Βασισμένο σε NMR Metabolomics Profiles for Radical Scavenging and Anti-aging Properties Part 2

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

2.5. Ταξινόμηση εκχυλισμάτων βοτάνων με ανάλυση κύριου συστατικού

Η διακύμανση του μεταβολίτη μεταξύ των φύλλων των βοτάνων που δοκιμάστηκαν αναλύθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας ανάλυση δεδομένων πολλαπλών μεταβλητών (MVDA). Η ανάλυση κύριου συστατικού (PCA), μια μέθοδος αναγνώρισης προτύπων, είναι ένα MVDA χωρίς επίβλεψη που παρέχει μια σημαντική κατανόηση της συσχέτισης μεταξύ των δειγμάτων. Τα διαγράμματα βαθμολογίας PCA έδειξαν τον διαχωρισμό των βοτάνων σε ομάδες, ενώ τα διαγράμματα φόρτωσης τόνισαν τους μεταβολίτες που παρέχουν τον διαχωρισμό [85,86]. Το μοντέλο PCA επέδειξε καλή φυσική κατάσταση (R2X=0.997) και υψηλή προβλεψιμότητα (Q2=0.993) όπου η διακύμανση μεταξύ R2X(cum) και Q2(cum) ήταν μικρότερη από 0 .3, υποδεικνύοντας έτσι ότι κάθε ένα από τα εκχυλίσματα βοτάνων συνέβαλε εξίσου και ομοιόμορφα στον παρατηρούμενο διαχωρισμό της ομάδας. Αυτή η παρατήρηση ήταν σε ευθυγράμμιση με τους Wheelock et al. [87].

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Η γραφική παράσταση βαθμολογίας ανάλυσης κύριου συστατικού έδειξε ότι τα επιλεγμένα βότανα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες χωρίς αξιοσημείωτα ακραία σημεία όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α. Το κύριο συστατικό (PC)1 παρουσίασε τη μεγαλύτερη απόκλιση δείγματος, και στη συνέχεια ακολουθήθηκε από το PC2. Το PC1 και το PC2 συνέβαλαν στο ποσοστό διακύμανσης σε 29,7 τοις εκατό και 24,9 τοις εκατό, αντίστοιχα. Επομένως, η συνολική διακύμανση περίπου 54,6 τοις εκατό περιγράφηκε από αυτούς τους υπολογιστές. Τα αποτελέσματα από το διάγραμμα στήλης φόρτωσης αποκάλυψαν τους μεταβολίτες που ευθύνονται για το διαχωρισμό των βοτάνων στη θετική πλευρά του PC1 (V.negundo και C.longa) και στην αρνητική πλευρά του PC1 (P. minus, P. indica, O.javanica και C. caudatus) (Εικόνα 4Β).

Τα δεδομένα από το διάγραμμα στήλης φόρτωσης του PC1 ανακάλυψαν ότι οι φαινολικές ενώσεις, κυρίως η ομάδα φλαβονοειδών και τα φαινολικά οξέα, ήταν υπεύθυνες για τον διαχωρισμό των επιλεγμένων βοτάνων. Κερσετίνη (1), κερκετίνη-3-Ο-ραμνοσίδη (2), κερσετίνη-3-Ο-γλυκοσίδη (3), κερκετίνη-3-Ο-γλυκουρονίδιο (4), κερκετίνη-3- Ο-αραβινοφουρανοσίδη (5), ρουτίνη (6), παράγωγα mvricetin (7), κατεχίνη (8), επικατεχίνη (9), ισοραμνετίνη (10), αστραγαλίνη (11), χλωρογενικό οξύ (12), γαλλικό οξύ (13), Οι περιεκτικότητες σε κουμαρικό οξύ (14), ασκορβικό οξύ (15), μυρμηκικό οξύ (21), φουμαρικό οξύ (22), 3-μεθυλξανθίνη (26) και απιγενίνη (28) ήταν ως επί το πλείστον υψηλότερες στο P. minus, P. indica , C. caudatus και O.javanica καθώς βρίσκονταν στην αρνητική πλευρά του οικοπέδου. Αντίθετα, το V.negundo και το C.longa διαφοροποιήθηκαν από τα άλλα βότανα με την παρουσία σεροτονίνης (27) και D-λιμονενίου (29) στα εκχυλίσματά τους.

2.6. Συσχέτιση μεταξύ βιοδραστηριοτήτων και των μεταβολιτών με χρήση μερικής ανάλυσης ελαχίστων τετραγώνων (PLS)

