Νευροπροστατευτικές επιδράσεις τεσσάρων φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών σε H2O2-Επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC12 μέσω της οδού Nrf2/ARE

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Maiquan Li 1, Tao Xu 1, Fei Zhou 1, Mengmeng Wang 1, Huaxin Song 1, Xing Xiao και Baiyi Lu 1,*

1. Εισαγωγή

Το οξειδωτικό στρες, το οποίο είναι μια ανισορροπία της αντιοξειδωτικής ομοιόστασης, προκαλεί υπεροξείδωση λιπιδίων, τραυματισμό πρωτεΐνης και DNA, γήρανση των κυττάρων και κυτταρικό θάνατο. Αυτή η διαδικασία πιθανότατα συμβάλλει σε πολλές νευροεκφυλιστικές διαταραχές, όπως η νόσος του Alzheimer (AD), η νόσος του Parkinson (PD) και η ισχαιμία/επαναιμάτωση [1]. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), το οποίο είναι ένα από τα κύρια δραστικά είδη οξυγόνου (ROS), είναι γνωστό ότι προκαλεί υπεροξείδωση λιπιδίων και βλάβη του DNA [2]. Επιπλέον, το H2O2 είναι μια ενδογενής πηγή ελεύθερων ριζών υδροξυλίου που συμβάλλει στο επίπεδο υποβάθρου του κυτταρικού οξειδωτικού στρες [3,4]. Ως εκ τούτου, οι θεραπευτικές στρατηγικές για την πρόληψη της απόπτωσης που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες μπορεί να έχουν τη δυνατότητα στη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών.

Ο πυρηνικός παράγοντας ερυθροειδούς 2-σχετιζόμενος παράγοντας 2 (Nrf2), είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται έντονα με το οξειδωτικό στρες. Η ενεργοποίηση του Nrf2 προκαλεί τη μεταγραφή πολλών αντιοξειδωτικών και γονιδίων αποτοξίνωσης, συμπεριλαμβανομένης της οξυγενάσης της αίμης-1 (HO-1), της οξειδορεδουκτάσης της κινόνης NAD(P)H, της αντιφλεγμονώδους [13] και της ανοσοτροποποιητικής [14 ] βιοδραστηριότητες. Το Osmanthusfragrans είναι ένα κοινό συστατικό σε πολλά ασιατικά τρόφιμα και καταναλώνεται εδώ και πολύ καιρό. Δείξαμε προηγουμένως ότι τα εκχυλίσματα λουλουδιών O.fragrans ενίσχυσαν τη χωρική μάθηση και τη μνήμη, ανέστειλαν την οξειδωτική βλάβη και παρουσίαζαν νευροπροστατευτικές δραστηριότητες στη γήρανση που προκαλείται από d-γαλακτόζη σε ένα μοντέλο ποντικού ICR [15]. Η σαλιδροζίδη, η ακτεοσίδη και η ισοακτεοσίδη είναι η κύρια απόκριση των PhGs για τις αντιοξειδωτικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων λουλουδιών O.fragrans [16].

Μελέτες σχετικά με τη νευροπροστατευτική δράση των PhGs έχουν επιτύχει επιθυμητά αποτελέσματα. Η σαλιδροσίδη μείωσε σημαντικά την κυτταρική απόπτωση των κυττάρων PC12 που εκτέθηκαν σε MPP plus [17,18]. Η ακτεοσίδη ανακούφισε επίσης την επαγόμενη από MPP συν απόπτωση και το οξειδωτικό στρες στα κύτταρα PC12 [19] και τον τραυματισμό των κυττάρων SH-SY5Y από A p25-35- [20]. Η εχινακοσίδη διερευνήθηκε για την απόπτωση που προκαλείται από τον παράγοντα νέκρωσης όγκου-α (TNFa) σε κύτταρα SH-SY5Y [21], η επαγόμενη από MPTP ντοπαμινεργική τοξικότητα σε ποντικούς [22], οι τραυματισμένες από γλουταμικό πρωτογενείς καλλιέργειες φλοιωδών κυττάρων αρουραίου [23] και { {19}}Βλάβη που προκαλείται από OHDA σε κύτταρα PC12 [24]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PhGs παρουσίασαν κυτταροπροστατευτική δράση και είναι πιθανοί παράγοντες για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες των PhGs αποτελούν τη βάση πολλών άλλων βιοδραστηριοτήτων για αυτές τις ενώσεις [25]. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τον μοριακό μηχανισμό των PhGs έναντι της οξειδωτικής τοξικότητας.

Στη μελέτη μας, επιλέξαμε τέσσερα τυπικά PhGs ως εξής: σαλιδροζίτη (φαινυλαιθανοειδείς μονοσακχαρίτες), ακτεοσίδη (φαινυλαιθανοειδείς δισακχαρίτες), ισοακτεοσίδη (φαινυλαιθανοειδείς δισακχαρίτες) και εχινακοσίδη (φαινυλαιθανοειδείς τρισακχαρίτες). Χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο νευρωνικού θανάτου χρησιμοποιώντας διαφοροποιημένα κύτταρα PC12 [26] για να διερευνήσουμε το προστατευτικό αποτέλεσμα και τον μοριακό μηχανισμό των PhG στο μοντέλο κυττάρων PC12 που επάγεται από H2O{3}}. Δείξαμε ότι τα PhGs ενεργοποίησαν την οδό Nrf2/ARE δεσμεύοντας την πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με την ECH παρόμοια με Kelch (Keap1). Αυτή η διαδικασία ρύθμισε τα αντιοξειδωτικά ένζυμα και αύξησε την αντίσταση των κυττάρων PC12 στο οξειδωτικό στρες.

