου με ελευρωπαΐνη σε αυθόρμητα υπερτασικούς αρουραίους. Food Function 7, 584–593.

9. Hall, JE Νεφρική δυσλειτουργία, παρά μη νεφρική αγγειακή δυσλειτουργία. Μεσολαβεί στην υπέρταση που προκαλείται από το αλάτι. Κυκλοφορία 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Βαζοπρεσσίνη και η ρύθμιση της ακουαπορίνης-2. Clin. Exp. Nephrol. 17, 751–764.