Προκειμένου να κατανοηθεί η συσχέτιση μεταξύ των μετρούμενων βιοδραστηριοτήτων και των μεταβολιτών που βρέθηκαν στα βότανα που δοκιμάστηκαν, το PLS, ως εποπτευόμενη μεθοδολογία MVDA, εφαρμόστηκε για να συσχετίσει τα δεδομένα ανεξάρτητων μεταβλητών (NMR χημική μετατόπιση των μεταβολιτών) με τα δεδομένα των εξαρτημένων μεταβλητών, τα οποία ήταν η αναστολή των αναλύσεων DPPH, ABTS και ORAC, καθώς και η δράση κατά της ελαστάσης και της κολλαγενάσης. Αυτή η μεθοδολογία εφαρμόστηκε επειδή το PLS έχει ένα μεγάλο επίτευγμα προκειμένου να συνδέσει τις δοκιμασμένες βιοδραστηριότητες με μεταβολίτες, και έτσι μπορεί να παρέχει ένα μοντέλο για πρόβλεψη [88]. Μέσω της ανάλυσης PLS, θα μπορούσε να διαπιστωθεί η σχέση μεταξύ βιοδραστηριοτήτων, όπως οι δραστηριότητες δέσμευσης ριζών και οι αντιγηραντικές ιδιότητες με τους μεταβολίτες στα δείγματα. Ως εκ τούτου, θα μπορούσαν να προταθούν μεταβολίτες που ήταν υπεύθυνοι ως βιοδραστικοί δείκτες.

Το biplot είναι ένα μείγμα βαθμολογιών και διαγραμμάτων φόρτωσης που προκύπτουν από την ανάλυση PLS, όπως αναφέρεται από τους Mediani et al. [80]. Ένα μερικό biplot ελαχίστων τετραγώνων για τη δράση δέσμευσης ριζών (Εικόνα 5Α) και τις ιδιότητες αντιγήρανσης (Εικόνα 5Β) έδειξε ότι όλα τα δείγματα ήταν καλά διαχωρισμένα και συγκεντρώθηκαν χωρίς αξιοσημείωτα ακραία σημεία. Το PC1 διαχώρισε τα φύλλα των P. minus, C.caudatus και P. indica από τα V. negundo, O.jaoanica και C.longa. Με βάση τις δραστηριότητες καθαρισμού ριζών και τις ιδιότητες αντιγήρανσης των biplots, το μοντέλο παρουσίασε τιμές καλής φυσικής κατάστασης (R'Y) {{10}}.988 και 0.966, αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, η προβλεψιμότητα (Q4) για τις δραστηριότητες καθαρισμού ριζών και τις ιδιότητες αντιγήρανσης ήταν στο 0,984 και 0,951, αντίστοιχα.

Όπως φαίνεται από το biplot PLS των δραστηριοτήτων καθαρισμού ριζών (Εικόνα 5Α), οι βιοδραστηριότητες (DPPH, ABTS και ORACassay) κατευθύνθηκαν στη θετική πλευρά του biplot, που ήταν οι πιο ενεργές περιοχές και πιο κοντά στο P.minus, P. indica και C.caudatus. Αντίθετα, οι V. negundo, O.javanica και C. longa κατευθύνθηκαν στις αρνητικές πλευρές του biplot, οι οποίες θεωρήθηκαν οι λιγότερο ενεργές περιοχές και ήταν πιο μακριά από τις αναλύσεις DPPH, ABTS και ORAC και έδειξαν αρνητική συσχέτιση με βιοδραστηριότητες. Σε αυτήν την περίπτωση, τα P. mimus, P. indica και C.caudatus συγκεντρώθηκαν εκτός από τα λιγότερο ενεργά βότανα, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα βότανα παρουσίασαν ισχυρότερη δράση δέσμευσης ριζών, υποδηλώνοντας έτσι ότι αυτά τα εκχυλίσματα βοτάνων μπορεί να περιείχαν υψηλότερα επίπεδα φαινολικών ενώσεις. Μεταξύ των τριών πιο δραστικών βοτάνων, το P. minus βρέθηκε να συσχετίζεται ισχυρότερα με τον προσδιορισμό DPPH και ABTS, ακολουθούμενο από τον προσδιορισμό ORAC.

Αυτό το εύρημα ήταν σε συμφωνία με τα in vitro αποτελέσματα των δραστηριοτήτων ριζικής σάρωσης που είχαν πραγματοποιηθεί. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P. minus παρουσίασε ένα ισχυρό αποτέλεσμα δέσμευσης ελεύθερων ριζών σε σύγκριση με τα άλλα βότανα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν έτσι ότι το P. minus είναι το πιο δραστικό βότανο για τον εκριζωτικό ενεργών ειδών οξυγόνου. Σημαντικοί δευτερογενείς μεταβολίτες που συνέβαλαν στη δραστηριότητα δέσμευσης ριζών του P. minus αναγνωρίστηκαν ως κερκετίνη, κερκετίνη-3-Ο-ραμνοσίδη, κατεχίνη, ισοραμνετίνη, αστραγαλίνη και απιγενίνη.οφλαβονοειδέςΌλοι αυτοί οι μεταβολίτες εντοπίστηκαν πιο κοντά στο P. μείον και επίσης στους προσδιορισμούς καθαρισμού ριζών DPPH και ABTS. Μια προηγούμενη μελέτη των Mediani et al.[80] ανακάλυψε επίσης ότι ένα λυοφιλοποιημένο δείγμα φυτών έδειξε υψηλότερη ποσότητα -γλυκόζης, -γλυκόζης, κατεχίνης και χλωρογενικού οξέος, τα οποία μπορεί να συνέβαλαν στην ισχυρή ικανότητα σάρωσης ριζών DPPH του βοτάνου. Ωστόσο, το υψηλό αποτέλεσμα δέσμευσης ριζών του P.minus θα μπορούσε επίσης να συνεισφέρει από τους μη αναγνωρισμένους μεταβολίτες στο εκχύλισμα.

