Η απώλεια του JAK1 οδηγεί σε έμφυτη ανοσολογική ανεπάρκεια ​

Το μονοπάτι σηματοδότησης κινάσης Janus-μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές της μεταγραφής (JAK-STAT) είναι κρίσιμο για τον συντονισμό των ανοσολογικών αποκρίσεων και η απορρύθμισή του συνδέεται στενά με τον καρκίνο και τις ανοσολογικές διαταραχές. Η διαταραχή της οδού σηματοδότησης ιντερλευκίνης (IL)-15/STAT5 λόγω απώλειας των αλυσίδων υποδοχέων IL-15, JAK3 ή STAT5 οδηγεί σε ανοσοανεπάρκειες με ανωμαλίες κυττάρων φυσικού φονέα (NK). Το JAK1, μαζί με το JAK3 μεταδίδει σήματα κατάντη του IL-15, αλλά η ακριβής συμβολή του JAK1 στη βιολογία των κυττάρων ΝΚ μένει να διευκρινιστεί. Για να μελετήσουμε τις συνέπειες της ανεπάρκειας JAK1 σε κύτταρα ΝΚ, δημιουργήσαμε ποντίκια με υπό όρους διαγραφή του JAK1 σε κύτταρα NKp46+ (Jak1fl/flNcr1Cre). Δείχνουμε εδώ ότι η διαγραφή του εγγενούς JAK1 των ΝΚ κυττάρων μείωσε σημαντικά τον αριθμό των ΝΚ κυττάρων στο μυελό των οστών και μείωσε την ανάπτυξή τους. Στη σειρά, παρατηρήσαμε σχεδόν πλήρη απώλεια κυττάρων ΝΚ στον σπλήνα, το αίμα και το ήπαρ, αποδεικνύοντας τον κρίσιμο ρόλο του JAK1 στα περιφερειακά ΝΚ κύτταρα. Στη σειρά, τα ποντίκια Jak1fl/+Ncr1Cre εμφάνισαν σημαντικά μειωμένη επιτήρηση όγκου με τη μεσολάβηση ΝΚ κυττάρων. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το JAK2 δεν είναι σε θέση να αντισταθμίσει την απώλεια του JAK1 στα κύτταρα ΝΚ. Είναι σημαντικό ότι η υπό όρους διαγραφή του JAK2 σε κύτταρα NKp46+ δεν είχε καμία επίδραση στα περιφερειακά ΝΚ κύτταρα αποκαλύπτοντας ότι το εγγενές JAK2 των κυττάρων ΝΚ είναι απαραίτητο για την επιβίωση των ΝΚ κυττάρων. Συνοπτικά, εντοπίσαμε ότι η απώλεια του JAK1 στα κύτταρα ΝΚ οδηγεί σε έμφυτη ανοσολογική ανεπάρκεια, ενώ η ανεπάρκεια JAK2 αφήνει αναλλοίωτα τον αριθμό των κυττάρων ΝΚ και την ωρίμανση. Επομένως, προτείνουμε ότι σε αντίθεση με τους αναστολείς JAK1/JAK2 που χρησιμοποιούνται σήμερα, η χρήση ειδικών αναστολέων JAK2-θα ήταν επωφελής για τους ασθενείς αφήνοντας τα κύτταρα ΝΚ ανέπαφα.

Λέξεις-κλειδιά: JAK-STAT, φυσικά κύτταρα φονείς, JAK1, JAK2, επιτήρηση όγκου

Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα φυσικά κύτταρα φονιάς (ΝΚ) είναι έμφυτα λεμφοκύτταρα που αναγνωρίζουν και σκοτώνουν κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιούς ή μετασχηματίζονται (1). Η ανεπάρκεια κυττάρων ΝΚ είναι ένας σπάνιος αλλά όλο και περισσότερο εκτιμώμενος υποτύπος πρωτοπαθούς ανοσοανεπάρκειας (PID). Η κλασική ανεπάρκεια ΝΚ κυττάρων χαρακτηρίζεται από την απουσία κυττάρων ΝΚ στο περιφερικό αίμα και έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη ευαισθησία σε ιογενείς λοιμώξεις (2). Η κινάση Janus (JAK) - μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT) σηματοδοτική οδός δρα κατάντη πολλαπλών κυτοκινών, αυξητικών παραγόντων και ορμονών ρυθμίζοντας έτσι κριτικά τις ανοσολογικές αποκρίσεις (3, 4). Κατά τη δέσμευση ενός συγκεκριμένου συνδετήρα στον συγγενή του υποδοχέα, οι αλλαγές διαμόρφωσης οδηγούν σε ολιγομερισμό υποδοχέα και ενεργοποίηση των JAK που σχετίζονται με τον υποδοχέα. Τα JAK αυτο- και trans-φωσφορυλιώνονται το ένα το άλλο και φωσφορυλιώνονται οι αλυσίδες υποδοχέων, παρέχοντας τις θέσεις σύνδεσης για τα μόρια STAT. Στη συνέχεια, τα STAT υφίστανται φωσφορυλίωση με τη μεσολάβηση JAK, διμερίζονται και μετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου ρυθμίζουν τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων (5). Το JAK3 και το STAT5 είναι κρίσιμοι παράγοντες στη μεταγωγή του σήματος κατάντη των κυτοκινών που χρησιμοποιούν τον υποδοχέα c (6). Οι μεταλλάξεις "απώλειας λειτουργίας" (LOF) σε γονίδια που κωδικοποιούν JAK3 (7) ή STAT5B (8) οδηγούν σε PIDs με ανωμαλία των κυττάρων ΝΚ, υπογραμμίζοντας τη σημασία της οδού για τα έμφυτα λεμφοκύτταρα. Η ανοσοανεπάρκεια αυτών των ασθενών έχει εξηγηθεί από τις μειωμένες αποκρίσεις IL{-7 και IL-15 (6). Είναι σημαντικό ότι το JAK1 έχει κυρίαρχο ρόλο έναντι του JAK3 στην ενεργοποίηση του STAT5 κατάντη των υποδοχέων κυτοκίνης που περιέχουν c (9). Είναι ελκυστικό να υποθέσουμε ότι οι μεταλλάξεις LOF του JAK1 θα μπορούσαν επίσης να οδηγήσουν σε PID. Μέχρι σήμερα, μόνο ένας ασθενής που φέρει μεταλλάξεις βλαστικής σειράς JAK1, όπου το JAK1 ήταν μειωμένο αλλά δεν απουσίαζε, έχει εντοπιστεί και πράγματι παρουσιάστηκε με ανοσοκαταστολή (10). Στα ποντίκια, η πλήρης απώλεια του JAK1 οδηγεί σε περιγεννητική θνησιμότητα και τα νεογέννητα ποντίκια εμφανίζουν έντονη μείωση των θυμοκυττάρων και των Β κυττάρων (11). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν σε ενήλικα ποντίκια: η επαγόμενη διαγραφή του JAK1 οδηγεί σε βλάβη της ομοιόστασης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) και μειώνει σημαντικά τις συχνότητες των Β κυττάρων και του υποσυνόλου B220+CD11c+NK1.1+ Κύτταρα ΝΚ (12). Ωστόσο, μέχρι σήμερα, καμία μελέτη δεν έχει αναλύσει άμεσα την επίδραση της απώλειας του JAK1 σε συμβατικά κύτταρα ΝΚ.

