Μεταβολική ανάλυση βασισμένη σε NMR για τις επιδράσεις του συμπληρώματος κετογλουταρικού στους μυοβλάστες C2C12 σε διαφορετικές ενεργειακές καταστάσεις

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετε συμπληρώματα αντιγήρανσης και ανακούφισης από την κόπωση Cistanche

1. Εισαγωγή

Ο σκελετικός μυς είναι το μεγαλύτερο όργανο στο ανθρώπινο σώμα και διατηρεί τις φυσιολογικές δραστηριότητες της ζωής.Προπόνηση παρατεταμένης άσκησηςή παθολογικήl διεργασίες ασθενειών προκαλούν μυϊκή βλάβηήανεπαρκής παροχή μυϊκής ενέργειας, αυτή τη στιγμή, η αποκατάσταση της μυϊκής δύναμης και λειτουργίας είναι ιδιαίτερα σημαντική. Διάφορα συμπληρώματα διατροφής έχουν χρησιμοποιηθεί για την προώθηση της υπερτροφίας των σκελετικών μυών και την ενίσχυση της αθλητικής απόδοσης [1]. Ως τομή του οργανικού μεταβολισμού άνθρακα και αζώτου και ταυτόχρονα κρίσιμο ενδιάμεσο στον κύκλο TCA, το -Ketoglutarate (AKG) έχει δείξει πλειοτροπικά αποτελέσματα για τη βελτίωση της μυϊκής απόδοσης σε κλινικά και πειράματα σε ζώα [2-9]. Για παράδειγμα, το AKG μπορεί να μειώσει τη βλάβη του εντερικού βλεννογόνου [8] και τη φλεγμονή [9], να μειώσει τηνανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου[4] και ηπατική ίνωση [5], προάγουν την ανάπτυξη [6] και μειώνουν τη νοσηρότητα καικαθυστερήσει τη γήρανση[7]. Προηγούμενες εργασίες έχουν δείξει ότι η συμπλήρωση AKG μπορεί να ανακουφίσει την απώλεια μυών με παρεντερική χορήγηση σε ένα μοντέλο τραυματισμού ασθενών που υποβάλλονται σε ολική αρθροπλαστική ισχίου [2] και να προάγει τη μυϊκή υπερτροφία και τη σύνθεση πρωτεϊνών μέσω των σηματοδοτικών οδών Akt/mTOR [10,11]. Στην περίπτωση της μυϊκής δυστροφίας Duchenne, η συμπλήρωση AKG μπορεί να αποτρέψει τη μυϊκή ατροφία και δυσλειτουργία μέσω της διαμεσολαβούμενης οδού PHD3/ADRB2- [12]. Η προηγούμενη εργασία μας έδειξε επίσης ότι η συμπλήρωση AKG μπορεί να διευκολύνει βαθιά τον πολλαπλασιασμό των μυοβλαστών C2C12 και να ανακουφίσει την ατροφία των μυοσωλήνων C2C12 που καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο χωρίς γλυκόζη [13]. Δεδομένου ότι η γλυκόζη είναι η κύρια πηγή ενέργειας για τη διατήρηση των φυσιολογικών φυσιολογικών λειτουργιών των σκελετικών μυών, τα αποτελέσματα του συμπληρώματος AKG για τη βελτίωση της μυϊκής απόδοσης εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από το επίπεδο γλυκόζης στους σκελετικούς μυς. Οι διαφορές των επιδράσεων που προκαλούνται από το AKG στους σκελετικούς μυς μεταξύ διαφορετικών ενεργειακών καταστάσεων είναι ασαφείς.

