Νέα αντιοξειδωτικά συστατικά από παραπροϊόντα ζυθοποιίας για καλλυντικές συνθέσεις

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να αξιολογήσει τη συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη και την αντιοξειδωτική δράση διαφορετικών τύπων χειροποίητων μπύρας (Ego, Alter, Ifiat Lux, Triplo Malto, Ubi και Maior), καθώς και των πρώτων υλών (βύνες, λυκίσκος και μαγιά), τα ενδιάμεσα προϊόντα και τα απόβλητα προϊόντα (βύνες, λυκίσκος και μαγιά), λόγω της χρήσης τους σε καινοτόμες συνθέσεις καλλυντικών. Οι εκχυλίσεις από τα αρχικά και τα χρησιμοποιημένα δείγματα ελήφθησαν από νερό ή αλκοόλη 70 βαθμών. Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη (Folin Ciocalteau Essay) όλων των προϊόντων ζυθοποιίας εξαρτιόταν από το συγκεκριμένο υπό έρευνα προϊόν. Οι υψηλότερες τιμές βρέθηκαν στον αρχικό λυκίσκο (που κυμαίνονται από περίπου 93 έως 155 mg GAE/g, σύμφωνα με τον διαλύτη εκχύλισης), στις ενδιάμεσες τιμές στη βύνη εκκίνησης και στη μαγιά έναρξης, και τις χαμηλότερες τιμές στο μούστο. Η συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλες στις τελικές μπύρες προέρχεται από τις φαινόλες που εξήχθησαν από τα διάφορα συστατικά, δηλαδή τις αρχικές βύνες, τον λυκίσκο και τη μαγιά, αλλά μη αμελητέες τιμές εξακολουθούσαν να παρατηρούνται στα αναλωμένα προϊόντα. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης, η αντιοξειδωτική ικανότητα ισοδύναμης Trolox (LPPH), η αντιοξειδωτική παράμετρος μείωσης των ιόντων σιδήρου (FRAP) και η δραστηριότητα δέσμευσης κατιόντων ριζών και η αναγωγική ισχύς (ABTS) επηρέασαν έντονα τα αποτελέσματα. Γενικά, τα αποτελέσματα αντανακλούσαν την τάση που παρατηρήθηκε για τη συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλες: ότι οι μπύρες εμπλουτίζονται σταδιακά από φαινόλες που προέρχονται από όλα τα αρχικά συστατικά και ότι τα αναλωμένα προϊόντα εξακολουθούν να έχουν μη αμελητέα αντιοξειδωτική δράση.cistanche χοληστερόληΕίναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η απόβλητη μαγιά εμφάνιζε συχνά υψηλότερες τιμές από αυτές της πρώτης ύλης. μπορεί να συναχθεί ότι η μαγιά είναι σε θέση να απορροφήσει φαινόλες από τη μπύρα κατά τη διάρκεια της ζυθοποιίας. Λαμβάνοντας υπόψη το ενδιαφέρον για την εκμετάλλευση των απορριμμάτων που προέρχονται από την επεξεργασία τροφίμων, η βιολογική δραστηριότητα των αποβλήτων προϊόντων ζυθοποιίας Alter έχει αξιολογηθεί σε κυτταρική καλλιέργεια κερατινοκυττάρων (αναλωθέντα προϊόντα βύνης, λυκίσκου και μαγιάς). Πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικές in vitro δοκιμές σε κύτταρα HaCaT κερατινοκυττάρων για την αξιολόγηση της πιθανής βιοδραστικότητας των εξαντλημένων εκχυλισμάτων. Μεταξύ των χρησιμοποιημένων εκχυλισμάτων, τα εκχυλίσματα λυκίσκου και μαγιάς έδειξαν την ικανότητα να βελτιώνουν τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα και να αποτρέπουν το οξειδωτικό στρες στα κύτταρα HaCaT, δύο χαρακτηριστικά στη γήρανση του δέρματος. φαινόλες για την παρασκευή καλλυντικών κατά της γήρανσης του δέρματος.

