Η λαμιβουδίνη βελτιώνει τη γνωστική παρακμή σε ποντίκια SAMP8: Ενσωμάτωση in Vivo Φαρμακολογικής Αξιολόγησης και Φαρμακολογίας Δικτύου Ⅱ

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Το 3TC αναστρέφει την απώλεια σωματικού βάρους που προκαλείται από τη γήρανση και βελτιώνει τη βαθμολογία γήρανσης

Οι αλλαγές σωματικού βάρους των ποντικών σε διαφορετικές πειραματικές ομάδες φαίνονται στο Σχήμα 1Δ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα ποντίκια κέρδισαν σωματικό βάρος σε 4 εβδομάδες. Κάτω από μια τυπική δίαιτα, τα ποντίκια SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με 3TC κέρδισαν βάρος πιο γρήγορα από αυτά που έλαβαν θεραπεία με οχήματα. Τα αποτελέσματα των βαθμολογιών γήρανσης πριν και μετά τις θεραπείες του 3TC ή του φορέα έδειξαν ότι οι μέσες βαθμολογίες γήρανσης των ποντικών SAMP8 ήταν σχετικά υψηλότερες, ενώ η αντίστροφη τάση επιτεύχθηκε με τη θεραπεία με 3TC (Εικόνα 1Ε). Τα αποτελέσματα των βαθμολογιών που σχετίζονται με τη γήρανση κάθε ομάδας ποντικών που συλλέχθηκαν την τελευταία ημέρα του πειράματος έδειξαν ότι τα ποντίκια SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με 3TC εμφάνισαν σημαντικές βελτιώσεις σε αρκετές βαθμολογίες γήρανσης, συμπεριλαμβανομένης της γυαλάδας του δέρματος (ρ < 0. 01, t=3.901), η αδιαφάνεια του κερατοειδούς (p < 0,01, t=4,753) και το έλκος του κερατοειδούς (p < 0,05 , t=6.125) (Συμπληρωματικός Πίνακας S1).

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε πώς λειτουργεί το Cistanche στη γνωστική λειτουργίαΚαι λάβετε προϊόντα προς πώληση

3.2|Το 3TC βελτιώνει τη γνωστική έκπτωση των ποντικών SAMP8

Οι δοκιμές λαβύρινθου νερού Morris πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση τουγνωστικές επιδράσειςτου 3TC (Εικόνα 2). Τα αποτελέσματα των τροχιών και των πειραμάτων κατευθυντικής πλοήγησης για πέντε διαδοχικές ημέρες έδειξαν ότι τα ποντίκια SAMR1 εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερες καθυστερήσεις διαφυγής από εκείνα των ποντικών SAMP8 (p < 0.05, t=3. 194) (Εικόνα 2Α–Β). Ωστόσο, την τρίτη και την πέμπτη ημέρα, οι λανθάνοντες χρόνοι διαφυγής των ποντικών SAMP8 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3TC ήταν σημαντικά μικρότεροι σε σύγκριση με τα ποντίκια SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με όχημα (p < 0,05, t=3,115), ενώ δεν υπήρχε στατιστική Η σημασία αποκαλύφθηκε σε σύγκριση με την ομάδα SAMR1. Αν και η ταχύτητα κολύμβησης των ποντικών SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με 3TC την πρώτη ημέρα ήταν σημαντικά ταχύτερη από αυτή των άλλων δύο ομάδων, δεν εντοπίστηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών πειραματικών ομάδων στις επόμενες 4 ημέρες των πειραμάτων (Εικόνα 2C).

Τα αποτελέσματα των δοκιμών ανιχνευτή και η τροχιά την 6η ημέρα έδειξαν ότι τόσο η ομάδα SAMP8 που υποβλήθηκε σε θεραπεία με SAMR1 όσο και η ομάδα SAMP8 που υποβλήθηκε σε αγωγή με 3TC πέρασαν περισσότερο χρόνο στο τεταρτημόριο στόχο από την ομάδα SAMP8 που υποβλήθηκε σε θεραπεία με όχημα (p < 0.{{{{ 19}}5, t=4.512· Εικόνα 2D–E). Επιπλέον, ο αριθμός των διασταυρώσεων ήταν επίσης μεγαλύτερος τόσο στα ποντίκια SAMR1 όσο και στην ομάδα SAMP8 που έλαβε αγωγή με 3TC από ό,τι στην ομάδα SAMP8 που έλαβε θεραπεία με όχημα, με μια στατιστικά σημαντική διαφορά αποκαλύφθηκε μεταξύ των ομάδων με και χωρίς τη θεραπεία με 3TC (p < 0.05, t=5.79· Εικόνα 2F). Η ομάδα SAMP8 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα έδειξε τους υψηλότερους λανθάνοντες χρόνους για την εύρεση της πλατφόρμας κάτω από το νερό μεταξύ όλων των ομάδων με μια στατιστικά σημαντική διαφορά που αποκαλύφθηκε μεταξύ των ομάδων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και δεν έλαβαν θεραπεία με 3TC (p < 0,05, t=4 .415· Εικόνα 2G).