Cistanche deserticola ma-Διατήρηση του ήπατος

Οι πρώτες γνώσεις σχετικά με τη συμβολή του JAK1 στη βιολογία των κυττάρων ΝΚ προέρχονται από μελέτες που χρησιμοποιούν αναστολείς JAK—εγκεκριμένα φάρμακα για τη θεραπεία καρκίνων και αυτοάνοσων ασθενειών (13). Τόσο τα ποντίκια όσο και οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με τον αναστολέα JAK1/JAK2 Ruxolitinib εμφάνισαν μειωμένο αριθμό κυττάρων ΝΚ, μειωμένη ωρίμανση και λειτουργία (14, 15). Εφόσον το JAK2 έχει επίσης εμπλακεί στην οδήγηση της διαφοροποίησης των ΝΚ κυττάρων (14, 16), μένει να διευκρινιστεί ποια από τις δύο κινάσες είναι υπεύθυνη για τα παρατηρούμενα αποτελέσματα της θεραπείας με Ruxolitinib. Χρησιμοποιώντας ποντίκια με νοκ-άουτ Jak1 ή Jak2 σε κύτταρα NKp{11}}, δείχνουμε εδώ ότι το JAK2 είναι απαραίτητο για την επιβίωση των κυττάρων ΝΚ. Αντίθετα, η διαγραφή του JAK1 στα ώριμα ΝΚ κύτταρα οδηγεί σε ανεπάρκεια ΝΚ κυττάρων και η απώλεια ενός αλληλόμορφου του Jak1 είναι αρκετή για να βλάψει τον έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου. Έτσι, αναγνωρίσαμε το JAK1 ως βασικό παράγοντα για ώριμα ΝΚ κύτταρα και δημιουργήσαμε ένα μοντέλο ποντικού κλασικής ανεπάρκειας ΝΚ κυττάρων.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ποντίκια και κυτταρικές γραμμές

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H· παρασχέθηκαν ευγενικά από τον Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Βιέννη, Αυστρία). Το αλληλόμορφο Jak1tm1c του μεταλλαγμένου δημιουργήθηκε από ποντίκια με το πρώτο αλληλόμορφο Jak1tm1a (περιγράφεται από την International Mouse Phenotyping Consortium https://www.mousephenotype. org) με εκτομή της κασέτας lacZ-neo μέσω ανασυνδυασμού Flp.

Το υπό όρους δυναμικό των ποντικών Jak1fl/fl ενεργοποιήθηκε με Cre-ανασυνδυασμό και εκτομή του εξωνίου 3 του Jak1 με πλευρική loxP. Ο ειδικός για τον ιστό ανασυνδυασμός προκλήθηκε με διασταύρωση Jak1fl/fl ή Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] με B6NTg(Ncr1Cre); (18) ποντίκια. Οι ποντικοί Stat5fl/fl (19) και Stat5fl/flNcr1Cre (18) περιγράφηκαν προηγουμένως. Τα ποντίκια Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre ήταν σε φόντο C57B6/N και Jak2fl/fl ήταν σε μικτό υπόβαθρο. Τα πειραματόζωα ταιριάστηκαν ανάλογα με την ηλικία (8-12 εβδομάδες) και διατηρήθηκαν υπό συγκεκριμένες συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα στο Πανεπιστήμιο Κτηνιατρικής της Βιέννης σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της Ομοσπονδίας Εργαστηριακών Ενώσεων Επιστημών των Ζώων (FELASA) (2014). Τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας και Ευημερίας των Ζώων του Πανεπιστημίου Κτηνιατρικής της Βιέννης και την εθνική αρχή (Αυστριακό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Επιστήμης και Έρευνας) σύμφωνα με τις §§ 26 επ.. of Animal Experiments Act, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, με άδειες BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 και BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 και διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της FELASA και της ARIVE. Σε όλη την εργασία, το Jak1WT αναφέρεται σε συγκεντρωμένα δεδομένα από ποντίκια Jak1fl/+ και Jak1fl/fl. Οι κυτταρικές σειρές λεμφώματος ποντικού RMA-Rae1 [παραχωρούνται ευγενικά από τον Καθ. A. Cerwenka; (20)] και YAC-1 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI1640 (Sigma) που περιείχε 10% FCS (Bio & Sell), 100 U/mL πενικιλλίνη, 100 mg/mL στρεπτομυκίνη (Sigma) και 50 μΜ {{58 }}μερκαπτοαιθανόλη (Sigma).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Μοντέλο όγκου in vivo

Σε ποντίκια Jak1fl/+ και Jak1fl/+Ncr1Cre εγχύθηκαν υποδορίως 106 κύτταρα RMA-Rae1 και στις δύο πλευρές και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν κάθε δεύτερη μέρα. Δέκα ημέρες μετά την ένεση τα ποντίκια θυσιάστηκαν και προσδιορίστηκε το βάρος του όγκου. Για την κυτταρομετρική ανάλυση ροής κυττάρων ΝΚ που διεισδύουν στον όγκο, οι όγκοι κόπηκαν σε κομμάτια ~5 mm2 και το εναιώρημα ενός κυττάρου λήφθηκε χρησιμοποιώντας gentleMACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) με ρυθμιστικό διάλυμα πέψης που περιέχει κολλαγενάση D (1 mg/mL, Sigma Aldrich). και DNAάση Ι (20 mg/mL, Roche).

Απομόνωση, Επέκταση και Διέγερση Κυττάρων ΝΚ

Κύτταρα ΝΚ απομονώθηκαν από εναιωρήματα μονοκυττάρου σπλήνας χρησιμοποιώντας σφαιρίδια MACS επισημασμένα με DX5- σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Miltenyi Biotec). Τα κύτταρα ΝΚ επεκτάθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 5,000 U/mL rhIL-2 (Proleukin, Novartis) για 7 ημέρες. Ο αριθμός των κυττάρων CD3−NK1.1+ αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής τις ημέρες 0, 3, 5 και 7. Την ημέρα 7 τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε λύση για ανάλυση Western blot. Για ανάλυση pSTAT5, 106 σπληνοκύτταρα διεγέρθηκαν με 50 ng/ml rmIL-15 (PeproTech) για 15 λεπτά και τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 2% PFA ακολουθούμενα από διαπερατότητα μεθανόλης και επανυδάτωση.

Δοκιμασία Κυτταροτοξικότητας ΝΚ-Κυττάρων

Για in vitro προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας, τα DX5-MACS-ταξινομημένα NK κύτταρα επεκτάθηκαν για 7 ημέρες σε IL-2 όπως περιγράφεται παραπάνω και αναμίχθηκαν σε ενδεικνυόμενες αναλογίες τελεστή: στόχος με διοξική καρβοξυφθοροσκεΐνη ηλεκτριμιδυλεστέρα (CFSE, Molecular Probes , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) επισημασμένα κύτταρα-στόχοι. Μετά από 4 ώρες επώασης στους 37◦C, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer) και η συγκεκριμένη λύση των κυττάρων-στόχων αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής.