Λέξεις-κλειδιά:σπιτική μπύρα; προϊόντα ζυθοποιίας? συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη. αντιοξειδωτική δράση? κυτταροτοξικότητα, αντιγήρανση

1. Εισαγωγή

Η Craftbeer έχει γίνει ολοένα και πιο δημοφιλής στις ΗΠΑ και την Ευρώπη [1,2], με σημαντικές επιπτώσεις στην οικονομία [3]. Αυτή η επιτυχία τροφοδοτήθηκε από το ενδιαφέρον των καταναλωτών να δοκιμάσουν νέες μπύρες με διαφορετικές γεύσεις και αρώματα [2] και την προσοχή στα οφέλη για την υγεία από τη μέτρια κατανάλωση μπύρας [4].

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Σε αντίθεση με τις εμπορικές μπύρες, οι μπύρες craft είναι μη φιλτραρισμένες και μη παστεριωμένες, και έτσι τα αισθητηριακά τους χαρακτηριστικά παραμένουν αναλλοίωτα από τη διαδικασία παρασκευής. Επιπλέον, ουσίες που είναι ωφέλιμες για την υγεία, όπως τα αντιοξειδωτικά, μπορεί επίσης να εξοικονομηθούν.

Οι μπύρες του εμπορίου και τα απόβλητά τους έχουν ήδη αξιολογηθεί για τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες. Οι Zhao et al. [5] προσδιόρισε τα προφίλ φαινόλης και τις αντίστοιχες αντιοξειδωτικές δραστηριότητες 34 εμπορικών μπύρας και βρήκε αξιοσημείωτες διαφορές στη συνολική και μεμονωμένη περιεκτικότητα σε φαινόλη και στην αντιοξειδωτική δράση. Οι πιο άφθονες φαινολικές ενώσεις ήταν το γαλλικό και το φερουλικό οξύ. Την ίδια περίοδο, οι Ribeiro Tafulo et al. [6] προσδιόρισε την αντιοξειδωτική δράση 27 άλλων εμπορικών μπύρας, χρησιμοποιώντας διάφορες φασματοφωτομετρικές μεθόδους. Την ίδια χρονιά, οι Piazzon et al., 2010 [7] αξιολόγησαν την αντιοξειδωτική δράση και το περιεχόμενο φαινολών διαφορετικών τύπων εμπορικών μπύρας (abbey, ale, bock, wheat, lager, pilsner και dealcoholized) και βρήκαν μεγάλη ποικιλία μεταξύ τους. Σε μια μελέτη για τις σπιτικές μπύρες, οι Farcas et al. [8] προσδιόρισε τη συνολική περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες και την αντιοξειδωτική δράση κατά τη διάρκεια ολόκληρης της παραγωγικής διαδικασίας, ξεκινώντας από τις πρώτες ύλες (βύνη και λυκίσκο) και τελειώνοντας με τα ανακτημένα απόβλητα. Έδειξαν ότι μια αρχική υψηλότερη περιεκτικότητα σε ολική πολυφαινόλη και αντιοξειδωτική δράση στις πρώτες ύλες οφειλόταν στην παρουσία βύνης και ότι η συνολική περιεκτικότητα σε πολυφαινόλη μειώθηκε σημαντικά όταν περνούσε στην μπύρα και την εξαντλημένη βύνη στο τελικό προϊόν μπύρας και στην αναλωμένη βύνη. Η μαγιά δεν αναλύθηκε.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Το γεγονός ότι οι αντιοξειδωτικές ενώσεις που προέρχονται από τη βύνη αποδείχθηκαν από τον Zhao και τους συνεργάτες του [9], οι οποίοι έδειξαν την αντιοξειδωτική δράση και τη συνολική περιεκτικότητα σε φαινόλη πολλών ποικιλιών κριθαριού βύνης. Άλλοι συγγραφείς αναγνώρισαν σαράντα επτά ενώσεις φαινόλης από τέσσερις τύπους εμπορικής μπύρας, χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με μια τεχνική φασματομετρίας μάζας Orbitrap υβριδικής γραμμικής τετραπολικής ιονοπαγίδας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού [10]. Πρόσφατα, ο εντοπισμός χαμηλού μοριακού βάρους φαινολικών και αζωτούχων ενώσεων σε μπίρες craft επιτεύχθηκε με αναλύσεις HPLC-ESI-MS/MS [11]. Οι συγγραφείς προσπάθησαν να διαφοροποιήσουν τους τύπους μπύρας, όπως IPA, Lager και Weiss, σύμφωνα με τις φαινολικές και αζωτούχες ενώσεις, αλλά δεν βρήκαν σημαντικές διαφορές σε αυτές τις ενώσεις μεταξύ των διαφόρων τύπων μπύρας.