Το AKG συμμετέχει στη σύνθεση αμινοξέων, βιταμινών καιοργανικά οξέακαιμεταβολισμού ενέργειαςστο σώμα, η οποία περιλαμβάνει τη μετατροπή του AKG σε γλουταμικό από τη γλουταμική αφυδρογονάση και την επακόλουθη αμίδωση του γλουταμικού με αμμωνία από τη συνθετάση της γλουταμίνης. Το AKG παρέχει την ενέργεια για την κυτταρική ανάπτυξη μέσω του κύκλου TCA και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και προάγει τον κυτταρικό μεταβολισμό και τη σηματοδότηση αλληλεπιδρώντας με τον υποδοχέα OXGR (ένας υποδοχέας συζευγμένος με πρωτεΐνη G) στην κυτταρική μεμβράνη [14,15]. Επιπλέον, η AKG μπορεί να ρυθμίσει τον οξειδωτικό μεταβολισμό των μιτοχονδρίων και να προάγει την επιτρεπτή επιγενετική κατάσταση διαμεσολαβώντας την πρώιμη μετάβαση της κατάστασης των εμβρυϊκών κυττάρων και την ανάπτυξη γεννητικών κυττάρων [16]. Επιπλέον, το AKG που προκαλείται από την άσκηση μπορεί να διεγείρει τον υποδοχέα OXGR1 στα επινεφρίδια για να ελέγχει τη θερμογένεση και τη διάσπαση των τριγλυκεριδίων στον λιπώδη ιστό και να παράγει ευεργετικά αποτελέσματα στους μεταβολισμούς [17].

Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για να αποκαλύψουν μεταβολικές αλλαγές των σκελετικών μυών που προκαλούνται από AKG σε διαφορετικές ενεργειακές καταστάσεις και τους υποκείμενους μεταβολικούς μηχανισμούς. Πρόσφατα, η μεταβολομική ανάλυση έχει χρησιμοποιηθεί για τη συστηματική αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που κρύβονται πίσω από τα ευεργετικά αποτελέσματα των συμπληρωμάτων διατροφής. Οι εναλλαγές των μεταβολιτών που δρουν ως τα κατάντη προϊόντα της γονιδιακής μεταγραφής μπορεί να αντικατοπτρίζουν τις συνολικές μεταβολικές αλλαγές διαισθητικά. Ως ιδιαίτερα κατάλληλες τεχνικές για την ποσοτική ανίχνευση μεταβολών των επιπέδων του μεταβολίτη σε βιορευστά, ιστούς και κύτταρα, η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1Η υψηλής ανάλυσης (NMR) έχει εφαρμοστεί εκτενώς σε μεταβολομικές αναλύσεις. Είναι σημαντικό ότι το μεταβολομικό προφίλ που βασίζεται σε NMR έχει πολλά πλεονεκτήματα, όπως υψηλή αναπαραγωγιμότητα, ποσοτική μέτρηση χωρίς προκατάληψη και εύκολη προετοιμασία του δείγματος [18,19]. Προηγουμένως, πραγματοποιήσαμε μεταβολομικές αναλύσεις βασισμένες σε NMR για να διασαφηνίσουμε τόσο τις επιδράσεις της συμπλήρωσης κρεατίνης στους μυοβλάστες C2C12 [20] όσο και τις επιδράσεις της συμπλήρωσης αλανυλο-γλουταμίνης σε μυοβλάστες που τραυματίστηκαν από στέρηση ενέργειας [21].

2. Αποτελέσματα

2.1. Πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση των μυοβλαστών C2C12 με συμπλήρωμα AKG

Τα κύτταρα μυοβλάστη C2C12 που καλλιεργήθηκαν σε ένα φυσιολογικό μέσο ανάπτυξης με και χωρίς συμπλήρωμα AKG ομαδοποιήθηκαν ως Nor-A και Nor, ενώ εκείνα σε μέσο ανάπτυξης χαμηλής γλυκόζης με ή χωρίς συμπλήρωμα AKG ομαδοποιήθηκαν ως Low-A και Low. Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη [10], τα κύτταρα Nor-A με συμπλήρωμα AKG σε συγκέντρωση 2 mm εμφάνισαν μια σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική βιωσιμότητα σε σχέση με τα κύτταρα Nor (Εικόνα S1).