ΣΧΗΜΑ 2 Τα αποτελέσματα της θεραπείας με 3TC στις βελτιώσεις της γνωστικής έκπτωσης σε ποντικούς SAMP8. (Α) Χάρτης τροχιάς ποντικών μετά την είσοδο στο νερό από το δεύτερο τεταρτημόριο κατά τη διάρκεια της δοκιμής πλοήγησης θέσης την 5η ημέρα. (Β) Διαφυγή καθυστέρησης στο πείραμα πλοήγησης θέσης για κάθε ομάδα. (Γ) Ταχύτητα κολύμβησης ποντικών σε κάθε ομάδα σε δοκιμές συμπεριφοράς. (Δ) Χάρτης τροχιάς ποντικών στο πείραμα εξερεύνησης του διαστήματος. (Ε) Ποσοστό του συνολικού χρόνου που αφιερώθηκε στο τεταρτημόριο στόχο κατά τη διάρκεια των δοκιμών ανίχνευσης σε κάθε ομάδα. (ΣΤ) Ο αριθμός των φορών που τα ποντίκια διέσχισαν την πλατφόρμα σε κάθε ομάδα στις δοκιμές ανιχνευτών. (Ζ) Χρόνος διαφυγής για στόχο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Τεστ μαθητή: *p < 0.05, **p < 0.01 και ***p < 0,001. ns: καμία στατιστική σημασία. Οι μαύροι αστερίσκοι ή "ns" αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα οχημάτων SAMR1 plus. Οι κόκκινοι αστερίσκοι ή "ns" αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα οχημάτων SAMP8 plus. Κάθε ομάδα αποτελούνταν από τουλάχιστον οκτώ ζώα

3.3|Τα γονίδια-στόχοι του 3TC αποκαλύφθηκαν με την ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το 3TC μπορεί να μειώσει τα σήματα απόκρισης SASP και IFN-I στα λεία μυϊκά κύτταρα των ηλικιωμένων ποντικών, αλλά δεν υπάρχει αναφορά για τα σχετικά γονίδια νευρολογικής εκφυλιστικής νόσου στον εγκεφαλικό ιστό. Για να διερευνήσουμε την επίδραση του 3TC στον εγκέφαλο των ποντικών, διερευνήσαμε την έκφραση δέκα υποψηφίων γονιδίων ενδιαφέροντος στον ιππόκαμπο και τον φλοιό των ποντικών χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο. Στον ιππόκαμπο (Εικόνα 3Α), τα σημαντικά ρυθμισμένα προς τα πάνω γονίδια για τη γήρανση (ομάδες SAMR1 έναντι SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με όχημα) περιλάμβαναν ένα γονίδιο που σχετίζεται με το τρανσποζόνιο (L1-ORF1, p < 0. 05), τρία γονίδια απόκρισης IFN-I (Ifna, Irf7 και Oas1, p < {{20}}.05), δύο γονίδια που σχετίζονται με την AD (PS{ {19}} και APP, p < {0.01) και τρία αντιπροσωπευτικά γονίδια SASP (Il6, Mmp3 και Pai1, p < 0.01), ενώ η σημαντική μείωση -ρυθμισμένα γονίδια για θεραπεία 3TC (ομάδες SAMP8 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα έναντι SAMP8 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 3TC) περιελάμβαναν ένα γονίδιο που σχετίζεται με το τρανσποζόνιο (L1-ORF2, p <0,05), δύο γονίδια απόκρισης IFN-I (Ifna και Oas1, p < 0,001) και τρία αντιπροσωπευτικά γονίδια SASP (Il6, Mmp3 και Pai1, p < 0,01). Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν στον φλοιό, αν και η προς τα πάνω ρύθμιση του γονιδίου που σχετίζεται με την AD μειώθηκε με τη θεραπεία του 3TC στον φλοιό σε σύγκριση με τον ιππόκαμπο (ρ < 0,05, Εικόνα 3Β).