Πιο πρόσφατα [12], 20 φαινολικές ενώσεις, για παράδειγμα, γαλλικό οξύ, κατεχίνη, καφεϊκό οξύ, κερσετίνη, ξανθοχουμόλη και χουμουλόνη, επιλέχθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν σε διαφορετικές μπύρες χειροποίητης παραγωγής, βότανα, αρχικά συστατικά παρασκευής (βύνη κριθαριού, λυκίσκος και μαγιά ) και υποπροϊόντα (φλοιός κριθαριού, αναλωμένος λυκίσκος και αναλωμένη μαγιά). Από αυτή τη μελέτη, διαπιστώθηκε ότι υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ όλων των δειγμάτων και ότι η σύνθεση της μπύρας εξαρτάται από τη διαδικασία παραλαβής και παρασκευής. Οι φαινολικές ενώσεις της μπύρας προέρχονταν κυρίως από τη βύνη κριθαριού και, είναι ενδιαφέρον ότι η μαγιά ήταν σε θέση να απορροφήσει φαινολικές ενώσεις από άλλες πηγές.

Έτσι, η αξιολόγηση των αντιοξειδωτικών στα απόβλητα από την παραγωγή μπύρας μπορεί να έχει μεγάλη σημασία αν σκεφτεί κανείς την ταχεία ανάπτυξη της αγοράς της βιοτεχνικής μπύρας παγκοσμίως.

Η εκμετάλλευση των υποπροϊόντων της ζυθοποιίας για την ανάπτυξη προϊόντων υγείας όπως καλλυντικά ή/και συμπληρώματα θα συμβάλει στην αύξηση της βιωσιμότητας της παραγωγής μπύρας. Αυτή η μελέτη έχει πολλαπλούς στόχους: αξιολόγηση της συνολικής περιεκτικότητας σε φαινόλη και αντιοξειδωτική δράση διαφορετικών τύπων ιταλικών craft μπίρες (lager, amber, triple malt, red και black) και αξιολόγηση του ενδιάμεσου παραγωγής τους, καθώς και των απορριμμάτων τους. Η βιολογική δραστηριότητα των αποβλήτων εκχυλισμάτων από το ζυθοποιείο Alter αξιολογήθηκε έτσι σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα. Αυτό ανοίγει νέες και ενδιαφέρουσες ευκαιρίες για την εκμετάλλευση νέων συστατικών από υποπροϊόντα ζυθοποιίας για καλλυντικά σκευάσματα.