Κυτταρομετρία Ροής

Παρασκευάστηκαν εναιωρήματα μονοκυττάρων από τον σπλήνα, τον μυελό των οστών ή το ήπαρ. Το ήπαρ εγχύθηκε μέσω της πυλαίας φλέβας με 5–10 mL αποστειρωμένο PBS. Ο διαχωρισμός των λεμφοκυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το 37,5% των προσωπικών (GE Healthcare). Για ανάλυση αίματος, τα ερυθροκύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα λύσης BD FACS σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (BD Bioscience). Τα αντισώματα (κλώνοι) που στοχεύουν τις ακόλουθες πρωτεΐνες αγοράστηκαν από την eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) και Ter119 (TER-119). Τα αντισώματα CD49a (Ha31/8) και pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] αγοράστηκαν από την BD Pharminogen και το pan-Rae1 (186107) από την R&D Systems. Ο συνολικός αριθμός κυττάρων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας σφαιρίδια μέτρησης Count Bright Beads (Invitrogen). Πειράματα κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκαν σε BD FACSCanto II (BD Bioscience) ή Cytoflex (Beckman Coulter) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) ή FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

ΣΧΗΜΑ 1|Η απώλεια του JAK1 στα κύτταρα NKp46+ οδηγεί σε σχεδόν πλήρη απουσία περιφερειακών κυττάρων ΝΚ. (Α) Η συχνότητα (αριστερό πλαίσιο) και οι συνολικοί αριθμοί (δεξιός πίνακας) των κυττάρων Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ NK στον μυελό των οστών αξιολογήθηκαν με ροή κυτταρομετρία. (Β) Τα κύτταρα Lin−CD122+ μυελού των οστών διαιρέθηκαν περαιτέρω σε πρόδρομες ενώσεις NK (NKPs: NKp46−NK1.1−), ανώριμα κύτταρα ΝΚ (iNKs: NKp46−NK1.1+) και ώριμα κύτταρα NKs. Κύτταρα NK (mNKs: NKp46+NK1.1+). (Γ) Η συχνότητα των CD3−NKp46+ NK κυττάρων στον σπλήνα αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής και παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις. (D, E) Η συχνότητα (αριστερό πλαίσιο) και οι συνολικοί αριθμοί (δεξιός πίνακας) των CD3−NKp46+ NK κυττάρων στον (D) σπλήνα και στο (E) αίμα αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (ΣΤ) Η συχνότητα των συμβατικών κυττάρων ΝΚ (CD3−NK1.{{24}NKp46+CD49b+, αριστερό πλαίσιο) και των κυττάρων ILC1 (CD3−NK1.1+NKp{{32}CD49a+ , δεξιό πλαίσιο) αναλύθηκε στο ήπαρ ποντικών Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre και Jak1fl/flNcr1Cre με κυτταρομετρία ροής. (A, B,D-F) Τα γραφήματα ράβδων αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM 1-2 ανεξάρτητων πειραμάτων. n=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001.

ΕΙΚΟΝΑ 2|Τα υπόλοιπα Jak1fl/flNcr1Cre NK κύτταρα δείχνουν έναν ανώριμο φαινότυπο. (Α, Β) Σπλήνα CD3−NKp46+ NK κύτταρα αναλύθηκαν για έκφραση των CD27 και CD11b με κυτταρομετρία ροής. (Α) Εμφανίζεται η συχνότητα των κυττάρων σε κάθε στάδιο ωρίμανσης: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}}CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). Ο συνολικός αριθμός κυττάρων σε κάθε στάδιο ωρίμανσης φαίνεται στο Σχήμα S1C. (Β) Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικά διαγράμματα. (Γ) κύτταρα pSTAT5(Y694)+ αναλύθηκαν εντός του πληθυσμού CD3−NKp46+NK1.1+ ex vivo μετά από διέγερση 15 λεπτών με IL-15 με κυτταρομετρία ροής. (Δ) Σπλήνα CD3−NKp{{30}} ΝΚ κύτταρα αναλύθηκαν για έκφραση των υποδεικνυόμενων ενεργοποιητικών και ανασταλτικών υποδοχέων με κυτταρομετρία ροής. Δείχνεται το ποσοστό των ΝΚ κυττάρων θετικών για κάθε υποδοχέα. Τα δεδομένα μέσης έντασης φθορισμού παρουσιάζονται στο Σχήμα S1D. (A–D) Τα γραφήματα ράβδων και οι αριθμοί στα διαγράμματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM 2 ανεξάρτητων πειραμάτων. n=5–8. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Western Blot

Κυτταρόλυση, SDS-PAGE και στυπώματα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (21). Η ανίχνευση της χημειοφωταύγειας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα Clarity Western ECL (BioRad) και το ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) και αναλύθηκε από το λογισμικό Image Lab (BioRad). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-ακτίνη (C4, sc-47778) από τη Santa Cruz ως έλεγχος φόρτωσης, anti-JAK2 (D2E12; #3230), antiPerforin (#3693) και anti-JAK1 (#3332 ) από την τεχνολογία Cell Signaling Technology.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Στατιστική ανάλυση

Πραγματοποιήθηκαν μη ζευγαρωμένες δοκιμές t ή μονόδρομες δοκιμές ANOVA με Tukey με χρήση της έκδοσης 5 του GraphPad Prism.00 (Λογισμικό GraphPad). Το επίπεδο σημαντικότητας υποδεικνύεται για κάθε πείραμα (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p <0,001).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η διαγραφή JAK1 μειώνει τους αριθμούς κυττάρων NK και ILC1 με τρόπο που εξαρτάται από τη δόση