Θεραπεία νευροεκφυλιστικών διαταραχών:PhGs από το cistanche

2. Αποτελέσματα

2.1. PhGs καταστέλλουν H2O2-Επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα PC12

Δοκιμάστηκαν κυτταροτοξικές επιδράσεις του H2O2 και των PhGs (0.1,1,5 και 10 卩g/mL) σε κύτταρα PC12. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το H2O2 προκάλεσε απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων PC12 με τρόπους που εξαρτώνται από τη συγκέντρωση και τον χρόνο (Εικόνα 1Α). Η έκθεση των κυττάρων PC12 σε 200 H2O2 για 2 ώρες είχε ως αποτέλεσμα τη βιωσιμότητα των κυττάρων 57,4 τοις εκατό. Η προεπεξεργασία των κυττάρων με PhGs στα 0.1,1, 5 και 10 昭/mL δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα 1Β) και προστάτευσε σημαντικά τα κύτταρα PC12 από την πρόκληση βλάβης από H2O2- βελτιώνοντας την βιωσιμότητα κυττάρων ως 9.549-22.141 τοις εκατό, 12.092-25.289 τοις εκατό, 1.{37}}.289 τοις εκατό και 3.{40}}.441 τοις εκατό, αντίστοιχα ( Εικόνα 1C). Ωστόσο, η προεπεξεργασία με σαλιδροζίτη (0,1 ^g/mL), ισοακτεοσίδη (0,1, 1, 5 και 10 ^g/mL), εχινακοσίδη (0,1,1 και 5 ^g/mL) δεν έδειξε σημαντική διαφορά στα επαγόμενα από HzOz κύτταρα βλάβη. Η προεπεξεργασία των κυττάρων με PhGs βελτίωσε επίσης το μορφολογικό χαρακτηριστικό που επάγεται από το H2O2 (Εικόνα 1D).

Φιγούρα 1.Τα PhG κατέστειλαν την επαγόμενη από H2O2-κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα PC12. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Κυτταροτοξική επίδραση H2O2 (A) και PhGs (B) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε κύτταρα PC12. (Γ) Τα εξασθενημένα PhGs H2O2-προκάλεσαν μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα κύτταρα PC12 επωάστηκαν με PhGs (0.1 και 10 mg/mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 200 pM H2O2 για άλλες 2 h μετά την αφαίρεση των PhG. (Δ) Μορφολογική παρατήρηση. Τα κύτταρα μετά τη θεραπεία παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (x100), CK: φυσιολογική ομάδα, H2O2: ομάδα που έλαβε θεραπεία με H2O2, HL: ομάδα που έλαβε αγωγή με χαμηλή δόση σαλιδροσίδη, HH: ομάδα αγωγής με υψηλή δόση σαλιδροσίδη, ML: ομάδα αγωγής με χαμηλή δόση ακτεοσίδης, ΜΗ: ομάδα που έλαβε αγωγή με ακτεοσίδη με υψηλή δόση, IL: ομάδα αγωγής με ισοακτεοσίδη χαμηλής δόσης, ΙΗ: ομάδα αγωγής με ισοακτεοσίδη υψηλής δόσης, SL: ομάδα αγωγής με χαμηλή δόση εχινακοσίδης, SH: ομάδα αγωγής με υψηλή δόση εχινακοσίδης. ** p < 0,01="" έναντι="" της="" ομάδας="" χωρίς="" θεραπεία.="" #="" p="">< 0,05,="" έναντι="" της="" ομάδας="" που="" υπέστη="" αγωγή="" με="" h2o2.="" ##="" p="">< 0,01,="" έναντι="" της="" ομάδας="" που="" υποβλήθηκε="" σε="" αγωγή="" με="">

2.2. Τα PhGs καταστέλλουν το H2O2-Προκαλούμενη ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS, υπεροξείδωση λιπιδίων (MDA) και αυξημένες δραστηριότητες υπεροξειδίου δισμουτάσης (SOD) σε κύτταρα PC12

Η έκθεση των κυττάρων PC12 σε 200 pM H2O2 για 2 ώρες αύξησε τα επίπεδα ROS, την περιεκτικότητα σε MDA και μείωσε τη δραστηριότητα SOD (Εικόνα 2). Η προεπεξεργασία PhG μείωσε το επίπεδο ROS, τη σαλιδροσίδη και την ακτεοσίδη και η υψηλή δόση της προεπεξεργασίας ισοακτεοσίδης και εχινακοσίδης μείωσε σημαντικά το επίπεδο ROS (p < 0,01).="" η="" προεπεξεργασία="" με="" σαλιδροζίτη="" δεν="" έδειξε="" καμία="" επίδραση="" στην="" περιεκτικότητα="" σε="" mda,="" αλλά="" η="" προεπεξεργασία="" με="" ακτεοσίδη="" μείωσε="" σημαντικά="" την="" περιεκτικότητα="" σε="" mda="" (p="">< 0,05).="" η="" προεπεξεργασία="" με="" ισοακτεοσίδη="" και="" εχινακοσίδη="" μείωσε="" σημαντικά="" την="" περιεκτικότητα="" σε="" mda="" σε="">