3.4|Το 3TC εξασθενεί μορφολογικές ανωμαλίες και απώλεια νευρώνων στον ιππόκαμπο ποντικών SAMP8 που προκαλείται από τη γήρανση

Εφαρμόσαμε και τις δύο μεθόδους χρώσης H & E και Nissl για να διερευνήσουμε τις μορφολογικές αλλαγές που προκαλούνται από το 3TC στον ιππόκαμπο, ο οποίος ήταν η βασική περιοχή της γνώσης και της μνήμης. Σε σύγκριση με την ομάδα του SAMR1 που υποβλήθηκε σε αγωγή με ένα όχημα, η ομάδα του SAMP8 που υποβλήθηκε σε θεραπεία με ένα όχημα έδειξε αυξημένο ρυθμό κάθαρσης των νευρώνων του ιππόκαμπου, ελαφρώς διαταραγμένη διάταξη των κυττάρων, πυρηνική συγκέντρωση που βρέθηκε σε ορισμένους νευρώνες και ήπιο οίδημα ιππόκαμπου. Αυτές οι βλάβες βελτιώθηκαν στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με 3TC (Εικόνα 4Α). Οι απώλειες βιώσιμων νευρωνικών κυττάρων θετικών για Nissl με τυπική νευροπαθολογική αλλαγή παρατηρήθηκαν στην ομάδα SAMP8 με βάση τη χρώση Nissl, ενώ αυτές οι αλλαγές αντιστράφηκαν εν μέρει στην ομάδα των SAMP8 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3TC (Εικόνα 4B–C). Ο θάνατος νευρώνων στον ιππόκαμπο ανιχνεύθηκε επίσης με χρώση TUNEL με τις περισσότερες και τις λιγότερες ποσότητες θετικών στο TUNEL κυττάρων (πράσινα) που παρατηρήθηκαν στην ομάδα των SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με όχημα και στην ομάδα SAMR1 που υποβλήθηκε σε θεραπεία με όχημα, αντίστοιχα, ενώ η ομάδα των Το SAMP8 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3TC αποκαλύφθηκε σημαντικά λιγότερο από την ομάδα SAMP8 που υποβλήθηκε σε θεραπεία με όχημα (Εικόνα 4D–E).

3,5|Υποτιθέμενοι στόχοι του 3TC

Η φαρμακολογική ανάλυση δικτύου αποκάλυψε συνολικά 269 πρωτεΐνες ως προβλεπόμενους στόχους για 3TC με 164 να προσδιορίζονται από τη βάση δεδομένων Pharmmapper και 105 από τη βάση δεδομένων ChEMBL, αντίστοιχα (Συμπληρωματικός Πίνακας S3). Το δίκτυο PPI κατασκευάστηκε με βάση τα γονίδια-στόχους του 3TC χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων String με συνολικά 32 κόμβους πυρήνα στο δίκτυο που προσδιορίζονται ως οι βασικοί στόχοι του 3TC στα ποντίκια SAMP8 (Εικόνα 5Α). Χρησιμοποιήσαμε το String 9.1 για να μιμηθούμε τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ βασικών πρωτεϊνών-στόχων του 3TC για να αναγνωρίσουμε τρεις ομάδες πρωτεϊνών με παρόμοιες λειτουργίες (Εικόνα 5Β).

3.6|Ανάλυση εμπλουτισμού των δικτύων βασικών στόχων 3TC

3.6.1|GO Ανάλυση

Η ανάλυση εμπλουτισμού GO των γονιδίων-στόχων που εντοπίστηκαν υπό την επεξεργασία του 3TC χρησιμοποιώντας STRING αποκάλυψε συνολικά 550 βιολογικές διεργασίες με p < 0.05 (Εικόνα 6Α, Συμπληρωματικός Πίνακας S4), όπως η απόκριση σε όξινη χημική ουσία, απόκριση σε δραστικά είδη οξυγόνου και αρνητική ρύθμιση της αποπτωτικής διαδικασίας. Η ανάλυση GO εντόπισε επίσης συνολικά 23 κυτταρικά συστατικά με p < 0,01, όπως το σύστημα ενδομεμβράνης, το κυτοπλασματικό κυστίδιο, το κυστίδιο, το κυτταροπλασματικό τμήμα και το τμήμα της πλασματικής μεμβράνης (Συμπληρωματικός Πίνακας S5), ενώ συνολικά 69 μοριακές λειτουργίες αναγνωρίστηκαν από Η ανάλυση GO ομαδοποιήθηκε σε συνολικά 19 κατηγορίες (Συμπληρωματικός Πίνακας S6). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο όρος δέσμευσης πρωτεΐνης tau, με τον οποίο πιστεύεται ότι συνδέεταιΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερ, έδειξε σημαντική σχέση με το 3TC (p < 0.05).

