Μικροφυσιολογικά συστήματα για την ανακεφαλαίωση του άξονα εντέρου-νεφρού

Laura Giordano,^1,3Silvia Maria Mihaila,^1,3Hossein Eslami Amirabadi,^1,2και η Rosalinde Masereeuw

ΧρόνιοςνεφρόΗ νόσος (ΧΝΝ) εμφανίζεται συνήθως παράλληλα με άλλες συννοσηρότητες, υπογραμμίζοντας την υποκείμενη πολύπλοκη παθοφυσιολογία που πιστεύεται ότι ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από το αμφίδρομο έντερο-νεφρόστιχομυθία. Συνδυάζοντας τις προόδους στη μηχανική ιστών, την κατασκευή, τα μικρορευστικά και τους βιοαισθητήρες, τα μικροφυσιολογικά συστήματα (MPS) έχουν αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενες προσεγγίσεις για την εξομοίωση της in vitro διασύνδεσης πολλαπλών οργάνων, ενώ αντιμετωπίζουν τους περιορισμούς των ζωικών μοντέλων. Η μίμηση των (παθο)φυσιολογικών καταστάσεων του άξονα εντέρου-νεφρού in vitro απαιτεί ένα MPS που μπορεί να προσομοιώσει όχι μόνο αυτή την άμεση αμφίδρομη συνομιλία αλλά και τη συμβολή άλλων φυσιολογικών συμμετεχόντων, όπως το ήπαρ και το ανοσοποιητικό σύστημα. Συζητάμε τις πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα που θα μπορούσαν ενδεχομένως να οδηγήσουν σε in vitro μοντελοποίηση του άξονα εντέρου-νεφρού στη ΧΝΝ.

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com

Το Cistanche tubulosa αποτρέπει τη νεφρική νόσο, κάντε κλικ εδώ για να λάβετε το δείγμα

Χρόνια Νεφρική Νόσος: Μεταβολική Διαταραχή με Διαταραχή Διαοργανικής και Διαοργανιστικής Σηματοδότησης

Χρόνιοςνεφρόνόσος (ΧΝΝ) είναι η πιο διαδεδομένηνεφρόασθένεια και χαρακτηρίζεται από τη σταδιακή απώλεια της λειτουργίας των οργάνων με την πάροδο του χρόνου, η οποία μειώνει την ικανότητα φιλτραρίσματος των μεταβολικών αποβλήτων από το αίμα (Πλαίσιο 1). Οι νεφροί έχουν πολλές εξαιρετικά εξειδικευμένες λειτουργίες, όπως διήθηση αίματος και ενεργή έκκριση για την απομάκρυνση των μεταβολικών αποβλήτων, επαναρρόφηση βασικών θρεπτικών συστατικών, διατήρηση όγκου αίματος και ομοιόστασης ηλεκτρολυτών και μεταβολική και ενδοκρινική δραστηριότητα [1].

Η περίπλοκη και αινιγματική παθοφυσιολογία της ΧΝΝ πιστεύεται ότι διαμορφώνεται απόνεφρόσυνομιλία με πολλαπλά όργανα και συστήματα, ιδιαίτερα μέσω αμφίδρομης ενδοοργανικής επικοινωνίας με το γαστρεντερικό σωλήνα, που αναφέρεται ως άξονας εντέρου-νεφρού[2]. Το ανθρώπινο έντερο φιλοξενεί μια σύνθετη κοινότητα μικροβίων που ζουν σε μια συγγενική σχέση με τον ξενιστή τους [3] και παρέχουν σημαντικές και μοναδικές συνεισφορές στον ανθρώπινο μεταβολισμό (βλ. Γλωσσάρι). Στη συμβίωση, η εντερική απορρόφηση διασφαλίζει την πρόσληψη ωφέλιμων μικροβιακών μεταβολιτών, ενώ οι νεφροί διατηρούν την ομοιόσταση αποβάλλοντας δυνητικά τοξικά μεταβολικά τελικά προϊόντα. Αντίθετα, η νεφρική ανεπάρκεια έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση μεταβολιτών που προέρχονται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου (δηλ. ουραιμικές τοξίνες) που οδηγεί στην ανάπτυξη του ουραιμικού συνδρόμου. Αυτή η επιπλοκή συμβάλλει στη δυσβίωση του εντέρου που επηρεάζει δυσμενώς τις φλεγμονώδεις, ενδοκρινικές και νευρολογικές οδούς που εμπλέκονται στην έναρξη και την εξέλιξη της ΧΝΝ (Πλαίσιο 2 και Εικόνα 1)[4]. Συνολικά, η ΧΝΝ μπορεί να θεωρηθεί ως μια μεταβολική διαταραχή που αντανακλά τη διαταραγμένη ενδοοργανική και ενδοοργανική ροή μεταβολιτών και μορίων σηματοδότησης που συνοδεύεται από υπερενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος (Εικόνα 2). Κατά συνέπεια, ο κεντρικός ρόλος της απομακρυσμένης σηματοδότησης εντέρου-νεφρού μέσω ουραιμικών τοξινών [5] εγείρει την ανάγκη για περαιτέρω χαρακτηρισμό του μεταβολισμού του εντέρου στη ΧΝΝ.

Παραδοσιακά,νεφρόΗ έρευνα ασθενειών βασίστηκε σε μεγάλο βαθμό σε κλινικές [6] και μελέτες σε ζώα [7] που προσφέρουν περιορισμένο έλεγχο των πειραματικών παραμέτρων και έχουν υψηλή μεταβλητότητα μεταξύ των ειδών. Λόγω της έλλειψης κατάλληλων πειραματικών μοντέλων in vitro, υπάρχει επί του παρόντος επιτακτική ανάγκη για συστήματα κυτταροκαλλιέργειας που μπορούν να συλλάβουν τις διαφορετικές πτυχές της in vivo λειτουργίας οργάνων μέσω της χρήσης εξαιρετικά ελεγχόμενων και εξειδικευμένων μικροπεριβαλλόντων καλλιέργειας, συμπεριλαμβανομένων τρισδιάστατων ικριωμάτων και μικρορευστών [8. ]. Λαμβάνοντας υπόψη τις προόδους στην πολυκυτταρική καλλιέργεια και τη βιοκατασκευή, την ενσωμάτωση χαρακτηριστικών παρακολούθησης σε πραγματικό χρόνο και τον ανεξάρτητο έλεγχο των πειραματικών παραμέτρων, η καταγραφή των πολυπλοκοτήτων της ανθρώπινης φυσιολογίας in vitro είναι σίγουρα ορατό. Παρέχουμε μια ολοκληρωμένη επισκόπηση των πιο εμβληματικών και πρόσφατων προόδων στον τομέα των τρισδιάστατων μοντέλων in vitro και υπογραμμίζουμε τη σημασία τους για την ανάπτυξη ενός τρισδιάστατου αμφίδρομου συστήματος άξονα εντέρου-νεφρού. Συζητάμε επίσης τα σημαντικά εμπόδια που συνεπάγονται, πώς να τα ξεπεράσουμε και προσφέρουμε νέες γνώσεις για την τρέχουσα κατεύθυνση αυτού του τομέα στο πλαίσιο της ΧΝΝ.

Μικροφυσιολογικά μοντέλα για την αποκάλυψη σύνθετων διασυνδέσεων οργάνων

Η έλευση των κοινωνιολογικών συστημάτων μικρογραφίας (MPS), που αναφέρονται επίσης ως organ-on-chips (OOCs), έχει δημιουργήσει νέες δυνατότητες για τη μελέτη των φυσιολογικών διεργασιών που εμπλέκονται σε μεμονωμένα όργανα και μεταξύ των οργάνων. Αναδύεται μια σειρά διαφορετικών πολλαπλών MPS που στηρίζουν μια προσέγγιση «φυσιώματος-σε-τσιπ» για την προσομοίωση των λειτουργικών μονάδων των οργάνων, καθώς και τη συνομιλία μεταξύ τους, αντί να στοχεύουν στην αναπαραγωγή του πλήρους οργάνου. Από τεχνική άποψη, τα MPS αποτελούνται συχνά από μεμονωμένα ή πολλαπλά μικρορευστικά κανάλια με διαστάσεις διατομής εκατοντάδων μικρομέτρων στα οποία μικροί όγκοι (νανολίτρα σε μικρολίτρα) κυκλοφορούν (επανα). Εξασφαλίζοντας στενή επαφή μεταξύ των κυττάρων, αυτοί οι όγκοι επιτρέπουν την καταγραφή της δυναμικής αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου, εξασφαλίζοντας παράλληλα ελάχιστη κατανάλωση αντιδραστηρίου και αραίωση ένωσης [9,10]. Η προστιθέμενη στρωτή ροή μπορεί να τροφοδοτεί συνεχώς τα κύτταρα με φρέσκα θρεπτικά συστατικά και οξυγόνο ενώ ταυτόχρονα απομακρύνει τα άχρηστα προϊόντα και μπορεί να δημιουργήσει ακριβείς χωροχρονικές χημικές και μηχανικές διαβαθμίσεις στην περιοχή τους [11]. Η φυσική απομόνωση διαφορετικών αναλόγων ιστού επιτυγχάνεται μέσω της διαμερισματοποίησης σε μικροκανάλια που χωρίζονται από λεπτές πορώδεις μεμβράνες ή στρώματα εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) [12].

Η δημιουργία της πλατφόρμας lung-on-a-chip, στην οποία συνδυάστηκαν μηχανικά στελέχη και πολλαπλοί τύποι κυττάρων για να μιμηθούν την αναπνοή του πνεύμονα, πρωτοστάτησε στην ανάπτυξη βιολογικά εμπνευσμένων MPS [13]. Έκτοτε, η πρόοδος στον χειρισμό μικρορευστών κατέστησε δυνατή τη σύνδεση διαφορετικών μοντέλων οργάνων και τον έλεγχο της αλληλεπίδρασής τους σε μία ή περισσότερες συσκευές [14,15]. Οι τελευταίες εξελίξεις στον τομέα μας ωθούν να συζητήσουμε αυτές τις προόδους σε σχέση με τη μοντελοποίηση του εντέρου-νεφρόάξονα στη ΧΝΝ και να διερευνήσουν τις απαιτήσεις των MPS για την υποστήριξη της ενδοοργανικής επικοινωνίας, λαμβάνοντας επίσης υπόψη τη συνεργιστική προσέγγιση του συνδυασμού τους σε μοντέλα silico.

Καθ'οδόν για την αναπαραγωγή του άξονα εντέρου-νεφρού με χρήση MPS

Πολλά συστήματα εντέρου σε τσιπ έχουν καθιερωθεί με την ενσωμάτωση μικρορευστοποιήσεων, μηχανικής ιστών και μικροηλεκτρομηχανικών συστημάτων. Μεταξύ των πιο αντιπροσωπευτικών διαμορφώσεων, το gut-on-a-chip από το Ινστιτούτο Wyss (ΗΠΑ) μιμήθηκε επιτυχώς το δυναμικό ανθρώπινο εντερικό μικροπεριβάλλον μέσω της εφαρμογής φυσιολογικά σχετικών ρευστών και μηχανικών δυνάμεων που μοιάζουν με περισταλτισμό, και αυτές υποστήριξαν τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε λάχνη. - και δομές που μοιάζουν με κρύπτες, ο σχηματισμός μιας παχιάς επιθηλιακής μονοστιβάδας και ενισχυμένη κυτταρική λειτουργία (Εικόνα 3Α) [16-19]. Πρόσφατα, τοπολογικά χαρακτηριστικά αναδείχθηκαν ως καθοριστικά για την κατεύθυνση της λειτουργίας του κυττάρου, αλλά μόνο λίγες μελέτες έχουν προσπαθήσει να αναπαραγάγουν την αρχιτεκτονική της κρύπτης-λάχνης σε μικρορευστικά συστήματα που μπορούν τώρα να ληφθούν εύκολα μέσω της τρισδιάστατης στερεολιθογραφίας υψηλής ανάλυσης [20], της φωτολιθογραφίας [21 ], και μικρο-χύτευση υδρογέλης με σταυροδεσμούς [22]. Επί του παρόντος, η μίμηση δομών που μοιάζουν με εντερικά σωληνάρια έχει αντιμετωπιστεί με καλλιέργεια εντερικών κυττάρων στην κορυφαία πλευρά ενός συστήματος μεμβράνης ανά εύτηκτου κοίλου ίνας [23,24] ή στον αυλό των μικροκαναλιών [25]. Η προσθήκη μιας επικάλυψης ECM και ενός μονόδρομου κορυφαίου υποτρόφου οδήγησε σε έναν ώριμο φαινότυπο του εντερικού σωληνίσκου με δομές που μοιάζουν με λάχνες. Η έκθεση στην εκκρινόμενη τοξίνη Α από το Clostridium difficile, έναν φυσικό παράγοντα λοιμογόνου δράσης του εντέρου και διαταράκτη του εντερικού φραγμού στη δυσβίωση, ή στον μεταβολίτη που προέρχεται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου, την p-κρεσόλη, οδήγησε σε ενισχυμένη διαπερατότητα φραγμού [23,24]. Ταυτόχρονα, η π-κρεσόλη μετατράπηκε σε p-κρεζυλοθειικό και p-κρεζυλογλυκουρονίδιο, τους τελικούς μεταβολίτες που συσσωρεύονται στο πλάσμα κατά την εξέλιξη της ΧΝΝ, πιθανότατα μέσω του μεταβολισμού που διαμεσολαβείται από το κυτόχρωμα450- ακολουθούμενο από σύζευξη, υπογραμμίζοντας έτσι τη συμβολή του το έντερο στη βιομετατροπή μεταβολιτών που προέρχονται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου σε ουραιμικές τοξίνες [23].

Η πολυπλοκότητα και η ποικιλομορφία του εντερικού επιθηλίου μπορεί να ανακεφαλαιωθεί αξιόπιστα χρησιμοποιώντας τρισδιάστατα οργανοειδή ανθρώπινου ιστού [26,27]. Ωστόσο, η χρήση τους έχει αποδειχθεί προκλητική επειδή η κλειστή, εξωτερική τους διαμόρφωση εμποδίζει τις μελέτες μεταφοράς και την έκθεση σε κοινά και παθογόνα βακτήρια. Ωστόσο, ο Thorne και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι, μέσω της ενζυματικής διάστασης των οργανοειδών, τα πρωτογενή εντερικά κύτταρα ήταν σε θέση να αυτο-οργανώνονται και de novo να διαχωρίζονται σε αδιαφοροποίητες ή διαφοροποιημένες περιοχές, σχηματίζοντας τμήματα που μοιάζουν με κόγχες [28]. Με την ενσωμάτωση ενός ξεχωριστού μικροαγγειακού ενδοθηλίου που καλλιεργήθηκε υπό ανεξάρτητη συντροφική και κυκλική παραμόρφωση, αξιολογήθηκαν οι ιδιότητες απορρόφησης αυτών των κυττάρων [29,30]. Πρόσφατα, η συμπερίληψη περιοχών κρύπτης-λάχνης σε ένα επιθήλιο σχήματος σωλήνα με ανά εύτηκτο αυλό αποδείχθηκε ότι διατηρεί στερεότυπα χαρακτηριστικά κυτταρικών μοτίβων με δυνατότητα αυτο-αναγέννησης [31].

Η in vitro μελέτη των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-μικροχλωρίδας έχει παρεμποδιστεί από την αδυναμία των συμβατικών μοντέλων να διατηρήσουν μια βιώσιμη σύνθετη μικροχλωρίδα για αρκετές ημέρες. Αν και η συμβολή της στιβάδας βλέννας στις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-μικροβιώματος έχει συχνά παραβλεφθεί, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι η ενσωμάτωση ενός παχύ στρώματος βλέννας - λειτουργεί ως φυσιολογικός φραγμός μεταξύ των βακτηρίων και του εντερικού επιθηλίου - θα μπορούσε να καθυστερήσει τη βλάβη του φραγμού και την παρακυτταρική διαπερατότητα [32,33]. Αντίστοιχα, το εξελιγμένο μικρορευστικό μοντέλο, HuMiX, επέτρεψε την άμεση συγκαλλιέργεια αναερόβιων βακτηρίων και εντερικών κυττάρων ενσωματώνοντας ένα λειτουργικό στρώμα βλέννας καθώς και παλμική και μηχανική διέγερση (Εικόνα 3Β) [34].

Η πλειοψηφία της μικροχλωρίδας του εντέρου είναι υποχρεωτικά αναερόβια που απαιτούν<0.5% o2="" growth="" conditions="" that="" are="" difficult="" to="" represent="" in="" vitro="" [19,35].="" this="" limitation="" was="" overcome="" by="" engineering="" mpss="" that="" incorporate="" physiologic="" oxygen="" gradients="" and="" support="" the="" dynamic="" interaction="" between="" intestinal="" and="" vascular="" endothelial="" layers.="" the="" chip="" consisted="" of="" an="" upper="" anaerobic="" epithelial="" chamber="" and="" a="" lower="" aerobic="" endothelial="" chamber,="" separated="" by="" a="" polydimethylsiloxane="" (pdms)="" membrane.="" through="" a="" radial="" oxygen="" gradient="" generated="" by="" the="" system,="" intestinal="" cells="" were="" oxygenated="" whereas="" anaerobic="" conditions="" allowed="" microbiota="" growth,="" as="" assessed="" by="" real-time="" monitoring="" via="" integrated="" noninvasive="" oxygen="" sensors="" [19,36].="" similar="" physiological="" hypoxia="" conditions="" were="" achieved="" by="" zhang="" and="" coworkers="" who="" cocultured="" oxygen="" super-sensitive="" bacterial="" species="" using="" a="" differently="" designed="" mps,="" the="" gumi="" (figure="" 3c)="" [37].="" this="" platform="" induced="" a="" steep="" oxygen="" gradient="" through="" the="" addition="" of="" a="" long-term="" continuous="" fellow="" of="" anoxic="" apical="" medium="" and="" aerobic="" basal="" media.="" the="" use="" of="" polysulfone,="" which="" unlike="" pdms="" is="" an="" oxygen-impermeable="" material,="" prevented="" any="" oxygen="">

Η ανάπτυξη τηςνεφρόΤα συστήματα -σε ένα τσιπ ήταν επίσης προκλητικά λόγω της έλλειψης λειτουργικών κυττάρων για να ανακεφαλαιώσουν in vitro την πολυκυτταρική δομή και τη λειτουργική πολυπλοκότητα εντός του νεφρώνα. Αντίστοιχα, σε σχέση με τη συσκευή gut-on-a-chip, η ανάπτυξη τουνεφρό-τα συστήματα σε ένα τσιπ υστερούν σε κάποιο βαθμό. Μέχρι σήμερα, έχουν αναπτυχθεί μοντέλα της φυσιολογίας του σπειραματικού, του εγγύς σωληναρίου και του άπω σωληναρίου, αλλά η ενσωμάτωση όλων των συστατικών σε έναν πλήρη νεφρώνα-σε-ένα-τσιπ μένει να επιτευχθεί [38]. Για να είναι φυσιολογικά σχετικό, εκτός από την κυτταρική πολυπλοκότητα, ένα βιομιμητικόνεφρό-σε ένα τσιπ θα πρέπει να ενσωματώνει (i) αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου όπως αυτές μεταξύ των ποδοκυττάρων ή των επιθηλιακών κυττάρων του εγγύς σωληναρίου και του (μικρο)αγγειακού ενδοθηλίου, (ii) τις διακυττάριες ηλεκτροχημικές και οσμωτικές διαβαθμίσεις πίεσης που οδηγούν υγρά και μεταβολίτες σε όλο το διάμεσος χώρος, (iii) υγρό σύντροφο και (iv) η δομική διάταξη των νεφρικών σωληναρίων, καθώς και (v) οι κυτταρικές μεταβολικές και ενδοκρινικές λειτουργίες [38].

Το εγγύς σωληνάριο παίζει κρίσιμο ρόλο στην απέκκριση των μεταβολικών αποβλήτων και στην επαναρρόφηση των βιομορίων και, ως εκ τούτου, έχει αποτελέσει κύριο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη in vitroνεφρό-συστήματα σε τσιπ που ανακεφαλαιώνουν in vivoνεφρόιστός. Η ανάπτυξη των λειτουργικώννεφρόσωληνάρια που χρησιμοποιούν κύτταρα εγγύς σωληναρίου με βιολειτουργικές κοίλες ίνες επέτρεψαν στον Jansen και τους συναδέλφους να μελετήσουν την εκκριτική κάθαρση μεταβολιτών που προέρχονται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου. Αυτό το σύστημα επέτρεψε στους ερευνητές να δείξουν πώς, μέσω τηλεπισκόπησης και σηματοδότησης, τα εγγύς σωληνάρια ανιχνεύουν αυξημένα επίπεδα θειικού ινδοξυλεστέρα και κατά συνέπεια προσαρμόζουν την έκφραση των μεταφορέων που είναι υπεύθυνοι για την απέκκρισή τους σε μια προσπάθεια να διατηρήσουν σταθερά επίπεδα μεταβολιτών και ομοιόσταση [39].

Οι αλληλεπιδράσεις ενδοθηλίου-ενδιάμεσου χώρου-επιθηλίου διέπουν τη συνεχή ανταλλαγή διαλυμένων ουσιών μεταξύ του κυκλοφορικού και του διαμερίσματος των ούρων. Ο Lin και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν με επιτυχία ένα διαχύσιμο τρισδιάστατο αγγειοποιημένο εγγύς σωληνάριο που ήταν σε θέση να προσομοιώσει, μέσω της ανταλλαγής διαλυμένων ουσιών σωληνάριο-αγγειακό σύστημα, την ενεργή λειτουργία επαναρρόφησης τουνεφρό[40]. Αυτό το μοντέλο επιτρέπει την ποσότητα για την πιστοποίηση της πρόσληψης λευκωματίνης από τα νεφρά και της επαναρρόφησης γλυκόζης με την πάροδο του χρόνου, προσφέροντας ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για τη διερεύνηση των (παθο)φυσιολογικών λειτουργιών των νεφρών και τη φαρμακολογία. Εκτός από μια ανταλλαγή διαλυμένης ουσίας, τονεφρόο διάμεσος χώρος θεωρείται επίσης κεντρικός για την ανάπτυξη τουνεφρόίνωση, χαρακτηριστικό της ΧΝΝ. Αυτό πιστεύεται ότι προκαλείται από ουλές στον διάμεσο χώρο των σωληναρίων ως αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του διάμεσου μυοϊνοβλαστών και της επακόλουθης εναπόθεσης ECM. Ωστόσο, μόνο λίγες μελέτες έχουν αναφέρει την ενσωμάτωσή του σε τρισδιάστατα συστήματα in vitro. Η επικύρωση ενός απλού και εξαιρετικά αναπαραγώγιμου μοντέλου μικροπεριβάλλοντος τρισδιάστατου σωληνίσκου/ενδιάμεσου για τη μελέτη της ινώσεως των νεφρών σε ένα φυσιολογικά σχετικό σύστημα in vitro αναφέρθηκε από τον Moll και τους συνεργάτες του [41]. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε σισπλατίνη για να μιμηθεί με επιτυχία την οξεία σωληναριακή βλάβη. Η in vitro αντιγραφή του μικροπεριβάλλοντος νεφρικού σωληναρίου/ενδιάμεσου ιστού επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες αντί για νεφρικούς ινοβλάστες επειδή οι πρώτοι εκφράζουν χαμηλά επίπεδα ινωτικών δεικτών υπό βασικές συνθήκες. Ωστόσο, παρά αυτόν τον περιορισμό, το σύστημα έδειξε ότι τα επιθηλιακά κύτταρα παίζουν κεντρικό ρόλο στην ενεργοποίηση της ενεργοποίησης και της διαφοροποίησης των μυοϊνοβλαστών. Ο Moll και οι συνάδελφοί του προσπάθησαν να επαναλάβουν αυτή τη μελέτη χρησιμοποιώντας πρωτογενείς νεφρικούς ινοβλάστες, αλλά αντιμετώπισαν μεγάλη μεταβλητότητα στα αποτελέσματα. Δεδομένης της σημασίας του ενδιάμεσου χώρου στη ΧΝΝ, θα χρειαστούν περαιτέρω 3D in vitro μελέτες για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος του στην εμφάνιση και την εξέλιξη της νόσου.

ονεφράενεργοποιήστε επίσης την 25(OH)βιταμίνη D με υδροξυλίωση στη θέση 1, με αποτέλεσμα την 1,25 (OH)2βιταμίνη D, μια βασική ορμόνη που είναι συχνά ανεπαρκής στους ασθενείς με ΧΝΝ και που μπορεί να επηρεάσει τη σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου και την ακεραιότητα του φραγμού. Πρόσφατα, μια αναπαράσταση στο τσιπ του ηπατικού μεταβολισμού καινεφρόΗ ενεργοποίηση της βιταμίνης D αναπτύχθηκε με την έγχυση του μέσου που περιέχει βιταμίνη D σε ένα μικρορευστοποιητικό τσιπ, υποδηλώνοντας ότι οι σύνθετες μεταβολικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των οργάνων είναι εξαιρετικά εφικτές με τη χρήση τεχνολογιών MPS [42].

Στη ΧΝΝ, η μείωση της παραγωγής λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFA), που συμπληρώνεται από την ταυτόχρονη αύξηση της παραγωγής ουραιμικής τοξίνης και της συστηματικής συσσώρευσής τους [4], θεωρείται ότι οδηγεί τη χρόνια φλεγμονώδη κατάσταση που είναι χαρακτηριστική της ΧΝΝ [4,43 ]. Πράγματι, τα SCFAs, ιδιαίτερα το βουτυρικό, έχουν τόσο νεφροπροστατευτικά όσο και εντερικά προστατευτικά αποτελέσματα [4,44] και τα υψηλά επίπεδα βουτυρικού έχουν συσχετιστεί με την ακεραιότητα του φραγμού του εντέρου και τις βελτιώσεις της εντερικής ανοσίας ως αποτέλεσμα των αντιφλεγμονωδών ιδιοτήτων του [45]. Ωστόσο, αυτό διαψεύστηκε πρόσφατα από την Trapecar και τους συναδέλφους τους, οι οποίοι, σε μια ψυχομιμητική προσέγγιση, απέδειξαν ότι τα SCFAs μπορούν να επιδεινώσουν μια φλεγμονώδη απόκριση σε ένα μοντέλο εντέρου-ήπατος. Συνδέοντας δύο πνευματικές πλάκες χωριστά που αντιπροσωπεύουν το έντερο και το ήπαρ, τα CD4 συν Τ κύτταρα και τα βοηθητικά κύτταρα Τ φλεγμονώδους τύπου 17 (Th17) θα μπορούσαν να κυκλοφορούν εντός και μεταξύ των δύο διαμερισμάτων. Οι αντίθετες επιδράσεις των SCFAs μπορεί να συσχετίζονται με τον βαθμό φλεγμονής, με μια αυξημένη φλεγμονώδη κατάσταση να προκαλεί μια πιο επιβλαβή επίδραση [46].

Από όσο γνωρίζουμε, δεν υπάρχει επί του παρόντος MPS που να αντιμετωπίζει τις επιδράσεις των μεταβολιτών που προέρχονται από το έντερο στο έντερο,νεφρό, ή άλλα όργανα, με ταυτόχρονη παρακολούθηση της βιομετατροπής τους, στο πλαίσιο της ΧΝΝ. Ο συντονισμός του τσιπ για να ανακεφαλαιώσει πιστά την αμφίδρομη ροή των ροών παραγωγής και απομάκρυνσης των μεταβολιτών θα είναι μια πρόκληση. Η ενσωμάτωση μικροβίων που προέρχονται από δείγματα κοπράνων ασθενών με ΧΝΝ σε ένα εντερικό μικρορευστο σύστημα θα μας επέτρεπε να μελετήσουμε τις αλλαγές στον μικροβιακό μεταβολισμό και να αναλύσουμε τις (έμμεσες) επιδράσεις τους σε απομακρυσμένα όργανα, ένα χαρακτηριστικό που δεν μπορεί να επιτευχθεί μέσω πειραμάτων in vivo.

Τεχνολογικές πρόοδοι Ενίσχυση της In Vivo μεταφραστικής αξίας των MPS Ο σχεδιασμός ενός MPS αποτελεί πρόκληση και απαιτεί μια διεπιστημονική προσέγγιση. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι κανένα MPS δεν μπορεί να τα κάνει όλα και, ανάλογα με την εφαρμογή, μπορεί να απαιτούνται διαφορετικά συστήματα. Τα πλεονεκτήματα και οι περιορισμοί των διαθέσιμων συστημάτων για την αντιμετώπιση του εντέρου-νεφρόΟι άξονες συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Μία από τις πιο κοινές προκλήσεις στο πεδίο είναι να σχεδιαστεί ένα σύστημα που είναι βιολογικά πολύπλοκο και επαρκώς τεχνικά απλό για να εγκατασταθεί σε εργαστήρια κυτταροκαλλιέργειας.

Η ομάδα Ingber (Ινστιτούτο Wyss, Η.Π.Α.) έχει καθιερώσει καλά βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα για την καλλιέργεια κυττάρων, τη σύνδεση μικρορευστωδών συστατικών στο τσιπ και τη δειγματοληψία [16-18,47]. Αν και τεχνολογικά προηγμένο, το μικρορευστικό τους σύστημα απαιτεί σημαντική εκπαίδευση μη τεχνικών χειριστών, ακόμη και για αυτόματους μικρορευστικούς προσδιορισμούς [47]. Τα τσιπ πολλαπλών οργάνων χωρίς αντλία, που πρωτοστάτησε στο εργαστήριο Shuler (Πανεπιστήμιο Cornell, ΗΠΑ), καθώς και από εταιρείες όπως η Hesperos Inc. (Εικόνα 3Ε) και η InSphero, αυξάνουν την απόδοση εις βάρος του περιορισμένου ελέγχου του συναδέλφου και της πολυπλοκότητας της συσκευής [48] (https://hesperosinc.com/). Αν και περιορισμένο στην αναπαραγωγή βιοφυσικών ενδείξεων, το MPS που αναπτύχθηκε από το εργαστήριο Griffith (Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Μασαχουσέτης, ΗΠΑ) χρησιμοποιεί πιο συμβατικά πρωτόκολλα, για παράδειγμα, επιτρέποντας την άμεση πρόσβαση στο ανάλογο ιστού και χρησιμοποιώντας τροποποιημένα τυπικά ένθετα Transwell® (Εικόνα 3C, D) [37,49].

Καινοτόμες εταιρείες έχουν αναπτύξει ομοίως πλατφόρμες πολλαπλών οργάνων, όπως το TissUse®. Οι αντλίες τους στο τσιπ συνδέουν τα όργανα και κάνουν το σύστημα λιγότερο επιρρεπές σε παγίδευση φυσαλίδων και διαρροή. Ωστόσο, αυτές οι συσκευές προσφέρουν περιορισμένη μικρορευστοποιητική δρομολόγηση, για παράδειγμα, λείπει η κορυφαία στο μοντέλο του εντέρου και η προσαρμογή των μοντέλων ιστού είναι δύσκολη.

Μια άλλη σημαντική πρόκληση είναι το υλικό τσιπ. Το PDMS είναι ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα υλικά λόγω της εξαιρετικής διαπερατότητας του οξυγόνου, της οπτικής διαύγειας και των ιδιοτήτων δημιουργίας πρωτοτύπων. Ωστόσο, η διαπερατότητα του οξυγόνου είναι ένα μειονέκτημα κατά τη συγκαλλιέργεια του υποχρεωτικού αναερόβιου μικροβιώματος με εντερικά κύτταρα [20,37]. Κατά τη δοκιμή υδρόφοβων ενώσεων, για παράδειγμα, σε μελέτες τοξικότητας φαρμάκων ή αποτελεσματικότητας, το PDMS δεν συνιστάται επειδή απορροφά μικρά υδρόφοβα μόρια. Ως εκ τούτου, τα MPS που αποτελούνται από πιο αδρανή υλικά, που εμποδίζουν τη μη ειδική δέσμευση των ενώσεων, είναι τα πιο αξιόπιστα. Για παράδειγμα, ο Edington και οι συνεργάτες του ανέπτυξαν μια πλατφόρμα μικρορευστών με βάση το πολυστυρένιο διασυνδεδεμένων MPS σε μια προσπάθεια να αναδημιουργήσουν ένα physiome-on-a-chip που μπορεί να δημιουργήσει πολύπλοκα προφίλ μοριακής διανομής για προηγμένες εφαρμογές ανακάλυψης φαρμάκων [50].

Η ανάπτυξη πλατφορμών με ενσωματωμένους αισθητήρες (οξυγόνο, ουρία, γαλακτικό ή γλυκόζη) και/ή οπτική διαφάνεια, έχουν διευκολύνει την μη επεμβατική κυτταρική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο (Πλαίσιο 3) [51,52]. Πρόσφατα αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα με πλήρως ενσωματωμένη αρθρωτή αίσθηση. Αυτό λειτουργεί μονάδες MPS με συνεχή, δυναμικό και αυτοματοποιημένο τρόπο και περιλαμβάνει φυσικούς αισθητήρες για την παρακολούθηση του εξωκυττάριου μικροπεριβάλλοντος, βιοχημικούς αισθητήρες για τη μέτρηση διαλυτών βιοδεικτών, μικροσκοπικά μικροσκόπια για την καταγραφή μορφολογικών αλλαγών και έναν πίνακα ψωμιού με μικρορευστοποίηση για την έγκαιρη δρομολόγηση υγρών τρόπο [53].

Η υπολογιστική ανάλυση είναι επίσης απαραίτητη για να διαπιστωθεί εάν τα πειραματικά δεδομένα που προέρχονται από MPS μπορούν να επεκταθούν σε απόδοση in vivo [54]. Έτσι, η ενοποίηση των αλγορίθμων μηχανικής μάθησης (σε μοντελοποίηση πυριτίου) θα πρέπει να γίνει στρατηγικό συστατικό των MPS [55]. Το υπολογιστικό μοντέλο μπορεί να προσαρμοστεί για να βοηθήσει στην επίλυση των περιορισμών των πειραματικά συνδεδεμένων MPS και να φέρει τα δεδομένα εντός του εύρους των μελετών σε ζώα και των μεθόδων παρέκτασης [54]. Οι προβλέψεις που λαμβάνονται από μελέτες πυριτίου μπορούν να παρέχουν ανατροφοδότηση για περαιτέρω βελτίωση των μοντέλων MPS [55]. Για παράδειγμα, στο silico μελέτες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη μοντελοποίηση της κινητικότητας του ανοσοποιητικού κυττάρου μετά από βλάβη του εντερικού φραγμού και την πρόβλεψη της συμπεριφοράς των κυττάρων κατά την έκθεση σε συγκεκριμένες παραμέτρους ή βιομόρια [56-59].

Συμπερασματικές παρατηρήσεις και μελλοντικές προοπτικές

Τον επόμενο αιώνα, ο επιπολασμός της ΧΝΝ προβλέπεται να αυξηθεί δραστικά παγκοσμίως, θέτοντας σημαντικές οικονομικές και κοινωνικές προκλήσεις. Ανεξάρτητα από τη χώρα προέλευσης, το ετήσιο κόστος της υγειονομικής περίθαλψης και της κοινωνίας έχει βρεθεί ότι αυξάνεται παράλληλα με την εξέλιξη της ΧΝΝ [60], υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για μια πλατφόρμα μοντέλου ασθενειών στην οποία θα μελετηθεί η παθοφυσιολογία της ΧΝΝ και θα εντοπιστούν πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι.

Ωστόσο, πολλές προκλήσεις απομένουν να αντιμετωπιστούν και αρκετά ζητήματα πρέπει να επιλυθούν πριν αναπτυχθούν MPS που να μοντελοποιούν με ακρίβεια τη ΧΝΝ (βλ. Εκκρεμείς ερωτήσεις). Για παράδειγμα, τα αρχικά συμβάντα που οδηγούν την έναρξη της ΧΝΝ παραμένουν άγνωστα, καθιστώντας τη μοντελοποίηση της έναρξης ΧΝΝ στο MPS δύσκολη.ΝεφρόΟι τραυματισμοί που οδηγούν στην ανάπτυξη ΧΝΝ είναι ποικίλης φύσης και συχνά περιλαμβάνουν καρδιαγγειακό συστατικό, καθιστώντας την αναπαράστασή τους ακόμη πιο δύσκολη. Επιπλέον, η σύνθεση του μικροβιώματος του εντέρου είναι πολύπλοκη και δύσκολη στην αναπαραγωγή. Ωστόσο, είναι απαραίτητη προϋπόθεση για ένα μοντέλο νόσου ΧΝΝ. Οι τελευταίες επιτυχημένες εξελίξεις των MPS που ενσωματώνουν αναερόβια βακτήρια κατέστησαν δυνατές με την ενσωμάτωση βιοαισθητήρων για ανίχνευση οξυγόνου, καθώς και με τη συμπερίληψη ελεγχόμενων ροών και ενός στρώματος βλέννας που μειώνει την υπερανάπτυξη βακτηρίων και περιορίζει τη βλάβη των εντερικών κυττάρων (Πίνακας 1). Ωστόσο, απομένουν να επιτευχθούν ευρείες αναερόβιες βακτηριακές κοινοπραξίες εντός των συστημάτων, αν και αυτό θα είναι απαραίτητο για μια φυσιολογική αναπαράσταση του μικροβιώματος του εντέρου. Τα ζητήματα με απορροφητικά και διαπερατά από τον αέρα υλικά αποτελούν επίσης ένα σημαντικό εμπόδιο στο πεδίο, αμφισβητώντας την καταλληλότητα των συστημάτων για την ανάπτυξη αναερόβιων βακτηρίων ή για τη δοκιμή λιπόφιλων ενώσεων. Η συνάφεια των διασυνδέσεων οργάνων έχει τονιστεί έντονα σε αυτήν την ανασκόπηση. Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας η ενσωμάτωση του κυκλοφορικού και του ανοσοποιητικού συστήματος στα MPS, αλλά αυτά έχουν ενσωματωθεί σε λίγα μόνο μοντέλα.

Ενισχύοντας τη διεπιστημονικότητα, η ενσωμάτωση βιοεκτύπωσης, βιοϋλικών και βιοαισθητήρων για παρακολούθηση του μικροπεριβάλλοντος σε πραγματικό χρόνο θα μπορούσε να αντιμετωπίσει τα ανατομικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά, καθώς και την πολυπλοκότητα των συστημάτων που είναι απαραίτητα για την αύξηση της φυσιολογικής τους συνάφειας. Καθώς η τεχνολογία MPS προχωρά, παράλληλα με την τρέχουσα τάση προς βελτιωμένες διεπιστημονικές προσεγγίσεις, αυτά τα αναπάντητα ερωτήματα θα αντιμετωπιστούν τελικά.

Ευχαριστίες

Αυτό το έργο έλαβε χρηματοδότηση από το πρόγραμμα έρευνας και καινοτομίας «EU Horizon 2020» στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης Marie Skłodowska Curie STRATEGY-CKD H2020-2019-ETN (860329), καθώς και της πρόσκλησης WIDESPREAD-05-2018-TWINNING ΑΝΑΜΟΝΤΕΛΑ (857491). Το έργο αυτό υποστηρίχθηκε περαιτέρω από τους ΟλλανδούςΝεφρόΘεμέλιο (DKF, 17OI13). Η RM είναι μέλος της Ομάδας Εργασίας EUTox που έχει εγκριθεί από την ESAO/ERA-EDTA.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Himmelfarb, J. et al. (2020) Το σημερινό και μελλοντικό τοπίο της αιμοκάθαρσης. Nat. Αιδ. Nephrol. 16, 573–585

2. Evenepoel, P. et al. (2017) Το έντερο -νεφρόάξονας. Παιδιατρ. Nephrol. 32, 2005–2014

3. De Sordi, L. et al. (2017) Η μικροχλωρίδα του εντέρου διευκολύνει τις μετατοπίσεις στη γενετική ποικιλομορφία και τη μολυσματικότητα των βακτηριακών ιών. Cell Host Microbe 22, 801–808

4. Rukavina Mikusic, NL et al. (2020) Εντερική μικροχλωρίδα και χρόνιανεφρόασθένεια: στοιχεία και μηχανισμοί που μεσολαβούν σε μια νέα

επικοινωνία στον γαστρεντερικό-νεφρικό άξονα. Pflugers Arch. 472, 303–320

5. Nigam, SK and Bush, KT (2019) Ουραιμικό σύνδρομο χρόνιαςνεφρόασθένεια: αλλοιωμένη τηλεπισκόπηση και σηματοδότηση. Nat. Αιδ. Nephrol. 15, 301–316

6. Okada, Η. et al. (2020) Βασικά σημεία από τις κατευθυντήριες γραμμές κλινικής πρακτικής βάσει τεκμηρίων για χρόνιαΝεφρόΝόσος 2018. Κλιν. Exp. Nephrol. 23, 1–15

7. Becker, GJ and Hewitson, TD (2013) Ζωικά μοντέλα χρόνιαςνεφρόασθένεια: χρήσιμο αλλά όχι τέλειο. Nephrol. Καντράν. Μεταμόσχευση. 28, 2432–2438

8. Faria, J. et al. (2019)Νεφρό-βασισμένα in vitro μοντέλα για δοκιμές τοξικότητας που προκαλούνται από φάρμακα. Αψίδα. Toxicol. 93, 3397–3418

9. Beebe, DJ et al. (2002) Φυσική και εφαρμογές της μικρορευστικότητας στη βιολογία. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 261–286

10. Zhang, Β. et αϊ. (2018) Πρόοδοι στη μηχανική organ-on-a-chip. Nat. Σεβ. Mater. 3, 257–278

11. Lin, B. and Levchenko, A. (2015) Spatial manipulation with microfluidics. Εμπρός. Bioeng. Biotechnol. 3, 39

12. Yum, Κ. et αϊ. (2014) Φυσιολογικά σχετικά όργανα σε τσιπ. Biotechnol. J. 9, 16–27

13. Huh, D. et αϊ. (2010) Ανασύσταση πνευμονικών λειτουργιών σε επίπεδο οργάνου σε ένα τσιπ. Science 328, 1662–1668

14. Lee, SH and Sung, JH (2018) Τεχνολογία οργάνου σε τσιπ για την αναπαραγωγή πολυοργανικής φυσιολογίας. Adv. Healthc. Μητήρ. 7, 1700419

15. Sung, JH et αϊ. (2019) Πρόσφατες εξελίξεις στα συστήματα body-on-a-chip. Πρωκτικός. Chem. 91, 330–351

16. Kim, HJ et al. (2012) Ανθρώπινο έντερο σε τσιπ κατοικείται από μικροβιακή χλωρίδα που βιώνει κινήσεις και ροή που μοιάζουν με την εντερική περίσταλση. Lab Chip 12, 2165–2174

17. Kim, HJ and Ingber, DE (2013) Το μικροπεριβάλλον Gut-on-a-Chip προκαλεί τα ανθρώπινα εντερικά κύτταρα να υποστούν διαφοροποίηση λαχνών. Ακέραιος αριθμός. Biol. (Camb) 5, 1130–1140

18. Kim, HJ et al. (2016) Συμβολή μικροβιώματος και μηχανικής παραμόρφωσης στην εντερική βακτηριακή υπερανάπτυξη και φλεγμονή σε ένα ανθρώπινο έντερο σε τσιπ. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 113, E7–E15

19. Jalili-Firoozinezhad, S. et al. (2019) Ένα σύνθετο μικροβίωμα ανθρώπινου εντέρου καλλιεργημένο σε αναερόβιο έντερο-σε-ένα-τσιπ. Nat. Biomed. Eng. 3, 520–531

20. Creff, J. et al. (2019) Κατασκευή τρισδιάστατων ικριωμάτων που αναπαράγουν τοπογραφία εντερικού επιθηλίου με 3D στερεολιθογραφία υψηλής ανάλυσης. Biomaterials 221, 119404