Σχήμα 2.Τα PhG μπλοκάρουν τη συσσώρευση ROS και MDA και αύξησαν τις δραστηριότητες του SOD στα κύτταρα PC12. Τα κύτταρα PC12 επωάστηκαν με PhGs (0.1 και 10 4g/mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 200 |^M H2O2 για άλλο 2 ώρες μετά την αφαίρεση των PhG. (Α) Τα PhG μπλοκάρουν τη συσσώρευση ROS και MDA. (Β) Τα PhGs εμπόδισαν τη συσσώρευση MDA. (Γ) Τα PhG αύξησαν τις δραστηριότητες του SOD. CK: κανονική ομάδα, Μοντέλο: ομάδα που έλαβε θεραπεία με H2O2, Σαλιδροζίδη: ομάδα που έλαβε αγωγή με σαλιδροζίτη, Ακτεοσίδη: ομάδα που έλαβε αγωγή με ακτεοσίδη, Ισοακτεοσίδη: ομάδα αγωγής με ισοακτεοσίδη, Εχινακοσίδη: ομάδα αγωγής με εχινακοσίδη. ** p < 0.01="" έναντι="" ομάδας="" χωρίς="" θεραπεία.="" #="" p="">< 0,05,="" έναντι="" της="" ομάδας="" που="" υποβλήθηκε="" σε="" θεραπεία="" με="" h2o2,="" ##="" p="">< 0,01,="" έναντι="" της="" ομάδας="" που="" έλαβε="" θεραπεία="" με="">

2.3. PhGs Ανέστρεψε H2O2-Προκαλούμενη απόπτωση σε κύτταρα PC12

Η θεραπεία με H2O2 (200 |1M) για 2 ώρες αύξησε σημαντικά την απόπτωση στα κύτταρα PC12, με συνολικό ποσοστό απόπτωσης έως και 16,02 τοις εκατό (Εικόνα 3). Ωστόσο, η προεπεξεργασία με PhGs (0,1 και 10 μg/mL) για 24 ώρες μείωσε τον ρυθμό απόπτωσης κατά τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (ρ < 0,01).="" η="" σαλιδροζίδη,="" η="" ακτεοσίδη,="" η="" ισοακτεοσίδη="" και="" η="" εχινακοσίδη="" μείωσαν="" σημαντικά="" το="" ποσοστό="" της="" κυτταρικής="" απόπτωσης="" κατά="" 4.750-6.627="" τοις="" εκατό="" ,="" 4.413-5.800="" τοις="" εκατό,="" 6.593-10.047="" τοις="" εκατό="" και="" 1.530-7.510="" τοις="" εκατό,="">

Εικόνα 3. Τα PhGs ανέστρεψαν την απόπτωση που προκάλεσε το H2O2- σε κύτταρα PC12. Τα κύτταρα PC12 επωάστηκαν με PhGs (0.1 και 10 卩g/mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 200 pM H2O2 για άλλες 2 ώρες μετά την Τα PhG αφαιρέθηκαν. Στη συνέχεια, η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας φθορίζοντα ανιχνευτή PI/FITC. CK: κανονική ομάδα, Μοντέλο: ομάδα που έλαβε θεραπεία με H2O2, Σαλιδροζίδη: ομάδα που έλαβε αγωγή με σαλιδροζίτη, Ακτεοσίδη: ομάδα που έλαβε αγωγή με ακτεοσίδη, Ισοακτεοσίδη: ομάδα αγωγής με ισοακτεοσίδη, Εχινακοσίδη: ομάδα αγωγής με εχινακοσίδη. ** p < 0,01="" έναντι="" της="" ομάδας="" χωρίς="" θεραπεία.="" ##="" p="">< 0,01,="" έναντι="" της="" ομάδας="" που="" υποβλήθηκε="" σε="" αγωγή="" με="">

2.4. PhGs Ανέστρεψε το H2O2-Προκαλούμενη μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης του HO-1, του NQO1, του GCLC και του GCLM

Τα HO{{{0}}, NQO1 και η λιγάση γλουταμινικής κυστεΐνης (GCL) είναι σημαντικά κυτταρικά αντιοξειδωτικά ένζυμα και τα HO-1, NQO1 και καταλυτικές ή τροποποιητικές υπομονάδες του GCL (GCLC ή GCLM) είναι Nrf2-ρύθμισε γονίδια κατάντη [27]. Η έκφραση πρωτεΐνης των HO-1, NQO1, GCLC και GCLM παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία. Βρέθηκε μια προφανής διαφορά μεταξύ της έκφρασης πρωτεΐνης του HO-1 και του NQO1 με ή χωρίς H2O2 (Εικόνα 6A-C) (p < 0.01).="" τα="" phgs="" (0.1="" και="" 10="" p^g/ml)="" ανέστρεψαν="" την="" προκαλούμενη="" από="" h2o2-καθοδική="" ρύθμιση="" της="" πρωτεϊνικής="" έκφρασης="" του="" ho{-1="" (εκτός="" από="" τη="" σαλιδροσίδη="" στο="" {{32}="" }.1="" pg/ml),="" nqo1="" (εκτός="" από="" ακτεοσίδη="" σε="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< {{0}}.01).="" το="" h2o2="" μείωσε="" επίσης="" την="" έκφραση="" της="" πρωτεΐνης="" gclc="" και="" gclm="" (ρ="">< 0.05)="" (εικόνα="" 6a,d,e).="" τα="" phgs="" (0.1="" και="" 10="" pg/ml)="" αντέστρεψαν="" το="" h2o2-προκαλώντας="" μείωση="" της="" έκφρασης="" πρωτεΐνης="" του="" gclc="" (εκτός="" από="" εχινακοσίδη="" σε="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01)="" και="" gclm="" (εκτός="" από="" τη="" σαλιδροσίδη="" στα="" 0,1="" pg/ml)="" (ρ="">< 0,01).="" στη="" συνέχεια,="" οι="" χημικοί="" αναστολείς="" για="" ho{-1="" χρησιμοποιήθηκαν="" για="" την="" περαιτέρω="" αξιολόγηση="" του="" ρόλου="" των="" αντιοξειδωτικών="" ενζύμων="" στη="" ρύθμιση="" της="" προστασίας="" των="" phg="" από="" την="" επαγόμενη="" από="" h2o2-κυτταροτοξικότητα.="" τα="" phg="" (0,1="" και="" 10="" pg/ml)="" απέτρεψαν="" την="" επαγόμενη="" από="" h2o2-κυτταροτοξικότητα,="" αλλά="" αυτή="" η="" προστατευτική="" δράση="" αντιστράφηκε="" από="" τον="" αναστολέα="" ho{-1="" znpp="" (p="">< 0,01)="" στα="" 20="" pm="" (εικόνα="" 6f,="" p=""><0,01)>