3.6.2|Μεταβολικά μονοπάτια των δικτύων-στόχων 3TC

Συνολικά 109 σημαντικά μονοπάτια θεραπείας εξετάστηκαν με ανάλυση KEGG (ρ < 0.05; Εικόνα 6Β; Συμπληρωματικός Πίνακας S7) με πολλές οδούς που σχετίζονται με καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. μονοπάτια στον καρκίνο, τη χημική καρκινογένεση, τον καρκίνο του προστάτη, τις πρωτεογλυκάνες στον καρκίνο και τα microRNA στον καρκίνο. Τρεις οδοί που αποκαλύφθηκαν ότι σχετίζονται με τη νευροφλεγμονή, τον κυτταρικό θάνατο και τη μετάδοση νευρωνικού σήματος περιελάμβαναν τη σηματοδότηση οιστρογόνων (p < {0.0001), την κινάση του φωσφορικού ινοσιτιδίου 3- και την κινάση πρωτεΐνης Β (PI3K/Akt) (p < 0,0001), και τα μονοπάτια σηματοδότησης αλληλεπίδρασης νευροενεργού συνδέτη-υποδοχέα (p < 0,001).27-29

3.6.3|Λειτουργία δέσμευσης

Πραγματοποιήθηκαν μελέτες σύνδεσης μεταξύ 3TC και τριών επιλεγμένων πιθανών στόχων, δηλαδή ο EGFR που αντιπροσωπεύει το μονοπάτι σηματοδότησης των οιστρογόνων, το AKT1 που αντιπροσωπεύει το μονοπάτι σηματοδότησης P13K/Akt και το ADRB2 που αντιπροσωπεύει το μονοπάτι σηματοδότησης αλληλεπίδρασης νευροενεργού συνδέτη-υποδοχέα. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης τρόπου δέσμευσης έδειξαν (Εικόνα 6C) ότι τα υπολείμματα αμινοξέων Thr854, Asn842, Arg841 και Glu762 της πρωτεΐνης υποδοχέα EGFR αλληλεπιδρούν με μικρά μόρια συνδέτη 3TC για να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου, ενώ τα υπολείμματα αμινοξέων Lys55, Val4, Οι Met111, Val158, Asn114, Leu168, Ser155, Asp169, Lys153, Asn156s και Gly35 σχημάτισαν υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με μικρά μόρια του συνδέτη 3TC. Τα υπολείμματα αμινοξέων Asp292, Glu191, His194, Glu198s και Thr195 της πρωτεΐνης υποδοχέα AKT1 σχημάτισαν αλληλεπίδραση δεσμού υδρογόνου με 3TC, ενώ τα υπολείμματα αμινοξέων Phe179, Leu295, Glu198 και Lys179 σχημάτισαν αλληλεπίδραση με υδρόφοβο 3TC. Τα υπολείμματα αμινοξέων Asp331 και Phe332 του ADRB2 αλληλεπιδρούν με το 3TC για να σχηματίσουν έναν δεσμό υδρογόνου, ενώ τα υπολείμματα αμινοξέων Phe336, Ala335, Val54, Ala57, Ile58, Leu64, Asn69, Ile72 και Pro330 του υδροφοβικού δεσμού σχηματίζουν αλληλεπίδραση με ABRTC. Αυτά τα αποτελέσματα των μελετών σύνδεσης παρείχαν στοιχεία για τη δέσμευση του 3TC στους στόχους του, κάτι που ήταν σημαντικό για την κατανόηση του μηχανισμού δράσης του φαρμάκου. Περαιτέρω πραγματοποιήσαμε πειράματα in vitro για να επαληθεύσουμε τα αποτελέσματα της ανάλυσης βιοπληροφορικής

ΣΧΗΜΑ 3 Επιδράσεις της θεραπείας με 3TC στις εκφράσεις υποψήφιων γονιδίων σε ιστούς εγκεφάλου ποντικού. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα ή 3TC συνεχώς για 4 εβδομάδες. Για όλες τις καταστάσεις, η έκφραση των L1-ORF1 και L1-ORF2, τριών αντιπροσωπευτικών γονιδίων απόκρισης IFN-I (Ifna, Irf7 και Oas1), δύοΓονίδια που σχετίζονται με τη νόσο Αλτσχάιμερ(PS{0}} και APP) και τρία αντιπροσωπευτικά γονίδια SASP (Il6, Mmp3 και Pai1) στον ιππόκαμπο (Α) και τον φλοιό (Β) αξιολογήθηκαν με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο με το προφίλ έκφρασης των γονιδίων που εμφανίζονται στο ιστόγραμμα. Τεστ μαθητή: *p < 0.05, **p <0,01 και ***p < 0,001. ns: καμία στατιστική σημασία. Οι μαύροι αστερίσκοι ή "ns" αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα οχημάτων SAMR1 plus. Οι κόκκινοι αστερίσκοι ή "ns" αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα οχημάτων SAMP8 plus.

3.7|Το 3TC προστατεύει τα κύτταρα HT22 από την επαγόμενη από FA κυτταροτοξικότητα ρυθμίζοντας μια ποικιλία μορίων

Για να διερευνήσουμε τα αποτελέσματα του 3TC ως αναστολέα ανάστροφης μεταγραφάσης σε γηρασμένους νευρώνες in vitro, προκαλέσαμε τη γήρανση σε κύτταρα HT22 με FA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η LINE-1 ενεργοποιήθηκε στους γηρασμένους νευρώνες και αυτή η τάση αντιστράφηκε από το 3TC (Εικόνα 7A–B). Επιπλέον, το 3TC έδειξε ανταγωνιστικό αποτέλεσμα στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από FA (Εικόνα 7C). Όπως αναμενόταν, η διέγερση των κυττάρων TH22 με FA για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αναστολή στην έκφραση των EGFR, p-AKT1 και ADRB2 (ρ < 0.001), σε σύγκριση με τον μάρτυρα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία χωρίς θεραπεία, όπως αναμενόταν. , ενώ η ταυτόχρονη θεραπεία με 3TC οδήγησε σε σημαντικά αυξημένη έκφραση των επαγόμενων από FA EGFR, p-AKT1 και ADRB2 (ρ < 0,001; Εικόνα 7D,E).

4|ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Οι γνωστικές εκπτώσεις, ιδιαίτερα η απώλεια μνήμης, συνδέονται συνήθως με τη φυσική γήρανση. οεπιπτώσεις της γήρανσηςείναι ιδιαίτερα έντονες στον προμετωπιαίο φλοιό και στον ιππόκαμπο, τις περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται κρίσιμα στη γνωστική λειτουργία και τη διάθεση.30 Τα ποντίκια SAMP8 προήλθαν από τη σειρά SAM-P/2 ως μοντέλο άνοιας σε ποντίκια που γερνά ταχέως. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι τα ποντίκια SAMP8 εμφάνισαν σχετιζόμενη με την ηλικία γνωστική έκπτωση με σύντομη διάρκεια ζωής, εμφανίζοντας προοδευτικά ελλείμματα μάθησης και μνήμης καθώς και νευροπαθολογικά χαρακτηριστικά άνοιας στον προμετωπιαίο φλοιό και στον ιππόκαμπο.31 Η διάρκεια ζωής των ποντικών SAMP8 είναι σχεδόν η μισή. του SAMR1, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για το SAMP8.32 Στη μελέτη μας, τα ποντίκια SAMP8 επιλέχθηκαν ως ιδανικό ζωικό μοντέλο για τη διερεύνηση της μείωσης της γνωστικής λειτουργίας κατά τη γήρανση, με τα ομόλογα κανονικά αναπτυσσόμενα ποντίκια SAMR1 να χρησιμοποιούνται ως αντι- ομάδα ελέγχου γήρανσης

ΣΧΗΜΑ {{0}}Το TC μειώνει τη νευρωνική βλάβη στον ιππόκαμπο ποντικών SAMP8. (Α) Φωτομικρογραφίες τμημάτων ιππόκαμπου που έχουν χρωματιστεί με H & E για κάθε ομάδα ποντικών (ράβδος=50 μm). Τα μαύρα βέλη σηματοδοτούν τους συγκεντρωμένους πυρήνες και τα μπλε βέλη επισημαίνουν περιοχές όπου οι νευρώνες χάνονται σοβαρά και διαταράσσονται. (Β) Προσδιορισμός νευρωνικής επιβίωσης με χρώση Nissl στον ιππόκαμπο (ράβδος=20 μm). (Γ) Η ποσότητα των υγιών νευρωνικών κυττάρων σε κάθε οπτικό πεδίο με πυκνά χρωματισμένα σώματα Nissl. (D) Εικόνες αποπτωτικών κυττάρων που σημειώνονται με δοκιμασία TUNEL (Πράσινο) σε κάθε ομάδα ποντικών (bar=20 μm). (Ε) Ποσοτικοποίηση των θετικών στο TUNEL κυττάρων σε κάθε οπτικό πεδίο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Student's t-test: ***p < 0,001. Οι μαύροι αστερίσκοι αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα οχημάτων SAMR1 plus. Οι κόκκινοι αστερίσκοι αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα οχημάτων SAMP8 plus.

Η γήρανση συνήθως προκαλεί το σώμα να χάσει βάρος λόγω απώλειας οστού, μυϊκής ατροφίας και δυσλειτουργίας του πεπτικού συστήματος.33 Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το 3TC μείωσε εν μέρει την τάση απώλειας βάρους. Σε σύγκριση με τα ποντίκια που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία, τα ποντίκια SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με 3TC έδειξαν μια τάση να αυξάνουν το σωματικό τους βάρος με την ηλικία. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με αυτά που αναφέρθηκαν προηγουμένως, υποδηλώνοντας ότι το 3TC βελτιώνει την υγεία των σωμάτων των ποντικών.34 Προκειμένου να αξιολογηθούν αντικειμενικά και με ακρίβεια τα αποτελέσματα της θεραπείας με 3TC στη βελτίωση τηςχαρακτηριστικά γήρανσηςποντικών, καταγράψαμε τις βαθμολογίες γήρανσης κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι με την αύξηση του χρόνου θεραπείας 3TC, τα ποντίκια SAMP8 έδειξαν τάση να επιβραδύνουν τη γήρανση. Συγκεκριμένα, η θεραπεία του 3TC έπαιξε σημαντικό ρόλο στη βελτίωση της γυαλάδας του δέρματος, της αδιαφάνειας του κερατοειδούς και του έλκους του κερατοειδούς που προκαλείται από τη γήρανση σε ποντίκια SAMP8. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο στόχος κατά της γήρανσης του 3TC υπάρχει στο δέρμα και στους ιστούς του κερατοειδούς. Προηγούμενες μελέτες επιβεβαίωσαν ότι το L1 χρησιμοποιήθηκε ως στόχος για τη βελτίωση των εκφυλιστικών ασθενειών που προκαλούνται από τη γήρανση, ενώ οι αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης συμπεριλαμβανομένου του 3TC χρησιμοποιήθηκαν ως μεταφερόμενοι αναστολείς του L1.13 Μέχρι σήμερα, ο μοριακός μηχανισμός του ρόλου του L1 στο νευρικό σύστημα και το Η δυνατότητα θεραπείας ασθενειών που σχετίζονται με το νευρικό σύστημα όπως η ΝΑ με τη ρύθμιση του L1 δεν έχουν εξηγηθεί πειστικά. Επιπλέον, μελέτες έχουν προτείνει ότι ο γενετικός ανασυνδυασμός στο γονίδιο APP μπορεί να είναι ένα βασικό συμβάν στην παθογένεση της σποραδικής AD, η οποία είναι ένας τύπος άνοιας. Δεν έχει αναφερθεί ανασυνδυασμός νευρωνικού γονιδίου 15, ενώ η εμφάνισή του και βλάβες στο DNA και τα ενδιάμεσα RNA απαιτούν δραστηριότητες αντίστροφης μεταγραφάσης των πρωτεϊνικών λειτουργιών. Επομένως, οι αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης όπως ο 3TC μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο στην πρόληψη και τη θεραπεία της AD που προκαλεί γνωστική έκπτωση. Αυτή η εικασία επιβεβαιώθηκε από τα αποτελέσματά μας των πειραμάτων με υδάτινο λαβύρινθο Morris που ερευνούσαν τις επιδράσεις του 3TC στη γνωστική ικανότητα σε ποντικούς SAMP8.

ΣΧΗΜΑ 7 Πειράματα in vitro επιβεβαίωσαν τα βασικά μόρια του 3TC έναντι του νευρωνικού εκφυλισμού. Η γήρανση των κυττάρων HT22 του νευρώνα ποντικού επάγεται από τη φορμαλδεΰδη (FA). (Α) Ανίχνευση ανοσοφθορισμού LINE-1 ORF1p σε ομάδες ελέγχου, FA και FA συν 3TC (bar=20 μm). (Β) Ποσοτικοποίηση της ανάλυσης ανοσοφθορισμού στο (Α). (Γ) Ποσοτικοποίηση των επιζώντων νευρώνων ανά πεδίο ×400 σε διάφορες ομάδες. (Δ) EGFR, ρ-ΑΚΤ1 και ADRB2 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western. (Ε) Ποσοτικοποίηση ανάλυσης στυπώματος Western στο (D). Student's t-test: ***p < 0,001. Οι μαύροι αστερίσκοι αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Οι κόκκινοι αστερίσκοι αντιπροσωπεύουν μια σύγκριση με την ομάδα FA

Τα αποτελέσματά μας από τις δοκιμές λαβύρινθου νερού Morris έδειξαν ότι μετά από 5 ημέρες προπόνησης κολύμβησης, τα ποντίκια SAMP8 που είχαν λάβει από το στόμα 3TC μπόρεσαν να βρουν την κρυμμένη πλατφόρμα πιο γρήγορα από τα ποντίκια SAMP8 που δεν είχαν λάβει θεραπεία. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 3TC έδειξαν μεγαλύτερο σωματικό βάρος, το οποίο μπορεί να σχετίζεται με τον αριθμό των σκελετικών μυών, καταγράψαμε την ταχύτητα κολύμβησης κάθε ομάδας ποντικών προκειμένου να εξαλειφθεί η επίδραση της μυϊκής δύναμης. Αν και τα ποντίκια που έλαβαν 3TC κολύμπησαν γρηγορότερα από άλλες ομάδες την πρώτη ημέρα της προπόνησης κολύμβησης, η διαφορά δεν παρέμεινε στις επόμενες 4 ημέρες. Ως εκ τούτου, αποκλείουμε την επίδραση της μυϊκής δύναμης στα αποτελέσματα των δοκιμών λαβύρινθου νερού. Ομοίως, τα αποτελέσματα του πειράματος εξερεύνησης του διαστήματος την 6η ημέρα έδειξαν ότι τα ποντίκια SAMP8 που έλαβαν θεραπεία με 3TC έδειξαν μια τάση να βρίσκουν την αρχική πλατφόρμα πιο ενεργά από τα ποντίκια που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με 3TC βελτιώνει τις γνωστικές μειώσεις και τη μνήμη που προκαλούνται από τη γήρανση σε ποντικούς SAMP8. Για να διερευνήσουμε τους πιθανούς μοριακούς μηχανισμούς του 3TC που βελτιώνουν τη γήρανση του εγκεφάλου, εφαρμόσαμε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο για να μετρήσουμε τα επίπεδα mRNA των υποψηφίων γονιδίων στον ιππόκαμπο και τους ιστούς του φλοιού κάθε ομάδας ποντικών. Τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι η θεραπεία με 3TC ανέστειλε την L1 που προκλήθηκε από τη γήρανση στον εγκέφαλο και μείωσε την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με IFN, SASP και AD, υποδεικνύοντας ότι οι οδοί σήματος που ενεργοποιήθηκαν από τη γήρανση καταστέλλονταν από τη θεραπεία με 3TC. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το 3TC μπορεί να ενισχύσει τους φαινοτύπους της ευφυΐας και της γήρανσης αναστέλλοντας τη μεταφορά L1 για να βελτιώσει τελικά τη χρόνια φλεγμονή στον εγκέφαλο που προκαλείται από τη γήρανση. Σημειώνουμε ότι απαιτούνται περισσότερες μελέτες για την παροχή ισχυρής υποστήριξης για αυτούς τους μοριακούς μηχανισμούς βελτίωσης της γήρανσης του εγκεφάλου με τη θεραπεία 3TC που αποκαλύφθηκε σε αυτή τη μελέτη. Επί του παρόντος, η έρευνα για τον φαρμακολογικό μηχανισμό των αναστολέων της ανάστροφης μεταγραφάσης στα νευρικά κύτταρα διεξάγεται στο εργαστήριό μας χρησιμοποιώντας μοντέλα γήρανσης γλοιακών και νευρωνικών κυττάρων in vitro.

Τα αποτελέσματά μας των πειραμάτων χρώσης HE και Nissl έδειξαν ότι το 3TC αποκατέστησε την απώλεια νευρώνων στον ιππόκαμπο που προκλήθηκε απόγηράσκων, βελτιώνοντας τελικά τον νευροεκφυλισμό με τη διάσωση των νευρώνων από το θάνατο. Επιπλέον, παρατηρήσαμε περισσότερα αποπτωτικά κύτταρα στον ιππόκαμπο των ποντικών SAMP8 σε σύγκριση με τα ποντίκια SAMR1. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν περαιτέρω ότι η θεραπεία με 3TC μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων, πιθανώς λόγω της άμεσης επίδρασης του 3TC στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αποπτωτική οδό ή σε άλλα μόρια προς τα πάνω.

Η μάθηση και η μνήμη είναι σημαντικές γνωστικές ικανότητες που περιλαμβάνουν ένα σύνθετο δίκτυο λειτουργικών περιοχών του εγκεφάλου που συνεργάζονται για τη διαχείριση και την επεξεργασία πληροφοριών. Ως εκ τούτου, οποιεσδήποτε ενώσεις παρουσιάζουν επιδράσεις στον εγκέφαλο θα πρέπει να λαμβάνονται με προσοχή με τους πιθανούς στόχους τους πλήρως κατανοητούς. Η δικτυακή φαρμακολογική προσέγγιση είναι μια συστηματική αναλυτική τεχνολογία που χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση των δικτύων αλληλεπίδρασης πολλαπλών παραγόντων, όπως ασθένειες, φάρμακα, γονίδια και πρωτεϊνικούς στόχους. Διεξάγαμε τις φαρμακολογικές αναλύσεις δικτύου, συμπεριλαμβανομένων των αναλύσεων PPI και εμπλουτισμού, με βάση συνολικά 269 πιθανούς στόχους (με 32 βασικούς στόχους) του 3TC με σχολιασμούς χρησιμοποιώντας βάσεις δεδομένων Pharmmapper και ChEMBL. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το 3TC μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση των φυσιολογικών λειτουργιών του νευρικού συστήματος τόσο μέσω της σηματοδότησης των οιστρογόνων όσο και των οδών σηματοδότησης αλληλεπίδρασης PI3K/Akt και νευροενεργού συνδέτη-υποδοχέα, γεγονός που εξηγεί περαιτέρω τις επιδράσεις του 3TC στην προστασία των φυσιολογικών νευρικών λειτουργιών και την αναστολή του θανάτου των νευρωνικών κυττάρων. Επιλέχθηκαν αντιπροσωπευτικά μόρια στα σχετικά μονοπάτια για τη διεξαγωγή πειραμάτων μοριακής σύνδεσης και in vitro για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της βιοπληροφορικής ανάλυσης. Προκειμένου να παρασχεθούν περισσότερα στοιχεία για την υποστήριξη αυτών των εικαζόμενων μοριακών μηχανισμών του 3TC που λειτουργούν συνεργιστικά με το νευρικό σύστημα, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τον εντοπισμό των ακριβών συστατικών που εμπλέκονται και ρυθμίζονται σε αυτές τις οδούς.

Ως μέρος τουαντιρετροϊκή θεραπεία(ART), το 3TC έχει μελετηθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια και έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του ιού της χρόνιας ηπατίτιδας Β (HBV).35 Πρέπει να σημειωθεί ότι εάν το 3TC χρησιμοποιείται για τη θεραπείανευροεκφυλιστικές βλάβες που σχετίζονται με τη γήρανση, είναι απαραίτητο να εξεταστεί η φαρμακολογική του τοξικότητα λόγω του αδύναμου ανοσοποιητικού συστήματος σε ηλικιωμένους πληθυσμούς και καρκινοπαθείς. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες του 3TC περιλαμβάνουν λοίμωξη της ανώτερης αναπνευστικής οδού, ναυτία, έμετο, κοιλιακό άλγος και διάρροια. Επομένως, η κλινική εφαρμογή του 3TC θα πρέπει να είναι εξαιρετικά προσεκτική. Προς το παρόν, το 3TC μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως φαρμακολογικό εργαλείο για τη μελέτη μοριακών μηχανισμών αλλά όχι ως υποτιθέμενη θεραπεία. Συνοπτικά, η μελέτη μας έδειξε για πρώτη φορά ότι το 3TC βελτιώνει τις γνωστικές λειτουργίες των ποντικών SAMP8 αναστρέφοντας τη γήρανση του εγκεφάλου, παρέχοντας πειραματικά στοιχεία για τη χρήση αναστολέων ανάστροφης μεταγραφάσης ως πιθανές θεραπείες για νευροεκφυλιστικές ασθένειες.

ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81670942, 81470704 και 81972057).

ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Baulac S, Lu Η, Strahle J, et al. Αυξημένη έκφραση του DJ-1 υπό οξειδωτικό στρες και μέσαΕγκέφαλοι της νόσου του Αλτσχάιμερ. ΜοΙ Νευροεκφυλιστικό. 2009; 4:12.

2. Delgado-Lara DL, González-Enríquez GV, Torres-Mendoza BM, et al. Επίδραση της χορήγησης μελατονίνης στα γονίδια ρολογιού PER1 και BMAL1 σε ασθενείς μεΝόσος Πάρκινσον. Biomed Pharmacother. 2020;129:110485.

3. Agatonovic-Kustrin S, Kettle C, Morton DW. Μια μοριακή προσέγγιση στην ανάπτυξη φαρμάκων για τη νόσο του Αλτσχάιμερ. Biomed Pharmacother. 2018;106:553-565.

4. Khosla S, Farr JN, Tchkonia T, Kirkland JL. Ο ρόλος της κυτταρικής γήρανσης στη γήρανση και στις ενδοκρινικές παθήσεις. Nat Rev Endocrinol. 2020;16:263-275.

5. Zolfaghari MA, Karimi A, Kalantari E, et al. Μια συγκριτική μελέτη της ανοσοαντιδραστικότητας πρωτεΐνης με μακρό διάσπαρτο στοιχείο-1 σε δερματικές κακοήθειες. Καρκίνος BMC. 2020; 20:567.

6. Sae-Lee C, Biasi J, Robinson Ν, et αϊ. Μοτίβα μεθυλίωσης DNA των LINE-1 και Alu για προσυμπτωματική άνοια σε διαβήτη τύπου 2. PLoS One. 2020; 15: e0234578. 7. Baeken MW, Moosmann Β, Hajieva Ρ. Ενεργοποίηση ρετροτρανσποζονίου από διαταραγμένα μιτοχόνδρια σε νευρώνες. Biochem Biophys Res Commun. 2020;525:570-575. 8. Jones RB, Garrison KE, Wong JC, Duan EH, Nixon DF, Ostrowski MA. Οι αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης νουκλεοσιδικών αναλόγων αναστέλλουν διαφορικά την ρετρομετάθεση του ανθρώπινου LINE-1. PLoS One. 2008; 3: e1547