Ο αναστολέας JAK1/JAK2 Ruxolitinib έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τον αριθμό των κυττάρων ΝΚ, την ωρίμανση και τη λειτουργία (14, 15). Για να συγκρίνουμε και να αντιμετωπίσουμε τη συνεισφορά των JAK1 και JAK2 για τη βιολογία των κυττάρων ΝΚ, δημιουργήσαμε ποντίκια με υπό όρους διαγραφή είτε του JAK1 είτε του JAK2 σε κύτταρα NKp46+. Έτσι διασταυρώσαμε ποντίκια Ncr1Cre (18) με Jak1fl/fl ή Jak2fl/fl [βλ. ενότητα Υλικά και Μέθοδοι και (17)] ποντίκια, αντίστοιχα. Τα NK κύτταρα αναπτύσσονται στον μυελό των οστών από πρόδρομους κυτταρικούς NK (NKPs), οι οποίοι ορίζονται ως Lin−CD122+NK1.1−NKp46−. Αναπτύσσονται σε ανώριμα κύτταρα ΝΚ (iNKs) που γίνονται NK1.1+ ενώ μόνο τα ώριμα NK κύτταρα (mNKs) είναι NK1.1+NKp46+ (22). Καθώς η έκφραση ανασυνδυάσης Cre σε ποντικούς Ncr1Cre καθοδηγείται από τον προαγωγέα NKp46, η διαμεσολαβούμενη από Cre διαγραφή περιορίζεται στα κύτταρα ΝΚ. Παρατηρήσαμε σημαντική μείωση στο ποσοστό και τον συνολικό αριθμό των ΝΚ κυττάρων του μυελού των οστών σε ποντικούς Jak1fl/flNcr1Cre (Εικόνα 1Α). Τα κύτταρα Lin−CD122+ NK σε ποντικούς Jak1fl/flNcr1Cre εμφάνισαν εμπλουτισμένα ποσοστά προδρόμων κυττάρων ΝΚ (NKPs) και ανώριμων κυττάρων ΝΚ, ενώ τα mNKs μειώθηκαν σημαντικά στον μυελό των οστών σύμφωνα με ένα αναπτυξιακό αποκλεισμό στο κύτταρο iNK στάδιο που εμποδίζει την εξέλιξη σε στάδιο mNK κυττάρων (Εικόνα 1Β). Η διαγραφή ενός αλληλόμορφου του Jak1 οδήγησε σε ενδιάμεσους αριθμούς ΝΚ κυττάρων μυελού των οστών (Εικόνα 1Α). Με συνέπεια, η ανάπτυξη κυττάρων ΝΚ έδειξε έναν ενδιάμεσο φαινότυπο που υποδηλώνει μια επίδραση δοσολογίας γονιδίου Jak1 στην ανάπτυξη των κυττάρων ΝΚ (Εικόνα 1Β). Ο αποκλεισμός στην ανάπτυξη ΝΚ κυττάρων μυελού των οστών μεταφράστηκε σε δραστικά μειωμένο αριθμό κυττάρων ΝΚ στην περιφέρεια. Η απώλεια του JAK1 οδήγησε σε σχεδόν πλήρη ανεπάρκεια σπληνικών και ΝΚ κυττάρων του αίματος (Εικόνες 1C–E). Σύμφωνα με ένα αποτέλεσμα δοσολογίας γονιδίου Jak1, τα ποντίκια Jak1fl/+Ncr1Cre εμφάνισαν μειωμένα ποσοστά και συνολικούς αριθμούς κυττάρων ΝΚ στο 50% σε σύγκριση με τα άγριου τύπου νεογνά στη σπλήνα και στο αίμα (Εικόνες 1C–E). Η διαγραφή του JAK1 κατάντη τελεστή και του μεταγραφικού παράγοντα STAT5 σε κύτταρα NKp46+ οδηγεί επίσης σε μείωση των ώριμων ΝΚ κυττάρων (18). Μια άμεση σύγκριση ποντικών Jak1fl/flNcr1Cre και Stat5fl/flNcr1Cre αποκάλυψε ότι η διαγραφή του JAK1 προκάλεσε ακόμη πιο έντονη ανεπάρκεια ΝΚ κυττάρων στον σπλήνα και στο αίμα από τη διαγραφή του STAT5 (Εικόνες S1A, B). Τα έμφυτα λεμφοκύτταρα του ήπατος NKp46+ περιλαμβάνουν δύο ομάδες διακριτών σειρών (23). Τα συμβατικά κύτταρα ΝΚ (cNK) χαρακτηρίζονται από την έκφραση του CD49b και κυκλοφορούν ελεύθερα, ενώ τα εγγενή λεμφοκύτταρα τύπου 1 (ILC1) που κατοικούν στο ήπαρ χαρακτηρίζονται από την έκφραση του CD49a και περιορίζονται στο ήπαρ (24). Ομοίως με τον σπλήνα και το αίμα, τα cNKs του ήπατος και τα ILC1 που κατοικούν στον ιστό καταργήθηκαν σχεδόν πλήρως μετά την απώλεια του JAK1 (Εικόνα 1F). Και πάλι η διαγραφή ενός αλληλόμορφου του Jak1 είχε ως αποτέλεσμα μια ενδιάμεση αφθονία εγγενών λεμφοκυττάρων στο ήπαρ (Εικόνα 1ΣΤ). Συνοπτικά, αυτά τα ευρήματα μας οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση του JAK1 σε κύτταρα NKp46+ είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και τη διατήρηση των κυττάρων ΝΚ στα περιφερειακά όργανα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Το JAK1 είναι ζωτικής σημασίας για την ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ

Στην περιφέρεια, τα κύτταρα ΝΚ υφίστανται στάδια ωρίμανσης τα οποία χαρακτηρίζονται από διαδοχική έκφραση επιφανειακών δεικτών CD27 και CD11b (22). Ένα αλληλόμορφο του Jak1 ήταν αρκετό για να οδηγήσει την ωρίμανση των ΝΚ κυττάρων καθώς δεν εντοπίσαμε διαφορές στο ποσοστό των κυττάρων σε κάθε στάδιο ωρίμανσης μεταξύ των κυττάρων Jak1WT και Jak1fl/+Ncr1Cre (Εικόνες 2Α, Β). Τα υπόλοιπα Jak1fl/flNcr1Cre NK κύτταρα έδειξαν αύξηση στον ανώριμο πληθυσμό (CD27+CD11b-) και μείωση στον ώριμο πληθυσμό CD27−CD11b+ (Εικόνες 2Α, Β και Εικόνα S1C). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι τα υπόλοιπα κύτταρα μπορεί απλώς να έχουν χάσει το JAK1 και να μην έχουν λάβει επαρκή σηματοδότηση IL-15 για να ωριμάσουν πλήρως. Πράγματι, τα υπόλοιπα Jak1fl/flNcr1Cre ΝΚ κύτταρα έδειξαν μειωμένη φωσφορυλίωση του STAT5 ex vivo κατά τη βραχυπρόθεσμη διέγερση με IL-15 (Εικόνα 2C). Η δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων ελέγχεται από μια ισορροπία μεταξύ ενεργοποιητικών και ανασταλτικών υποδοχέων. Η διαγραφή ούτε ενός ούτε και των δύο αλληλόμορφων του Jak1 είχε επίδραση στο ποσοστό των ΝΚ κυττάρων που εκφράζουν τους ακόλουθους ενεργοποιητικούς και ανασταλτικούς υποδοχείς: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E και Ly49A (Εικόνα 2D). Η πιο εμφανής διαφορά ήταν μια ελαφρά μείωση στα Ly49G2+ NK κύτταρα και μια αύξηση στα DNAM-1+ NK κύτταρα στα ποντίκια Jak1fl/flNcr1Cre (Εικόνα 2D). Ομοίως, δεν ανιχνεύθηκαν μεγάλες διαφορές στο επίπεδο έκφρασης (MFI) κάθε υποδοχέα, εκτός από μια αύξηση στο MFI του DNAM1 και του Ly49G2 (Εικόνα S1D). Εκτός από τον ρόλο του ως ενεργοποιητικού υποδοχέα, η έκφραση DNAM- 1 σηματοδοτεί ένα αναπτυξιακό βήμα. Τα κύτταρα DNAM-1+ δημιουργούν κύτταρα DNAM-1- (25). Θεωρήσαμε ότι οι αλλαγές στο DNAM-1+ αντικατοπτρίζουν το μπλοκ ωρίμανσης των κυττάρων Jak1fl/flNcr1Cre NK.