Παρόμοια ευρήματα βρέθηκαν και για τις αντιγηραντικές ιδιότητες. Το Σχήμα 5Β παρουσιάζει το biplot που λαμβάνεται από το PLS των αντιγηραντικών ιδιοτήτων. Οι βιοδραστηριότητες (δραστηριότητες κατά της ελαστάσης και κατά της κολλαγενάσης) προβλήθηκαν στη θετική πλευρά του biplot, που ήταν η πιο ενεργή περιοχή και ήταν πιο κοντά στα P.minus, P. indica και C.caudatus. Αντίθετα, οι V.negundo, O.javanica και C.longa κατευθύνθηκαν στην αρνητική πλευρά του biplot, η οποία θεωρήθηκε η λιγότερο ενεργή περιοχή και ήταν πιο μακριά από τις δραστηριότητες κατά της ελαστάσης και της κολλαγενάσης. Αυτό έδειξε αρνητική ή ασθενέστερη συσχέτιση με τις βιοδραστηριότητες. Σε αυτήν την κατάσταση, τα P.mimus, P.indica και C. caudatus συγκεντρώθηκαν εκτός από τα λιγότερο ενεργά βότανα, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα εκχυλίσματα βοτάνων εμφάνισαν μεγαλύτερη αναστολή ελαστάσης και κολλαγενάσης. Μεταξύ των τριών πιο δραστικών βοτάνων, το P. minus και πάλι βρέθηκε να έχει ισχυρή συσχέτιση με αυτές τις αντιγηραντικές ιδιότητες σε σύγκριση με τα άλλα βότανα.

Αυτό το εύρημα συμφωνούσε με τα in vitro αποτελέσματα των αντιγηραντικών ιδιοτήτων που είχαν πραγματοποιηθεί νωρίτερα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το P.minus ήταν το πιο δραστικό βότανο για την αναστολή των ενζύμων ελαστάσης και κολλαγενάσης. Σημαντικοί δευτερογενείς μεταβολίτες που συνέβαλαν στις αντιγηραντικές ιδιότητες του P. minus αναγνωρίστηκαν ως κερκετίνη, κερκετίνη-3-Ο-ραμνοσίδη, παράγωγα μυρικετίνης, κατεχίνη, ισοραμνετίνη, αστραγαλίνη και απιγενίνη. Άλλοι μεταβολίτες όπως -γλυκόζη, -γλυκόζη, φουμαρικό οξύ και λιπαρό οξύ μπορεί επίσης να είναι υπεύθυνοι για τις βιοδραστηριότητες. Όλοι αυτοί οι μεταβολίτες εντοπίστηκαν πιο κοντά στο P. minus και στις δραστηριότητες κατά της ελαστάσης και κατά της κολλαγενάσης.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Η διάκριση αυτών των επιλεγμένων βοτάνων ήταν σε συμφωνία με τα δείγματα υψηλής ριζικής δραστικότητας δέσμευσης ιδιαίτερα. μείον, P.India και C.caudatus, οι οποίοι αναμενόταν να διακρίνονται από τους άλλους λόγω της υψηλής συγκέντρωσης δευτερογενών μεταβολιτών, ιδιαίτερα φλαβονοειδών. Η παρουσία αυτών των φαινολικών ενώσεων πιστεύεται επίσης ότι συμβάλλει στις μεγαλύτερες ανασταλτικές δραστηριότητες ελαστάσης και κολλαγενάσης αυτά τα βότανα [67-79,89-92].

Η συμβολή των βιοδραστικών ενώσεων φυτικών εκχυλισμάτων στην ικανότητα σάρωσης των ελεύθερων ριζών και στην αντιγηραντική δράση έχει τεκμηριωθεί από διάφορες μελέτες [66,72,75,79,92-101]. Επιπλέον, μεταβολίτες όπως τα φλαβονοειδή (κερκετίνη, καμπφερόλη, μυρικετίνη, επικατεχίνη και κατεχίνη) και άλλες φαινόλες όπως η ρεσβερατρόλη και η προκυανιδίνη Β2, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν σημαντικά την ελαστάση και την κολλαγενάση [69-71,79].