2.5. Ανάλυση έκφρασης Keap1 και μοριακής σύνδεσης

Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το Keap1 δρα ως κατασταλτική πρωτεΐνη του Nrf2 δεσμεύοντας τον τομέα Neh2 του Nrf2 και στοχεύοντας τον Nrf2 σε μια λιγάση ουβικιτίνης E3 με βάση το Cul για ουβικουιτίνη και επακόλουθη αποδόμηση από το πρωτεάσωμα 26S [28]. Η ικανότητα δέσμευσης στο Keap1 των PhGs αξιολογήθηκε με ανάλυση μοριακής σύνδεσης για να διερευνηθεί ο μηχανισμός υπό την αντιοξειδωτική τους δράση.

Αντιοξειδωτική δράση: CistanchePhGs

3. Συζήτηση

Ερευνήσαμε τη νευροπροστασία των PhGs στην επαγόμενη από H2O2 κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα PC12. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η προεπεξεργασία με PhGs κατέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από το HzOz κυτταροτοξικότητα, μείωσε το ενδοκυτταρικό επίπεδο ROS, βελτίωσε το επίπεδο των ενδοκυτταρικών αντιοξειδωτικών ενζύμων και τελικά ανέστρεψε την κυτταροτοξικότητα που προκάλεσε το H2O2- στα κύτταρα PC12. Επιπλέον, τα PhG αύξησαν τη μεταγραφική ενεργοποίηση του Nrf2, ανέστρεψαν την προκαλούμενη από το HzOz μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης των HO-1, NQO1, GCLC και GCLM. Επιπλέον, τα PhGs έδειξαν πιθανή αλληλεπίδραση με τη θέση δέσμευσης Nrf2 στην πρωτεΐνη Keap1.

Στον τραυματισμό των κυττάρων PC12 που προκαλείται από H2O{1}, η υπεροξείδωση των λιπιδίων, η οποία αναφέρεται στην οξειδωτική αποικοδόμηση των λιπιδίων, αύξησε τη διαπερατότητα των μεμβρανών, οδηγώντας σε κυτταρική βλάβη [29]. Ο σχηματισμός MDA χρησιμοποιείται ευρέως ως δείκτης υπεροξείδωσης λιπιδίων [30]. Το H2O2 ενίσχυσε την παραγωγή ROS και εξάντλησε τα ένζυμα αντιοξειδωτικής άμυνας, όπως το SOD, η καταλάση και το GPx. Αυτή η διαδικασία οδηγεί σε οξειδωτικό στρες [31], το οποίο παίζει βασικό ρόλο στην πρόκληση και την εξέλιξη της πλειονότητας των νευροεκφυλιστικών διαταραχών. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε αυξημένο επίπεδο ROS, μειωμένα ενδοκυτταρικά αντιοξειδωτικά ένζυμα και ενισχυμένη απόπτωση των κυττάρων PC12 μετά τη θεραπεία με H2O2. Η προεπεξεργασία PhGs εξασθένησε σημαντικά την επαγόμενη από το HzOz αύξηση των ενδοκυτταρικών ROS, βελτίωσε τα ενδοκυτταρικά αντιοξειδωτικά ένζυμα και τελικά ανέστρεψε την επαγόμενη από το HzOz κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα PC12.

Kuang et al. [32] ανέφερε ότι η εχινακοσίδη έδειξε σημαντική νευροπροστατευτική επίδραση στην επαγόμενη από H2O2-κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα PC12 μέσω της μιτοχονδριακής αποπτωτικής οδού. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η εχινακοσίδη, η σαλιδροζίδη, η ακτεοσίδη και η ισοακτεοσίδη έδειξαν νευροπροστατευτικά αποτελέσματα ενισχύοντας την αντιοξειδωτική δράση των κυττάρων PC12 επειδή αύξησαν τη μεταγραφική ενεργοποίηση του Nrf2 και ρύθμισαν προς τα πάνω την έκφραση πρωτεΐνης των HO{{6}, NQO1, GCLC και GCLM. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ξεκάθαρα ότι η ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων Nrf2, ιδιαίτερα του HO-1, σε αστροκύτταρα και νευρώνες προστατεύει έντονα από τη φλεγμονή, την οξειδωτική βλάβη και τον κυτταρικό θάνατο. Το σύστημα HO{10}} έχει αναφερθεί ότι είναι πολύ ενεργό στο κεντρικό νευρικό σύστημα και η διαμόρφωσή του προφανώς παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεση των νευροεκφυλιστικών διαταραχών [33]. Πρόσφατες μελέτες διευκρίνισαν επίσης τον ρόλο του Nrf2 στην εξέλιξη και τον κίνδυνο της PD [9] και του Keap1 ως αποτελεσματικού στόχου για την επανενεργοποίηση του Nrf2 στην AD [34]. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν νέα στοιχεία για το Nrf2 ως θεραπευτικό στόχο σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες.