Ως εκ τούτου, η συγκέντρωση AKG των 2 mm χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα για την αξιολόγηση αλλαγών που προκαλούνται από AKG στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των μυοβλαστών. Σε σύγκριση με τα κύτταρα Nor, τα κύτταρα Low εμφάνισαν βαθύτατα μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού λόγω ανεπάρκειας ενέργειας (Εικόνα 1Α). Παρόλο που η συμπλήρωση AKG δεν προκάλεσε σημαντικά διαφορετική μορφολογία των μυοβλαστών στις δύο ενεργειακές καταστάσεις, όχι μόνο ενίσχυσε τον ρυθμό πολλαπλασιασμού των Χαμηλών κυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε μέσο χαμηλής γλυκόζης αλλά επίσης ενίσχυσε αυτόν των κυττάρων Nor που καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο προηγούμενες μελέτες [10,12]. Οι αριθμοί κυττάρων ανά δεδομένη περιοχή μετρήθηκαν για τις τέσσερις ομάδες μυοβλαστών (n=4 για την ομάδα): Ούτε, 563,8 ± 10.4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Χαμηλό, 493,8 ± 14,5; Χαμηλό Α, 547,0 ± 11,7 (Εικόνα 1Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα Low-A δεν εμφάνισαν στατιστικά διαφορετικούς αριθμούς κυττάρων από τα κύτταρα Nor, υποδεικνύοντας ότι η συμπλήρωση AKG θα μπορούσε να ανακτήσει αριθμούς κυττάρων για τους μυοβλάστες υπό συνθήκες καλλιέργειας χαμηλής γλυκόζης (Εικόνα 1Β).

Εικόνα 1, Ικανότητες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των μυοβλαστών C2C12 υπό συνθήκες φυσιολογικής καλλιέργειας και χαμηλή. καλλιέργεια γλυκόζης. (Α) Μορφολογίες μυοβλαστών. (Β) Αριθμοί κελιών που αντιστοιχούν στο πλαίσιο A (n=4). (Γ) Κυτταρική βιωσιμότητα σε σχέση με κύτταρα Nor που αναλύθηκαν με δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων MTS (n=5). (Δ) Εκφράσεις MyoD1 σε μυοβλάστες που αναλύθηκαν με στύπωμα western. Το αντίσωμα αντι-GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την τυποποίηση της ποσότητας πρωτεΐνης σε κάθε λωρίδα. (Ε) Στατιστική ανάλυση που αντιστοιχεί στους πίνακες (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Επιπλέον, ο προσδιορισμός MTS πραγματοποιήθηκε για να συγκριθούν ποσοτικά οι ρυθμοί πολλαπλασιασμού των τεσσάρων ομάδων κυττάρων (Εικόνα 1C). Τα χαμηλά κύτταρα είχαν σαφώς μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα κύτταρα Nor, υποδεικνύοντας ότι το μέσο χαμηλής γλυκόζης δεν ευνοούσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Σημαντικά, η συμπλήρωση AKG ενίσχυσε τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων Nor-A και Low-A σε σχέση με τα κύτταρα Nor και Low, αντίστοιχα. Σημειώστε ότι τα κύτταρα Low-A έδειξαν ικανότητα πολλαπλασιασμού χαμηλότερη από τα κύτταρα Nor, υπονοώντας ότι η συμπλήρωση AKG αποκατέστησε μόνο εν μέρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο χαμηλής γλυκόζης