2. πειραματικός

2.1. Υλικά

11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX), 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(98%TLC)(ABTS), gallic acid, sodium carbonate monohydrate ACS reagent, sodium acetate and ethanol(ethanol absolute grade) were purchased from Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany). Manganese (IV)oxidize activated(>90 τοις εκατό) και το αντιδραστήριο φαινόλης του Folin-Ciocalteu αγοράστηκε από τη Fluka (Buchs, Ελβετία). Το άνυδρο οξικό νάτριο και ο άνυδρος χλωριούχος σίδηρος (III) αγοράστηκαν από την JT Baker (Center Valley, PA, ΗΠΑ) και το άνυδρο ανθρακικό νάτριο αγοράστηκε από την Carlo Erba (Μιλάνο, Ιταλία). Όλοι οι διαλύτες και τα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ποιότητας. Το υπερκαθαρό νερό παρήχθη από την Gradient Milli-Q (Millipore, Molsheim, Γαλλία). Οι πρώτες ύλες, οι μπύρες χειροτεχνίας, τα βότανα και τα απόβλητά τους παρασχέθηκαν ευγενικά από την Birrificio Collesi (Απέκιο, Ιταλία).

Τα λεπτομερή χαρακτηριστικά των μπύρας που ερευνήθηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχονται στον Πίνακα 1. Ο τύπος της βύνης εκκίνησης και του λυκίσκου καθόρισε τις κύριες διαφορές μεταξύ όλων των μπύρας. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν πέντε διαφορετικές βύνες εκκίνησης, συχνά σε μείγματα και σε διαφορετικές αναλογίες. Ο λυκίσκος Perle και Saaz χρησιμοποιούνται σε διαφορετικές αναλογίες για τα διαφορετικά αρώματά τους. Η ίδια μαγιά, Saccharomyces Cerevisiae, χρησιμοποιήθηκε για όλες τις μπύρες, οι οποίες ήταν όλες τύπους υψηλής ζύμωσης. Οι διάφοροι συνδυασμοί αποδίδουν διαφορετικούς τύπους μπύρας (lager, amber, triple malt, red και black) με περιεκτικότητα σε αλκοόλ που κυμαίνεται από 6.0 έως 9.0 τοις εκατό V/V.

2.2. Η προετοιμασία των δειγμάτων

Πριν από τις αναλύσεις, οι πρώτες ύλες (βύνη, λυκίσκος και μαγιά), οι μπύρες, το μούστο και τα απόβλητα (εξαντλημένη βύνη, λυκίσκος και μαγιά) υποβλήθηκαν σε διαφορετικές διεργασίες ανάλογα με τη φυσική τους κατάσταση, οι οποίες μπορούσαν να αποξηρανθούν στερεά, υγρά. στερεό ή θολό υγρό (Πίνακας 2).

Τα υγρά στερεά και υγρά υποβλήθηκαν αρχικά σε λυοφιλοποίηση σε θερμοκρασία {{0}} βαθμών και πίεση 0,03 bar (FreeZone 1 Liter Benchtop Series77400 freeze-drier, LABCONCO, Kansans City, MO, ΗΠΑ). Τα αποξηραμένα στερεά υποβλήθηκαν σε άλεση σε μύλο κοπής. Στη συνέχεια, όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε εκχυλίσεις. Μια ποσότητα δείγματος ζυγίστηκε προσεκτικά και διασκορπίστηκε σε 100 mL διαλύτη (νερό ή αιθανόλη 70 βαθμών). Το προκύπτον υγρό τοποθετήθηκε στη φιάλη Erlenmeyer, η οποία στη συνέχεια κλείστηκε προσεκτικά. Τα δείγματα αναδεύτηκαν μαγνητικά για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 rpm στους 20 βαθμούς για 10 λεπτά για να αφαιρεθούν τα αδιάλυτα σωματίδια (Zetalab CNZ-140HE, Padova, Ιταλία). Τα δείγματα λυοφιλοποιήθηκαν και αποθηκεύτηκαν σε -20 βαθμό σε φιαλίδια πολυαιθυλενίου των 50 mL με βιδωτό πώμα (BD Falcon TM, BD Biosciences, Bedford, MA, ΗΠΑ) προκειμένου να διασφαλιστούν οι βέλτιστες συνθήκες αποθήκευσης.