ΣΧΗΜΑ 3|Το JAK2 είναι απαραίτητο για την επιβίωση και την ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ. (Α) Η συχνότητα (αριστερό πλαίσιο) και ο συνολικός αριθμός (δεξιό πλαίσιο) των CD3 −NKp46+ NK κυττάρων στους σπλήνες των ποντικών Jak2WT και Jak2fl/flNcr1Cre αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Β) Σπλήνα CD3−NKp46+ NK κύτταρα αναλύθηκαν για έκφραση των CD27 και CD11b με κυτταρομετρία ροής. Η συχνότητα των κυττάρων σε κάθε στάδιο ωρίμανσης εμφανίζεται: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (Γ) Η έκφραση του JAK2 και της -ακτίνης αναλύθηκε με στύπωμα Western σε κύτταρα ΝΚ σε 6 ημέρες επέκτασης σε IL-2. Σαρώσεις πλήρους κηλίδων είναι διαθέσιμες στο Συμπληρωματικό Υλικό. (A,B) Τα γραφήματα ράβδων αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SEM 2-3 ανεξάρτητων πειραμάτων. n=5–12.

ΕΙΚΟΝΑ 4|Η απώλεια ενός αλληλίου του Jak1 βλάπτει τη δραστηριότητα των κυττάρων ΝΚ. (Α) Τα κύτταρα ΝΚ καθαρίστηκαν με MACS από σπλήνες και καλλιεργήθηκαν σε IL-2 για 7 ημέρες. Ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων CD3−NK1.1+NKp46+ αξιολογούνταν κάθε 2-3 ημέρες. Τα σύμβολα και οι γραμμές σφάλματος που υπάρχουν σημαίνει ± SEM 2–4 βιολογικών αντιγράφων. (Β) Η έκφραση των JAK1, Perforin και -ακτίνης αναλύθηκε σε διευρυμένα κύτταρα ΝΚ από δύο ανεξάρτητα πειράματα με στύπωμα Western. Σαρώσεις πλήρους κηλίδων είναι διαθέσιμες στο Συμπληρωματικό Υλικό. (Γ) Διευρυμένα κύτταρα NK από ποντίκια Jak1WT και Jak1fl/+Ncr1Cr αναμίχθηκαν με κύτταρα στόχους YAC{{20}} που έχουν χρωματιστεί με CFSE (αριστερό πλαίσιο) ή RMA-Rae1 (δεξιό πλαίσιο) σε υποδεικνυόμενες αναλογίες στόχων τελεστών . Η συγκεκριμένη λύση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Για το YAC-1 εμφανίζεται ένα αντιπροσωπευτικό γράφημα ενός από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Τα σύμβολα και οι γραμμές σφάλματος παρουσιάζουν τον μέσο όρο ± SEM 2 τεχνικών αντιγράφων. Για το RMA-Rae1 παρουσιάζεται ένας μέσος όρος από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Τα σύμβολα και οι γραμμές σφάλματος που υπάρχουν σημαίνει ± SEM 2–3 βιολογικών αντιγράφων. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Το JAK2 είναι διαθέσιμο για την επιβίωση και την ωρίμανση των κυττάρων NK

Μέχρι στιγμής έχουμε δείξει ότι η ενδογενής διαγραφή JAK1 των ΝΚ κυττάρων οδηγεί σε ανεπάρκεια ΝΚ κυττάρων. Για να αποσαφηνιστεί εάν το JAK2 επηρεάζει την επιβίωση και την ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ, αναλύσαμε τα σπληνικά κύτταρα ΝΚ σε ποντικούς Jak2fl/flNcr1Cre και τα άγριου τύπου γέννα τους. Δεν καταφέραμε να εντοπίσουμε οποιαδήποτε επίδραση της διαγραφής JAK2 στη συχνότητα ή στον συνολικό αριθμό των κυττάρων CD3−NKp46+ στον σπλήνα (Εικόνα 3Α). Επιπλέον, τα ποντίκια Jak2fl/flNcr1Cre εμφάνισαν φυσιολογική ωρίμανση κυττάρων ΝΚ, καθώς παρόμοια ποσοστά κυττάρων CD27−CD11b+ ανιχνεύθηκαν και στους δύο γονότυπους (Εικόνα 3Β). Καθώς η διαγραφή της πρωτεΐνης JAK2 στα κύτταρα ΝΚ ήταν πολύ αποτελεσματική (Εικόνα 3C), αυτά τα δεδομένα ορίζουν κατηγορηματικά ότι σε αντίθεση με το JAK1, το εγγενές JAK2 των κυττάρων ΝΚ είναι απαραίτητο για την επιβίωση και την ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ.

Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Η απώλεια ενός αλληλίου του Jak1 βλάπτει τη λειτουργικότητα των κυττάρων NK

Για να λάβουμε περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο το JAK1 ρυθμίζει τη λειτουργικότητα των ΝΚ κυττάρων, αναλύσαμε την ανάπτυξη των καθαρισμένων με MACS σπληνικών κυττάρων ΝΚ από τα Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre και Jak1fl/flNcr1Cre. Τα κύτταρα ΝΚ με ανεπάρκεια JAK1-δεν επεκτάθηκαν, γεγονός που δείχνει ότι ακόμη και κάτω από μια πολύ υψηλή δόση IL-2 άλλα JAK δεν μπορούν να αντισταθμίσουν την απώλεια του JAK1 (Εικόνα 4Α). Η απώλεια ενός αλληλόμορφου του Jak1 είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή ανεπάρκεια ανάπτυξης (Εικόνα 4Α). Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε τη μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης JAK1 σε διευρυμένα κύτταρα Jak1fl/+Ncr1Cre ΝΚ η οποία ήταν παράλληλη με μειωμένα επίπεδα περφορίνης (Εικόνα 4Β). Στη σειρά, τα κύτταρα ΝΚ Jak1fl/+Ncr1Cre εμφάνισαν εξασθενημένη κυτταροτοξική δραστηριότητα έναντι των κυτταρικών σειρών-στόχων YAC-1 και RMA-Rae1 (Εικόνα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το JAK1 δεν είναι μόνο απαραίτητο για τη διατήρηση των ΝΚ κυττάρων στην περιφέρεια, αλλά συμβάλλει επίσης στην κυτταροτοξική τους δράση.