Η ανάλυση μοριακής σύνδεσης έδειξε ότι τα PhGs μπορούσαν να συνδεθούν με το Keap1, με τις ακόλουθες ικανότητες δέσμευσης: εχινακοσίδη > ισοακτεοσίδη > ακτεοσίδη > σαλιδροσίδη. Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, η προεπεξεργασία των PhGs οδήγησε στην πυρηνική μετατόπιση του Nrf2, με την ακόλουθη έκφραση Nrf2 στον πυρήνα: εχινακοσίδη > ισοακτεοσίδη * ακτεοσίδη > σαλιδροζίτη. Υποθέσαμε ότι ο αριθμός των γλυκοσιδών επηρέασε τον πιθανό τρόπο δέσμευσης των PhGs και του Keap1 και ο τρόπος δέσμευσης προκάλεσε περαιτέρω την απελευθέρωση Nrf2 από το Keap1. Αυτή η διαδικασία είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του Nrf2 και των κατάντη γονιδίων και τελικά προστατεύει τα κύτταρα PC12 από το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το H2O2 -.

Νευροπροστατευτικές επιδράσεις του cistanchePhGs

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Χημικές ενώσεις και αντιδραστήρια

Σαλιδροζίτη (Αρ. CAS {{0}}), ακτεοσίδη (Αρ. CAS 61276-17-3), ισοακτεοσίδη (Αρ. CAS 61303-13-7) και εχινακοσίδη (Αρ. CAS {{3} }) αγοράστηκαν από την YYuanye Biotechnology Company (Σαγκάη, Κίνα). Τα PhGs διαλύθηκαν σε PBS για να παραχθεί ένα αποθεματικό διάλυμα 10 mg/mL, το οποίο αποθηκεύτηκε σε -20 βαθμό . Το H2O2 αγοράστηκε από την Aladdin® (Σαγκάη, Κίνα). Το μέσο RPMI-1640 και ο εμβρυϊκός βόειος ορός αγοράστηκαν από την Hyclone (Logan, UT, ΗΠΑ) και 0,5 τοις εκατό τρυψίνης EDTA, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη αγοράστηκαν από την Keyi (Hangzhou, Κίνα). Τα διαγνωστικά κιτ MDA, SOD, MTT και DCFH-DA αγοράστηκαν από το Beyotime Institute of Biotechnology (Nanjing, Jiangsu, Κίνα). Το κιτ διπλής χρώσης Annexin V-FITC/PI αγοράστηκε από τη Solarbio Life Sciences (Πεκίνο, Κίνα). Αντισώματα κατά Nrf2, Histone H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM και π-ακτίνης, αντι-υπεροξειδίου χρένου (HRP) IgG και αντι-κουνελιού-HRP-IgG αγοράστηκαν από την Abcam (Λονδίνο, Η.Β.). Οι αναστολείς του HO-1 και του ZnPP αγοράστηκαν από τη Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Το RNAiso Plus, το κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript™RT με γόμα gDNA και το SYBR® Premix Ex Taq™ II αγοράστηκαν από την Takara (Shiga, Ιαπωνία). Το Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent αγοράστηκε από την Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK). Οι αλληλουχίες Nrf2 siRNA ήταν οι εξής: εμπρός, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; και αντίστροφα, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Εν τω μεταξύ, οι αλληλουχίες siRNA ελέγχου ήταν οι εξής: εμπρός, UUCUCCGAACGUGUCACGU; και αντίστροφα, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Κυτταρικής καλλιέργειας

Η γραμμή φαιοχρωμοκυτώματος επινεφριδίων ποντικού (κύτταρα PC12) ελήφθη από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας, SIBS, (CAS, Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Hyclone) που περιείχε 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (Hyclone), 100 U/mL πενικιλλίνη και 0,1 mg/mL στρεπτομυκίνη στους 37 βαθμούς με 5 τοις εκατό CO2. Το μέσο άλλαζε κάθε δεύτερη μέρα.

4.3. Εκτίμηση βιωσιμότητας κυττάρων

Τα κύτταρα PC12 σπάρθηκαν σε τρυβλία 96-φρεατίων σε 2 x 104 κύτταρα/φρεάτιο. Μετά την προσκόλληση, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με ή χωρίς αναστολέα για 20 λεπτά, επωάστηκαν με ή χωρίς PhGs για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με H2O2 για άλλες 2 ώρες αφού αφαιρέθηκαν τα PhG. Μετά την επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 mg/mL ΜΤΤ για 4 ώρες στους 37 βαθμούς και τα μέσα αφαιρέθηκαν προσεκτικά. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που είχαν σχηματιστεί από επιζώντα κύτταρα διαλύθηκαν σε 150 rL DMSO για να δημιουργήσουν ένα μπλε χρώμα [35] και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm σε συσκευή ανάγνωσης πλακών. Οι έλεγχοι χρησιμοποίησαν την ίδια συγκέντρωση μέσου μόνο με DMSO. Η βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε ως ποσοστό ελέγχου.