2.3. Προσδιορισμός Ολικής Περιεκτικότητας σε Φαινόλη

Η Ολική Περιεκτικότητα σε Φαινόλη (TPC) των δειγμάτων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο Folin-Ciocalteu [13] με ορισμένες τροποποιήσεις [14]. Εν συντομία, όλα τα λυοφιλοποιημένα προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή διαυγών διαλυμάτων σε συγκέντρωση 10 mg mL-1. Δείγμα 50 μL αυτού του διαλύματος προστέθηκε σε 150 μL αντιδραστηρίου φαινόλης Folin-Ciocalteu, αραιωμένο 1:4 με νερό. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 uL κορεσμένου διαλύματος Na, CO3. Μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, η απορρόφηση κάθε φρεατίου προσδιορίστηκε στα 765 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (FLUOstar Omega, BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Γερμανία). Η μέτρηση συγκρίθηκε με ένα πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης γαλλικού οξέος (GA) και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως χιλιοστόγραμμα ισοδυνάμων γαλλικού οξέος (GAE) ανά γραμμάριο παραπροϊόντος (mg GAE/g).

2.4. Αξιολόγηση της Αντιοξειδωτικής Δραστηριότητας

Η αντιοξειδωτική δράση της μπύρας craft και των παραπροϊόντων αξιολογήθηκε με μέτρηση της δραστηριότητας καθαρισμού ριζών {{1}διφαινυλ-2-πικρυυλυδραζυλ (DPPH"), 2,2'-Azino-bis(3- Ικανότητα σάρωσης κατιόντων ρίζας αιθυλοβενζοθειαζολίνης-6-σουλφονικού οξέος (ABTS*) και αντιοξειδωτική ικανότητα μείωσης του σιδήρου (FRAP).cistanche δοσολογία redditΩς πρότυπο βαθμονόμησης χρησιμοποιήθηκε Trolox(6-Υδροξυ-2,5,7,8-τετραμεθυλοχρωμαν-2-καρβοξυλικό οξύ). Οι τιμές εκφράστηκαν ως mmol ισοδύναμο Trolox/g του δείγματος ως συνάρτηση του IC50, που ορίζεται ως η συγκέντρωση του εξεταζόμενου υλικού που απαιτείται για να προκαλέσει 50 τοις εκατό μείωση στην αρχική συγκέντρωση DPPH, ABTS ή σιδήρου.

2.5. Αξιολόγηση της ισοδύναμης αντιοξειδωτικής ικανότητας Trolox (DPPH)

Η δραστηριότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών DPPH αξιολογήθηκε μέσω μιας αναλυτικής δοκιμασίας μικροπλάκας σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευμένες μεθόδους[15] με ορισμένες τροποποιήσεις [16]. Εν συντομία, ένα δείγμα 50 μL του δείγματος (συγκέντρωση 10 mg mL-') και το πρότυπο προστέθηκε σε 150 μL DPPH σε απόλυτη αιθανόλη σε 96-πλάκα μικροτιτλοδότησης φρεατίου (BD FalconTM) Μετά από επώαση στους 37°C βαθμού για 20 λεπτά, η απορρόφηση κάθε φρεατίου προσδιορίστηκε στα 517 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η αντιοξειδωτική δράση υπολογίστηκε και εκφράστηκε έναντι της ποσότητας Trolox σύμφωνα με την Εξίσωση (1)[17] όπου Ag και A είναι οι απορροφήσεις του διαλύματος ρίζας DPPH● στα 517 nm παρουσία του δείγματος ελέγχου και των δειγμάτων εκχυλίσματος, αντίστοιχα.