.Η έκφραση της πρωτεΐνης μυογονικής διαφοροποίησης 1 (MyoD1) χρησιμοποιείται συνήθως για να χαρακτηρίσει την ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων. Έτσι, συγκρίναμε ποσοτικά τις εκφράσεις του MyoD1 μεταξύ των τεσσάρων ομάδων κυττάρων (Εικόνα 1D). Τα χαμηλά κύτταρα έδειξαν μια βαθιά μειωμένη ικανότητα διαφοροποίησης σε σύγκριση με τα κύτταρα Nor. Σημαντικά, το συμπλήρωμα AKG ρυθμίζει προς τα πάνω τις ικανότητες διαφοροποίησης των κυττάρων που καλλιεργούνται τόσο σε κανονικό μέσο όσο και σε μέσο χαμηλής γλυκόζης, όπως υποδεικνύεται από περίπου 30 τοις εκατό αύξηση της έκφρασης MyoD1 στα κύτταρα Nor-A και Low-A. Σημειωτέον, τα κύτταρα Low-A δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντικά διαφορετική έκφραση MyoD1 από τα κύτταρα Nor, υποδηλώνοντας την υψηλή αποτελεσματικότητα της συμπλήρωσης AKG για την αποκατάσταση της ικανότητας διαφοροποίησης των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο χαμηλής γλυκόζης.

Επιπλέον, αναλύσαμε τις ικανότητες διαφοροποίησης του μυοσωλήνα για τις τέσσερις ομάδες μυοβλαστών C2C12. Οι μυοσωλήνες σχηματίστηκαν μέσω της σύντηξης μυοβλαστών που καλλιεργήθηκαν σε φυσιολογικά και χαμηλής γλυκόζης μέσα διαφοροποίησης με ή χωρίς συμπλήρωμα AKG Εικόνα S3). Μορφολογίες των μυοσωλήνων C2C12 έδειξαν ότι η καλλιέργεια χαμηλής γλυκόζης μείωσε την ικανότητα διαφοροποίησης των μυοσωλήνων των κυττάρων και η συμπλήρωση AKG θα μπορούσε να προάγει τη διαφοροποίηση μυοσωλήνα των μυοβλαστών που καλλιεργήθηκαν τόσο σε κανονικό μέσο όσο και σε μέσο γλυκόζης.

2.2. Φάσματα NMR Υδατικών Εκχυλισμάτων Μυοβλαστών C2C12

Τυπικά φάσματα 1Η NMR 850 MHz καταγράφηκαν σε υδατικά εκχυλίσματα που προέρχονται από τις ομάδες Nor, Nor-A, Low και Low-A των μυοβλαστών C2C12 (Εικόνα 2Α). Συνολικά 34 μεταβολίτες εκχωρήθηκαν και συνοψίστηκαν στον Πίνακα S1. Οι εκχωρήσεις συντονισμού των μεταβολιτών επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση φασμάτων 2D 1H-13C HSOC και 1H-H TOCSY (Εικόνες S4 και S5). Η οπτική επιθεώρηση των φασμάτων NMR έδειξε ότι η καλλιέργεια μυοβλαστών με συμπλήρωμα AKG είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές συσσωρεύσεις ενδοκυτταρικού AKG σε κύτταρα Nor-A και Low-A (Εικόνα 2Β).

Εικόνα 2, Μέσος όρος 850 MHz lH φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) που καταγράφηκαν σε υδατικά εκχυλίσματα που προέρχονται από τις ομάδες Nor, Nor-A, Low και Low-A των μυοβλαστών C2C12. (Α) Σύγκριση των μέσων φασμάτων NMR των τεσσάρων ομάδων. Οι κατακόρυφες κλίμακες διατηρήθηκαν σταθερές σε όλα τα φάσματα lH NMR. Η περιοχή νερού (4.7-5.2 ppm) αφαιρέθηκε (Β) Τοπικές ενισχυμένες περιοχές κορυφών α-κετογλουταρικού (AKG). Μπλε/πράσινη/κίτρινη/κόκκινη γραμμή: φασματικές περιοχές από τις ομάδες Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, α-κετογλουταρικό; PC, Ο-φωσφοχολίνη; GPC, sn-γλυκερό-3-φωσφοχολίνηUDP-γλυκόζη, διφωσφορική ουριδίνη γλυκόζη: CTP, sn-γλυκερό-3-φωσφοχολίνη. NAD plus, νικοτιναμίδιο αδενινο δινουκλεοτίδιο AXP αδενίνη μονο/δι/τριφωσφορική.