Στην παρούσα μελέτη, τα σήματα μεταβολίτη για μεταβλητή σημασία στις τιμές προβολής (VIP) αναγνωρίστηκαν και αναθεωρήθηκαν για να ληφθούν οι πιο σημαντικοί μεταβολίτες που συσχετίστηκαν με τις δοκιμασμένες βιοδραστηριότητες. Αυτό έγινε για να αυξηθεί η ακεραιότητα των αποτελεσμάτων που παρουσιάζονται εδώ, τα οποία εξέτασαν τη διακριτική δυνατότητα των προσδιορισμένων μεταβολιτών.πουριτανς βιταμίνη cGenerally, the metabolites signal with VIP>Το {{0}}.5 λήφθηκε υπόψη ως σημαντικό για τη διάκριση [102]. Σε αυτή τη μελέτη, όλοι οι μεταβολίτες που συμβάλλουν στις δραστηριότητες σάρωσης ριζών και στις ιδιότητες αντιγήρανσης θα μπορούσαν να ταξινομηθούν ως σημαντικοί διακριτικοί μεταβολίτες, καθώς οι τιμές VIP τους ήταν πάνω από 1,0 (Πίνακας 2). Το μοντέλο δύο PLSbiplots επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας 100 τυχαίες μεταθέσεις, για να επιβεβαιωθεί η εγκυρότητα (R2) και οι προγνωστικές (Q2) ικανότητες του αρχικού μοντέλου με πολλά μοντέλα, σε σύγκριση με την καλή προσαρμογή. Το R2 απέδειξε ότι η καταλληλότητα του μοντέλου ήταν σημαντική και εξήγησε τον βαθμό των μεταβλητών Υ στο μοντέλο, ενώ το Q2 προσέφερε στο μοντέλο προγνωστική ποιότητα παρόμοια με αυτή που αναφέρθηκε από τους Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι όλες οι παρεμβολές του άξονα Υ του R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheΟι τιμές τομής R2 και Q2 ήταν στην περιοχή από 0.0367-0.0872 και-0.444 έως-0.492, αντίστοιχα, υποδηλώνοντας ότι και τα δύο μοντέλα PLS ήταν έγκυρα. και δεν έδειξε overfit. Επομένως, αυτά τα δύο μοντέλα PLS θα μπορούσαν να κατηγοριοποιηθούν ως μοντέλα καλής απόδοσης και αυτά τα ευρήματα αύξησαν την αξιοπιστία των μοντέλων.

2.7. Σχετική ποσοτικοποίηση δευτερογενών μεταβολιτών

Ο σχετικός ποσοτικός προσδιορισμός ορισμένων από τους δευτερογενείς μεταβολίτες που είχαν εντοπιστεί από τα επιλεγμένα βότανα φαίνεται στο Σχήμα 6. Αυτοί οι μεταβολίτες βρέθηκαν κυρίως υψηλότεροι στα πιο ενεργά βότανα όπως το P. minus, βρίσκονταν στη θετική πλευρά των διπλών τεμαχίων, και ήταν πιο κοντά σε όλες σχεδόν τις βιοδραστηριότητες που δοκιμάστηκαν.τι είναι το cistancheΑυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι οι δευτερογενείς μεταβολίτες ειδικά από την ομάδα των φλαβονοειδών ενώσεων που υπάρχουν σε υψηλές ποσότητες στο P. minus μπορεί να συνέβαλαν στην εξάλειψη των ελεύθερων ριζών και στις αντιγηραντικές ιδιότητες αυτού του βοτάνου;

Σε σύγκριση με τις διαφορετικές δομές του φλαβονοειδούς που θα μπορούσαν να έχουν συμβάλει στην αποτελεσματικότητά τους, σημειώθηκε ότι το πρότυπο υδροξυλίωσης στον δακτύλιο Β μπορεί να είναι ένας από τους σημαντικούς παράγοντες για την ανασταλτική επίδραση των μεταβολιτών στη δραστηριότητα των ενζύμων γήρανσης[80] . Sim et al.[104] αποκάλυψε επίσης ότι τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, η ανασταλτική δράση αυτών των φλαβονοειδών έγινε ισχυρή με έναν αυξανόμενο αριθμό ομάδων στον δακτύλιο Β και εξέτασαν τη συσχέτιση δομής-δραστικότητας ορισμένων φλαβονοειδών σε MMP-1 γονιδιακή έκφραση σε ακτινοβολούμενους με υπεριώδη ακτινοβολία ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

Η δευτεριωμένη μεθανόλη-d4(CH3OH-d4), η μη δευτεριωμένη KH2PO4, το οξείδιο του δευτερίου νατρίου (NaOD), το τριμεθυλοσιλυλοπροπιονικό οξύ-d4 άλας νατρίου (TSP), η αιθανόλη και η μεθανόλη παρέχονται από τη Merck Millipore International (Darmstadt, Γερμανία). Κερσετίνη, ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, 2,2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζυλ (DPPH), 2,2-αζινοδις(3-αιθυλο-βενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ)[ABTS ],Trolox,υπερθειικό κάλιο,2,2'-αζωδις(2-αμιδινοπροπάνιο)[AAPH,γαλλική επιγαλλοκατεχίνη (EGCG),ρυθμιστικό διάλυμα HEPES,ένζυμα ελαστάσης,Ν-μεθοξυηλεκτρυλ-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Μεθοξυηλεκτρυλο-Ala-Ala-Pro-Val-p-νιτροανιλίδιο και οξείδιο του δευτερίου (D2O) παρέχονται από τη Sigma (Aldrich, Γερμανία).

3.2. Φυτικό Υλικό και Δειγματοληψία

Φρέσκα φύλλα O.jacanica, P. minus και C.longa συλλέχθηκαν από το Felda Sungai Koyan Satu, το Raub και το Pahang. Τα φύλλα V.negundo ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Βιοεπιστήμης, Universiti Putra Malaysia. Φρέσκα φύλλα του P. indica συλλέχθηκαν στο University Agriculture Park, Universiti Putra Malaysia, και φρέσκα φύλλα των φύλλων C. caudatus συλλέχθηκαν στο Agricultural Institute, Serdang, Selangor. Ένα δείγμα κουπονιού αυτών των βοτάνων τοποθετήθηκε στο ερμπάριο, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών, Universiti Putra Malaysia, και κάθε δείγμα επικυρώθηκε από τον βοτανολόγο.Αντιγηραντικό κιστανάκιΌλα τα φύλλα συγκομίστηκαν με συνέπεια το πρωί, τις ηλιόλουστες μέρες για να διασφαλιστεί η αξιοπιστία της περιεκτικότητας σε μεταβολίτες. Το οικόπεδο στο ανοιχτό πεδίο για κάθε βότανο χωρίστηκε σε έξι μέρη και κάθε δείγμα συλλέχθηκε από κάθε τμήμα ως έξι αντίγραφα.

3.3.Προετοιμασία δείγματος

Μετά τη συγκομιδή, τα φρέσκα φύλλα πλύθηκαν με τρεχούμενο νερό βρύσης για να αφαιρεθούν όλα τα υπολείμματα, ξηράνθηκαν με εργαστηριακό λεπτό χαρτί και καταψύχθηκαν αμέσως με υγρό άζωτο για να σταματήσουν όλες οι ενζυματικές αντιδράσεις και διατηρήθηκαν οι μεταβολίτες πριν από τη λυοφιλοποίηση. Τα δείγματα στη συνέχεια ξηράνθηκαν σε ξηραντήρα κατάψυξης LABCONCO (Kansas City, MO, USA) έως ότου το σταθερό βάρος και η περιεκτικότητα σε υγρασία έφθασαν κάτω από 10 τοις εκατό. Όλα τα αποξηραμένα δείγματα αλέστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εργαστηριακό αναμικτήρα σε λεπτή σκόνη και κοσκινίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εργαστηριακό δοκιμαστικό κόσκινο (ENDECOTTS LTD. Λονδίνο, Αγγλία) μεγέθους 300 um για να ληφθεί το ομοιόμορφο μέγεθος. Τα κονιοποιημένα δείγματα συσκευάστηκαν σε κενό σε συσκευασία αλουμινίου για την προστασία τους από την έκθεση στο φως και την υγρασία και αποθηκεύτηκαν σε{3}} βαθμό πριν από τις αναλύσεις.

3.4. Εξαγωγή

Η διαδικασία εκχύλισης που περιγράφεται από τους Mediani et al. Το [105] ακολουθήθηκε με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, 10 g από κάθε δείγμα σε σκόνη βυθίστηκαν σε 100 mL αιθανόλης 60 τοις εκατό σε μια κεχριμπαρένια κωνική φιάλη και υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 1 ώρα χρησιμοποιώντας υπερηχητική συσκευή μπάνιου (WiseClean, μοντέλο WUC-D10H, Σεούλ, Κορέα) υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία (κάτω από 40 βαθμούς). . Τα δείγματα διηθήθηκαν μέσω διηθητικού χαρτιού Whatman αρ. 1 και τα υπολείμματα εκχυλίστηκαν εκ νέου δύο φορές και διηθήθηκαν μετά την ολοκλήρωση της πρώτης εκχύλισης. Τα εκχυλίσματα στη συνέχεια συνενώθηκαν και συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστή υπό κενό στους 40 βαθμούς. Οι παραγόμενες παχύρρευστες ουσίες στη συνέχεια λυοφιλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λυοφιλιωτή LABCONCO για να διασφαλιστεί η πλήρης αποβολή του νερού και αποθηκεύτηκαν σε{12}} βαθμό μέχρι την περαιτέρω χρήση. Τέλος, τα αποξηραμένα ακατέργαστα εκχυλίσματα αραιώθηκαν στις απαραίτητες συγκεντρώσεις για όλες τις έρευνες που πραγματοποιήθηκαν.

3.5. Δραστηριότητα καθαρισμού ριζών DPPH

Η δραστικότητα ριζικής δέσμευσης των δειγμάτων προσδιορίστηκε ακολουθώντας την τεχνική που αναπτύχθηκε από τους Kong et al.[106], η οποία αναπτύχθηκε από μια τροποποιημένη μέθοδο των Brand-Williams et al. [107]με μια μικρή τροποποίηση. Εν συντομία, 50 uL εκχυλίσματα δείγματος σε μεθανόλη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0 έως 500 ug/mL) προστέθηκαν με διάλυμα 195 uL πρόσφατα παρασκευασμένο 0,2 mMμεθανολικό2,2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζυλ (DPPH) και αποθηκεύτηκαν. Όλα τα δείγματα δοκιμής παρασκευάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Η διαδικασία αποχρωματισμού καταγράφηκε στα 515 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο (Biotek EL 800 microplate reader, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) μετά από 60 λεπτά επώασης στο σκοτάδι και συγκρίθηκε με θετικό έλεγχο και τυφλά δείγματα. Το ποσοστό της δραστηριότητας δέσμευσης ριζών μετρήθηκε σύμφωνα με την ακόλουθη εξίσωση:

όπου Α έλεγχος είναι η απορρόφηση του μάρτυρα χωρίς φυτικά εκχυλίσματα και Απλή είναι η απορρόφηση φυτικών εκχυλισμάτων.