2.6. Δραστηριότητα καθαρισμού κατιόντων ριζών και μειωτική ισχύς (ABTS)

Ο προσδιορισμός ABTS διεξήχθη σύμφωνα με προηγούμενες διαδικασίες [18] και εφαρμόστηκε σε μια ανάλυση τρυβλίου 96-πηγαδιού μικρολίτρων. Το διάλυμα ABTS* plus (5 mM) παρασκευάστηκε με οξείδωση ABTS με MnO, σε νερό για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Ένα κλάσμα 50 μL από τις διαφορετικές συγκεντρώσεις του δείγματος και του προτύπου (Trolox) προστέθηκε σε 150 μL διαλύματος ABTS* σε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης 96-πηγαδιού (BD FalconTM).οφέλη από το εκχύλισμα κιστάνςΜετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, η απορρόφηση κάθε φρεατίου προσδιορίστηκε στα 734 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Οι τιμές υπολογίστηκαν και εκφράστηκαν έναντι της ποσότητας Trolox σύμφωνα με την Εξίσωση (2) [17] όπου Ag και A είναι οι απορροφήσεις του διαλύματος ριζών OHe στα 734 nm παρουσία του δείγματος ελέγχου και των δειγμάτων εκχυλίσματος, αντίστοιχα.

2.7. Αντιοξειδωτική παράμετρος που μειώνει τον σίδηρο (FRAP)

Οι τιμές FRAP της βιοτεχνικής μπύρας/υποπροϊόντων καθορίστηκαν σύμφωνα με μια προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο [19], με ορισμένες τροποποιήσεις [20]. Το αντιδραστήριο FRAP παρασκευάστηκε με ανάμειξη των ακόλουθων τριών διαλυμάτων:

1. 50mL0,3M ρυθμιστικό διάλυμα οξικού pH3,6 (1,23 g οξικού νατρίου σε 50 mL νερού που οξινίζεται

με οξικό οξύ)?

2. 5 mLofstock διάλυμα 5mMTPTZ(2,4,6-Τριπυριδυλ-s-τριαζίνης) (15,6 mg) σε 40 mM HCl;3. 5 mL 5 mM FeCl3:6 H2O (16,2 mg) σε 40 mM HCl.

Το αντιδραστήριο FRAP θερμάνθηκε στους 37 βαθμούς C πριν από τη χρήση. Δείγματα δείγματος 25 μL (διαλύματα σε συγκέντρωση 10 mg mL-1) προστέθηκαν εις τριπλούν σε φρεάτια 96-πλάκας φρεατίου (BD Falcone). Ο προσδιορισμός ξεκίνησε με την προσθήκη 175 μL αντιδραστηρίου FRAP σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα ανακινήθηκε αμέσως σε συσκευή ανάγνωσης πλακών FLUOstar Omega για 30 δευτερόλεπτα και η αντίδραση αφέθηκε να τρέξει για 10 λεπτά και στη συνέχεια η πλάκα διαβάστηκε σε συσκευή ανάγνωσης πλακών (593 nm). Ένα διάλυμα αναφοράς του Trolox εκτελέστηκε ταυτόχρονα και χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία της καμπύλης βαθμονόμησης με γραμμική παλινδρόμηση. Η τυπική καμπύλη ήταν γραμμική μεταξύ 25 και 800μM Trolox (TE). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε μΜ Trolox ισοδύναμο (TE) δείγμα gI.

2.8. Κυτταρικές Καλλιέργειες

Η κυτταρική σειρά ανθρώπινων κερατινοκυττάρων, HaCaT, αναπτύχθηκε τακτικά σε τροποποιημένο Eagle's Medium (DMEM) της Dulbecco, συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη, 50 U/mL πενικιλίνη και 50ug/mL σε στρεπτομυκίνη 7 βαθμούς έναν υγροποιημένο επωαστήρα με 5 τοις εκατό CO. Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα, η μιτοχονδριακή δραστηριότητα και ο ενδοκυτταρικός σχηματισμός ROS, τα κύτταρα HaCaT σπάρθηκαν σε τρυβλία 96-πηγαδιών σε 2×10* κύτταρα/φρεάτιο. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO. Για τα πειράματα με κύτταρα HaCaT, παρασκευάστηκαν μητρικά διαλύματα αναλωμένων εκχυλισμάτων σε νερό στα 60 mg/mL. Τα μητρικά διαλύματα στη συνέχεια αραιώθηκαν σε ένα πλήρες μέσο για να ληφθούν οι επιθυμητές συγκεντρώσεις εξαντλημένων εκχυλισμάτων.