Η εξάντληση των κυττάρων NK που προκαλείται από την απώλεια ενός αλληλίου του Jak1 βλάπτει την επιτήρηση του όγκου

Τα κύτταρα ΝΚ είναι ζωτικής σημασίας για την έγκαιρη αναγνώριση και εξάλειψη των μετασχηματισμένων κυττάρων. Για να διερευνήσουμε εάν η μείωση των κυττάρων ΝΚ και η μειωμένη λειτουργικότητά τους σε ποντικούς Jak1fl/+Ncr1Cre οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία στην ανάπτυξη όγκου και δεν αντισταθμίζεται με άλλα μέσα, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα λεμφώματος RMA-Rae1. Αυτή η κυτταρική σειρά είναι ένα εργαλείο για τη μελέτη της επιτήρησης όγκων που εξαρτάται από τα κύτταρα ΝΚ με ισχυρό και αποτελεσματικό τρόπο (20). Μεταμοσχεύσαμε υποδορίως κύτταρα λεμφώματος RMA-Rae1 και στις δύο πλευρές των ποντικών Jak1fl/+ και Jak1fl/+Ncr1Cre. Η έλλειψη ενός αλληλόμορφου του Jak1 μείωσε την ικανότητα των ΝΚ κυττάρων να ελέγχουν την ανάπτυξη του όγκου όπως απεικονίζεται από το αυξημένο μέγεθος όγκου (Εικόνα 5Α) και το βάρος του όγκου στο Jak1fl/+Ncr1Cre (Εικόνα 5Β). Στη σειρά, αυτοί οι όγκοι έδειξαν σημαντικά μειωμένη διήθηση κυττάρων ΝΚ (Εικόνες 5C, D). Δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουμε καμία διαφορά στη συχνότητα των ΝΚ κυττάρων που διεισδύουν στον όγκο NKG2D+ (Εικόνα 5Ε), τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για την αναγνώριση των όγκων RMA-Rae1. Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο μειωμένος αριθμός κυττάρων ΝΚ σε συνδυασμό με μια εξασθενημένη λειτουργικότητα των κυττάρων ΝΚ σε ποντικούς Jak1fl/+Ncr1Cre επαρκούν για να επηρεάσουν σημαντικά τον έλεγχο ανάπτυξης του όγκου in vivo.

ΕΙΚΟΝΑ 5|Η απώλεια ενός αλληλόμορφου του Jak1 βλάπτει την επιτήρηση του όγκου. (Α, Β) Σε ποντίκια Jak1fl/+ και Jak1fl/+Ncr1Cre εγχύθηκαν υποδορίως 106 κύτταρα RMA-Rae1 και μετά από 10 ημέρες αξιολογήθηκε το βάρος του όγκου. Εμφανίζονται (Α) αντιπροσωπευτικές εικόνες όγκου και (Β) διαγράμματα με κουκκίδες με οριζόντιες γραμμές που αντιπροσωπεύουν το μέσο βάρος όγκου ± SEM από 2 ανεξάρτητα πειράματα. n=6–8 (C, D) ΝΚ κύτταρα διείσδυσης όγκου αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικά διαγράμματα κυττάρων CD3−NKp46+ που διεισδύουν σε όγκο και το ποσοστό τους μεταξύ των κυττάρων Rae1−. (D) Ο συνολικός αριθμός κυττάρων CD3−NKp46+ που διεισδύουν στον όγκο ανά γραμμάριο όγκου και (E) ποσοστά NKG2D+ NK κυττάρων παρουσιάζονται ως γραφήματα ράβδων που δείχνουν μέσο όρο ± SEM από ένα πείραμα n=4– 5. ***p < 0,001.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η απορρύθμιση της οδού σηματοδότησης JAK-STAT συνδέεται στενά με την ανάπτυξη καρκίνου καθώς και με διαταραχές του ανοσοποιητικού συστήματος (7). Η πρώτη συνδεδεμένη με το JAK ασθένεια που ανακαλύφθηκε ήταν η σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) που χαρακτηριζόταν από ανωμαλίες των ΝΚ κυττάρων που προκαλούνται από μεταλλάξεις LOF JAK3 (26, 27). Εδώ δείχνουμε ότι η διαγραφή του JAK1 στα κύτταρα NKp46+ οδηγεί σε έμφυτη ανοσολογική ανεπάρκεια με απώλεια κυττάρων NK και ILC1 στα περιφερειακά όργανα, ενώ το JAK2 είναι περιττό για την επιβίωση και την ωρίμανση των ΝΚ κυττάρων. Η προηγούμενη εργασία μας αποκάλυψε ότι η απώλεια STAT5 σε κύτταρα ΝΚ οδηγεί σε σοβαρή μείωση του αριθμού των κυττάρων ΝΚ στα περιφερειακά όργανα (18). Η απώλεια κυττάρων ΝΚ σε ποντίκια Stat5fl/flNcr1Cre διασώθηκε με επιβεβλημένη έκφραση του μορίου προ-επιβίωσης BCL2 (28). Αυτή η μελέτη όρισε το STAT5 ως κρίσιμο παράγοντα επιβίωσης για τα κύτταρα ΝΚ. Τα ποντίκια με έλλειψη STAT5B στερούνται σε μεγάλο βαθμό κύτταρα ΝΚ (29), σύμφωνα με το γεγονός ότι το STAT5 σηματοδοτεί κατάντη κυτοκινών που είναι ζωτικής σημασίας για τη βιολογία των κυττάρων ΝΚ, όπως η IL-2 ή η IL-15 (30). Το IL-15 είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη και την επιβίωση των ΝΚ κυττάρων καθώς τα ποντίκια Il15−/− στερούνται σε μεγάλο βαθμό περιφερειακά κύτταρα ΝΚ (31). Το IL-15 σηματοδοτεί μέσω ενός συμπλέγματος υποδοχέα αλυσίδας υποδοχέα c, IL-2R και IL-15r (32). Τα ποντίκια νοκ-άουτ κάθε αλυσίδας υποδοχέα αποδεικνύουν έναν απολύτως κρίσιμο ρόλο για τα σήματα που αποστέλλονται κατάντη της IL-15 για την ανάπτυξη των κυττάρων ΝΚ (33, 34). Μέχρι σήμερα, η συμβολή του JAK3 που σχετίζεται με το c στην ανάπτυξη των κυττάρων ΝΚ έχει καθιερωθεί καλά. Τα ποντίκια με ανεπάρκεια JAK3 εμφανίζουν παρόμοιο φαινότυπο SCID όπως παρατηρείται σε ανθρώπους ασθενείς και η ανάπτυξη ΝΚ κυττάρων μπλοκάρεται στο προ-ΝΚ προγονικό στάδιο (35, 36). Τώρα τοποθετούμε το JAK1 που δεν είχε εκτιμηθεί προηγουμένως ως κρίσιμο μέρος του άξονα IL{-15/STAT5 στα κύτταρα ΝΚ. Τα κύτταρα ΝΚ Jak1fl/flNcr1Cre εμφανίζουν αναπτυξιακό αποκλεισμό στο στάδιο των κυττάρων iNK και σχεδόν πλήρη απώλεια κυττάρων ΝΚ στα περιφερειακά όργανα.

Είναι ενδιαφέρον ότι οι συνέπειες της διαγραφής JAK1 για τα κύτταρα ΝΚ υπερβαίνουν τα αποτελέσματα της ανεπάρκειας STAT5-. Η βλάβη της συνδυασμένης ενεργοποίησης STAT3 και STAT5 μπορεί να αποτελεί τη βάση της πιο έντονης απώλειας ΝΚ κυττάρων, καθώς η STAT3 έχει αποδειχθεί ότι επάγει την έκφραση του κρίσιμου γονιδίου επιβίωσης των κυττάρων ΝΚ Mcl1 (37, 38). Εναλλακτικά, το JAK1 και το STAT5 μπορεί να έχουν διαφορετικούς χρόνους ημιζωής που αντιστοιχούν σε διαφορετικές συχνότητες "απλώς διαγραφέων" - κύτταρα ΝΚ που μόλις έχουν χάσει το γονίδιο αλλά εξακολουθούν να φέρουν την πρωτεΐνη, γεγονός που μπορεί να εξηγεί τις διαφορές. Το αποτέλεσμα της γονιδιακής δοσολογίας της ανεπάρκειας του JAK1-αντανακλάται στους αριθμούς των ΝΚ κυττάρων, ενώ η απώλεια ενός αλληλόμορφου του JAK1 είναι απαραίτητη για την ωρίμανση των ΝΚ κυττάρων. Αυτό υποδηλώνει ότι το ενεργοποιημένο STAT5 είναι περιοριστικό για την επιβίωση των ΝΚ κυττάρων αλλά όχι για την ωρίμανση. Η διαγραφή ενός αλληλόμορφου του Jak1 είναι επίσης επαρκής για να βλάψει σημαντικά την επιτήρηση του όγκου με βάση τον μειωμένο αριθμό κυττάρων ΝΚ σε συνδυασμό με μια μειωμένη λειτουργικότητα των υπόλοιπων ΝΚ κυττάρων. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας, η ειδική για τα κύτταρα ΝΚ διαγραφή του γονιδίου στόχου STAT5 Mcl1 οδηγεί σε σοβαρή ανεπάρκεια ΝΚ κυττάρων που προκαλεί σημαντική αύξηση του μεταστατικού φορτίου (38).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Τα JAK μπορεί να εμφανίζουν περιττές λειτουργίες και να αντισταθμίζουν το ένα το άλλο. Κατάντη του υποδοχέα ιντερφερόνης JAK1 μπορεί εν μέρει να αντισταθμίσει την απώλεια της δραστικότητας της JAK2 κινάσης (39). Το JAK2 έχει επίσης αποδειχθεί ότι φωσφορυλιώνει το STAT5 κατάντη της IL-15 κατά την in vitro διαφοροποίηση των ΝΚ κυττάρων (16). Από την άλλη πλευρά, το συστατικά ενεργό JAK2 μπορεί μόνο μέτρια να αντισταθμίσει την απώλεια του JAK1 στα βλαστοκύτταρα υποδηλώνοντας έναν μη περιττό ρόλο του JAK1 και του 2 στα HSC. Συνακόλουθα, παρατηρούμε ότι απουσία JAK1, το JAK2 αποτυγχάνει να αντισταθμίσει την ενεργοποίηση του STAT5, ακόμη και υπό υψηλή δόση IL-2 in vitro, για να επιτρέψει την επιβίωση των ΝΚ κυττάρων. Μένει να διευκρινιστεί εάν μπορούν να επιτευχθούν αντισταθμιστικά αποτελέσματα εκφράζοντας μια συστατικά ενεργή μορφή του JAK2. Το πιο σημαντικό, δείχνουμε ότι η απώλεια του JAK2 σε κύτταρα NKp46+ είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων ΝΚ. Τα ανεπαρκή κύτταρα ΝΚ{19}}JAK είναι πλήρως ώριμα, αποδεικνύοντας ότι το εγγενές JAK2 των κυττάρων ΝΚ δεν οδηγεί την ωρίμανση των κυττάρων ΝΚ. Αυτό υποδεικνύει επίσης ότι η εξασθενημένη ωρίμανση των ΝΚ κυττάρων σε ποντικούς Jak2fl/flMx1Cre (14) πιθανότατα προκαλείται από εξωγενείς λειτουργίες των κυττάρων ΝΚ του JAK2. Θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι η συστατική διαγραφή του JAK2 αλλάζει το περιβάλλον της κυτοκίνης.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Φυσικά κύτταρα φονιάς: ανάπτυξη, ωρίμανση και κλινική χρήση. Front Immunol. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Orange JS. Φυσική ανεπάρκεια φονικών κυττάρων. J Allergy Clin Immunol. (2013) 132:515-25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK και STAT σηματοδοτικά μόρια σε ανοσορύθμιση και ανοσοδιαμεσολαβούμενη νόσο. Immunity (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Stark GR, Darnell JE. Το μονοπάτι JAK-STAT στα είκοσι. Immunity (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Shuai K, Liu B. Ρύθμιση της σηματοδότησης JAK-STAT στο ανοσοποιητικό σύστημα. Nat Rev Immunol. (2003) 3:900–11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAKs και STATs στην ανοσία, την ανοσοανεπάρκεια και τον καρκίνο. N Engl J Med. (2013) 368:161-70. doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. Η ρύθμιση των JAKs στη σηματοδότηση κυτοκίνης και η διάσπασή της στη νόσο. Κυτοκίνη (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [Epub πριν από την εκτύπωση].

8. Lorenzini T, Dotta L, Giacomelli M, Vairo D, Badolato R. Μεταλλάξεις STAT ως εναλλάκτες προγραμμάτων: μετατροπή πρωτογενών ανοσοανεπάρκειων σε αυτοάνοσες ασθένειες. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G, et al. Το Jak1 έχει κυρίαρχο ρόλο έναντι του Jak3 στη μεταγωγή σήματος μέσω υποδοχέων κυτοκίνης που περιέχουν c. Chem Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Eletto D, Burns SO, Angulo Ι, Plagnol V, Gilmour KC, Henriquez F, et αϊ. Διαλληλικές μεταλλάξεις JAK1 σε ανοσοανεπαρκή ασθενή με μυκοβακτηριακή λοίμωξη. Nat Commun. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe ΡΑ, Riley JK, Arthur CD, et αϊ. Η διακοπή του γονιδίου Jak1 καταδεικνύει υποχρεωτικούς και μη περιττούς ρόλους των Jaks σε βιολογικές αποκρίσεις που προκαλούνται από κυτοκίνη. Cell (1998) 93:373-83.

12. Kleppe Μ, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi Ε, et αϊ. Το Jak1 Ενσωματώνει την αίσθηση κυτοκίνης για τη ρύθμιση της λειτουργίας των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων και την αιμοποίηση του στρες. Cell Stem Cell (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Schwartz DM, Kanno Y, Villarino A, Ward M, Gadina M, O'Shea JJ. Η αναστολή JAK ως θεραπευτική στρατηγική για ανοσολογικές και φλεγμονώδεις νόσους. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos Α, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli Α, Frei Α, Tzankov Α, et al. Η μειωμένη ανοσοεπιτήρηση όγκου ΝΚ ως συνέπεια της αναστολής του JAK ενισχύει τη μετάσταση σε μοντέλα καρκίνου του μαστού. Nat Commun. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Schönberg Κ, Rudolph J, Vonnahme Μ, Parampalli Yajnanarayana S, Cornez Ι, Hejazi Μ, et αϊ. Η αναστολή του JAK βλάπτει τη λειτουργία των ΝΚ κυττάρων σε μυελοπολλαπλασιαστικά νεοπλάσματα. Cancer Res. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Kim WS, Kim MJ, Kim DO, Byun JE, Huy H, Song HY, et al. Ο καταστολέας της σηματοδότησης κυτοκίνης 2 ρυθμίζει αρνητικά τη διαφοροποίηση των ΝΚ κυττάρων αναστέλλοντας τη δραστηριότητα του JAK2. Sci Rep. (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Krempler A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Δημιουργία ενός αλληλίου υπό όρους νοκ-άουτ για το γονίδιο Janus kinase 2 (Jak2) σε ποντίκια. Genesis (2004) 40:52-7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart Ε, Warsch W, Zebedin Ε, Simma Ο, Stoiber D, Kolbe Τ, et αϊ. Ένα νέο ποντίκι Ncr1 -Cre αποκαλύπτει τον ουσιαστικό ρόλο του STAT5 για την επιβίωση και την ανάπτυξη των ΝΚ-κυττάρων. Blood (2011) 117:1565-74. doi: 10.1182/blood-2010-06-291633

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C, et αϊ. Η απενεργοποίηση του Stat5 στο επιθήλιο του μαστού ποντικού κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης αποκαλύπτει διακριτές λειτουργίες στον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. ΜοΙ Cell ΒίοΙ. (2004) 18:8037-47. doi: 10.1128/MCB.24.18.{10}}.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Η έκτοπη έκφραση του πρώιμου επαγόμενου-1 γονιδίου του ρετινοϊκού οξέος (RAE-1) επιτρέπει την απόρριψη με τη μεσολάβηση κυττάρων φυσικού φονέα ενός όγκου που φέρει MHC κατηγορίας Ι in vivo. Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ. (2001) 98:11521-6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz Ε, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar Α, Wirth S, Berger Α, et αϊ. Η διαμεσολαβούμενη από το CDK STAT1-Φωσφορυλίωση S727 περιορίζει την κυτταροτοξικότητα των ΝΚ κυττάρων και την επιτήρηση του όγκου. Cell Rep. (2013) 4:437-44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Geiger TL, Sun JC. Ανάπτυξη και ωρίμανση φυσικών φονικών κυττάρων. Curr Opin Immunol. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas Β, Yang L, Pak-Wittel Μ, Artyomov ΜΝ, Ivanova Υ, et αϊ. Τα κύτταρα φυσικού φονέα (NK) που κατοικούν στον ιστό είναι κυτταρικές σειρές που διαφέρουν από τα κύτταρα του θυμικού και τα συμβατικά κύτταρα ΝΚ του σπλήνα. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng Η, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei Η, Gao X, et αϊ. Τα κύτταρα ΝΚ που κατοικούν στο ήπαρ προσδίδουν προσαρμοστική ανοσία στη φλεγμονή με την επαφή με το δέρμα. J Clin Invest. (2013) 123:1444-56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Martinet L, Ferrari De Andrade L, Guillerey C, Lee JS, Liu J, Souza-Fonseca Guimaraes F, et al. Η έκφραση DNAM-1 σηματοδοτεί ένα εναλλακτικό πρόγραμμα ωρίμανσης κυττάρων ΝΚ. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F, et al. Μεταλλάξεις του γονιδίου Jak-3 σε ασθενείς με αυτοσωμική σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID). Nature (1995) 377(6544):65–8.

27. Russell SM, Tayebi N, Nakajima Η, Riedy MC, Roberts JL, Aman MJ, et αϊ. Μετάλλαξη του Jak3 σε ασθενή με SCID: ουσιαστικός ρόλος του Jak3 στην ανάπτυξη λεμφοειδών. Science (1995) 270:797-800.

28. Gotthardt D, Putz ΕΜ, Grundschober Ε, Prchal-Murphy Μ, Straka Ε, Kudweis Ρ, et αϊ. Το STAT5 είναι ένας βασικός ρυθμιστής στα κύτταρα ΝΚ και λειτουργεί ως ο μοριακός διακόπτης από την επιτήρηση του όγκου στην προώθηση του όγκου. Cancer Discov. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino Α V., Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti Β, Robinson GW, et al. Τα κατώφλια STAT5 που ορίζονται από υποσύνολα και ιστούς ελέγχουν την ομοιόσταση και τη λειτουργία των εγγενών λεμφοειδών κυττάρων. J Εχρ Med. (2017) 214:2999–3014. doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais Α, Viel S, Grau Μ, Henry Τ, Marvel J, Walzer Τ. Ρύθμιση ανάπτυξης και λειτουργίας κυττάρων ΝΚ ποντικού από κυτοκίνες. Front Immunol. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy ΜΚ, Glaccum Μ, Brown SN, Butz ΕΑ, Viney JL, Embers Μ, et αϊ. Αναστρέψιμα ελαττώματα σε γενεαλογίες CD8 Τ κυττάρων φυσικού δολοφόνου και μνήμης σε ποντίκια με έλλειψη ιντερλευκίνης 15-. J Εχρ Med. (2000) 191:771-80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ikemizu S, Chirifu Μ, Davis SJ. Συμπλέγματα σηματοδότησης IL-2 και IL-15: διαφορετικά αλλά ίδια. Nat Immunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett Μ, et αϊ. Διαφοροποίηση φυσικών φονικών κυττάρων: πληροφορίες από μοντέλα νοκ-άουτ και διαγονιδιακών ποντικιών και συστήματα in vitro. Immunol Rev. (1998) 165:47-61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, et al. Ο υποδοχέας IL-15 διατηρεί τη λεμφική ομοιόσταση υποστηρίζοντας την επιστροφή και τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων. Immunity (1998) 9:669-76.

35. Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, et al. Αναπτυξιακά ελαττώματα λεμφοειδών κυττάρων σε ποντικούς με έλλειψη κινάσης Jak3. Immunity (1995) 3:771-82.

36. Robinette ML, Cella Μ, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder Κ, et αϊ. Η ανεπάρκεια Jak3 εμποδίζει την έμφυτη ανάπτυξη των λεμφικών κυττάρων. Mucosal Immunol. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD, et al. Το sorafenib ευαισθητοποιεί τους συμπαγείς όγκους σε αντισώματα αγωνιστή υποδοχέα Apo2L/TRAIL και Apo2L/TRAIL από τον άξονα Jak2-Stat3-Mcl1. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ, et al. Έμφυτη ανοσοανεπάρκεια μετά από γενετική αφαίρεση του Mcl1 σε κύτταρα φυσικών φονέων. Nat Commun. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil Ε, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling Μ, Liebfried Ρ, Strobl Β, et αϊ. Σημαντική λειτουργία ικριώματος της κινάσης Janus 2 που αποκαλύφθηκε από ένα νέο μοντέλο ποντικιού που φιλοξενεί μια μετάλλαξη βρόχου ενεργοποίησης Jak2. Blood (2014) 123:520–9. doi: 10.1182/blood-2013-03-492157