2.3. Πολυμεταβλητή Ανάλυση Δεδομένων για Εξερεύνηση Κυτταρικών Μεταβολικών Προφίλ

Πραγματοποιήσαμε περαιτέρω ανάλυση πολυμεταβλητών δεδομένων στα φασματικά δεδομένα NMR για μεταβολικό προφίλ των τεσσάρων ομάδων μυοβλαστών C2C12. Αρχικά δημιουργήσαμε τρία μοντέλα PCA χωρίς επίβλεψη με τα δύο πρώτα συστατικά (PC1, PC2) για να εξετάσουμε τις τάσεις ομαδοποίησης και να αποκαλύψουμε μεταβολικές διαφορές μεταξύ των ομάδων μυοβλαστών. Τα διαγράμματα βαθμολογίας ThePCA δείχνουν ότι το μεταβολικό προφίλ των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο χαμηλής γλυκόζης διακρίθηκε σαφώς από αυτό που καλλιεργήθηκε σε ένα κανονικό μέσο (Εικόνα 3Α) και η συμπλήρωση AKC άλλαξε σημαντικά τα μεταβολικά πρότυπα των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν τόσο σε φυσιολογικό μέσο όσο και σε σε μέσο χαμηλής γλυκόζης (Εικόνα 3Β, Γ). Ωστόσο, η μεταβολική διαφορά μεταξύ των ομάδων Nor-A και Nor ήταν μεγαλύτερη από εκείνη μεταξύ των ομάδων Low-A και Low, υπονοώντας ότι τα αποτελέσματα της συμπλήρωσης AKG στο μεταβολικό προφίλ των μυοβλαστών εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την ενεργειακή κατάσταση των κυττάρων.

Σχήμα 3. Πολυμεταβλητές αναλύσεις για φάσματα «HNMR καταγράφηκαν σε υδατικά εκχυλίσματα που προέρχονται από C2C12 μυοβλάστες των ομάδων Nor, Nor-A, Low και Low-A. (AC) Το PCA βαθμολογεί τις γραφικές παραστάσεις των ομάδων Low και Nor, οι ομάδες Low-A και Low τις ομάδες Nor-A και Nor. (DF) Το OPIS-DA βαθμολογεί τις γραφικές παραστάσεις των ομάδων Low και Nor (R2: 0.999, 02: 0.996), τις ομάδες Low-A και Low (R2: 0.918: 02: 0.761), οι ομάδες Nor-A και Nor (R2: 0.927: 02: 0.838). Οι ελλείψεις δείχνουν το όριο εμπιστοσύνης 95 τοις εκατό.

Επιπλέον, δημιουργήσαμε τρία εποπτευόμενα μοντέλα OPLS-DA για να απεικονίσουμε τους μεταβολικούς διαχωρισμούς μεταξύ των τεσσάρων ομάδων μυοβλαστών (Εικόνα 3D-F). Όπως αναμενόταν, τα μοντέλα OPLSDA μεγιστοποίησαν τις μεταβολικές διακρίσεις μεταξύ των τεσσάρων ομάδων διατηρώντας τις συσχετισμένες πληροφορίες ορθογώνιας μεταβλητής και φιλτράροντας τις μη συσχετισμένες πληροφορίες ορθογώνιας μεταβλητής. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε δοκιμές τυχαίας μετάθεσης (n=200) για να αξιολογήσουμε την αξιοπιστία των μοντέλων OPLS-DA (Εικόνα S6), τα οποία υποδεικνύουν την εγκυρότητα των καθιερωμένων μοντέλων OPLS-DA.

2.4. Αναγνωρίσεις διαφορικών και σημαντικών μεταβολιτών

Για να συγκρίνουμε ποσοτικά τα επίπεδα μεταβολιτών μεταξύ των τεσσάρων ομάδων μυοβλαστών C2C12, υπολογίσαμε τα σχετικά επίπεδα των ταυτοποιημένων μεταβολιτών με βάση τα σχετικά ολοκληρώματά τους (Πίνακας S2). Η λήψη συμπληρωμάτων AKG αύξησε δραματικά τα ενδοκυτταρικά επίπεδα AKG στις ομάδες Nor-A και Low-A αλλά δεν άλλαξε σημαντικά εκείνα στην ομάδα Nor-A και Low-A. Πραγματοποιήσαμε τη δοκιμή t Student για τον εντοπισμό διαφορικών μεταβολιτών με κριτήριο p < 0.05 (Εικόνα 4). Η σύγκριση Nor έναντι Low ταυτοποίησε 29 διαφορικούς μεταβολίτες (Εικόνα 4Α), συμπεριλαμβανομένων 18 ενισχυμένων μεταβολιτών (λευκίνη, ισολευκίνη, βαλίνη, οξικό, γλουταμικό, γλουταμίνη, μεθειονίνη, ασπαρτικό, λυσίνη, κρεατίνη, PC (Ο-φωσφοχολίνη)ταυρίνη, , φαινυλαλανίνη, ιστιδίνη, NAD plus, μυρμηκικό, AXP) και 11 μείωσαν το Metabo. λίτες (γλουταθειόνη, πυρογλουταμικό, φωσφοκρεατίνη, βήτα-αλανίνη, GPC, γλυκόζη, γλυκίνη, οξική, θρεονίνη, GTP, UDP-γλυκόζη). Η σύγκριση των διαφορικών μεταβολιτών Low-A έναντι χαμηλής ταυτοποίησης (Εικόνα 4Β), συμπεριλαμβανομένων 7 αυξημένων μεταβολιτών (αιθανόλη, AKGbeta-alanine, PC, ταυρίνη, γλυκίνη και GTP) και 3 μειωμένων μεταβολιτών (γλουταμίνη, λυσίνη και μυοινοσιτόλη). Η σύγκριση του Nor-A έναντι του Nor εντόπισε 18 διαφορικούς μεταβολίτες (Εικόνα 4C), συμπεριλαμβανομένων 6 ρυθμιζόμενων μεταβολιτών (AKG, πυρογλουταμικό, γλουταμίνη, λυσίνη, γλυκόζη, γαλακτικό) και 12 προς τα κάτω ρυθμισμένους μεταβολίτες (αλανίνη, οξική, γλουταθειόνη μεθειονίνη, φωσφοκρεατίνη, PC, μυοινοσιτόλη, γλυκίνη, θρεονίνη, GTP, UDP-γλυκόζη και AXP).

Σχήμα 4. Οι σχετικές εντάσεις διαφορικών μεταβολιτών ταυτοποιήθηκαν από συγκρίσεις ανά ζεύγη μεταξύ των τεσσάρων ομάδων μυοβλαστών C2C12. (Α) Χαμηλό εναντίον Ούτε. (Β) Χαμηλό-Α έναντι Χαμηλού. (Γ) Nor-A vs. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} για κάθε ομάδα.

Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε τα μοντέλα OPLS-DA για να αναγνωρίσουμε σημαντικούς μεταβολίτες με κριτήριο VIP > 1 (Εικόνα 5). Συνολικά, 12, 10 και 10 σημαντικοί μεταβολίτες αναγνωρίστηκαν από τα μοντέλα OPLS-DA Nor-A vs. Nor, Nor vs Low, Low-A vs Low.

Σχήμα 5. Οι βαθμολογίες VIP σημαντικών μεταβολιτών ταυτοποιήθηκαν από συγκρίσεις ανά ζεύγη μεταξύ των τεσσάρων ομάδων των C2C12 μυοβλαστών. (Α) Χαμηλό εναντίον Ούτε. (Β) Χαμηλό-Α έναντι Χαμηλού. (Γ) Nor-A vs. Η κόκκινη/μπλε γραμματοσειρά υποδηλώνει αυξημένα/μειωμένα επίπεδα του μεταβολίτη.

Ο συνδυασμός των αναγνωρισμένων σημαντικών μεταβολιτών και των διαφορικών μεταβολιτών έδωσε χαρακτηριστικούς μεταβολίτες (Πίνακας 1). Οι συγκρίσεις κατά ζεύγη των χαμηλών έναντι κανενός, χαμηλού-Α έναντι χαμηλών και του Nor-A εναντίον ούτε εντόπισαν 10, 6 και 10 χαρακτηριστικούς μεταβολίτες, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι τα αποτελέσματα της συμπλήρωσης AKG στους μυοβλάστες συσχετίστηκαν στενά με την ενέργεια κατάσταση των κυττάρων.

2.5. Προσδιορισμός Σημαντικά Μεταβολικού Μεταβολικού

Οδοί Πραγματοποιήσαμε ανάλυση μεταβολικής οδού για να αναγνωρίσουμε σημαντικά αλλαγμένα μεταβολικά μονοπάτια (σημαντικά μονοπάτια) με βάση τα επίπεδα μεταβολιτών που προσδιορίστηκαν από τις συγκρίσεις ανά ζεύγη μεταξύ των τεσσάρων ομάδων μυοβλαστών C1C12 (Εικόνα S7, Πίνακας 2 και Πίνακας S3). Η ανάλυση του Nor vs. Low εντόπισε 11 σημαντικές οδούς: (1) μεταβολισμό αλανίνης, ασπαρτικού και γλουταμικού. (2) Μεταβολισμός γλυκίνης, σερίνης και θρεονίνης. (3) Μεταβολισμός γλουταθειόνης. (4) Μεταβολισμός D-γλουταμίνης και D-γλουταμινικού. (5) Μεταβολισμός αμύλου και σακχαρόζης. (6) μεταβολισμός βήτα-αλανίνης. (7) Μεταβολισμός ταυρίνης και υποταυρίνης. (8) Μεταβολισμός φαινυλαλανίνης. (9) Βιοσύνθεση φαινυλαλανίνης, τυροσίνης και τρυπτοφάνης. (10) Μεταβολισμός νικοτινικών και νικοτιναμιδίων. (11) Μεταβολισμός ιστιδίνης. Αυτή η σημαντική οδός συσχετίστηκε με τον ενεργειακό μεταβολισμό, το οξειδωτικό στρες και την αναπληρωτική ροή του κύκλου TCA.

Η ανάλυση του Nor-A vs. Διαφορετικά, η ανάλυση του Low-A έναντι του Low εντόπισε μόνο έξι σημαντικά μονοπάτια: τα πρώτα τέσσερα μονοπάτια 1-4 κοινοποιήθηκαν από τις συγκρίσεις του Low-A εναντίον Nor, Nor-A vs. δύο μονοπάτια 6-7 που μοιράζονται με τη σύγκριση του Low vs. Σημειώστε ότι η συμπλήρωση AKG δεν άλλαξε σημαντικά την οδό 5 (μεταβολισμός αμύλου και σακχαρόζης) σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε μέσο χαμηλής περιεκτικότητας σε γλυκόζη, αλλά παρενέβη σε δύο άλλες οδούς (μεταβολισμός βήτα-αλανίνης και μεταβολισμός ταυρίνης και υποταυρίνης). Για να απεικονίσουμε αλλαγές που προκαλούνται από το AKG σε χαρακτηριστικούς μεταβολίτες, προβάλαμε αυτούς τους μεταβολίτες σε έναν μεταβολικό χάρτη που βασίζεται στη βάση δεδομένων της Κιότο Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων (KEGG) (Εικόνα 6). Το KEGG έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως ένας από τους κύριους πόρους δεδομένων για την ανακατασκευή των μεταβολικών δικτύων και τονίζει σημαντικά μεταβολικά μονοπάτια. Τόσο οι αλλαγμένοι χαρακτηριστικοί μεταβολίτες όσο και τα σημαντικά αλλαγμένα μεταβολικά μονοπάτια παρέχουν νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς στους οποίους βασίζονται τα αποτελέσματα της συμπλήρωσης AKG στους μυοβλάστες C2C12.