2.9. Κυτταροτοξικότητα και μιτοχονδριακή δραστηριότητα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη μείωση των {{{{1{0}}}}(4,5-Διμεθυλ-2-θειαζολυλ)-2,5-διφαινυλ -2Η-τετραζόλιο βρωμίδιο (MTT) στην αδιάλυτη φορμαζάνη του, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 21]. Εν συντομία, τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος (0.{11}} mg/mL) στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO. Στη συνέχεια, το μέσο επεξεργασίας αντικαταστάθηκε με ΜΤΤ στο διάλυμα ισορροπημένου αλατιού του Hank ( HBSS) (0,5 mg/mL) για 2 ώρες στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO. Μετά από πλύση με HBSS, οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε ισοπροπανόλη. Τα επίπεδα φορμαζάνης μετρήθηκαν (570 nm, φίλτρο αναφοράς 690 nm) χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών ετικετών VICTORTM X3 (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό των κυττάρων ελέγχου.

Η μιτοχονδριακή δραστηριότητα προσδιορίστηκε με ΜΤΤ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις [22].παρενέργειες cistanche deserticolaΕν συντομία, τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 4 ώρες είτε με DMEM 10 τοις εκατό FBS (θρεπτικό μέσο) είτε με φυσιολογικό ορό Dulbecco ρυθμισμένο με φωσφορικά (αλατούχο διάλυμα χωρίς θρεπτικά συστατικά) παρουσία 0,03 mg/mL εκχυλίσματος στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO. Στη συνέχεια, η επεξεργασία αντικαταστάθηκε με ΜΤΤ για 2 ώρες στους 37 βαθμούς σε 5 τοις εκατό CO2. Μετά από πλύση με HBSS, οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε ισοπροπανόλη. Τα επίπεδα φορμαζάνης που συσχετίστηκαν με τη μιτοχονδριακή δραστηριότητα μετρήθηκαν (570 nm, φίλτρο αναφοράς 690 nm) χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών ετικετών VICTORTM X3 (PerkinElmer). Η μιτοχονδριακή δραστηριότητα εκφράστηκε ως ποσοστό των κυττάρων ελέγχου.

2.10. Ενδοκυτταρικός Σχηματισμός ROS

Ο σχηματισμός αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) αξιολογήθηκε από τον φθορίζοντα ανιχνευτή 2'-7'διοξική διχλωροδιϋδροφθοροσκεΐνη (H2DCF-DA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] (τα κύτταρα HaCaT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 2 ώρες με 0.{ {23}}3 mg/mL εκχυλίσματος σε 37Cin 5 τοις εκατό CO2. Στη συνέχεια, το μέσο επεξεργασίας αφαιρέθηκε και 100 μL H2DCF-DA (10ug/mL) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 30 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, το Το διάλυμα H2DCF-DA αντικαταστάθηκε με διάλυμα H2O2 (100 μΜ) για 30 λεπτά. Ένα παράλληλο σύνολο κυττάρων HaCaT υποβλήθηκε σε επεξεργασία με H2O και 0,03 mg/mL εκχύλισμα για 30 λεπτά.Cistanche Genghis KhanΟ σχηματισμός ROS μετρήθηκε ως προς τις αυθαίρετες μονάδες φθορισμού, AUF (διέγερση στα 485 nm και εκπομπή στα 535 nm), χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών ετικετών VICTORTM X3 (PerkinElmer). Τα δεδομένα εκφράζονται ως πολλαπλάσια αύξηση του σχηματισμού ROS έναντι των μη επεξεργασμένων κυττάρων (δηλ. AUF κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με Η, Ο,/AUF μη επεξεργασμένων κυττάρων).

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Cosmetics 2021, 8, 96. https://doi.org/10.3390/cosmetics8040096 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics