Nano Milk Protein-Mucilage Complexes: Characterization and Anticancer Effect Part 1

Για περισσότερες λεπτομέρειες, επικοινωνήστεtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη: ΟαντικαρκινικόΗ δραστηριότητα των φυσικών ενώσεων προσέλκυσε πρόσφατα διεπιστημονική έρευνα. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε η συμπλοκοποίηση των πρωτεϊνών γάλακτος (MP) με βλέννα Isabgol husk (IHM) και Ziziphus Spina Christi mucilage (NabM). Σε αυτό το πλαίσιο, μετρήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των συμπλεγμάτων βλέννας πρωτεΐνης γάλακτος (MPMC) συμπεριλαμβανομένων των δεικτών pH, δείκτη Carr, υδατοδιαλυτότητας και απορρόφησης νερού και μελετήθηκε η συμπεριφορά ροής. Επιπλέον, το προφίλ αμινοξέων, η πεπτικότητα των πρωτεϊνών και το φαινολικό καιφλαβονοειδήΤο περιεχόμενο του MPMC διερευνήθηκε και η μικροδομή των συμπλεγμάτων οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης. οαντιοξειδωτικόκαι αντικαρκινική ισχύ του MPMC έναντι δύο καρκινικών κυτταρικών σειρών, του ανθρώπινου καρκίνου ήπατος HEPG-2 και του καρκίνου του μαστού MCF-7, σε σύγκριση με δύο φυσιολογικές κυτταρικές σειρές, συγκεκριμένα, Bj-1 και MCF{{ 3}}F, δοκιμάστηκαν με τη χρήση ουδέτερου προσδιορισμού πρόσληψης κόκκινου. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το MPMC είχε σαρωτική δράση έναντι των ριζών DPPH, ABTS και HS. Επιπλέον, το MPMC έχει τη δυνατότητα να αποτρέψει τη βλάβη του DNA που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες στην αντίδραση του Type-Fenton. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ουδέτερου κόκκινου έδειξαν σημαντική αναστολή ανάπτυξης τόσο των HEPG-2, MCF-7, ενώ δεν ανιχνεύθηκε σημαντική κυτταροτοξική επίδραση έναντι των Bj-1 και MCF-12F. Τα αποτελέσματα RT-qPCR έδειξαν απόπτωση που διεγείρεται από MPMC όπως αποκαλύπτεται από την ανοδική ρύθμιση των δεικτών γονιδίου προ-απόπτωσης Caspase-3, p53, Bax. Εν τω μεταξύ, το γονίδιο Bcl-2 κατά της απόπτωσης ρυθμίστηκε προς τα κάτω. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στις φυσιολογικές κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με MPMC. Συμπερασματικά, το MPMC μπορεί να θεωρηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική οντότητα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών για τον καρκίνο με συγκρίσιμη δραστηριότητα και ελάχιστες παρενέργειες σε σύγκριση με τις συμβατικές χημειοθεραπείες καρκίνου .

Λέξεις-κλειδιά: πρωτεΐνες γάλακτος; Φλοιό φλοιού Isabgol; Nabeq mucilage; πρωτεΐνες γάλακτος σύμπλοκα βλεννογόνου; αντικαρκινική δράση

Κάντε κλικ για να μάθετε περισσότερα για τα προϊόντα

1. Εισαγωγή

Καρκίνοςείναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σε όλο τον κόσμο με περίπου 10 εκατομμύρια θανάτους το 2020 [1]. Η έγκαιρη διάγνωση και η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων είναι η μόνη ελπίδα για να νικήσουμε τον καρκίνο. Οι συμβατικές θεραπείες για τον καρκίνο όπως η χημειοθεραπεία και η ακτινοβολία είναι σχετικά ακριβές και συνοδεύονται από σημαντικές παρενέργειες.

Επομένως, το επιστημονικό και ερευνητικό ενδιαφέρον τείνει στη χρήση φυσικών ενώσεων (π.χ. πρωτεΐνες, πολυσακχαρίτες και πολυφαινόλες) από τις πηγές τους που έχουν αντικαρκινογόνο δυναμικό καθώς θεωρείται ότι έχουν λιγότερες τοξικές παρενέργειες σε σύγκριση με τις συμβατικές θεραπείες.

Πολυσακχαρίτεςαπό φυτικές πηγές έχουν λάβει πρόσφατα αυξανόμενη προσοχή λόγω των βιοδραστικών τους ιδιοτήτων [2,3]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν ενδιαφερθεί για την απομόνωση βιοδραστικών πολυσακχαριτών και πολυφαινολών από φυσικές φυτικές πηγές όπως φρούτα, λαχανικά, δημητριακά και βότανα λόγω των ευεργετικών φαρμακολογικών τους επιδράσεων [4].

Το Plantago ovata (Psyllium ή Isabgol) και το Ziziphus Spina-Christi (Nabeg ή Sidr) είναι γνωστές πηγές βιοδραστικών πολυσακχαριτών. Τα IHM και NabM επιλέχθηκαν ως πολλά υποσχόμενα βιοενεργά υλικά. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα σύμπλοκα IHM και NabM με πρωτεΐνες γάλακτος βελτίωσαν τη λειτουργία του ήπατος και μείωσαν τον κίνδυνο καρδιαγγειακών παθήσεων[5]. Ο φλοιός Isabgol έχει αποδειχθεί αποτελεσματικός για τη θεραπεία της διάρροιας, της δυσκοιλιότητας, της ελκώδους κολίτιδας, του συνδρόμου ευερέθιστου εντέρου, της υπερχοληστερολαιμίας και του διαβήτη. Επιπλέον, η αντικαρκινική δράση του φλοιού isabgol κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου αποδόθηκε στην περιεκτικότητά του σε φυτικές ίνες, η οποία δρα στη μείωση των επιπτώσεών του μειώνοντας τον χρόνο διέλευσης. Αυτό θα οδηγήσει σε μείωση του μεταβολισμού της χολής από τη μικροχλωρίδα του εντέρου, αραίωση των χολικών οξέων με διόγκωση κοπράνων, μεταβολή του μεταβολισμού των μικροβιακών χολικών οξέων λόγω ζύμωσης ινών, μείωση του pH και παραγωγή λιπαρών οξέων βραχέων αλυσίδων ή με άμεση σύνδεση με τα χολικά οξέα και ως εκ τούτου την πρόληψη του μεταβολισμού τους [6]. Τα κύρια βιολογικά ενεργά συστατικά του Ziziphus Spina-Christi είναι η βιταμίνη C, τα φαινολικά, τα φλαβονοειδή και τα τριτερπενικά οξέα. Οι βιοδραστηριότητές του περιλαμβάνουν αντικαρκινικές, αντιβακτηριακές, αντιδιαβητικές, αντιπολλαπλασιαστικές και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες [7. Ο φλοιός Isabgol και οι καρποί Nabeq χρησιμοποιούνται για την παραγωγή βλεννώδους φλοιού Isabgol (IHM) και Nabeq mucilage (NabM), αντίστοιχα [5].

Από την άλλη πλευρά, οι θεραπείες με βάση τις πρωτεΐνες για τον καρκίνο έχουν αποκτήσει αυξανόμενο ενδιαφέρον λόγω βασικών χαρακτηριστικών όπως η χαμηλή κυτταροτοξικότητα, η ισχυρή ειδικότητα και η ευκολία τροποποίησης [8]. Εκτός από την παροχή των θρεπτικών αναγκών σε βασικά αμινοξέα, οι πρωτεΐνες γάλακτος συγκαταλέγονται στα βιολογικά μακρομόρια που έχουν πολλές λειτουργικές ιδιότητες όπως αντιοξειδωτικές, ανοσοτροποποιητικές, αντιδιαβητικές, αντιμικροβιακές και αντικαρκινικές ιδιότητες [9,10]. Για παράδειγμα, η αντικαρκινική δραστηριότητα των πεπτιδίων που προέρχονται από γαλακτοκομικά προϊόντα (δηλ., -καζομορφίνες που απομονώνονται από -καζεΐνη και 1-θραύσματα καζεΐνης 90-95 και 90-96[Arg90-Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) που εντοπίστηκε στο βόειο γάλα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες του γάλακτος δεν είναι μόνο θρεπτικής αξίας αλλά έχουν επίσης τη δυνατότητα για πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου [11,12]

Η συμπλοκοποίηση μεταξύ πρωτεϊνών γάλακτος και πολυσακχαριτών, όπως το σύμπλεγμα πρωτεϊνών γάλακτος-χιτοζάνης, παρήχθη προηγουμένως ως μια προσπάθεια ενίσχυσης των λειτουργικών ιδιοτήτων των φυσικών συστατικών τους [13]. Λόγω της διαθεσιμότητας και της ευκολίας παρασκευής, τέτοια σύμπλοκα έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν στην ανάπτυξη λιγότερο δαπανηρών αντικαρκινικών θεραπειών. Τέτοια θεραπευτικά θα είναι λιγότερο δαπανηρά και θα παρουσιάζουν συγκρίσιμη δραστικότητα με τα επί του παρόντος χρησιμοποιούμενα χημειοθεραπευτικά.

Η μη ομοιοπολική δέσμευση μέσω υδρόφοβων και ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων είναι οι πρωταρχικοί παράγοντες στη συσχέτιση των πρωτεϊνών γάλακτος μεπολυσακχαρίτες[14]. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν εκπληκτική ανθεκτικότητα στην αλληλεπίδραση με άλλα συστατικά στο εύρος του pH από 2 έως 11. Σε ένα συγκεκριμένο pH, η επιφανειακή αντιδραστικότητα της πρωτεΐνης αυξάνεται μέσω του ξεδιπλώματος της δομής της πρωτεΐνης [15].

Σε αυτό το πλαίσιο, η ομάδα μας έχει επικεντρωθεί πρόσφατα στον λειτουργικό ρόλο των συμπλεγμάτων πρωτεΐνης γάλακτος στην ανθρώπινη υγεία. Ωστόσο, τα σύμπλοκα πρωτεϊνών γάλακτος με IHM ή NabM, έχουν επιδείξει αντιυπερλιπιδαιμικές και ηπατοπροστατευτικές ιδιότητες [9]. Έτσι, με βάση προηγούμενες μελέτες, υποστηρίχθηκε ότι τα σύμπλοκα πρωτεΐνης γάλακτος-πολυσακχαρίτη μπορεί να έχουν ενδιαφέρουσα αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, καμία δημοσίευση δεν είχε διεξαγάγει μελέτη της αντικαρκινικής δράσης των συμπλεγμάτων πρωτεϊνών γάλακτος με IHM και NabM. Ως εκ τούτου, οι κύριοι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν ο χαρακτηρισμός των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των συμπλοκών βλέννας πρωτεΐνης γάλακτος που παρήχθη πρόσφατα, συμπεριλαμβανομένου του προφίλ αμινοξέων και των λειτουργικών ιδιοτήτων αυτών των συμπλεγμάτων. Επιπλέον, διερευνήθηκε η αντικαρκινική δράση συμπλεγμάτων πρωτεΐνης γάλακτος με βλέννα IHM και NabM έναντι δύο ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων (MCF7 και HEPG2) σε σύγκριση με μη καρκινικές κυτταρικές σειρές (Bi-1 και MCF-12F ). Ρίχνουμε επίσης φως στον τρόπο δράσης των παραγόμενων συμπλοκών βλεννογόνου πρωτεϊνών γάλακτος.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Φασματοσκοπία υπέρυθρων μετασχηματισμού Fourier (FTIR).

Τα υπέρυθρα φάσματα των IHM, MP και MP/IHM απεικονίζονται στο Σχήμα 1Α. Το φάσμα του IHM έδειξε τη χαρακτηριστική ζώνη των αραβινοξυλανών στα 100-1200 cm-1 και τις ζώνες για τις ομάδες αμιδίου Ι και αμιδίου II στα 1550 και 1650 cm-1, αντίστοιχα. Το φάσμα MP εμφανίζει ζώνες στα 1700-1600 και 1200-900 cm-I που αντιστοιχούν στο αμίδιο I (κυρίως το τέντωμα C=Ο των πρωτεϊνών) και τους υδατάνθρακες γάλακτος, αντίστοιχα [16]. Οι προαναφερθείσες κορυφές IHM και MP ήταν δεσμευμένες στο φάσμα του συμπλέγματος IHM/MP. Παρομοίως, οι χαρακτηριστικές ζώνες του γαλακτουρονικού οξέος στο NabM διατηρήθηκαν στο φάσμα του συμπλόκου NabM/MP (Εικόνα 1Β). Αυτό θα υποδείκνυε την απουσία χημικής αλληλεπίδρασης μεταξύ πολυσακχαριδικής βλέννας και MP και έτσι θα επιβεβαίωνε τον προτεινόμενο μηχανισμό ηλεκτροστατικής έλξης μεταξύ MP και πολυσακχαριτών (IHM και NabM). Τέτοιες παρατηρήσεις είναι σύμφωνες με εκείνες των Vukic et al, οι οποίοι ανέφεραν τον σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ των πρωτεϊνών του γάλακτος ορού γάλακτος και της πηκτίνης μέσω ηλεκτροστατικών και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων που οδήγησαν σε καλή συνοχή του συμπλόκου [17].

2.2. Φυσικοχημικές και Λειτουργικές Ιδιότητες MP και MPMC

Οι τιμές της χύδην πυκνότητας (BD), της πυκνότητας (TD), του δείκτη Carr και των μετρήσεων του pH παρατίθενται στον Πίνακα 1. Το BD και το TD του MP ήταν υψηλότερα από το IHM και το IHM είχε τη χαμηλότερη πυκνότητα όγκου και μέτρησης των δειγμάτων που δοκιμάστηκαν . Ομοίως, το σύμπλεγμα MP/IHM είχε σημαντικά (σελ<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

Το WSI και το WAI είναι σημαντικά λειτουργικά χαρακτηριστικά στην τεχνολογία τροφίμων. Ο Πίνακας 1 δείχνει ότι το WSI και το WAI του MP αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη συμπλοκοποίηση με IHM και NabM. Αυτό ήταν πιθανότατα επειδή τα υλικά με βάση το Isabgol είναι εξαιρετικά υδατοδιαλυτά με παχυντικό αποτέλεσμα μετά την προσθήκη επαρκών ποσοτήτων νερού [19]. Επιπλέον, οι Qaisrani et al. ανέφεραν ότι οι αραβινοξυλάνες του φλοιού Isabgol έχουν ικανότητα συγκράτησης νερού έως και δεκαπλάσια από αυτή του ξηρού βάρους τους [20]. Επιπλέον, το MP/IHM έχει υψηλότερο WSI και WAI από το MP/NabM αφού το IHM έχει υψηλότερο WSI και WAI από το NabM. Επιπλέον, η αύξηση του ποσοστού WSI για το MPMC σε σύγκριση με το MP οδήγησε σε αύξηση της διασποράς των ενεργών συστατικών-στόχων κατά τη χρήση τους σε θεραπευτικά ζητήματα [21]. Αυτό ήταν σαφές στα αντικαρκινικά αποτελέσματα που έδειξαν ότι αυτά τα σύμπλοκα έχουν κυτταροτοξική δράση από το MP.

2.3. Βιοενεργά συστατικά

2.3.1. Φαινολικές Ενώσεις PHM και NabM

Τα τρόφιμα περιέχουν πολύ σημαντικές βιοδραστικές ενώσεις (δηλαδή, φαινολικά και φλαβονοειδή) που δρουν ως αντιοξειδωτικές και αντικαρκινικές ιδιότητες. Η ανάλυση HPLC επιβεβαίωσε και ποσοτικοποίησε την παρουσία πολλών φαινολικών ενώσεων σε Nab και IHM όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Τα αποτελέσματα δείχνουν την υψηλή περιεκτικότητα σε διάφορες βιολογικά δραστικές ενώσεις όπως γαλλικό οξύ (177,96 mg/Kg), κατεχόλη (13,87 mg/Kg) p-Υδροξυ βενζοϊκό οξύ (24,02 mg/Kg), Κατεχίνη (5,93 mg/Kg) και ρουτίνη (123,70 mg/Kg) σε εκχύλισμα PHM και κατεχόλη (410,72 mg/Kg) π-υδροξυβενζοϊκό οξύ (426,71 mg/Kg) Χλωρικό (72,05 mg/Kg) Ρουτίνη (1750,57 mg/Kg), και δεντρολίβανο (1771,72 mg/Kg) σε NabM (Εικόνα 2Α, Β). Το περιεχόμενο αυτών των ενώσεων είναι πολύ σημαντικό για τα οφέλη για την υγεία. Η αντικαρκινική δράση των φαινολικών ενώσεων αναφέρθηκε προηγουμένως. Αυτή η επίδραση αποδόθηκε κυρίως στην αντιοξειδωτική δράση αυτών των ενώσεων.

2.3.2. Ολική φαινολική, φλαβονοειδής και αντιοξειδωτική δράση των MP και MPMC

Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι οι ενώσεις που παρουσιάζουν αντιοξειδωτικές ιδιότητες εμφανίζουν ως επί το πλείστον αντικαρκινική δράση[22]. Η ολική περιεκτικότητα σε φαινολικό (ΤΡ) και ολικό φλαβονοειδές (TF) προσδιορίστηκε σε NabM, IHM, MP και τα σύμπλοκά τους (Εικόνα 3Α, Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα TP και TF ήταν υψηλότερα σε NabM και MP/NabM σε σύγκριση με τα IHM και MP/IHM. Ωστόσο, τα περιεχόμενα TP και TF ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε MP σε σύγκριση με MPC. Αυτά τα αποτελέσματα ήρθαν σε συμφωνία με δεδομένα που αναφέρθηκαν από τους Singh et al.[23] ο οποίος διαπίστωσε ότι η TP και η TF του NabM ήταν 1,6 GAE mg/100 g ξηρού βάρους και 47 mg CE/100 g ξηρού βάρους, αντίστοιχα. Τα σύμπλοκα MP/NabM και MP/IHM παρουσίασαν σημαντική αύξηση 309 τοις εκατό και 59 τοις εκατό στο TP και 476 τοις εκατό και 123 τοις εκατό στο TF σε σύγκριση με το MP, αντίστοιχα. Η σύζευξη του MP με το IHM και το NabM οδήγησε σε απώλεια 23 τοις εκατό και 36 τοις εκατό του TPC που αντιστοιχεί στο IHM και στο NabM, αντίστοιχα. Το TF μειώθηκε κατά 44 τοις εκατό στο IHM και 46 τοις εκατό στο NabM όταν συνδυάστηκε με MP. Αυτό πιθανότατα οφειλόταν στο χαμηλό TP και TF του MP.

Η πιθανή δραστηριότητα δέσμευσης ριζών του MP/IHM και του MP/NabM σε σύγκριση με το MP που χρησιμοποιεί DPPH, ABTS και HS απεικονίζεται στο Σχήμα 3C-E. Τα δεδομένα που προέκυψαν από τη δράση των τριών αντιοξειδωτικών είχαν παρόμοια τάση υποδεικνύοντας ότι το NabM εμφάνισε υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση από το IHM και αυτό είναι στο πλαίσιο των αποτελεσμάτων των φαινολικών και

περιεκτικότητα σε φλαβονοειδή. Η αντιοξειδωτική ικανότητα του MP αυξήθηκε μετά από συμπλοκοποίηση με NabM και IHM. Με εξαίρεση τον προσδιορισμό ABTS, η αντιοξειδωτική δράση του NabM αυξήθηκε με σύζευξη με MP. Η αντιοξειδωτική δράση έδειξε ότι το MPMC είχε υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση σε σύγκριση με το MP. Η υπόθεσή μας δείχνει μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ MP και πολυσακχαριτών που οδηγεί στην απόκτηση της πιθανής αντιοξειδωτικής δράσης όπως περιγράφεται από τους Li et al. [24]. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας σάρωσης και της περιεκτικότητας σε φαινολικά/φλαβονοειδή 5]. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι παράγονται νέα βιοενεργά πεπτίδια εμπλουτισμένα με αμινοξέα που περιέχουν θείο, εξηγώντας την υψηλή αντιοξειδωτική δράση του MPMC σε σύγκριση με τα μη συμπλεγμένα συστατικά. Επιπλέον, τα μικρά πεπτίδια απελευθερώνονται σε κλάσματα ορού γάλακτος επηρεάζοντας τις υψηλές αντιοξειδωτικές ιδιότητες [4]. Τέλος, η περιεκτικότητα σε φαινολικά και φλαβονοειδή επηρεάζει διαφορετικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια δοκιμών in vitro κυτταροκαλλιέργειας, αυτές οι δραστηριότητες και μηχανισμοί παρατηρήθηκαν. Οι αντιοξειδωτικές και αντικαρκινικές δραστηριότητες των φαινολικών αποδίδονται σε διπλούς δεσμούς και υποκαταστάσεις υδροξυλίου στους αρωματικούς δακτυλίους [25].

2.4. Προφίλ αμινοξέων MP και MPMC

Τα προφίλ αμινοξέων των MP, NabM, MP/IHM και MP/NabMare απεικονίζονται στο Σχήμα 4. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα προφίλ αμινοξέων του MP και των συμπλόκων του με τα IHM και NabM. Αυτό έδειξε ότι η μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση του MP με την βλέννα πολυσακχαρίτη δεν άλλαξε τη σύνθεση των πρωτεϊνών γάλακτος. Τα αποτελέσματα δείχνουν την υψηλή περιεκτικότητα σε γλουταμικό οξύ σε MP και MPMC (Εικόνα 4) [26].

2.5. Ρεολογικές ιδιότητες MP και MPMC

2.5.1.Φαινόμενο ιξώδες

Το Σχήμα S1 δείχνει το ιξώδες των δειγμάτων πρωτεΐνης σε διαφορετικές τιμές rpm. Το IHM και το NabM είχαν υψηλό ιξώδες σε αργή περιστροφή, αλλά το ιξώδες μειώθηκε σημαντικά καθώς αυξανόταν η ταχύτητα περιστροφής. Αυτά τα ευρήματα συμφωνούσαν με τους Chen και Che, οι οποίοι κατέγραψαν ότι το φαινομενικό ιξώδες της υδατοδιαλυτής βλέννας της πράσινης λεκάνης (Monostroma iridium) μειώθηκε αυξάνοντας τον ρυθμό διάτμησης [27].

Τα αποτελέσματα στο Σχήμα S1 καταδεικνύουν επίσης ότι η συμπλοκοποίηση του MP με IHM και NabM οδήγησε σε σημαντική αύξηση (p Λιγότερο ή ίσο με 0.05) στο φαινομενικό ιξώδες του MP. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στις μοναδικές ιδιότητες του IHM (υδροκολλοειδές υλικό) το οποίο έχει μια επίδραση ενίσχυσης του ιξώδους [28].

2.5.2. Συμπεριφορά ροής

Η συμπεριφορά ροής (καμπύλες διατμητικής τάσης/ρυθμού διάτμησης) των πρωτεϊνών γάλακτος και των συμπλόκων τους απεικονίζεται στο Σχήμα S2. Με την αύξηση του ρυθμού διάτμησης, η διατμητική τάση αυξήθηκε. Μετασχηματίζοντας τα δεδομένα διατμητικής τάσης και ρυθμού διάτμησης στην εξίσωση νόμου ισχύος, οι τιμές του δείκτη συνέπειας ροής (K) και του δείκτη συμπεριφοράς ροής (n) φαίνονται στον Πίνακα S1. Το IHM και το MP/IHM είχαν τον υψηλότερο δείκτη συνέπειας ροής. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο υψηλό ιξώδες του υδατοδιαλυτού βλεννογόνου του IHM λόγω της υψηλής ικανότητάς του να συγκρατεί νερό και να σχηματίζει πηκτή σε ένα υδατικό μέσο. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι τα IHIM, NabM και MP/IHM είχαν συμπεριφορά αραίωσης διάτμησης (μη νευτώνεια ρευστά) με χαμηλή τιμή n που κυμαίνεται από 0.25 έως 0.64. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τους Thanatcha και Pranee που μελέτησαν τις φυσικοχημικές ιδιότητες του Ziziphus mauritiana[29]. Από την άλλη πλευρά, η τιμή n του MP ήταν περίπου 1(0.99) υποδεικνύοντας Νευτώνεια ροή. Ομοίως, η τιμή n για το σύμπλεγμα MP/NabM ήταν 0.95 όπως φαίνεται στον Πίνακα S1.

2.6.Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης MP και MPMC

Η θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της θερμικής σταθερότητας του MP και των συμπλόκων του με IHIM και NabM. Τα θερμογράμματα των MP και MPMC απεικονίζονται στο Σχήμα S3 και οι παράμετροι DSC παρέχονται στον Πίνακα 2. Παρατηρήθηκε ότι δεν υπήρχε σαφής ενδόθερμη κορυφή στο θερμόγραμμα MP, αλλά υπήρχε μια εμφανής ενδόθερμη κορυφή για MP/IHM και ευρεία ενδόθερμη κορυφή για MP/NabM. Αυτό πιθανώς οφείλεται στη σταδιακή εξάλειψη του ελεύθερου νερού, στο σημείο τήξης του NabM, στην αργή ζελατινοποίηση και στη μετουσίωση της πρωτεΐνης [30].

Σημειώθηκε επίσης ότι το MPMC ήταν πιο σταθερό στη θερμότητα από τη μη συμπλοκοποιημένη πρωτεΐνη όπως παρατηρείται από τη χαμηλή θερμοκρασία μετουσίωσης του MP (101,44 βαθμοί) σε σύγκριση με τα MP/IHM και MP/NabM (148,24 και 121,4 βαθμοί, αντίστοιχα) όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Επιπλέον, η θερμοκρασία αποδόμησης του MP καταγράφηκε στους 302,3 βαθμούς, ενώ δεν παρατηρήθηκε υποβάθμιση του MPMC με αύξηση θερμοκρασίας έως και 350 C. Αυτά τα ευρήματα συμφωνούσαν με αρκετές μελέτες, οι οποίες διαπίστωσαν ότι η θερμική σταθερότητα των πρωτεϊνών γάλακτος αυξήθηκε από την αλληλεπίδραση με φαινολικές ενώσεις που εμπόδιζαν τη συσσώρευση πρωτεϊνών [2,31].

Η θερμότητα που περνά μέσα ή έξω από το σύστημα κατά τη διάρκεια μιας αντίδρασης είναι η ενθαλπία (AH). Η υψηλότερη ενθαλπία των MP/IHM και MP/NabM σε σύγκριση με εκείνη του μη συμπλεγμένου MP θα μπορούσε να οφείλεται στην πιθανή χημική αντίδραση μεταξύ πρωτεϊνών γάλακτος (ορός γάλακτος και καζεΐνη) και μεταξύ πρωτεϊνών γάλακτος και πολυσακχαριτών σε υψηλή θερμοκρασία (αντίδραση Maillard)[ 31.

2.7.Ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (TEM) MP και MPMC

Το Σχήμα 5 δείχνει τη μικροδομή των IHM, NabM, MP και MPMC. Διαπιστώθηκε ότι το μέγεθος σωματιδίων του MPMC ήταν στην περιοχή νανο(114-250 nm) και ήταν μικρότερο από το μέγεθος σωματιδίων του MP(191-300 nm). Επιπρόσθετα, το TEM του MPMC (Εικόνα 5D, E) αποκάλυψε το διακλαδισμένο σχέδιο των σχηματισθέντων συμπλεγμάτων. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στην ηλεκτροστατική έλξη μεταξύ πρωτεϊνών γάλακτος και πολυσακχαριτών Goh, et al. [32]. Επιπλέον, η μεγαλύτερη διακλαδισμένη δομή του MP/IHM σε σύγκριση με το MP/NabM μπορεί να είναι υπεύθυνη για το υψηλότερο ιξώδες του, όπως φαίνεται στο Σχήμα S1.

2.8. Βιολογικές Μελέτες για MP και MPMC

2.8.1. Αντικαρκινική Δραστηριότητα MP και MPMC

Η κυτταροτοξική επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων (1, 5, 10 και 20 ug/mL) MP και MPMC σε κύτταρα HepG-2 και MCF-7 σε σύγκριση με MCF-12F και Bij{ {7}} φυσιολογικά κύτταρα απεικονίζονται στα Σχήματα 6 και 7. Το MPMC παρουσίασε αντικαρκινική επίδραση σε κύτταρα HepG-2 και MCF-7 Σχήμα 6Α, Β, αντίστοιχα. Η καμπύλη που ανταποκρίνεται στη δόση έδειξε μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε απόκριση σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Από την άλλη πλευρά, δεν παρατηρήθηκε σημαντική κυτταροτοξική επίδραση των MP και MPMC στα φυσιολογικά κύτταρα Bj{-1 και MCF-12F (Εικόνα 6C, D). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι το MP/NabM είχε υψηλότερη αντικαρκινική δράση έναντι των καρκινικών κυτταρικών γραμμών HepG-2 και MCF-7, με τιμές IC50 5,13 και 10,07 ug/mL, αντίστοιχα. Επιπλέον, το MP/IHM επέδειξε μέτρια κυτταροτοξική δράση έναντι των καρκινικών κυτταρικών σειρών σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους. Συνολικά, τα κυτταροτοξικά δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η συμπλοκοποίηση MP με IHM και NabM ενισχύει σημαντικά την αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με τις μη συμπλοκοποιημένες πρωτεΐνες γάλακτος, όπως φαίνεται στον Πίνακα 3. Ήταν επίσης προφανές ότι τα κύτταρα Hep G-2 ήταν πιο ευαίσθητα σε MP και MPMC σε σύγκριση με τα κύτταρα MCF-7 όπως εκδηλώνεται από τις χαμηλότερες τιμές του IC50.

Η αντικαρκινική δράση των αντικαρκινικών πεπτιδίων που προέρχονται από πρωτεΐνη γάλακτος έχει αναφερθεί στο παρελθόν. Σε αυτό το πλαίσιο, οι Jeong και Hong [33] παρατήρησαν ότι τα υδρολύματα θρυψίνης της -λακταλβουμίνης είχαν κυτταροτοξική επίδραση στον καρκίνο του ανθρώπινου οστού SJSA-1, στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου HCT 116 και στις κυτταρικές σειρές NCI-N87 του ανθρώπινου καρκίνου του στομάχου. Διαπιστώθηκε ότι η ο-λακταλβουμίνη αλληλεπιδρά με τους ρυθμιστές της κυτταρικής επιφάνειας και μεταβάλλει τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων, το ενδοκυτταρικό ασβέστιο και τον ρυθμό μεταφοράς ασβεστίου [34]. Αξίζει να σημειωθεί ότι η βόεια λακτοφερρίνη προκάλεσε απόπτωση στα κύτταρα MCF7 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο [35]. Επιπλέον, τα κλάσματα πρωτεΐνης καζεΐνης και ορού γάλακτος του γάλακτος παρουσίασαν αντικαρκινικά αποτελέσματα σε ένα ζωικό μοντέλο καθώς και in vitro αντιπολλαπλασιαστική δράση [36]. Επιπλέον, οι Elzoghby et al.[37] ανέφερε ότι τα νανοσωματίδια καζεΐνης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ενθυλάκωση του υδρόφοβου αντικαρκινικού φαρμάκου, τη φλουταμίδη, για τον έλεγχο της απελευθέρωσης του φαρμάκου, τη βελτίωση της αντικαρκινικής του δράσης και τη μείωση της ηπατοτοξικότητάς του.

Η αντικαρκινική δράση των IHIM και NabM είχε αναφερθεί προηγουμένως [6,38]. Η κυτταροτοξική δράση του MP και του MPMC μπορεί να αποδοθεί στην παρουσία αμινοξέων όπως η γλουταμίνη, η αργινίνη και η κυστεΐνη, τα οποία αναφέρεται ότι παρουσιάζουν αντικαρκινική δράση έναντι του καρκίνου του παχέος εντέρου [39]. Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την υψηλή περιεκτικότητα του MPMC σε γλουταμικό οξύ (Εικόνα 5).

2.8.2. Προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεϊνών p53, Bax, Caspase-3 και Bd-2

Προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός κυτταροτοξικότητας του MPMC, το επίπεδο των πρωτεϊνών δεικτών απόπτωσης p53, Bax, Caspase-3 και Bcl-2 προσδιορίστηκε σε HepG-2, MCF-7 , Bj-1 και MCF-12F κυτταρικές σειρές που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ICs0 του MPMC (Εικόνα 8). Το επίπεδο των προ- και αντι-αποπτωτικών δεικτών σχετίζεται με την πρόκληση απόπτωσης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές [40,41]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η MP/NabM και η MP/IHΜεγαλύτερη απόπτωση σε HepG-2 και MCF-7, αλλά όχι σε κυτταρικές σειρές MCF-12F και Bj{-1. Το επίπεδο της κασπάσης-3, p53, Bax αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Εικόνα 8), ενώ η πρωτεΐνη Bcl-2 μειώθηκε σε όλες τις θεραπείες. Είναι ενδιαφέρον ότι το MP έδειξε επίσης σημαντική μεταβολή στους δείκτες πρωτεΐνης απόπτωσης. Αυτό ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα της αντικαρκινικής μελέτης και θα μπορούσε να αναφέρεται ως η κυτταροτοξική επίδραση ενός αριθμού πεπτιδίων που προέρχονται από πρωτεΐνη γάλακτος όπως συζητήθηκε παραπάνω (Ενότητα 2.8.1).

2.8.3. Προστασία βλάβης DNA από MPMC έναντι οξειδωτικής διάσπασης του πλασμιδίου RNH1

Το πλασμιδιακό DNA RNH1 έχει τρεις μορφές σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης που ταξινομούνται από πάνω προς τα κάτω ως ανοιχτό κυκλικό, γραμμικό και υπερτυλιγμένο κυκλικό DNA. Το οξειδωτικό στρες από το αντιδραστήριο Fenton προκάλεσε βλάβη στο DNA. Στη συνέχεια, το επίπεδο των μορφών DNA μεταβάλλεται. Ωστόσο, οι ανοιχτές κυκλικές και γραμμικές μορφές υποδεικνύουν βλάβη στο DNA και το υπερτυλιγμένο κυκλικό DNA υποδεικνύει μεγαλύτερη δυνατότητα προστασίας. Σε αυτή τη δοκιμασία, δοκιμάσαμε εάν τα MP και MPMC στο IC50 τους μπορούν να προστατεύσουν από την υποβάθμιση της υπερτυλιγμένης κυκλικής μορφής ως απόκριση στο οξειδωτικό στρες. Ως αποτέλεσμα, τόσο το MP/NabM όσο και το MP/IHM έδειξαν υψηλή ικανότητα προστασίας παρόμοια με τον έλεγχο DNA (λωρίδες 3 και 4, Εικόνα 9Α). Από την άλλη πλευρά, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο DNA που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με MP σε σύγκριση με τον έλεγχο DNA και στο DNA που υποβλήθηκε σε επεξεργασία μόνο με αντιδραστήριο Fenton (λωρίδα 5).

2.8.4. Προστασία βλάβης DNA από MPMC έναντι οξειδωτικής διάσπασης του γονιδιωματικού DNA

Χρησιμοποιώντας την τεχνική PCR, εξετάστηκαν οι προστατευτικές ιδιότητες του MPMC στη βλάβη του γονιδιωματικού DNA που προκαλείται από την αντίδραση Fenton. Γενικά, η βλάβη του DNA μειώνει τον αριθμό αντιγράφων ορισμένων γονιδίων, παράγοντας επομένως χαμηλότερη ένταση ζώνης στην ηλεκτροφόρηση γέλης. Δοκιμάστηκε το γονίδιο MTHFR πυκνότητας ζώνης του γονιδιωματικού DNA του αίματος που επωάστηκε με το αντιδραστήριο Fenton με και χωρίς τα IC50 των MP, MP/NabM και MP/IHM. Διαπιστώθηκε ότι τα MP/NabM και MP/IHM (λωρίδες 3 και 4, Εικόνα 9Β) απέτρεψαν την καταστροφή του DNA και στη συνέχεια προστατεύουν τη θέση κοπής του προτύπου MTHFR. Επομένως, παρήχθη υψηλότερη ένταση ζώνης προϊόντος PCR στο πήκτωμα ηλεκτροφόρησης σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες (Εικόνα 9Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αντιοξειδωτική δράση του MPMC ανέστειλε την παραγωγή ελεύθερων ριζών που μεσολαβούσαν στη βλάβη του DNA.

2.8.5. Γονιδιακή έκφραση

Σε συμφωνία με τα δεδομένα που ελήφθησαν από τον δείκτη πρωτεΐνης απόπτωσης, τα αποτελέσματα της RT-qPCR αποκάλυψαν ότι η επώαση των κυττάρων HepG-2, MCF-7 με MP, MP/NabM και MP/IHM προκάλεσε σημαντική ανοδική ρύθμιση του προ- αποπτωτικοί δείκτες mRNA, συγκεκριμένα, Casp3, p53 και Bax, ενώ το επίπεδο έκφρασης του αντι-αποπτωτικού δείκτη Bcl-2 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα κάτω (Εικόνα 10A-D). Οι κασπάσες είναι πρωτεΐνες που παίζουν ζωτικό ρόλο στην έναρξη και διατήρηση της απόπτωσης. Ωστόσο, η ανοδική ρύθμιση της πρωτεΐνης κασπάσης 3 είναι ενδεικτική της εκτέλεσης της κύριας εγγενούς οδού απόπτωσης (Εικόνα 10Α, Β) η οποία χαρακτηρίζεται από την κατάρρευση της μιτοχονδριακής μεμβράνης με την επαγόμενη από το Bax απελευθέρωση κυτοχρώματος c και την ενεργοποίηση της κασπάσης 9 που οδηγεί στην επακόλουθη εμπλοκή της κασπάσης 3 [42]. Η ανοδική ρύθμιση των Casp3, p53 και Bax, μαζί με μείωση της έκφρασης Bcl-2 αποκάλυψε ότι τα MP, MP/NabM και MP/IHM προκάλεσαν απόπτωση. Από αυτή την άποψη, η ανοδική ρύθμιση της ρ53 διεγείρει την έκφραση του Bax, η οποία με τη σειρά της θα προκαλέσει απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, ακολουθούμενη από ενεργοποίηση κασπάσης{-9 και -3. Ωστόσο, το Bcl-2 ως αντι-απόπτωση είναι γνωστό ότι αναστέλλει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c [43], η θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα μεταγραφής mRNA του γονιδίου αντι-αποπτωτικού δείκτη Bcl-2 λόγω Θεραπεία MP/NabM και MP/IHM, η οποία διευκολύνει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c που δεν προκαλείται από το Bax και την επακόλουθη απόπτωση. Σε αυτή τη μελέτη, το MP/NabM προκάλεσε σοβαρή απόπτωση σε σύγκριση με το MP/IHM και το MP όπως παρατηρείται στο (Εικόνα 10). Οι παρατηρούμενες αντικαρκινικές επιδράσεις του MP/NabMor MP/IHM προχωρούν μέσω της διαμόρφωσης της εξαρτώμενης οδού απόπτωσης από την ap53-καθώς τόσο τα επίπεδα πρωτεΐνης όσο και τα επίπεδα μεταγραφής mRNA ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω.

Κάντε κλικ στον σύνδεσμο για περισσότερες πληροφορίες:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049190.html