Οι συγκεντρώσεις των PhGs (0.1,1,5 και 10 Rg/mL) επιλέχθηκαν ανάλογα με την ανάλυση κυτταροτοξικότητας των PhGs και την αναφερόμενη κυτταροπροστατευτική δράση της εχινακοσίδης [32]. Σύμφωνα με την έκθεση, δεν εμφανίστηκε επίδραση κυτταροτοξικότητας κάτω από 10 Rg/mL και η εχινακοσίδη αναφέρθηκε ότι εμφανίζει κυτταροπροστατευτική δράση στο μοντέλο κυττάρων που έχουν τραυματιστεί με HzOz.

4.4. Δοκιμασία απόπτωσης

Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με κιτ διπλής χρώσης Annexin V-FITC/PI (Solarbio). Τα κύτταρα PC12 σπάρθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων σε 2 x 105 κύτταρα/φρεάτιο. Μετά την προσάρτηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PhGs (0,1 και 10 Rg/mL) για 24 ώρες και επωάστηκαν με H2O2 για άλλες 2 ώρες μετά την αφαίρεση των PhGs. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS, φυγοκεντρήθηκαν δύο φορές στις 1500 rpm για 10 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε 500 rL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Επισημασμένη με FITC Αννεξίνη V (5 rL) και ιωδιούχο προπίδιο.

Συντομογραφίες

GCLC γλουταμινικό-λιγάση κυστεΐνης-καταλυτική υπομονάδα

GCLM γλουταμικό-λιγάση κυστεΐνης-καταλυτικός τροποποιητής υπομονάδας

H2O2 υπεροξείδιο του υδρογόνου

HO-1 αίμη οξυγενάση 1

Πρωτεΐνη συσχέτισης Keap1 Kelch ECH 1

NQO1 NAD(P)H οξειδοαναγωγάση κινόνης 1

Nrf2 πυρηνικός παράγοντας ερυθροειδής 2-σχετιζόμενος παράγοντας 2

PhGs salidroside, acteoside, isoacteoside και echinacoside

ROS αντιδραστικά είδη οξυγόνου

ZnPP ψευδάργυρος πρωτοπορφυρίνη

Εκχύλισμα Cistanche deserticola: PHG του cistanche

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Sun, AY; Chen, YM Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές διαταραχές. J. Biomed. Sci. 1998, 5, 401-414. [CrossRef] [PubMed]

2. Maheshwari, Α.; Micro, MM; Aggarwal, Α.; Sharma, RK; Nandan, D. Μονοπάτια που εμπλέκονται στην απόπτωση των γεννητικών κυττάρων των όρχεων που προκαλείται από H2O2 in vitro. FEBS J. 2009,276, 870-881. [CrossRef] [PubMed]

3. Halliwell, Β. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου και το κεντρικό νευρικό σύστημα. J. Neurochem. 1992, 59, 1609-1623. [CrossRef] [PubMed]

4. Richardson, JS; Subbarao, KV; Ang, LC Σχετικά με τον πιθανό ρόλο της επαγόμενης από τον σίδηρο υπεροξείδωσης ελεύθερων ριζών στον νευρικό εκφυλισμό στη νόσο του Alzheimer. Αννα. NY Acad. Sci. 1992, 648, 326-327. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, DD Μηχανιστικές μελέτες της οδού σηματοδότησης Nrf2-Keap1. Drug Metab. Rev. 2006, 38, 769-789. [CrossRef] [PubMed]

6. Itoh, K.; Tong, KI; Yamamoto, M. Μοριακός μηχανισμός που ενεργοποιεί το μονοπάτι Nrf2-Keap1 στη ρύθμιση της προσαρμοστικής απόκρισης στα ηλεκτρόφιλα. Free Radic. Biol. Med. 2004, 36,1208-1213. [CrossRef] [PubMed]

7. Kong, AN; Owuor, Ε.; Yu, R.; Hebbar, V.; Chen, C.; Hu, R.; Mandlekar, S. Επαγωγή ξενοβιοτικών ενζύμων από το μονοπάτι της κινάσης χάρτη και το στοιχείο απόκρισης αντιοξειδωτικού ή ηλεκτροφίλου (ARE/EpRE). Drug Metab. Rev. 2001, 33, 255-271. [CrossRef] [PubMed]

8. Buendia, Ι.; Michalska, Ρ.; Navarro, Ε.; Gameiro, Ι.; Egea, J.; Leon, R. Nrf2-ARE μονοπάτι: Ένας αναδυόμενος στόχος κατά του οξειδωτικού στρες και της νευροφλεγμονής σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Pharmacol. Εκεί. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. Skibinski, G.; Hwang, V; Ando, ​​DM; Daub, Α.; Lee, ΑΚ; Ravisankar, Α.; Modan, S.; Finucane, MM; Shabby, BA; Το Finkbeiner, S. Nrf2 μετριάζει τον νευροεκφυλισμό που προκαλείται από το LRRK2- και την α-συνουκλεΐνη ρυθμίζοντας την πρωτεόσταση. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2016, 114, 1165-1170. [CrossRef] [PubMed]

10. Jimenez, C.; Riguera, R. Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες στα φυτά: Δομή και βιολογική δραστηριότητα. Nat. Κέντρο. Rep. 1994, 11, 591-606. [CrossRef] [PubMed]

11. Georgiev, Μ.; Alipieva, Κ.; Orhan, Ι.; Abrashev, R.; Denev, Ρ.; Angelova, M. Αντιοξειδωτικές και ανασταλτικές δράσεις χολινεστεράσης του Verbascum xanthophoeniceum Griseb. και οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοζίτες του. Food Chem. 2011, 128, 100-105. [CrossRef] [PubMed]

12. Li, Ν.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Ζ.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Neuroprotective Effects ofCistanches HerbaΘεραπεία σε ασθενείς με μέτρια νόσο Alzheimer/s. Συμπλήρωμα με βάση το Evid. Εναλλακτική. Med. 2015, 2015, 103985. [CrossRef] [PubMed]

13. Liu, YL; Αυτός, WJ; Μο, L.; Shi, MF; Zhu, YY; Pan, S.; Li, XR; Xu, QM; Yang, SL Αντιμικροβιακές, αντιφλεγμονώδεις δραστηριότητες και τοξικολογία φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από τη Monochasma savatieri Franch. πρώην Μαξίμ. J. Ethnopharmacol. 2013,149, 431-437. [CrossRef] [PubMed]

14. Dong, Q.; Yao, J.; Fang, JN; Ding, K. Δομικός χαρακτηρισμός και ανοσολογική δραστηριότητα δύο πολυσακχαριτών που εκχυλίζονται με κρύο νερό απόCistanche deserticola YC Ma. Υδατάνθρακες. Res. 2007, 342, 1343-1349. [CrossRef] [PubMed]

15. Xiong, L.; Mao, S.; Lu, Β.; Yang, J.; Zhou, F.; Hu, Υ.; Jiang, Υ.; Shen, C.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans Flower Extract and Acteoside Protect Against d-Galactose-Induced Aging in a ICR Mouse Model. J. Med. Food 2016, 19, 54-61. [CrossRef] [PubMed]

16. Jiang, Υ.; Mao, S.; Huang, W.; Lu, Β.; Cai, Ζ.; Zhou, F.; Li, Μ.; Lou, Τ.; Zhao, Υ. Προφίλ γλυκοζίτη φαινυλαιθανοειδούς και αντιοξειδωτικές δράσεις του Osmanthusfragrans Lour. Flowers by UPLC/PDA/MS και Model Simulated Digestion. J. Agric. Food Chem. 2016, 64, 2459-2466. [CrossRef] [PubMed]

17. Li, Χ.; Ye, X.; Li, Χ.; Sun, X.; Liang, Q.; Tao, L.; Kang, Χ.; Ο Chen, J. Salidroside προστατεύει από την επαγόμενη από MPP συν απόπτωση σε κύτταρα PC12 αναστέλλοντας την οδό ΝΟ. Brain Res. 2011,1382, 9-18. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhang, L.; Ding, W.; Sun, Η.; Zhou, Q.; Huang, J.; Li, Χ.; Xie, Υ.; Ο Chen, J. Salidroside προστατεύει τα κύτταρα PC12 από την επαγόμενη από MPP συν απόπτωση μέσω ενεργοποίησης της οδού PI3K/Akt. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 2591-2597. [CrossRef] [PubMed]

19. Sheng, GQ; Zhang, JR; Pu, XP; Ma, J.; Li, CL Προστατευτική επίδραση της βερμπασκοσίδης στη νευροτοξικότητα που προκαλείται από το 1-μεθυλ-4- φαινυλοπυριδίνιο σε κύτταρα PC12. Ευρώ. J. Pharmacol. 2002, 451, 119-124. [CrossRef]

20. Wang, Η.; Xu, Υ.; Yan, J.; Zhao, Χ.; Sun, X.; Zhang, Υ.; Guo, J.; Το Zhu, C. Acteoside προστατεύει τα κύτταρα του ανθρώπινου νευροβλαστώματος SH-SY5Y από τραυματισμό κυττάρων που προκαλείται από βήτα-αμυλοειδές. Brain Res. 2009, 1283, 139-147. [CrossRef] [PubMed]

21. Min, D.; Jin, YZ; Yong, J.; Zheng, BL; Yao, HW Echinacoside σώζει τα νευρωνικά κύτταρα SHSY5Y από την επαγόμενη από TNFa απόπτωση. Πηγούνι. Pharmacol. Ταύρος. 2005, 505,11-18.

22. Zhao, Q.; Gao, JP; Li, WW; Cai, DF Νευροτροφικά και νευροδιασωτικά αποτελέσματα της εχινακοσίδης στο υποξεία μοντέλο MPTP ποντικού της νόσου του Πάρκινσον. Brain Res. 2010,1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

23. Koo, KA; Sung, SH; Park, JH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC In vitro νευροπροστατευτικές δράσεις φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από διχώτωμα Callicarpa. Planta Med. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

24. Liu, YG; Li, Χ.; Xiong, C.; Yu, Β.; Pu, Χ.; Ye, XS Συνθετικά παράγωγα γλυκοζιτών φαινυλαιθανοειδών ως πιθανοί νευροπροστατευτικοί παράγοντες. Ευρώ. J. Med. Chem. 2015, 95, 313-323. [CrossRef] [PubMed]

25. Fu, G.; Pang, Η.; Wong, YH Φυσικά απαντώμενοι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες: Πιθανοί οδηγοί για νέα θεραπευτικά. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 2592-2613. [CrossRef] [PubMed]

26. Greene, LA; Tischler, AS Καθιέρωση μιας νοραδρενεργικής κλωνικής σειράς κυττάρων φαιοχρωμοκυτώματος επινεφριδίων αρουραίου που ανταποκρίνονται στον αυξητικό παράγοντα νεύρων. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 1976, 73, 2424-2428. [CrossRef] [PubMed]

27. Liang, QN; Sheng, YC; Jiang, Ρ.; Ji, LL; Xia, YY; Min, Υ.; Wang, ZT Η διαφορά του αντιοξειδωτικού συστήματος γλουταθειόνης στο συκώτι νεοαπογαλακτισμένων και νεαρών ποντικών και η εμπλοκή του στην ηπατοτοξικότητα που προκαλείται από την ισολίνη. Αψίδα. Toxicol. 2011, 85, 1267-1279. [CrossRef] [PubMed]

28. Kobayashi, Α.; Kang, Μ.; Okawa, Η.; Ohtsuji, Μ.; Zenke, Υ; Chiba, Τ.; Igarashi, Κ.; Yamamoto, M. Ο αισθητήρας οξειδωτικού στρες Keap1 Λειτουργεί ως προσαρμογέας για Cul3-Βασισμένη στο E3 Ligase για τη ρύθμιση της πρωτεασωμικής αποικοδόμησης του Nrf2. ΜοΙ. Κύτταρο. Biol. 2004,24, 7130-7139. [CrossRef] [PubMed]

29. Cornelius, C.; Crupi, R.; Calabrese, V; Graziano, Α.; Milone, Ρ.; Pennisi, G.; Radak, Ζ.; Calabrese, EJ; Cuzzocrea, S. Τραυματική εγκεφαλική βλάβη: Οξειδωτικό στρες και νευροπροστασία. Αντιοξειδωτικό. Σήμα οξειδοαναγωγής. 2013, 19, 836-853. [CrossRef] [PubMed]

30. Hou, Ζ.; Luo, W.; Sun, X.; Hao, S.; Zhang, Υ.; Xu, F.; Wang, Ζ.; Liu, B. Το πλούσιο σε υδρογόνο φυσιολογικό ορό προστατεύει από οξειδωτική βλάβη και γνωστικά ελλείμματα μετά από ήπιο τραυματικό τραυματισμό του εγκεφάλου. Brain Res. Ταύρος. 2012, 88, 560-565. [CrossRef] [PubMed]

31. Ansari, MA; Roberts, KN; Scheff, SW Χρονική πορεία οξειδωτικού στρες που προκαλείται από μώλωπες και συναπτικών πρωτεϊνών στον φλοιό σε ένα μοντέλο TBI επίμυος. J. Neurotrauma 2008, 25, 513-526. [CrossRef] [PubMed]

32. Kuang, R.; Sun, Υ.; Yuan, W.; Lei, L.; Zheng, X. Προστατευτικές επιδράσεις της εχινακοσίδης, ενός από τους φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, στην επαγόμενη από H2O2-κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα PC12. Planta Med. 2009, 75, 1499-1504. [CrossRef] [PubMed]

33. Scapagnini, G.; Vasto, S.; Abraham, NG; Caruso, C.; Zella, D.; Fabio, G. Διαμόρφωση του μονοπατιού Nrf2/ARE από τις πολυφαινόλες τροφίμων: Μια διατροφική νευροπροστατευτική στρατηγική για γνωστικές και νευροεκφυλιστικές διαταραχές. ΜοΙ. Neurobiol. 2011, 44, 192-201. [CrossRef] [PubMed]

34. Kerr, F.; Sofolaadesakin, Ο.; Ivanov, DK; Gatliff, J.; Gomez, PB; Bertrand, HC; Martinez, Ρ.; Callard, R.; Snoeren, Ι.; Cochem, HM Direct Keap1-Διαταραχή Nrf2 ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη νόσο Alzheimer/s. PLoS Genet. 2017, 13, e1006593. [CrossRef] [PubMed]

35. Hansen, MB; Nielsen, SE; Berg, K. Επανεξέταση και περαιτέρω ανάπτυξη μιας ακριβούς και ταχείας μεθόδου βαφής για τη μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης/θανάτωσης κυττάρων. J. Immunol. Methods 1989, 119, 203-210. [CrossRef]

36. Press, C. Virtual Screening in Drug Discovery; Crc Press: Boca Raton, Φλόριντα, ΗΠΑ, 2005.

37. Muege, Ι.; Martin, YC; Hajduk, PJ; Fesik, SW Evaluation of PMF scoring in docking ασθενής συνδέτες στην πρωτεΐνη δέσμευσης FK506. J. Med. Chem. 1999, 42, 2498-2503. [CrossRef] [PubMed]

38. Kuntz, Ι.Δ. Blaney, JM; Oatley, SJ; Langridge, R.; Ferrin, TE Μια γεωμετρική προσέγγιση στις αλληλεπιδράσεις μακρομορίου-συνδέτη. J. ΜοΙ. Biol. 1982,161, 269-288. [CrossRef]

39. MD, Ε.; Murray, CW; Auton, TR; Paolini, GV; Mee, RP Εμπειρικές συναρτήσεις βαθμολόγησης: I. Η ανάπτυξη μιας γρήγορης εμπειρικής συνάρτησης βαθμολόγησης για την εκτίμηση της συγγένειας δέσμευσης των προσδεμάτων σε σύμπλοκα υποδοχέα. J. Comput.-Aided ΜοΙ. Des. 1997,11,425-445.

© 2018 από τους συγγραφείς. Δικαιούχος αδείας MDPI, Βασιλεία, Ελβετία. Αυτό το άρθρο είναι ένα άρθρο ανοιχτής πρόσβασης που διανέμεται υπό τους όρους και τις προϋποθέσεις της άδειας Creative Commons Attribution (CC BY) (http:ZZcreativecommons.org/licenses/byZ4.0Z).