Η ανεπάρκεια του στοχευόμενου επιθηλίου μιτοχονδριακού παράγοντα μεταγραφής νεφρού οδηγεί σε προοδευτική μιτοχονδριακή εξάντληση που σχετίζεται με σοβαρή κυστική νόσο
Mar 23, 2022
Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi & et al.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ
Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία (mt) είναι ένα καλά αναγνωρισμένο παθολογικό χαρακτηριστικό των κοινών νεφρικών παθήσεων και μπορεί να προκαλέσει κυτταρικό τραυματισμό, φλεγμονή και ίνωση. Στο νεφρό, τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) που παράγεται από την οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) επειδή εκτελούν πολλαπλές λειτουργίες μεταφοράς επιθηλίου που καταναλώνουν ενέργεια. Επομένως, η διατήρηση της αποτελεσματικής παραγωγής mt ATP είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική λειτουργία των νεφρών και τη συστηματική ομοιόσταση ηλεκτρολυτών. Επιπλέον, πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα μιτοχόνδρια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη γονιδιακή ρύθμιση, την κυτταρική σηματοδότηση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων μέσω της παραγωγής ενδιάμεσων μεταβολιτών και αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS).2 Παρά τις προόδους αυτές, ο ρόλος της σηματοδότησης mt στην παθογένεση κοινές νεφρικές παθήσεις δεν είναι καλά κατανοητές.
Για να διερευνήσουμε τη λειτουργία του mt στη νεφρική ομοιόσταση και παθογένεση,στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α(TFAM). TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)είναι ένας πυρηνικά κωδικοποιημένος παράγοντας απαραίτητος για τη λειτουργία mt, τη διατήρηση του αριθμού αντιγράφων mt και τη δομική σταθερότητα του mt DNA επειδή ρυθμίζει την αντιγραφή και τη μεταγραφή του γονιδιώματος του mt κάμπτοντας το DNA του προαγωγέα.3 Το mt DNA θηλαστικών περιέχει 37 γονίδια, 13 από τα οποία κωδικοποιούν πρωτεϊνικές υπομονάδες του συμπλόκου της αναπνευστικής αλυσίδας, 22 κωδικοποιούν RNA μεταφοράς και 2 ριβοσωμικά RNA. Ετσι,TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)εμπλέκεται άμεσα στη ρύθμιση της μεταφοράς ηλεκτρονίων mt και της σύνθεσης του ATP μέσω της μεταγραφής γονιδίων όπως το μιτοχονδριακά κωδικοποιημένο κυτόχρωμα b(MT-CYB), η μιτοχονδριακά κωδικοποιημένη υπομονάδα 1 οξειδάσης του κυτοχρώματος c (MT-CO1) και η μιτοχονδριακά κωδικοποιημένη υπομεμβρανάση 6 (MT-ATP6).3ΧωρίςTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α), τα κύτταρα χάνουν την ικανότητά τους να παράγουν ATP μέσω OXPHOS, δεν μπορούν να δημιουργήσουν σημαντικές ποσότητες mt ROS και εξαντλούνται προοδευτικά από μιτοχόνδρια.-Γενετικές μελέτες έχουν δείξει ότιTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)είναι απαραίτητη για την κανονική εμβρυογένεση επειδή είναι σφαιρική ομόζυγηTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η αδρανοποίηση οδήγησε σε ενδομήτρια θνησιμότητα μέχρι την εμβρυϊκή ημέρα 10,5, ενώ η ετερόζυγη ανεπάρκεια, αν και μείωσε τον αριθμό αντιγράφων mt κατά -40 τοις εκατό και οδήγησε σε ανεπάρκεια αναπνευστικής αλυσίδας, δεν οδήγησε σε εμβρυϊκή θνησιμότητα. Έτσι, η γενετική στόχευση τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α) είναι μια χρήσιμη πειραματική στρατηγική για την εξέταση του ρόλου της προοδευτικής δυσλειτουργίας mt στην κυτταρική διαφοροποίηση και την ομοιόσταση των ιστών. Ειδική για τον τύπο κυττάρου υπό όρους αδρανοποίηση τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)πρότεινε ότι η παραγωγή OXPHOS και/ή mt ROS είναι κρίσιμης σημασίας για την κυτταρική διαφοροποίηση, τη λειτουργία και τη φυσιολογική φυσιολογία.-1o.
Οι πρωτογενείς διαταραχές mt που οφείλονται σε πυρηνικές ή γονιδιακές μεταλλάξεις μπορεί να εμφανιστούν με νεφρική νόσο που εκδηλώνεται συχνότερα ως σωληναριακή διάμεση βλάβη ή μεμονωμένη σωληναριακή δυσλειτουργία.(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)που προκαλούν νεφρική νόσο δεν έχουν αναφερθεί. Πιο πρόσφατα, μειωμένοTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)έκφραση έχει συνδεθεί με χρόνια νεφρική νόσο. Απώλεια ακεραιότητας mt λόγωTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η αδρανοποίηση προκάλεσε σωληναριδική νόσο και νεφρική ανεπάρκεια σε ποντίκια, η οποία οφειλόταν εν μέρει στην ενεργοποίηση του κυκλικού διεγέρτη GMP-AMP συνθάσης (cGAS) που εξαρτώνται από το στρες του DNA των γονιδίων ιντερφερόνης (STING).
Εδώ αναφέρουμε ότι τα ποντίκια με υπό όρουςTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α) αδρανοποίηση σε προγονικά κύτταρα νεφρώνα που εκφράζουν homeobox 2(SIX2) που σχετίζονται με το sine oculis αναπτύσσουν σοβαρή κυστική νόσο και πεθαίνουν πρόωρα από νεφρική ανεπάρκεια ως νεαρά νεαρά ποντίκια.TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/-τα ποντίκια χαρακτηρίστηκαν από ελαττώματα στην ωρίμανση του νεφρώνα, η οποία συσχετίστηκε με μείωση του mt, μείωση του OXPHOS και μεταβολική στροφή προς τη γλυκόλυση στοTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7-νεφρικό επιθήλιο. Δεδομένης της σοβαρότητας της κυστικής νόσου σεTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7-ποντίκια, αναλύσαμε 2 μοντέλα ποντικιών πολυκυστικής νόσου των νεφρών (PKD), τα οποία προκύπτουν από μεταλλάξεις είτε στην πολυκυστίνη-1 (Pkd1) είτε στην κυστίνη-1 (Cys1), καθώς και σε ανθρώπους ιστούς από ασθενείς με αυτοσωμική επικρατούσα πολυκυστική νόσο των νεφρών (ADPKD). Το διαπιστώνουμεTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)είναι απορυθμισμένο σε κύστεις τόσο από ιστούς PKD ποντικού όσο και από ανθρώπινους. Συνολικά, οι μελέτες μας υποδηλώνουν ότι το TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η απορρύθμιση και η εξάντληση του mt είναι χαρακτηριστικά γνωρίσματα των νεφρικών κυστικών παθήσεων και μπορεί να συμβάλλουν στην παθογένειά τους.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)αδρανοποίηση σε κύτταρα γενεαλογίας SIX2 προκαλεί σοβαρή κυστική νόσο με αποτέλεσμα νεφρική ανεπάρκεια
Για να διερευνήσουμε τη λειτουργία του mt στο νεφρικό επιθήλιο, απενεργοποιήσαμεTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)σε ΕΞΙ2-εκφραστικά προγονικά κύτταρα, τα οποία δημιουργούν όλα τα τμήματα νεφρώνα, εκτός από τον αγωγό συλλογής (CD).15Για αυτό, διασταυρώσαμε τοTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)αλληλόμορφο με βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν μια ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη/συντηγμένη πρωτεΐνη ανασυνδυασμού Cre (eGFP/Cre) υπό μεταγραφικό έλεγχο του προαγωγέα Six2 (Εικόνα la). "Ποντίκια ομόζυγα γιαTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Το λειωμένο αλληλόμορφο και ετερόζυγο για το δια-γονίδιο eGFP/Cre (Six2-eGFP/Cre plus ; T fam) από εδώ και στο εξής αναφέρονται ως μεταλλαγμένα Six2-Tfam-/-. Έξι2-Tfam-/- ποντίκια γεννήθηκαν με αναμενόμενες αναλογίες Mendelian και δεν διακρίνονταν από τους ελέγχους Cre-littermate με οπτική επιθεώρηση κατά τη γέννηση. Ωστόσο, διαφορές στο σωματικό βάρος μεταξύ Έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Οι έλεγχοι {{0}}μεταλλαγμένες και Cre-littermate έγιναν εμφανείς την ημέρα μετά τον τοκετό(P)14(5,7±0.3g για τα μεταλλαγμένα έναντι 7,5±0,3g για τους ελέγχους,n{{11} } έκαστο, P=0.004· Συμπληρωματικός Πίνακας S1). Έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α) Τα μεταλλαγμένα ποντίκια χαρακτηρίστηκαν από διευρυμένους νεφρούς σε σύγκριση με τους μάρτυρες (αναλογία νεφρού/σωματικού βάρους 1,45 τοις εκατό ± 0.19 τοις εκατό για μεταλλαγμένα έναντι 0.60 τοις εκατό ±0,02 τοις εκατό για τον έλεγχο , n=4 το καθένα, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7- μεταλλάκτες ανέπτυξαν σημαντική λευκωματουρία (αναλογία λευκωματίνης ούρων/κρεατινίνης=362.4 ± 75,18 mg/g σε έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)--μεταλλαγές έναντι 43,58±3,39 mg/g στους μάρτυρες σε P14, n=6 και 10 αντίστοιχα·P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-'μεταλλαγμένα, ποντίκια με ετερόζυγαTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η ανεπάρκεια στα προγονικά κύτταρα SIX2 που αναπτύχθηκαν φυσιολογικά ήταν γόνιμα και δεν ανέπτυξε εμφανή νεφρική νόσο (Συμπληρωματικό Σχήμα S1).
Εικόνα 1|Η απενεργοποίηση του Tfam σε κύτταρα γενεαλογίας SIX2 οδηγεί σε σοβαρή κυστική νόσο και νεφρική ανεπάρκεια.(α) Ένα σχηματικό που απεικονίζει την πειραματική προσέγγιση και τη θέση των στοχευμένων αλληλουχιών μέσα στο αλληλόμορφο με ρολό Tfam. Ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ολικού γονιδιωματικού DNA νεφρού που απομονώθηκε από συγγενή μάρτυρα (Cre ) και Six{0}}Tfammice στην ηλικία μεταγεννητική ημέρα (P) 7; το μη ανασυνδυασμένο αλληλόμορφο Tfam floxed συμβολίζεται με 2-lox (2); το ανασυνδυασμένο αλληλόμορφο κατά 1-lox, το αλληλόμορφο άγριου τύπου κατά wt; þ ή - υποδεικνύουν την παρουσία ή την απουσία του διαγονιδίου Six2-eGFP/Cre. (β) Αριστερά πάνελ, φωτογραφίες νεφρών από Cre control και Έξι2-Tfam ποντίκια σε ηλικία P20. Τα βάρη των νεφρών (KWs) εκφράζονται ως ποσοστό του σωματικού βάρους (BW) (n ¼ 4–14). Δεξιά πλαίσια, επίπεδα αζώτου ουρίας αίματος (BUN) σε ποντίκια Cre littermate control (co) και Six2-Tfam ποντίκια ηλικίας P7 (n ¼ 7 και 6 ετών, αντίστοιχα) και καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier για Cre control και Six{ {16}}Ποντίκια Tfam σε σύγκριση με τη δοκιμή log-rank (n ¼ 10–13). (γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες σταθεροποιημένων με φορμαλίνη, ενσωματωμένων σε παραφίνη τμημάτων νεφρού από Cre control και Six2-Tfam ποντίκια ηλικίας P7 και P29 που χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E) και αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για ακτίνη λείου μυός (ACTA2) και διαφοροποίησης συστάδων (CD) αντιγόνο 31. Τα αριθμητικά σημάδια απεικονίζουν κυστικές δομές και οι αστερίσκοι απεικονίζουν σπειράματα. Ράβδοι ¼ 1 mm για ολόκληρες διατομές νεφρού, 100 mm για εικόνες υψηλής ισχύος H&E και 50 mm για εικόνες IHC. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος SEM και αναλύθηκαν με το 2-test Student's t-test. ***P < 0,001.="" για="" να="" βελτιστοποιήσετε="" την="" προβολή="" αυτής="" της="" εικόνας,="" ανατρέξτε="" στην="" ηλεκτρονική="" έκδοση="" αυτού="" του="" άρθρου="" στη="">www.kidney-international.org.
cistanche ανδρικά οφέλη
Η ανάλυση του Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/-ποντίκια, τα οποία εξέφραζαν επίσης το αλληλόμορφο αναφοράς ROSA{26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, που αναφέρεται εδώ ως Six2-mT/mG.TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7 ποντίκια, υποδεικνύοντας ότι η συντριπτική πλειονότητα των κυστικών δομών σεTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/-νεφροί (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Αυτά τα ευρήματα συμφωνούν με αυξημένα επίπεδα φωσφορυλιωμένης εξωκυτταρικής κινάσης ρυθμιζόμενης με σήμα (p-ERK) και -κατενίνης στο Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/- νεφρικός ιστός (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Συνολικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ οι νεφροί εμφανίζουν μοριακά χαρακτηριστικά που σχετίζονται συχνά με νεφρική κυστική νόσο.
Η ωρίμανση του νεφρώνα είναι ελαττωματική στο Έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ποντίκια Επειδή μπορεί να χρειαστούν έως και αρκετές εβδομάδες πριν από ποντίκια με ιστόTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)η αδρανοποίηση αναπτύσσει παθολογία, στη συνέχεια εξετάσαμε τη χρονική πορεία ανάπτυξης της νεφρικής νόσου στο Έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α){{0}}ποντίκια. Συλλέξαμε νεφρά από ποντίκια ελέγχου και μεταλλαγμένα σε ηλικίες P0, P7 και P14 και χρησιμοποιήσαμε ιστολογικές μεθόδους, χρώση ανοσοφθορισμού (IF) και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης σε εκχυλίσματα ολόκληρων νεφρών για αξιολόγηση. Η χρώση IF για SIX2 και E-cadherin στην ηλικία P0 έδειξε ότι οι νεφροί από τον έλεγχο και το Sic2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/- ήταν ιστολογικά παρόμοια. Ο σχηματισμός δομών φλοιώδους νεφρογενούς ζώνης, όπως το μεσέγχυμα SIX2 συν καπάκι, οι ουρητηρικές άκρες που εκφράζουν την Ε-καντερίνη και οι νεοφυείς δομές νεφρώνων όπως τα νεφρικά κυστίδια και τα σώματα σε σχήμα κόμματος και S, δεν αποκλείστηκαν στο Έξι{{7} }TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7- νεφροί (Εικόνα 2α). Αυτά τα ιστολογικά ευρήματα ήταν σύμφωνα με τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν νεφρογόνους δείκτες. Τα επίπεδα του Six2, του ζευγαρωμένου κουτιού 2 (Pax2), του LIM homeobox protein 1 (Lhx1) και του μεταγραφικού παράγοντα 1 (Sall) mRNA που μοιάζει με spalt δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ του ελέγχου και του Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ποντίκια σε ολικά ομογενοποιήματα νεφρού από Ρ0 νεφρούς (Εικόνα 2β). Αυτό πρότεινε ότιTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η αδρανοποίηση σε προγεννητικούς νεφρώνες SIX2 δεν επηρέασε σημαντικά τον σχηματισμό νεφρογόνων δομών.
Εικόνα 2|Η ωρίμανση του νεφρώνα είναι ελαττωματική σε έξι2-Tfam-7ποντίκια.(α)Αντιπροσωπευτικές εικόνες τμημάτων σταθεροποιημένων με φορμαλίνη, ενσωματωμένων σε παραφίνη από το Cre~ control και το Six2-Tfam-/νεφροί στην ηλικία μετά τον τοκετό (P) 0. Οι τομές νεφρών χρωματίστηκαν με μπλε τολουιδίνης και αναλύθηκαν με ανοσοφθορισμό για έκφραση homeobox 2 (SIX2) και E-cadherin (ECAD) που σχετίζεται με το sine oculis. Τα ουρητηρικά δέντρα περιγράφονται με διακεκομμένες λευκές γραμμές. Το μεσέγχυμα του καλύμματος (CM), το σώμα σε σχήμα κόμματος (CSB), το σώμα σε σχήμα S (SSB) και το ουρητηρικό άκρο (UT) σχολιάζονται. (β)Αριστερό πλαίσιο, σχετικά επίπεδα έκφρασης mRNA των αναπτυξιακών δεικτών με μια ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε ολικά ομογενοποιημένα νεφρικά προϊόντα από Six2-Tfam-/μεταλλάκτες σε ηλικία PO σε σύγκριση με μάρτυρες Cre littermate (n =6 το καθένα ). Δεξί πλαίσιο, σχετική σπειραματική (glom) και ειδική για το τμήμα νεφρών γονιδιακή έκφραση σε ολικά ομογενοποιήματα νεφρού από Έξι2-μεταλλαγμένα Tfam7 στην ηλικία P7 σε σύγκριση με μάρτυρες Cre-littermate (n =4 το καθένα). PT, εγγύς σωληνάριο; mTAL, παχύ ανερχόμενο άκρο του Henle. DT, άπω σωληνάριο; CD, αγωγός συλλογής. (γ) Τομές νεφρών χρωματισμένες με μπλε Alcian/περιοδικό οξύ-Schiff (AB-PAS) σε ηλικία P0, P7 και P14. Τα βέλη υποδεικνύουν θετικά PAS σωληνάρια με περίγραμμα βούρτσας, οι αστερίσκοι απεικονίζουν σπειράματα και τα αριθμητικά σημάδια απεικονίζουν κυστικά σωληνάρια, οι ράβδοι=100 um για τις εικόνες AB-PAS και 50 um για τις εικόνες με μπλε τολουϊδίνη και τις εικόνες IF. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος± SEM;2-Test Student's t-test;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
κριτικές cistanche
Αν και ο σχηματισμός της δομής του νεογέννητου νεφρώνα δεν αναστέλλεται, η χρώση με λεκτίνη αλσιανού/περιοδικού οξέος-Schiff και λωτού τετραγωνολοβού έδειξε ελαττωματική ωρίμανση τελικού νεφρώνα στο Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α){{0}}ποντίκια στην ηλικία P0. Το Alcian blue/περιοδικό οξύ-Schiff, το οποίο χρωματίζει τις σωληναριακές βασικές μεμβράνες και το όριο της βούρτσας, και η λεκτίνη του τετραγωνολόβου λωτού, που προσδιορίζει συγκεκριμένους ολιγοσακχαρίτες στο όριο της βούρτσας των εγγύς σωληναρίων κυττάρων, μειώθηκαν και οι δύο στους μεταλλαγμένους νεφρούς. Το Σχήμα 2γ δείχνει τη χρώση αλσιανικού μπλε/περιοδικού οξέος-Schiff στα χρονικά σημεία P0, P7 και P14. Η ιστοχημεία της λεκτίνης του Lotus tetragonolobus και η χρώση IF για την πρωτεΐνη του όγκου 1 Wilms στα χρονικά σημεία P0, P7 και P14 παρουσιάζονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S4. Στην ηλικία PO, η σχετική περιοχή που χρωματίστηκε θετικά με τη λεκτίνη του τετραγωνικού λωτού ήταν 2,10 τοις εκατό ±0,51 τοις εκατό και 0,39 τοις εκατό ± 0,1 τοις εκατό σε ηλικία P7 έναντι 6,25 τοις εκατό ± 0,28 τοις εκατό και 6,2 τοις εκατό ±1,1 τοις εκατό για τους ελέγχους, αντίστοιχα (n=3-4, P=0.0004 και 0,0007, αντίστοιχα; Συμπληρωματικό Σχήμα S4). Σε συμφωνία με αυτά τα ιστολογικά ευρήματα είναι η σημαντική μείωση της έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν δείκτες σπειραματικού και ειδικού για το τμήμα νεφρώνα podocin, nephrin, aquaporin 1 (Agp1), συμμεταφορέα φωσφορικού νατρίου 2a (NaPi2a), uromodulin, sodium-calsium cotransporterlor2 (Nkcc2) και ευαίσθητος σε θειαζίδιο συμμεταφορέας χλωριούχου νατρίου (Ncc) σε έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ ποντίκια (Εικόνα 2β). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/- οι νεφροί εμφανίζουν προοδευτική μείωση στον αριθμό των ώριμων τμημάτων του εγγύς νεφρώνα και των σπειραμάτων.
Επειδή η δραστηριότητα έξι2-eGFP/Cre έχει ως αποτέλεσμαTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-ελλιπή τμήματα νεφρών που προέρχονται από το μεσεγχύμα του καλύμματος, προβλέψαμε ότι η ωρίμανση των επιθηλιακών κυττάρων CD, τα οποία προέρχονται από ουρητηρικούς οφθαλμούς, δεν θα επηρεαζόταν στο Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ νεφρά. Συνεπής με αυτή την αντίληψη είναι ότι η χρώση με Dolichos biflorus agglutinin, η οποία αντιδρά με N-ακετυλο-D-γαλακτόζη στο περιφερικό σωληνάριο και CD, έδειξε μια σχετική υπερεκπροσώπηση των θετικών σε συγκολλητίνη δομών Dolichos biflorus στο Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/- νεφρά. Στην ηλικία P7, οι θετικά χρωματισμένες περιοχές για την αγλουτινίνη Dolichos biflorus αποτελούσαν το 13,91 τοις εκατό ±0,9 τοις εκατό της συνολικής περιοχής για τα μεταλλαγμένα έναντι 1,93 τοις εκατό ± 0,1 τοις εκατό για τον έλεγχο (n {{11} }, P=0.0002; Συμπληρωματικό Σχήμα S4). Η έκφραση mRNA της επιθηλιακής υπομονάδας 1 άλφα καναλιού νατρίου (Scnnla) ή της ακουαπορίνης 2 (Agp2), που και οι δύο εκφράζονται σε επιθηλιακά κύτταρα CD, δεν μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με το στοιχείο ελέγχου (Εικόνα 2β). Σε αντίθεση με το Έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/-νεφρά,TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)αδρανοποίηση σε προγονικά κύτταρα homeobox B7(HOXB7), τα οποία δημιουργούν επιθηλιακά κύτταρα CD, με αποτέλεσμα την απώλεια της έκφρασης του δείκτη CD νεφρώνα και την ήπια διαστολή των σωληναρίων αλλά όχι την κυστογένεση (Συμπληρωματικό Σχήμα S5). Συνολικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η απώλεια τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η λειτουργία στα προγονικά κύτταρα SIX2 δεν εμποδίζει την ανάπτυξη των νεοφυών δομών νεφρώνα, αλλά αναστέλλει την τελική ωρίμανση του νεφρώνα.
TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Οι -/-κύστεις είναι ανεπαρκείς σε κοινούς δείκτες τμημάτων νεφρώνων
Να χαρακτηρίσει την ιστογενετική προέλευση τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7νεφρικές κύστεις, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις IFTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um χαρακτηρίστηκαν από ενδοαυλικές εναποθέσεις ουρομοντουλίνης, οι οποίες υποδήλωναν προέλευση από τμήματα νεφρώνα μακριά από το εγγύς σωληνάριο και τον κατιόντα βρόχο του Henle (Εικόνα 3β).
Εικόνα 3 Οι κύστεις ITfam δεν εκφράζουν κοινούς δείκτες ειδικούς για το τμήμα νεφρώνα.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 μμ. (β)Αντιπροσωπευτικές εικόνες τμημάτων νεφρών μονιμοποιημένων με φορμαλίνη, ενσωματωμένων σε παραφίνη από Six2-mT/mG. Τα ποντίκια Tfam-7 ηλικίας P14 χρωματίστηκαν για eGFP και uromodulin με IF. Οι αστερίσκοι απεικονίζουν κύστεις με ενδοαυλική ουρομοντουλίνη. Η παρουσία ενδοαυλικής ουρομοντουλίνης εξετάστηκε σε κύστεις με μέγιστη διάμετρο είτε 50-100 um είτε σε κύστεις μεγαλύτερες από 100 um σε μέγιστη διάμετρο. Μπάρες =(a,b)100 um. Για να βελτιστοποιήσετε την προβολή αυτής της εικόνας, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου στη διεύθυνση www kinder-international.org.
Προοδευτικές ανωμαλίες στη λειτουργία και τη μορφολογία του mtTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7-επιθηλιακά κύτταρα
Να χαρακτηρίσει τη χρονική πορεία των μεταβολικών συνεπειών τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)διαγραφή, εξετάσαμε πρώτα τα επίπεδα mRNA τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)καιTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-ρυθμισμένα mt-Col, mt-Cyb και mt-Atp6 inTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/-νεφρά σε ηλικία PO, P7 και P14. Οπως αναμενόταν,TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α), τα επίπεδα mt-Col, mt-Cyb και nt-Atp6 mRNA μειώθηκαν σημαντικά (Εικόνα 4a). Επιθηλιακά κύτταρα T fam-7- επισημασμένα με eGFP(Six2-mT/mG· Tfam-7ποντίκια) εμφάνισαν σημαντική μείωση στην έκφραση πρωτεΐνης MT-CO1 (Συμπληρωματικό Σχήμα S7). Ο αριθμός αντιγράφων mt DNA μειώθηκε κατά 63 τοις εκατό , κάτι που είναι σύμφωνο με την εξάντληση του mt, χαρακτηριστικό τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)ανεπάρκεια (Εικόνα 4α). Αντίθετα, η έκφραση των πυρηνικών γονιδίων που κωδικοποιούν δινουκλεοτίδιο νικοτιναμίδης αδενίνης: πυρηνική υπομονάδα 3 (Ndufs3) οξειδοαναγωγάσης ουβικινόνης και υπομονάδα φλαβοπρωτεϊνών Α συμπλέγματος ηλεκτρικής αφυδρογονάσης (Sdha) δεν επηρεάστηκε στην ηλικία P0 αλλά μειώθηκε στην ηλικία P7 και P1 (Εικόνα 4α). Αυτά τα ευρήματα από την ανάλυση γονιδίου mt και πρωτεΐνης είναι σύμφωνα με την προοδευτική απώλεια του αριθμού αντιγράφων mt στο Tfam-/-επιθήλιο.
Στη συνέχεια ερευνήσαμε τις μεταβολικές επιδράσεις τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)αδρανοποίηση σε πρωτεύοντα επιθηλιακά κύτταρα εγγύς σωληνάριο (PTECs) που απομονώθηκαν στην ηλικία P7.TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7 Τα PTEC εμφάνισαν σημαντικές μειώσεις στους ρυθμούς βασικής κατανάλωσης οξυγόνου (40,77 ± 4,10 για μεταλλαγμένα έναντι 61,75± 5,18 pmol/min/10 κύτταρα για μάρτυρες, n=3 το καθένα, P= 0.034 ), Αναπνοή συνδεδεμένη με ATP (33,11 ± 3,91 για μεταλλαγμένα έναντι 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* κύτταρα για μάρτυρες, n=3 το καθένα, P=0,093), μέγιστη αναπνοή (116,8 ± 14,19 για μεταλλαγμένα έναντι 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* κύτταρα για μάρτυρες, n= 3 έκαστο, P=0,005) και πλεονάζουσα αναπνευστική ικανότητα (76,05 ± 10,18 για μεταλλάκτες έναντι ± 163. 8,61 pmol/min/10* κύτταρα για μάρτυρες, n=3 έκαστο, Ρ= 0.003· Εικόνα 4β).
cistanche reddit
Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω τον βαθμό εξάντλησης και βλάβης του mt, εξετάσαμεTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/- νεφροί με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης και 3-μικροσκόπιο δομημένου διαστάσεων φωτισμού (3D SIM). Στην ηλικία P7, τα μιτοχόνδρια εμφάνισαν ακανόνιστα σχήματα και μπαλόνια, τα οποία είναι σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα στοTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)νοκ άουτ ποντίκια. Η μικροσκοπική ανάλυση ηλεκτρονίων μετάδοσης έδειξε ότι οι δομικές ανωμαλίες των μιτοχονδρίων, όπως το αυξημένο μέγεθος και οι μη φυσιολογικοί κρύστες, προχώρησαν μεταγεννητικά επειδή οι μορφολογικές διαφορές μεταξύ μεταλλαγμένων και του ελέγχου ήταν λιγότερο εμφανείς στην ηλικία P0 και έγιναν πιο σοβαρές με την ηλικία (Εικόνα 4γ ). Χρησιμοποιήθηκε 3D SIM για την εξέταση του όγκου mt και του μεγέθους του δικτύου σε Six2-mT/mG;TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ μεταλλάξεις σε σύγκριση με Έξι2-mT/mG ποντίκια ελέγχου στην ηλικία P7. Ο όγκος mt μετρήθηκε σε διατομές 5 έως 8 σωληναρίων ανά τομή, εξετάζοντας 25 έως 40 φλοιώδη επιθηλιακά κύτταρα θετικά στο eGFP που χρωματίστηκαν για το εξαρτώμενο από την τάση κανάλι επιλεκτικό ανιόντος 1 με χρώση IF. Βρήκαμε ότι ο συνολικός όγκος mt ανά κύτταρο θετικό σε eGFP μειώθηκε σημαντικά (62,66 ± 16,46 um/κύτταρο για μεταλλαγμένα έναντι 177,4±30.17 μm'/κύτταρο για μάρτυρες, n=3 το καθένα , P= 0.0289) και συσχετίστηκε με μια αλλαγή στην αναλογία του συνολικού όγκου mt ανά συνολικό όγκο κελιών από 0.230 ±0.01 στους ελέγχους σε 0.089 ± 0.016 σε έξι 2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7 μεταλλαγμένα (n= 3 έκαστο, P=0.0017; Εικόνα 4γ). Το μέγιστο μέγεθος δικτύου mt, το οποίο μετρά το μεγαλύτερο δίκτυο mt που συναντήθηκε σε όλα τα θετικά σε eGFP κελιά που εξετάστηκαν, μειώθηκε στο Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ νεφροί (143,2 ± 23,2 μm² για μεταλλαγμένα έναντι 318,3 ± 49,45 um² για μάρτυρες, n= 3 έκαστος, P{10}},0327）. Συνολικά, τα υπερδομικά ευρήματα και τα ευρήματα SIM και τα ευρήματα από την ανάλυση γονιδίου και πρωτεΐνης mt συνάδουν με την προοδευτική απώλεια του αριθμού αντιγράφων mt στοTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-7-επιθήλιο.
Εικόνα 4| Το Tfam-/νεφρικό επιθήλιο χαρακτηρίζεται από προοδευτική μιτοχονδριακή εξάντληση.(α) Μιτοχονδριακή (mt) γονιδιακή έκφραση μέσω ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στην ηλικία μετά τον τοκετό (P){0}}, P7 και P14 (πλάσια αλλαγή έναντι του ελέγχου, n =6 το καθένα) και Περιεκτικότητα σε mt DNA (P7) σε ολικά ομογενοποιημένα νεφρά από Cre~ littermate control (co) και Six2-Tfam-/ποντίκια. (β) Ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) σε πρωτογενή εγγύς σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (PTECs) που απομονώθηκαν από τον μάρτυρα νεογνών Cre και Six2-7νεφρούς στην ηλικία P7 σε πλατφόρμα Seahorse XFe24. Αντιπροσωπευτικές μετρήσεις OCR σε μάρτυρες και Tfam-7PTEC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ολιγομυκίνη Α (ολίγο Α, αναστολή συνθάσης τριφωσφορικής αδενοσίνης [ATP]), καρβονυλοκυανίδιο-ρ-τριφθορο μεθοξυφαινυλουδραζόνη (FCCP, αποσύζευξη) και αναστολείς ροφωσφορικής φθοράς και αντιμυκίνη Α(ΑΑ). Εμφανίζονται επίσης η υπολογισμένη βασική και η μέγιστη αναπνοή, η αναπνοή που συνδέεται με ATP και η πλεονάζουσα αναπνευστική ικανότητα (n =3 το καθένα). (γ) Υπερδομική ανάλυση μιτοχονδρίων με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης. Αντιπροσωπευτικές μικροσκοπικές εικόνες ηλεκτρονίων μετάδοσης τμημάτων νεφρών από ποντίκια Cre- control και Six{17}}Tfam-7την ηλικία P0 και P7, τα κόκκινα βέλη απεικονίζουν μιτοχόνδρια. Γραμμή=500 nm. (δ) Τρισδιάστατες εικόνες μικροσκοπίας δομημένου φωτισμού τμημάτων νεφρού από Six2-mT/mG (co) και Six2-mT/mG. Tfam-/-ποντικοί σε ηλικία P7. Η ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (eGFP), η υπομονάδα 4 της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COXⅣ) και το εξαρτώμενο από την τάση κανάλι επιλεκτικό ανιόντος 1 (VDAC) ανιχνεύθηκαν με ανοσοφθορισμό. ) χρησιμοποιήθηκε για πυρηνική χρώση (μπλε φθορισμός).Οι λευκές διακεκομμένες γραμμές περιγράφουν το νεφρικό σωληνάριο στον έλεγχο και τον αυλό της κύστης στον μεταλλαγμένο νεφρό και τα αριθμητικά σημάδια απεικονίζουν σωληνοειδή αυλό στον έλεγχο ή αυλό κύστης στον μεταλλαγμένο νεφρό. Η περιοχή mt ποσοτικοποιήθηκε με Imaris λογισμικό (Oxford Instruments, Abingdon, UK; n =3 το καθένα). Συνολικός (tot) mt όγκος (vol) ανά κελί θετικό σε eGFP (25-40 κελιά/δείγμα που αναλύθηκε), ο λόγος του συνολικού mt όγκου ανά συνολικό όγκο κυψέλης και το μέγιστο (μέγιστο) μέγεθος του δικτύου mt ανά κυψέλη. Το μέγεθος δικτύου mt προσδιορίστηκε σε σωληνοειδές διατομή με 5 κελιά ανά διατομή. Μπάρες =4 um. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος± SEM και αναλύθηκαν με Student's t-test.*P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η ανεπάρκεια μετατοπίζει τον μεταβολισμό του νεφρικού επιθηλίου προς τη γλυκόλυση
Τα PTEC στα νεφρά χρησιμοποιούν οξείδωση λιπαρών οξέων και OXPHOS για την παραγωγή ATP και είναι γλυκονεογενετικά. βαθμό Για να αποκτήσουμε πρόσθετες γνώσεις σχετικά με μεταβολικές αλλοιώσεις που σχετίζονται με την απενεργοποίηση Tam, πραγματοποιήσαμε ανάλυση αλληλουχίας RNA των νεφρών από το Six2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/-και Cre~ ποντίκια ελέγχου σε ηλικία P7. Βρήκαμε ότι τα βασικά ρυθμιστικά γονίδια που εμπλέκονται στη γλυκόλυση, όπως η εξοκινάση 2(Hk2) και η ενολάση 2 (Eno2), ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Αντίθετα, η έκφραση των περισσότερων γονιδίων που εμπλέκονται στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος μειώθηκε (π.χ. ισοκιτρική αφυδρογονάση 1[Idh1), όπως και η έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην οξείδωση λιπαρών οξέων, όπως το ακετυλοσυνένζυμο Α ακυλοτρανσφεράση 1B(Acaalb). μέσης αλυσίδας ακυλο-συνένζυμο Α αφυδρογονάση (Acadm) (Εικόνα 5a και b, Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Συνάδει με τη μειωμένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στον έλεγχο του κύκλου του τρικαρβοξυλικού οξέος και τους μεταλλαγμένους νεφρούς στην ηλικία P7 χρησιμοποιώντας μια πλατφόρμα Seahorse XFe24 (Agilent, Santa Clara, CA). Τα μεταλλαγμένα PTECs χαρακτηρίστηκαν από σημαντική αύξηση στη βασική γλυκόλυση (ρυθμός εκροής πρωτονίων=117.4 ± 12.07 pmol/min για τα μεταλλαγμένα και 73,34 ± 6,33 pmol/min για τον έλεγχο, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) και μείωση του λόγου του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου mt έναντι του ρυθμού εκροής γλυκολυτικού πρωτονίου από 0,73 ± 0,08 στον έλεγχο σε 0,34 ± 0,02 σε μεταλλαγμένα PTECs(n=3,P=0.0074). Συνολικά, αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότιTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/- τα επιθηλιακά κύτταρα είχαν υποστεί μια μεταβολική μετατόπιση από την οξείδωση OXPHOS και λιπαρών οξέων προς τη γλυκόλυση (Εικόνα 5δ).
Εικόνα 5]Η ανεπάρκεια του νεφρικού επιθηλιακού μιτοχονδριακού παράγοντα μεταγραφής Α (TFAM) σχετίζεται με αυξημένη γλυκόλυση και μη φυσιολογικό μεταβολισμό λιπαρών οξέων.(α) Ανάλυση της έκφρασης του μεταβολικού γονιδίου με προσδιορισμό αλληλουχίας RNA του φλοιού ολόκληρου του νεφρού που απομονώθηκε από ποντίκια Six2-Tfam-/- και Cre-littermate ελέγχου (co) σε ηλικία μεταγεννητική ημέρα (P) 7 (n {{6 }} καθε). Εμφανίζονται διαφορικά ρυθμισμένα μεταβολικά γονίδια που εμπλέκονται στη γλυκόλυση και στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος. Τα γονίδια με στατιστικά σημαντική αύξηση στην έκφραση mRNA φαίνονται με κόκκινο και τα γονίδια με μειωμένη έκφραση παρουσιάζονται με πράσινο χρώμα. (β) επίπεδα έκφρασης mRNA επιλεγμένων διαφορικά ρυθμιζόμενων γονιδίων με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (n=4-6). (γ) Αλλοιωμένος μεταβολισμός λιπαρών οξέων σε έξι2-7Tfam-7μεταλλαγμένα ποντίκια. Αντιπροσωπευτικές εικόνες τμημάτων νεφρού με χρώση ελαιοκόκκινου Ο από ποντίκια Six2-Tfam-7και Cre-littermate σε ηλικία P14. Τα βέλη δείχνουν σε κόκκινα κελιά λαδιού Ο-θετικά και ο αριθμός sian απεικονίζει το κόστος. Bar=10 um.(δ) Ανάλυση γλυκολυτικής ροής πρωτογενών εγγύς σωληναριακών επιθηλιακών κυττάρων (PTECs) που απομονώθηκαν από τον μάρτυρα Cre littermate και Έξι2-Tfam-/νεφροί στην ηλικία P7 (n=4 το καθένα ) σε πλατφόρμα Seahorse XFe24. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές μετρήσεις του ρυθμού εκροής γλυκολυτικού πρωτονίου (glyco PER) σε μάρτυρες και Tfam-7PTEC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2-δεοξυγλυκόζη (2-DG) και αναστολείς οξειδωτικής φωσφορυλίωσης ροτενόνη και αντιμυκίνη A(AA) . Δείχνονται επίσης ο μέσος όρος γλυκόζης PER κατά την έναρξη και η αναλογία μιτοχονδριακού (mt) ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) έναντι του γλυκο PER. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SEM και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test. (Συνεχίζεται)
ΜειωμένοςTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)έκφραση σε ιστούς PKD ποντικού και ανθρώπου σχετίζεται με μείωση του mt
Επειδή έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/ οι νεφροί είχαν μεγάλη ομοιότητα με τους νεφρούς PKD, στη συνέχεια αξιολογήσαμε εάνTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)ήταν απορυθμισμένο στους ιστούς PKD. Αρχικά εξετάσαμεTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)και ρυθμιζόμενη από TFAM γονιδιακή έκφραση σε 2 καλά εδραιωμένα γενετικά μοντέλα ποντικών PKD.TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Τα επίπεδα mRNA μειώθηκαν σημαντικά σε ομογενοποιήματα ολόκληρου του νεφρού από ποντίκια Pkd1-/- και Cyspk/pk, τα οποία φέρουν μεταλλάξεις είτε σε Pkd1 είτε σε Cys1. Αυτό συσχετίστηκε με μείωση της έκφρασης μιτοχονδριακά και πυρηνικά κωδικοποιημένων γονιδίων mt καθώς και με απορρυθμισμένη έκφραση γλυκολυτικού γονιδίου. Παρόμοιο με το Έξι2-TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)-/νεφροί, νεφροί Pkd1-7 και CysPkpk χαρακτηρίστηκαν από αυξημένα επίπεδα Eno2 και Hk2 και σημαντικά μειωμένα επίπεδα μεταγραφής φωσφογλυκερικής κινάσης (Pkg)1, πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης κινάσης (Pdk)1 και Pdk4 (Εικόνα 6a).TFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η έκφραση πρωτεΐνης, όπως αξιολογήθηκε με χρώση IF, μειώθηκε στα επιθηλιακά κύτταρα που επενδύουν την κύστη σε σύγκριση με τα επιθηλιακά κύτταρα από γειτονικά μη κυστικά σωληνάρια (Εικόνα 6β). Αυτό συσχετίστηκε με μειωμένη έκφραση mt-Co1 και mt-Atp6 με φθορισμό RNA in situ υβριδισμό (Εικόνα 6b, Συμπληρωματικό Σχήμα S9). Ο όγκος mt, όπως προσδιορίστηκε από την 3D SIM, μειώθηκε κατά 55 τοις εκατό σε σύγκριση είτε με επιθηλιακά κύτταρα από γειτονικά, μη κυστικά σωληνάρια είτε με PTEC από φυσιολογικούς νεφρούς ελέγχου. Δεν βρέθηκαν διαφορές στον όγκο mt μεταξύ των κανονικών PTEC ελέγχου και των PTEC από μη κυστικά σωληνάρια (Εικόνα 6γ).
Εικόνα 6| Η έκφραση του μιτοχονδριακού μεταγραφικού παράγοντα Α (TFAM) μειώνεται στις νεφρικές κύστεις Pkd1-7-και CysPkepk.(α)Σχετικά επίπεδα έκφρασης mRNA (πλάσια αλλαγή σε σχέση με τον έλεγχο της γέννησης Cre) των μιτοχονδριακά και πυρηνικά κωδικοποιούμενων μιτοχονδριακών και γλυκολυτικών γονιδίων σε Pkd1-7και Cyskidneys (n=3-5). (β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες νεφρού τμήματα από Pkd1-7και ποντίκια ελέγχου γέννας που αναλύθηκαν στην ηλικία μετά τον τοκετό (P)22. Εμφανίζονται χρώση ανοσοφθορισμού (IF) για TFAM και RNA φθορίζον in situ υβριδισμό (RNA-FISH) για μιτοχονδριακά κωδικοποιημένη οξειδάση c 1(mt-Co1) και μιτοχονδριακά κωδικοποιημένη ATP μεμβράνη συνθάσης υπομονάδα script-A6p6. Τα λευκά βέλη προσδιορίζουν επιθηλιακά κύτταρα επένδυσης κύστης με έντονα μειωμένη έκφραση TFAM, mt-Co1 ή mt-Atp6. Τα σπειράματα σημειώνονται με gl. Οι σωληνοειδείς δομές που εκφράζουν TFAM αναγνωρίζονται με κόκκινο φθορισμό. Οι αστερίσκοι απεικονίζουν σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα με ανιχνεύσιμα μεταγραφήματα mt-Co1 και mt-Atp6. Χρησιμοποιήθηκε 4',6-διαμιδινο-2-φαινινδόλη (DAPI) για πυρηνική χρώση (μπλε φθορισμός). Μπάρες=25 um για εικόνες IF και 10 μm για εικόνες RNA-FISH. (γ) Τρισδιάστατο δομημένο μικροσκόπιο φωτισμού. Εμφανίζονται εικόνες τμημάτων νεφρών από Pkd1-7-νεφρούς που αναλύθηκαν με ιστοχημεία με λεκτίνη τετραγωνολόβου λωτού (LTL) και IF για την υπομονάδα 4 της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COXIV) και την εξαρτώμενη από την τάση έκφραση εκλεκτικού καναλιού 1 (VDAC) ανιόντος. Ο όγκος των μιτοχονδρίων (mt) ποσοτικοποιήθηκε με το λογισμικό Imaris με βάση τη χρώση COXIV. Τα βέλη απεικονίζουν επιθηλιακά κύτταρα που επενδύουν την κύστη, τα αριθμητικά σημάδια απεικονίζουν τον αυλό της κύστης και οι αστερίσκοι απεικονίζουν μη κυστικά σωληνάρια. Τα επιθηλιακά κύτταρα της επένδυσης της κύστης σκιαγραφούνται με διακεκομμένες γραμμές. Μπάρες=10 μm για το αριστερό πλαίσιο και 3 μm για το δεξί πλαίσιο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SEM και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Για να εξεταστεί αν η απώλεια τουTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)η έκφραση είναι ένα κοινό μοριακό χαρακτηριστικό της ανθρώπινης PKD, αναλύσαμε δείγματα νεφρεκτομής από 5 ασθενείς ADPKD με ανοσοϊστοχημεία, χρώση IF, υβριδισμό φθορισμού RNA in situ και 3D SIM. ΜειωμένοςTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)έκφραση παρατηρήθηκε στο 75,2 τοις εκατό ± 7,5 τοις εκατό των νεφρικών κύστεων που αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία. Αυτό συσχετίστηκε με μειωμένη έκφραση MT-CO1 και MT-ATP6 από φθορισμό RNA in situ υβριδισμό (Εικόνα 7a, Συμπληρωματικό Σχήμα S10). Ο όγκος mt στα επιθηλιακά κύτταρα που επενδύουν την κύστη μειώθηκε κατά περίπου 70 τοις εκατό όπως εκτιμήθηκε από το 3D SIM (Εικόνα 7β). Συνολικά, η ανάλυση 2 μοντέλων ποντικών PKD και ανθρώπινου ιστού ADPKD πρότεινε ότιTFAM(στοχευμένος μιτοχονδριακός μεταγραφικός παράγοντας Α)Η ανεπάρκεια και η εξάντληση του mt είναι κοινά ευρήματα στους ιστούς PKD και είναι πιθανό να επηρεάσουν την παθογένεση της νεφρικής κυστικής νόσου.
Εικόνα 7| Η έκφραση του μιτοχονδριακού μεταγραφικού παράγοντα Α (TFAM) σε νεφρικές κύστεις από ασθενείς με πολυκυστική νεφρική νόσο είναι μειωμένη.(α)Αντιπροσωπευτικές εικόνες τμημάτων ενσωματωμένων σε παραφίνη σταθεροποιημένων σε φορμαλίνη από φυσιολογικούς ανθρώπινους νεφρούς και νεφρούς από ασθενείς με πολυκυστική νεφρική νόσο (PKD) που αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία για έκφραση TFAM, με ανοσοφθορισμό (IF) για εξαρτώμενο από την τάση κανάλι επιλεκτικό ανιόντος 1(VDAC ) έκφραση και με υβριδισμό in situ φθορίζοντος RNA για μιτοχονδριακά κωδικοποιημένη οξειδάση c κυτοχρώματος c (MT-CO1) και μιτοχονδριακά κωδικοποιημένη υπομονάδα μεμβράνης συνθάσης ATP 6 (MT-ATP6) έκφραση mRNA. , και οι αστερίσκοι απεικονίζουν σπειράματα. Γραμμή=100 μm για εικόνες χαμηλής μεγέθυνσης και 10 um για εικόνες υψηλής μεγέθυνσης (β) Αντιπροσωπευτικές 3-μικροσκοπικές εικόνες δομημένου διαστάσεων δομημένου φωτισμού τμημάτων νεφρού ανθρώπου PKD που αναλύθηκαν με IF για έκφραση VDAC.4',{ {17}}διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPl) χρησιμοποιήθηκε για πυρηνική χρώση (μπλε φθορισμός). Οι διακεκομμένες γραμμές σηματοδοτούν τα σωληνάρια και τα αριθμητικά σημάδια απεικονίζουν σωληνοειδή ή κύστη αυλό. Ο όγκος των μιτοχονδρίων (mt) ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Imaris (n=5). Bar =4 μm. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος ± SEM και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Student's t.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