Τα εκχυλίσματα φυτών ή οι συγκεντρώσεις θετικού μάρτυρα που σάρωναν το 50 τοις εκατό της σταθερής DPPH ελεύθερων ριζών υπολογίστηκαν ως IC χρησιμοποιώντας το γραμμικό γράφημα του ποσοστού δραστηριότητας δέσμευσης ριζών έναντι

φυτικά εκχυλίσματα/ συγκεντρώσεις θετικού ελέγχου. Το χαμηλότερο ICso έδειξε υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε έξι επαναλήψεις με Trolox και quercetin ως θετικούς μάρτυρες.

3.6.Δοκιμασία ριζικής σάρωσης ABTS

Για τον προσδιορισμό καθαρισμού ριζών ABTS, η ανάλυση διεξήχθη ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται από τους Arnao et al.[108] με ορισμένες τροποποιήσεις. Τα μητρικά διαλύματα που παρασκευάστηκαν ήταν 7 mM ABTS συν διάλυμα και 2,45 mM διάλυμα υπερθειικού καλίου. Προκειμένου να παρασκευαστεί το διάλυμα εργασίας, τα δύο μητρικά διαλύματα αναμίχθηκαν στις ίδιες ποσότητες και αφέθηκαν να αντιδράσουν στο σκοτάδι για 16 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, το διάλυμα εργασίας αραιώθηκε με απεσταγμένο νερό για να αποκτήσει απορρόφηση 0,700±0,005 μονάδων στα 734 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (UV{10}}φασματοφωτόμετρο PC, Shimadzu, Κιότο, Ιαπωνία) και γνωστό ως Λύση ABTS plus. Το διάλυμα ABTS plus παρασκευάστηκε πρόσφατα για κάθε δοκιμασία. Αυτό το διάλυμα ABTS plus (900 μL) αφέθηκε να αντιδράσει με 100 μL εκχυλισμάτων βοτάνων για 2 λεπτά. Η απορρόφηση στη συνέχεια διαβάστηκε στα 734 nm χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο. Η πρότυπη καμπύλη που περιλαμβάνει 3,1 ug/mL έως και 50 ug/mL Trolox αναπτύχθηκε και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως mg ισοδύναμης αντιοξειδωτικής ικανότητας Trolox/g δείγματος (mg TEAC/g δείγματος).

3.7. ORAC Radical Scavenging Assay

Μια δοκιμασία ORAC για τη μέτρηση της αποτελεσματικότητας σάρωσης ρίζας υπεροξυλίου εφαρμόστηκε όπως δηλώθηκε από τους Huang et al. [109] χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη φθορισμού μικροπλάκας FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Ortenberg, Γερμανία). Κάθε εκχύλισμα βοτάνου και Trolox (στάνταρ) παρασκευάστηκαν σε 75 mM ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) pH 7,4. Σε 96-καλά μαύρη μικροπλάκα, προστέθηκαν συνολικά 150 μL φλουορεσκεΐνης (10 nM διαλυμένη σε PBS), ακολουθούμενα από 25 μL Trolox, φυτικά εκχυλίσματα ή PBS ως τυφλό. Αυτά τα διαλύματα μεταφέρθηκαν με πιπέτα σε τριπλά φρεάτια. Η μικροπλάκα επωάστηκε για 15 λεπτά στους 37 βαθμούς και καλύφθηκε με ένα καπάκι. Ο φθορισμός μετρήθηκε με μήκος κύματος διέγερσης στα 458 nm και μήκος κύματος εκπομπής στα 520 nm. Το σήμα φόντου προσδιορίστηκε λαμβάνοντας τη μέτρηση κάθε 90 δευτερόλεπτα.

Μετά από αυτό, εισήχθησαν 25 uL πρόσφατα παρασκευασμένου 2,2'-αζοβισ(2-αμιδινοπροπάνιο) (AAPH, 240 mM σε PBS) από εγχυτήρες επί του σκάφους. Η διάσπαση του φθορισμού στη συνέχεια λήφθηκε στα 90 λεπτά χρησιμοποιώντας τα ίδια μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής. Η αξιολόγηση έγινε για τις περιοχές κάτω από την καμπύλη για δείγματα (φθορισμός έναντι χρόνου) μείον την περιοχή κάτω από την καμπύλη για το τυφλό και συγκρίθηκε με μια τυπική καμπύλη (25-400 μM Trolox). Οι τιμές ORAC που σχετίζονται με το Trolox υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την εξίσωση ως εξής:

3.8. Δοκιμασία αναστολής ελαστάσης

Η ανασταλτική δράση της ελαστάσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με την τεχνική που περιγράφεται από τους Krause et al.[110], με μικρές τροποποιήσεις από τους Ndlovu et al. [75]. Τα φρεάτια του δείγματος περιείχαν 25 μL ρυθμιστικού διαλύματος HEPES 0,1 M (pH7,5), 25 μL εκχυλίσματος βοτάνου (100 ug/mL) και 25 μL ενζύμου ελαστάσης (1 ug/mL). Τα τυφλά φρεάτια περιείχαν μόνο 75 μL ρυθμιστικού διαλύματος HEPES και τα φρεάτια αρνητικού ελέγχου περιείχαν 50 μL ρυθμιστικού διαλύματος HEPES και 25 μL ενζύμου ελαστάσης. Τα φρεάτια θετικού ελέγχου περιείχαν 25 μL ρυθμιστικού διαλύματος HEPES, 25 μL Ν-μεθοξυηλεκτρυλ-Ala-Ala-Pro-Chloro (10 ug/mL) και 25 μL ενζύμου ελαστάσης. Τα φρεάτια ελέγχου διαλύτη περιείχαν 25 μL ρυθμιστικού διαλύματος HEPES, 25 μL 10 τοις εκατό μεθανόλης και 25 μL ενζύμου ελαστάσης. Τα λευκά στοιχεία ελέγχου για το εκχύλισμα βοτάνου (για τους ελέγχους χρώματος κάθε εκχυλίσματος που δοκιμάστηκε) περιείχαν 150 μL ρυθμιστικού διαλύματος HEPES και 25 uL εκχυλίσματος βοτάνου. Η πλάκα μικρο-πηγαδιού στη συνέχεια επωάστηκε για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από αυτό, προστέθηκε υπόστρωμα 100 μL (Ν-Μεθοξυηλεκτρυλο-Αla-Αla-Pro-Val-ρ-νιτροανιλίδιο, 1 mM). Στη συνέχεια οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 40 λεπτά στους 25 βαθμούς. Μετά την επώαση, η απορρόφηση διαβάστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Biotek EL800 αναγνώστης μικροπλακών) στα 405 nm. Η ποσοστιαία αναστολή των εκχυλισμάτων βοτάνων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση ως εξής:

όπου ένας έλεγχος είναι η απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος με ελαστάση και διαλύτης και Atest είναι η απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος, της ελαστάσης και του εκχυλίσματος βοτάνων ή του N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. Δοκιμασία αναστολής κολλαγενάσης

Η δράση αναστολής της κολλαγενάσης διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο των Van-Wart and Steinbrink [111] (1981) με τροποποιήσεις από τους Madrone et al. [92]. Η δοκιμή εφαρμόστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα TES 50 mM (pH 7,4 με 0,36 mM CaCl2). Το ένζυμο κολλαγενάση από το Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) παρασκευάστηκε σε συγκέντρωση 0,8 μονάδες/mL (διαλυμένο σε μητρικό ρυθμιστικό διάλυμα TES). Το συνθετικό υπόστρωμα Ν-[3-(2-φουρυλ)ακρυλοϋλ]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) παρασκευάστηκε σε συγκέντρωση 2 mM σε μητρικό ρυθμιστικό διάλυμα TES. Ο συνολικός όγκος 150 μL για το τελικό μείγμα αντίδρασης περιείχε 46,3 μL ρυθμιστικού διαλύματος TES, 60 μL FALGPA (τελική συγκέντρωση 0,8 mM FALGPA), 18,7 μL ένζυμο κολλαγενάση (0,1 μονάδες/mL τελική συγκέντρωση) και εκχυλίσματα 2 b 100 ug/mL). Εκχυλίσματα βοτάνων και ένζυμα σε ρυθμιστικό διάλυμα TES επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά πριν από την προσθήκη του υποστρώματος για την έναρξη της χημικής αντίδρασης. Οι αρνητικοί έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα TES. Μετά την προσθήκη του υποστρώματος, η απορρόφηση διαβάστηκε αμέσως στα 340 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων και μετρήθηκε συνεχώς για ένα άλλο 20 λεπτά. Ο θετικός έλεγχος διεξήχθη χρησιμοποιώντας γαλλική επιγαλλοκατεχίνη (EGCG) στα 12,5 μg/mL. Η ποσοστιαία αναστολή των δειγμάτων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση ως εξής:

όπου ένας έλεγχος είναι η απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος TES και Atest είναι η απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος TES, του ενζύμου κολλαγενάσης και του φυτικού εκχυλίσματος ή FALGPA.

3.10. Προφίλ μεταβολισμού με χρήση μέτρησης 'H-NMR

Το προφίλ μεταβολίτη με χρήση H-NMR επιλεγμένων βοτάνων πραγματοποιήθηκε με βάση το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Kim et al. [47] με μικρές τροποποιήσεις. Ακατέργαστα εκχυλίσματα βοτάνων (25 mg) μεταφέρθηκαν σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης mL. Ένα μείγμα μεθανόλης-d4 και ρυθμιστικού διαλύματος KHPO4 σε Dao (pH 6.0) που περιέχει 0.1 τοις εκατό άλας νατρίου τριμεθυλσιλυπροπιονικού οξέος (TSP) προστέθηκε στα δείγματα βοτάνων με συνολικό όγκο { {10}}.7 mL σε αναλογία (1:1). Οι σωλήνες μικροφυγοκέντρησης που περιείχαν εκχυλίσματα βοτάνων στη συνέχεια στροβιλίστηκαν για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθήθηκε από υπερήχους για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτό στα 5678 g για να διαχωριστεί το υπερκείμενο από τυχόν αδιάλυτα υλικά. Στη συνέχεια, 0,6 mL διαυγούς υπερκειμένου ενσωματώθηκαν σε σωλήνες NMR και υποβλήθηκαν σε ανάλυση 'H-NMR. Η ανάλυση του 'H-NMR πραγματοποιήθηκε μέσω ενός φασματόμετρου Varian INOVA NMR 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) το οποίο λειτουργούσε σε συχνότητα 499,887 MHz και τα φάσματα καταγράφηκαν στους 26 βαθμούς. Κάθε μεμονωμένο φάσμα περιελάμβανε 64 σαρώσεις με 3,53 λεπτά χρόνο λήψης και πλάτος 20 ppm. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Chenomx (v.6.2) (Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Καναδάς) για τη διεξαγωγή της διόρθωσης σταδιακής και βασικής γραμμής με μια συνεπή ρύθμιση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση δεδομένων διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό SIMCA (έκδοση 13.0, Umetrics, Umea, Σουηδία). 3.11. Κάδος φασμάτων 'H-NMR

Η δέσμευση των φασμάτων H-NMR εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας Chenomxsoftware (v.6.2, Edmonton, ΑΒ, Καναδάς). Όλα τα φάσματα δεσμεύτηκαν από την περιοχή 0.5-10.0 pprn με τις ίδιες παραμέτρους. Οι παράμετροι περιελάμβαναν ένα φασματικό πλάτος §0.04 που έλαβε συνολικά 245 ολοκληρωμένες περιοχές για κάθε φάσμα NMR. Η χημική μετατόπιση για το νερό και την υπολειπόμενη μεθανόλη-d στα δ4.{11}}.90 και δ3.27-3.35 αντίστοιχα εξαλείφθηκαν. Τα ομοιόμορφα δεσμευμένα δεδομένα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε πολυπαραγοντική ανάλυση δεδομένων (MVDA).

3.12. Σχετική ποσοτικοποίηση Μεταβολιτών

Οι ταυτοποιημένοι μεταβολίτες εξετάστηκαν για τη σχετική ποσοτικοποίησή τους, η οποία υπολογίστηκε με βάση τη μέση περιοχή κορυφής των σημάτων μετά τη σύνδεση των φασμάτων LH-NMR.

3.13. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα των έξι επαναλήψεων εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Για τις μετρήσεις των ενεργειών δέσμευσης ριζών, της αναστολής των ενεργειών ελαστάσης και κολλαγενάσης και της σχετικής ποσοτικοποίησης των μεταβολιτών, διεξήχθησαν στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας Minitab 16 (Έκδοση 16, Minitab Inc., State College, PA, USA). Οι αναλύσεις διακύμανσης (ANOVA) εφαρμόστηκαν για να εξεταστούν οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων με p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. Συμπεράσματα

Η εφαρμογή αναλύσεων H-NMR σε συνδυασμό με MVDA ήταν επιτυχής στη διερεύνηση της διακύμανσης των μεταβολιτών των επιλεγμένων βοτάνων. Η γραφική παράσταση βαθμολογίας PCA έδειξε έναν διακριτό διαχωρισμό των βοτάνων σύμφωνα με τις ομάδες τους. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε ότι το P. minus είχε το υψηλότερο αποτέλεσμα δέσμευσης ριζών μέσω των αναλύσεων DPPH και ABTS και παρουσίασε τις υψηλότερες αντιγηραντικές δραστηριότητες. Τα δύο biplots της ανάλυσης PLS επικύρωσαν περαιτέρω αυτό το αποτέλεσμα, καθώς βρέθηκε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των μεταβολιτών που προσδιορίστηκαν στο P. minus και των βιοδραστηριοτήτων που δοκιμάστηκαν. Οι ενεργοί μεταβολίτες που πιστεύεται ότι συμβάλλουν στις ριζικές δραστηριότητες σάρωσης και στις αντιγηραντικές ιδιότητες του P.minus περιλαμβάνουν κερκετίνη, κερκετίνη-3-Ο-ραμνοσίδη, παράγωγα μυρικετίνης, κατεχίνη, ισοραμνετίνη, αστραγαλίνη και απιγενίνη. Ως εκ τούτου, μπορεί να υποτεθεί ότι αυτοί οι μεταβολίτες ήταν υπεύθυνοι για το ισχυρό αποτέλεσμα καθαρισμού των ριζών και τις υψηλές αντιγηραντικές ιδιότητες του P. minus. Αυτοί οι μεταβολίτες προέρχονταν κυρίως από την ομάδα των φλαβονοειδών, ιδιαίτερα των φλαβονολών. Επομένως, μπορεί να προταθεί ότι οι μεταβολίτες από το P. minus θα μπορούσαν να είναι ένας πολλά υποσχόμενος εκριζωτής ελεύθερων ριζών και αναστολέας ενζύμων γήρανσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την καθυστέρηση των συμπτωμάτων γήρανσης και για τη θεραπεία χρόνιων ασθενειών που σχετίζονται με τη γήρανση. Αυτά τα ευρήματα θα βοηθήσουν να διαπιστωθεί η ισχύς του P. minus ως πιθανής φυσικής πηγής αντιγηραντικών παραγόντων και ως φυσικού εκριζωτικού ελεύθερων ριζών.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Molecules 2019, 24, 3208. doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules