Μηχανιστική ενόραση για την επαγόμενη από τη διοσμίνη νευροπροστασία και βελτίωση της μνήμης σε μοντέλο αρουραίου ενδοεγκεφαλοκοιλιακού-κινολινικού οξέος: Ανάσταση μιτοχονδριακών λειτουργιών και αντιοξειδωτικών Μέρος 3

2. Υλικό και Μέθοδοι

2.1. Πειραματικά Ζώα. .είναι η έρευνα επιτρέπεται από την IAEC βάσει του πρωτοκόλλου αριθ. ASCB/IAEC/14/20/145. Οι αρουραίοι AlbinoWistar (οποιουδήποτε φύλου, 200 g έως 250 g, ηλικίας 8 έως 9 μηνών) διατηρήθηκαν σε κυβοειδείς θαλάμους πολυπροπυλενίου τυπικού μεγέθους κάτω από τεχνητές ρυθμίσεις θερμοκρασίας (23 ± 2 βαθμοί), 12:12 ώρες ακολουθίες σκότους/φωτός και υγρασία (40 ± 10%) εντός του ιδρυματικού ζωοτροφείου. Τα τρωκτικά τρέφονταν με τυπικά θρεπτικά τρόφιμα (Ashirwad Manufacturers, Punjab) και καθαρίζονταν με νερό κατά βούληση.

Η σχέση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών και η μνήμη τραβούσε πάντα μεγάλη προσοχή. Είναι γνωστό ότι οι ανδρικές ορμόνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη σωματική ανάπτυξη, τη διατήρηση της υγείας και την προώθηση της σεξουαλικής ανάπτυξης και της σεξουαλικής λειτουργίας. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ανδρικές ορμόνες σχετίζονται στενά με τη μνήμη.

Μελέτες έχουν δείξει ότι οι άνδρες αποδίδουν καλύτερα από τις γυναίκες σε ορισμένες εργασίες μνήμης. Για παράδειγμα, οι άνδρες συνήθως έχουν καλύτερες επιδόσεις από τις γυναίκες στη χωρική μνήμη και ο λόγος είναι η επίδραση των ανδρικών ορμονών στον ιππόκαμπο. Ο ιππόκαμπος είναι η περιοχή στον εγκέφαλο που επεξεργάζεται τη χωρική μνήμη. Οι ανδρικές ορμόνες μπορούν να προάγουν τη λειτουργία του ιππόκαμπου, βελτιώνοντας έτσι την ικανότητα χωρικής μνήμης των ανδρών.

Ωστόσο, οι γυναικείες ορμόνες έχουν επίσης θετική επίδραση στη μνήμη. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι γυναικείες ορμόνες μπορούν να προάγουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη μνήμη στον εγκέφαλο και να αυξήσουν τον αριθμό και τη λειτουργία των νευρώνων στον ιππόκαμπο, βελτιώνοντας έτσι τη μνήμη των γυναικών. Επιπλέον, οι γυναικείες ορμόνες μπορούν να ανακουφίσουν το στρες, να αναστείλουν τον θάνατο των νευρωνικών κυττάρων, να προστατεύσουν τους εγκεφαλικούς νευρώνες και να βελτιώσουν περαιτέρω τη μνήμη των γυναικών.

Αυτό δείχνει ότι τόσο οι ανδρικές όσο και οι γυναικείες ορμόνες έχουν θετική επίδραση στη βελτίωση της μνήμης. Οι άνδρες και οι γυναίκες έχουν διαφορετικές επιδόσεις μνήμης, το καθένα με τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του, αλλά δεν σημαίνει ότι οι άνδρες έχουν καλύτερη μνήμη από τις γυναίκες ή ότι οι γυναίκες έχουν καλύτερη μνήμη από τους άνδρες. Επομένως, δεν πρέπει να χρησιμοποιούμε το φύλο ως μέτρο της μνήμης. Ο καθένας θα πρέπει να δίνει το πλήρες παιχνίδι προς όφελός του και να βελτιώνει συνεχώς τη μνήμη του.

Τέλος, είτε άνδρες είτε γυναίκες, θα πρέπει να προσέχουμε τη σωματική υγεία και την ψυχική μας κατάσταση και να επιλέγουμε τον σωστό τρόπο βελτίωσης της μνήμης μας. Για παράδειγμα, η συνεχής εκμάθηση νέων πραγμάτων, η ανάπτυξη τακτικών συνηθειών ζωής και η διατήρηση της συναισθηματικής σταθερότητας μπορεί να έχει θετικό αντίκτυπο στη βελτίωση της μνήμης. Ας εργαστούμε μαζί για να εξερευνούμε και να εξασκούμε συνεχώς μεθόδους για τη βελτίωση της μνήμης και τη δημιουργία ενός καλύτερου μέλλοντος για τον εαυτό μας. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή το Cistanche είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο με πολλά μοναδικά αποτελέσματα, ένα από τα οποία είναι η βελτίωση της μνήμης. Η αποτελεσματικότητα του Cistanche προέρχεται από τα διάφορα ενεργά συστατικά που περιέχει, όπως ταννικό οξύ, πολυσακχαρίτες, φλαβονοειδή γλυκοσίδες κ.λπ. Αυτά τα συστατικά μπορούν να προάγουν την υγεία του εγκεφάλου με πολλούς τρόπους.

Κάντε κλικ στο Μάθετε 10 τρόπους για να βελτιώσετε τη μνήμη

Όλες οι διαδικασίες σε ζώα εκτελούνται αποκλειστικά σύμφωνα με τις οδηγίες της CPCSEA, GOI, Νέο Δελχί. Οι κηδεμόνες και οι χειριστές ζώων τυφλώθηκαν σχετικά με διαφορετικά θεραπευτικά σχήματα που διευκολύνθηκαν σε κοόρτες ζώων. Πραγματοποιήθηκαν ερευνητικές δοκιμές σε ζώα, που πέτυχαν τουλάχιστον ένα δεκαπενθήμερο διάρκειας εξοικείωσης.

Όλες οι έρευνες με χρήση ζώων πραγματοποιήθηκαν μεταξύ 0900- και 1600-ώρες την ημέρα.2.2. Φάρμακα και Χημικά. Διοσμίνη (DSM: 520-27-4), κινολινικό οξύ (QA: 89-00-9) και τυπικές αναλυόμενες ουσίες αποκτήθηκαν από τη Merck (Ινδία).

Δισόξινο φωσφορικό νάτριο (NaH2PO4), υδροξείδιο του νατρίου (NaOH), διβασικό φωσφορικό κάλιο (K2HPO4), νιτροβλουτετραζόλιο (NBT), μεθοθειική φαιναζίνη (5-μεθυλθειϊκό μεθυλφαιναζίνιο), αιθυλενοδιαμινολευκωματικό οξύ (BSAumetra) 5}}[4-(2-υδροξυαιθυλ)πιπεραζιν-1-υλ]αιθανοσουλφονικό οξύ (HEPES), 1,2-δις[2-[δις(καρβοξυμεθυλ) αμινο]αιθοξυ]αιθάνιο (EGTA), ριβοφλαβίνη, κυανιούχο νάτριο (NaCN), νατριουμαζίδη (NaN3), πυροφωσφορικό τετρανάτριο, υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), δινάτριο NADH (DPNH), τετρανάτριο NADPH (Συνένζυμο II), ανηγμένο τετραφωσφορικό άλας Αντιδραστήριο Folin and Ciocalteu's (FCR) και σουλφοσαλικυλικό οξύ (5-SSA) (HiMedia Laboratories, Maharashtra, Ινδία). διγλυκίνη, παγόμορφο οξικό οξύ (CH3COOH), αντιδραστήριο Ellman (3-Καρβοξυ-4-νιτροφαινυλδισουλφίδιο, DTNB), αζαβενζόλιο (C5H5N) και λαυρυλοθειικό νάτριο (SLS) (LobaChemie, Mumbai, Ινδία). 4,6-Διυδροξυ-2-μερκαπτοπυριμιδίνη (2-TBA), ανθρακικό δινάτριο (Na2CO3) και (2-μερκαπτοαιθυλ)τριμεθυλαμμώνιο οξικό ιωδιούχο (TCI chemicals, Ινδία); θειικός ψευδάργυρος (ZnSO4), άλας Rochelle (L(+)-τρυγικό νάτριο κάλιο), διυδροχλωρική 2-(1-ναφθυλαμινο)αιθυλαμίνη, νιτρώδες οξύ (NaNO2) και π-αμινοβενζολοσουλφοναμίδιο (SiscoResearch India Laboratories, ) Χρησιμοποιήθηκε βουτυλική αλκοόλη (Fisher Scientific, India).2.3. Ενδοεγκεφαλοκοιλιακή Έγχυση Κινολινικού Οξέος.

Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αναισθησία με χορήγηση ενδοπεριτοναϊκώς (IP) κεταμίνης (90 mg/kg) και ξυλαζίνης (10 mg/kg) κοκτέιλ χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο νερό για ένεση. Το σώμα ήταν ξαπλωμένο σε πρηνή θέση σε ένα ζεστό μαξιλάρι θέρμανσης και στη βάση ενός οργάνου στερεοταξικής χειρουργικής, το κεφάλι ήταν τοποθετημένο. Το τριχωτό της κεφαλής κόπηκε στο ισόβελον σημείο και το κρανίο αποκαλύφθηκε με ανάσυρση του δέρματος.

Οποιαδήποτε από τις δύο πλάγιες κοιλίες επιλέχθηκε αυθαίρετα, και στο κρανίο, το βρεγματικό οστό είχε τρυπηθεί (στερεοταξικές συντεταγμένες -0.8 mm προσθοπίσθια από το βρεγμά, ±1,5 mm μεσόπλευρο από το μεσαίο ράμμα και ±3,6 mm οπίσθια οπίσθια οσφυϊκή περιοχή ) για να κάνετε μια τρύπα για γρέζια [21].

Την πρώτη ημέρα, το διάλυμα κινολινικού οξέος (QA) δημιουργήθηκε πρόσφατα (240 nmol) σε PBS (Na{1}}K+ [PO4]2- ρυθμισμένος ορός, pH 7,4) και εγχύθηκε σταδιακά χρησιμοποιώντας μια μικροσύριγγα Hamilton με ρυθμό ροής 1 μl/λεπτό στην αριστερή ή δεξιά εγκεφαλική κοιλία των αρουραίων σε διάρκεια 5 έως 6 λεπτών με όγκο ένεσης 5 μl οχήματος ICV [22].

Μετά τον εμβολιασμό ολόκληρου του φαρμάκου, η μικροβελόνα δεν απομακρύνθηκε για 4 έως 5 λεπτά για να καταστεί δυνατή η διάχυση του φαρμάκου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό και να αποτραπεί η παλινδρόμησή του. Ισοδύναμος όγκος (10 μl) του οχήματος PBS χορηγήθηκε ICV σε shamrats που χειρουργήθηκαν πανομοιότυπα, ωστόσο, το QA δεν εγχύθηκε.

Μετά τις ενέσεις φαρμάκου, οι τρύπες αποκαταστάθηκαν με τη χρήση ενός παράγοντα ώθησης (φωσφορικός ψευδάργυρος, PYRAX®) και ολοκληρώθηκε η ραφή του δέρματος. Για να αποφευχθεί η μόλυνση (βακτηριακή ανάπτυξη), το Neosporin® εφαρμόστηκε εκ των προτέρων.

Χορηγήθηκε μετεγχειρητική σήψη, Orizolin (Zydus Cadila), δόση 30 mg/kg (IP). Σε κάθε αρουραίο δόθηκε ζεστό περιβάλλον (37 ± 0,5 μοίρες) για να αποτραπεί η μετεγχειρητική υποθερμία. Σε κάθε αρουραίο αφέθηκε ημιστερεή τροφή (μέσα στο κλουβί) και νερό δωρεάν μετά από χειρουργική επέμβαση για επτά ημέρες και στεγάστηκε διακριτά σε ένα ξεχωριστό κλουβί (30 × 23 × 14 cm3).

2.4. Πειραματικό Πρωτόκολλο. Το DSM ενέθηκε σε δόσεις 50 και 100 mg/kg ανά σωματικό βάρος (bw) σε επίμυες μέσω της ενδοπεριτοναϊκής (IP) οδού χρησιμοποιώντας 0,5% διμεθυλοσουλφοξείδιο σε φυσιολογικό ορό (δόση-όγκος 5 ml/kg) [17].

Τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε 5 ομάδες σε μια απλή τυφλή λειτουργία (n � 5): (i) ψευδής (S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 και (v) QA + DNP. Οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ενδοεγκεφαλοκοιλιακή χορήγηση QA (QA-ICV) ή εικονική χειρουργική επέμβαση την 1η ημέρα.

Το DSM χορηγήθηκε για 21 συνεχόμενες ημέρες καθημερινά 120 λεπτά μετά το QA-ICV από την πρώτη ημέρα και μετά. Η Donepezil (DNP) χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο φάρμακο σε αυτή τη μελέτη και ενέθηκε (δόση 3 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκώς) σε αρουραίους στους οποίους έγινε ένεση QAICV για 21 διαδοχικές ημέρες.

Στα ζώα στις ομάδες ελέγχου του sham και του QA χορηγήθηκε όχημα (στείρο 0.5% διμεθυλοσουλφοξείδιο σε φυσιολογικό ορό σε δόση-όγκο 5 ml/kg) από την ημέρα 1 έως την 21η. .e ολόκληρη η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με το σχήμα που απεικονίζεται Εικόνα 1.2.5. Κινητική Δραστηριότητα.

Σε όλες τις ομάδες αρουραίων, η μέση κινητική δραστηριότητα τεκμηριώθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ακτοφωτόμετρου για 5 λεπτά. Ένα ξεχωριστό ζώο τοποθετήθηκε στο ακτοφωτόμετρο για 3 λεπτά εγκλιματισμού. Έπειτα στους αρουραίους .e δόθηκαν 5 λεπτά και τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μετρήσεις ανά 5 λεπτά [11].2.6. Δοκιμή Rotarod.

In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >60 δευτερόλεπτα στη ράβδο που περιστρέφεται με εννέα περιστροφές ανά λεπτό (rpm).

Μετά τις δοκιμές απόκτησης, ένας ξεχωριστός αρουραίος τοποθετήθηκε στον κυλινδρικό άξονα και η ταχύτητα περιστροφής ενισχύθηκε σε ένα σταθερό διάλειμμα 10 δευτερολέπτων από τις 6 σ.α.λ. (προκαταρκτική ταχύτητα) στις 30 σ.α.λ. (ταχύτητα ολοκλήρωσης), που εκτείνεται σε 50 δευτερόλεπτα. Η μέση καθυστέρηση πτώσης (σε δευτερόλεπτα) από τον περιστρεφόμενο κυλινδρικό άξονα δηλώθηκε στα αποτελέσματα.2.7.

Ανάλυση αποτυπώματος. Η αρχή πίσω από την εκτέλεση ανάλυσης αποτυπώματος σε αρουραίους είναι η αξιολόγηση των ανωμαλιών βάδισης.

Για τα ίχνη, τα πόδια του αρουραίου βυθίστηκαν σε τέσσερις διαφορετικές έγχρωμες μη τοξικές βαφές τροφίμων και τους επετράπη να τρέξουν σε κεκλιμένο διάδρομο (70 cm × 10 cm × 8 cm). Η βάση του διαδρόμου ήταν κλεισμένη με ένα φύλλο κυτταρίνης λευκού χρώματος. Οι αρουραίοι παρακινήθηκαν σε ένα αμυδρό ανηφορικό τμήμα στο τέλος του διαδρόμου για να αποκτήσουν καθαρά ίχνη. Η βαφή .e αφαιρέθηκε απαλά από κάθε ζώο χρησιμοποιώντας χλιαρό νερό μετά τις δοκιμές. Τα ίχνη .e σαρώθηκαν και το "μήκος διασκελισμού" μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν τυπικό χάρακα. Το μήκος του διασκελισμού ποσοτικοποιήθηκε με τον υπολογισμό της απόστασης μεταξύ των διαδοχικών τοποθετήσεων του ίδιου ποδιού του αρουραίου [11].

2.8. Νέα εργασία αναγνώρισης αντικειμένων (NORT). Το τυπικό πρωτόκολλο ακολουθήθηκε όπως δίνεται από τους Kumar και Bansal [23].

Το ORT είναι ένα ασύμφορο και μη εχθρικό εξωσυλληπτικό αρχέτυπο που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση του λειτουργικού τύπου συλλογικής μνήμης που αξιοποιείται μέσω της παρορμητικής διερευνητικής αγωγιμότητας των τρωκτικών. Η έρευνα .e πραγματοποιείται σε ένα κυβοειδές δοχείο από ανοιχτό κόντρα πλακέ ταράτσας (80 cm × 42 cm × 62 cm), τοποθετημένο σε μια ήσυχη περιοχή, που φωτίζεται από ένα LED 60 W για τη διαχείριση της σταθερής φωτεινότητας στο δοχείο.

Τα ξύλινα αντικείμενα σε σχήμα κυλίνδρου (λευκού)-, πυραμίδας (κόκκινο)- και κύβου (μαύρου) (ύψους 12 cm) (σε πανομοιότυπα τρίδυμα) ήταν συμπαγή και είχαν αρκετό βάρος ώστε να τα καθιστούν ακίνητα από τα τρωκτικά. Το NORT πραγματοποιήθηκε τη 16η ημέρα σε 3 στάδια (S): εγκλιματισμός (S1), απόκτηση (S2) και στάδιο εξέτασης (κατακράτηση) αναγνώρισης νέου αντικειμένου (S3).

Κατά τη διάρκεια του S1, τρεις διαδοχικές ημέρες πριν από την έκδοση των δοκιμών για την ανακάλυψη της άδειας βάσης δαπέδου του σκάφους (5 λεπτά) από τους αρουραίους. Με την ολοκλήρωση του S1, το μεμονωμένο ζώο εξοικειώθηκε σε οποιοδήποτε σύνολο στερεών στοιχείων στο στάδιο εκμάθησης (S2).

Δίδυμα πράγματα τοποθετήθηκαν σε 2 αυθαίρετα επιλεγμένες αντίθετες γωνίες του σκάφους (9 cm έως 11 cm κενό από τις πλευρικές επάλξεις). Ξεχωριστά, ένα τρωκτικό τοποθετήθηκε στο κέντρο του σκάφους με όψη απέναντι από τα δύο στερεά αντικείμενα και του επετράπη να ανακαλύψει τα δύο παρόμοια αντικείμενα για 5 λεπτά. Η οδήγηση του ρύγχους κοντά στο αντικείμενο σε απόσταση μικρότερη ή ίση με 2–3 cm ή η φυσική επαφή με το αντικείμενο με το ρύγχος υποτίθεται ως διερευνητική συμπεριφορά.

Μετά το S2, το τρωκτικό στεγάστηκε σε ένα σπίτι που περικλείεται από μια ενδοδοκιμαστική εσοχή (ITR) 60 λεπτών.

Οποιοδήποτε μεμονωμένο αντικείμενο που προσφερόταν στο S2 αντικαταστάθηκε από ένα διαφορετικό στερεό στοιχείο και τα τρωκτικά παρουσιάστηκαν ξανά στα δίδυμα αντικείμενα, δηλαδή ένα αντίγραφο του γνωστού αντικειμένου και του διαφορετικού στοιχείου.. το σύνολο των συγχωνεύσεων και θέσεων των αντικειμένων αντισταθμίστηκαν σε να μειώσει την πιθανή προκατάληψη που προκαλείται από μια τάση για ορισμένες ρυθμίσεις ή αντικείμενα. Το δοχείο και τα στερεά αντικείμενα σκουπίζονταν σχολαστικά (αιθυλική αλκοόλη 15% και στεγνό πανί) μετά από κάθε έρευνα για να περιοριστούν τα σημάδια δυσοσμίας. Το .e periodexpend ανακάλυψη κάθε στοιχείου στα S2 και S3 τεκμηριώθηκε χρησιμοποιώντας ένα χρονόμετρο. .e η διάρκεια που δαπανήθηκε για τη διερεύνηση των δύο αντιστοιχιζόμενων στοιχείων στο S2 (I1 � Ii1 + Ii2) και η διάρκεια που δαπανήθηκε για τη διερεύνηση των δύο ανόμοιων στοιχείων, δηλαδή, γνωστά και διαφορετικά, στο S3 (I2 � Ii3 + Ib) καταγράφηκε. Η διακύμανση στη διάρκεια που δαπανάται για τη διερεύνηση του διαφορετικού στοιχείου και η διάρκεια της διερεύνησης του εξοικειωμένου αντικειμένου (Ib–Ii3 � DI) αποκαλύπτει τη διατήρηση της συλλογικής μνήμης.

DI (δείκτης διάκρισης)/Διάρκεια S3 διερεύνησης τόσο του γνωστού όσο και του νέου στοιχείου (τροποποιημένο DI) βελτιώνει τις επιμέρους αποκλίσεις στην πλήρη έρευνα και υποδηλώνει την τάση για διαφορετικά στοιχεία σε αντίθεση με τα γνωστά {DI � (Ib–Ii3 )/(Ii3 + Ib)}. Η συλλογική μνήμη εκτιμήθηκε ποσοτικοποιώντας την ικανότητα των τρωκτικών να ξεχωρίζουν τα γνωστά/μυθιστορήματα στο S3 και δηλώθηκε ως DI (τροποποιήθηκε για τη συνολική περίοδο έρευνας στο S3) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). Ακολουθήθηκε το πρότυπο πρωτόκολλο .e, όπως δίνεται από τους Kumar και Bansal [25]. Το MWM κρίνει τη χωρική μνήμη με δοκιμές κολύμβησης, στις οποίες το τρωκτικό βρίσκει μια οδό διαφυγής σε ένα κρυφό βάθρο.

Μια μαύρης κυκλικής δεξαμενής (διάμετρος 2 m, 0.6 m ύψος) είχε γεμίσει νερό (25 ± 1 βαθμό ) σε βάθος 0,3 m. Η υδάτινη δεξαμενή χωρίστηκε δεξιόστροφα σε 4 παρόμοιες περιοχές (R1, R2, R3, και R4) χρησιμοποιώντας δύο νάιλον ίνες, στερεωμένες κάθετα στην επάνω περίμετρο της δεξαμενής.

Μια μαργαρίτα (10,5 cm χ 10,5 cm) τοποθετήθηκε υποβρύχια (1 cm κάτω από το νερό) στην περιοχή της δεξαμενής R4. Το σημείο της μαργαρίτας παρέμεινε ανέπαφο καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου απόκτησης.

Κάθε αρουραίος παρουσιάστηκε με τέσσερις σειριακούς γύρους απόκτησης (5 λεπτά ITR) καθημερινά. .e τρωκτικό απελευθερώθηκε απαλά στην υδάτινη δεξαμενή που έβλεπε το τοίχωμα της δεξαμενής, με την τοποθεσία να ποικίλλει με κάθε δοκιμή από R1-R4, R2-R1, R3-R2 και R{{ 7}}R3 τις ημέρες 1 έως 4, αντίστοιχα, και επιτρεπόταν 120 δευτερόλεπτα για τον εντοπισμό του υποβρύχιου βάθρου. Τα τρωκτικά συνέχισαν να ξεκουράζονται στο βάθρο για 20 δευτερόλεπτα.

Η αποτυχία ανίχνευσης της πλατφόρμας εντός 120 δευτερολέπτων υποδείκνυε τη χειροκίνητη τοποθέτηση του ratson στην πλατφόρμα και στη συνέχεια επιτρεπόταν 20 δευτερόλεπτα στην πλατφόρμα. Ο χρόνος λανθάνοντος χρόνου διαφυγής (ELT) είναι η διάρκεια (-ες) της ανακάλυψης της κρυμμένης στάθμης στην υδρόβια δεξαμενή.

Η χωρική μάθηση χαρακτηρίστηκε από την πρώτη ημέρα έναντι της τέταρτης ημέρας ELT. Στη δοκιμή με ανιχνευτή (5η ημέρα), τα τρωκτικά ερεύνησαν τη δεξαμενή για 120 δευτερόλεπτα, αλλά στερήθηκαν το βάθρο. Καταγράφηκε η μέση διάρκεια που δαπανήθηκε σε ολόκληρη τη δεξαμενή (4 περιοχές). Η μέση διάρκεια που δαπανήθηκε σε R4 (TSTQ:χρόνος που δαπανήθηκε στο τεταρτημόριο στόχο) ανίχνευσης για το κρυφό βάθρο θεωρήθηκε ως δείκτης μνήμης αναφοράς. .συγκριτική ρύθμιση της δεξαμενής σε σχέση με τα αντικείμενα του εργαστηρίου που λειτουργούν ως οπτικά σημάδια και η θέση του ερευνητή παρέμεινε αδιατάρακτη [26].

2.10. Εκτίμηση Βιοχημικών Παραμέτρων. Μετά την ολοκλήρωση των εξετάσεων συμπεριφοράς, ο πλήρης εγκέφαλος των θηραμάτων συγκεντρώθηκε και τοποθετήθηκε σε κονιοποιημένα παγάκια και ακολούθησε μπάνιο με αποστειρωμένο αλατούχο ορό (ισοτονικό308 mOsmol/l NaCl) για την απομάκρυνση των υπολειμμάτων και του αίματος.

Η ομογενοποίηση ολόκληρου του εγκεφάλου πραγματοποιήθηκε αμέσως σε ένα ρυθμιστικό διαχωρισμού κατάψυξης (pH 7,4) με τη σύνθεση 215 mM D-μαννιτόλη, 20 mM 2-[4-(2-υδροξυαιθυλο )πιπεραζιν-1-υλ]αιθανοσουλφονικό οξύ, 1 mM 1,2-δις[2-[δις(καρβοξυμεθυλ)αμινο]αιθοξυ]αιθάνιο, 75 mM σακχαρόζη και 0,1% BSA. Το ομογενοποίημα .e φυγοκεντρήθηκε στους 4 βαθμούς χρησιμοποιώντας δύναμη 13000 χ g για 5 λεπτά. Το ίζημα απορρίφθηκε και το υπερκείμενο διαχωρίστηκε σε δύο μέρη και επαναφυγοκεντρήθηκε (4 βαθμοί) με δύναμη 13000 χ g για 5 λεπτά. Το ακατέργαστο μιτοχονδριακό σφαιρίδιο διαχωρίστηκε και φυγοκεντρήθηκε ξανά σε ρυθμιστικό διαχωρισμού με 1,2-δις[2-[δις(καρβοξυμεθυλ)αμινο]αιθοξυ]αιθάνιο στα 12.500 × g για 11 λεπτά (4 βαθμοί). Η ημιστερεή απόθεση που ελήφθη με τον τρόπο αυτό και περιλαμβάνει μη μολυσμένα μιτοχόνδρια επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα αποχωρισμού (pH 7,4) που περιέχει 75 mM σακχαρόζη, 20 mM 2-[4-({{35}υδροξυαιθυλο)πιπεραζίνη{{36} υλ]αιθανοσουλφονικό οξύ και 215 mM D-μαννιτόλη [27].

Αργότερα, το μιτοχονδριακό κλάσμα του ομογενοποιήματος ολόκληρου του εγκεφάλου χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των βιοχημικών δεικτών χρησιμοποιώντας τυπικές μεθόδους.2.11. Εκτίμηση μιτοχονδριακού συμπλέγματος.

2.11.1. NADH: Δραστηριότητα Οξιδορεδουκτάσης Ubiquinone. Ο ρυθμός δραστικότητας του συμπλόκου Ι (αφυδρογονάση NADH) ποσοτικοποιήθηκε (nmol οξειδωμένης NADH/λεπτό/mg πρωτεΐνης) ακολουθώντας την τεχνική των King και Howard [28]. Η οξειδωτική παραγωγή NAD+ από NADH συνοδεύεται από αναγωγή του κυτοχρώματος c. Το μίγμα της δοκιμασίας αποτελούνταν από κυτόχρωμα c (10,5 mM), 6 mM-νικοτιναμίδιο αδενινοδινουκλεοτίδιο (DPNH) διαλυμένο χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα διγλυκίνης 2 mM και ρυθμιστικό διάλυμα διγλυκίνης (0,2 Μ, ρΗ 8,5).

Ένα διαλυτό μιτοχονδριακό κλάσμα ενσωματώθηκε στο παρασκεύασμα της δοκιμασίας για να πυροδοτήσει την αντίδραση. Παρακολουθήθηκε η διακύμανση της οπτικής πυκνότητας (OD) στα λmax £ 550 nm για 120 δευτερόλεπτα.

2.11.2. Succinate: Ubiquinone Oxidoreductase Activity..e ποσοστό δραστικότητας ηλεκτρικής αφυδρογονάσης (σύμπλοκο II) ποσοτικοποιήθηκε (nmol οξειδωμένο ηλεκτρικό/λεπτό/mg πρωτεΐνης) ακολουθώντας την τεχνική του King [29].

Η οξείδωση του ηλεκτρικού οξέος πυροδοτείται από έναν ψευδή δέκτη ηλεκτρονίων, το κυανοφερρικό κάλιο (K3Fe(CN)6). .e μείγμα ανάλυσης που αποτελείται από ηλεκτρικό οξύ (0.63 M), 1% BSA, K3Fe(CN)6 (0.036 M) και Na+-K+ [PO4]{12}} ρυθμιστικό (0,23 Μ, ρΗ 7,6). Ένα διαλυτό μιτοχονδριακό κλάσμα ενσωματώθηκε στο παρασκεύασμα της δοκιμασίας για να πυροδοτήσει την αντίδραση. Παρακολουθήθηκε η διακύμανση της OD στο μέγιστο 420 nm για 120 δευτερόλεπτα.2.12. Προσδιορισμός βιοδεικτών οξειδωτικού στρες2.12.1. Δραστικές Ουσίες ιοβαρβιτουρικού Οξέος (TBARS).

Για την αξιολόγηση του TBARS (nmol ανά mg πρωτεΐνης) [30], ο συνδυασμός ανάλυσης (τελική ποσότητα ~4 ml) που περιλαμβάνει0.10 ml ομογενοποιημένο εγκέφαλο, 1,51 ml 4,{{ 7}}διυδροξυ-2-μερκαπτοπυριμιδίνη (0,8%), 200 μl SLS (8,18%), 1,49 ml παγοξεικού οξέος (21%, ρΗ 3,51) και 0,71 ml απιονισμένου νερού υποβλήθηκαν σε θέρμανση σε υδατόλουτρο στους 96 βαθμούς για 60 λεπτά.

Μια αναλογία 15:1 βουτυλικής αλκοόλης/αζαβενζολίου (5,1 ml) συμπληρώθηκε σε ένα μείγμα ανάλυσης που φυγοκεντρήθηκε στα 4,000 × gpower (10 λεπτά) και το υπερκείμενο απομονώθηκε.

Με ένα φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης UV1700 (Shimadzu, Ιαπωνία), χρωμοφόρο μηλονοδιαλδεΰδη-4, 6-διυδροξυ-2-μερκαπτοπυριμιδίνη OD εκτιμήθηκε σε μήκος κύματος (λmax 532 nm) και 5 ε 6 nm και 5 ε 105/M/cm (μοριακός συντελεστής εξάλειψης) εφαρμόστηκε στον υπολογισμό 4,{10}}διυδροξυ-2-μερκαπτοπυριμιδίνης.

2.12.2. Μειωμένα Επίπεδα Γλουταθειόνης (Lc-Γλουταμυλ-L-Κυστεϊνυλ-γλυκίνη). Η διαδικασία του Ellman [31] εφαρμόστηκε για την εκτίμηση της περιεκτικότητας σε L-γλουταθειόνη (GSH). .e δοκιμαστικό παρασκεύασμα που περιελάμβανε ομογενοποίηση (1,1 ml) και 1 ml 4% 2-υδροξυ-5-σουλφοβενζοϊκού οξέος (5-SSA) φυγοκεντρήθηκε (4 μοίρες) για 11 λεπτά σε ισχύ 2.500 × g .

Αργότερα, 2,8 ml Na+-K+[PO4]2- ρυθμιστικού διαλύματος (51,2 mM, pH 7,77) και {{10}},21 ml 3-καρβοξυλίου{{13 }}νιτροφαινυλ δισουλφίδιο (0.12 mM, ρΗ 7,89) αναμίχθηκαν με το παραπάνω διαχωρισμένο υπερκείμενο (0,12 ml).

Το τριπεπτίδιο (μmolGSH ανά mg πρωτεΐνης) προσδιορίστηκε ποσοτικά με το φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης UV1700 (λmax � 412 nm). εφαρμογήε � 1,36 ×104/M/cm.2.12.3.

Δραστηριότητα υπεροξειδάσης γλουταθειόνης. Η δράση της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) (EC 1.11.1.9) εκτιμήθηκε με την εφαρμογή της τεχνικής των Mohandas et al. [32]. .eanalyze μίγμα που αποτελείται από 100 μl 10% ομογενοποιημένου προϊόντος, 100 μl αζιδίου του νατρίου (1,11 mM), 100 μl EDTA (1,13 mM), 40 μl αναγωγάσης γλουταθειόνης-δισουλφιδίου (GSR, 1 IU/ml) (EC1.8.1.7), 10 μl H2O2 (0,28 mM), 40 μl Lc-γλουταμυλ-L-κυστεϊνυλ-γλυκίνη (1,2 mM), 100 μl συνένζυμου II ανηγμένο τετρανάτριο άλας (0,22 mM ) και 0,12 Μ 1,49 ml Na+-K+ [PO4]2-ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 7,4) σε ολόκληρη ποσότητα 2000 μl. Η απώλεια τετρανάτριου μειωμένου με το συνένζυμο II σε λmax £ 340 nm τεκμηριώθηκε σε θερμοκρασία 25 βαθμών. Ο ρυθμός GPx υπολογίστηκε ως nmol οξειδωμένης NADPH/λεπτό/mg πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ε 6,22 x 103/M/cm.

For more information:1950477648nn@gmail.com