grΓλώσσα
Σπίτι / Η γνώση / Περιεχόμενο

Η γνώση

Η Ishophloroglucin A που απομονώθηκε από το Ishige Okamurae καταστέλλει τη μελανογένεση που προκαλείται από -MSH: In vitro και in vivo Μέρος 2

Apr 03, 2023

3. Συζήτηση

sdasdad

Η ένωση DPHC που απομονώθηκε από IOE είχε ήδη αναφέρει ανασταλτικό της τυροσινάσηςδραστηριότητα και προστατευτική δράσηκατά της κυτταρικής βλάβης που προκαλείται από την ακτινοβολία UV-Bin vitro[8]; ωστόσο,η δράση κατά της μελανογένεσηςτων συστατικών που προέρχονται από το IOE in silico με αλληλεπίδραση μετυροσινάση,in vivoσε μελέτες φαινοτύπων σε ζωικά μοντέλα και τους υποκείμενους μοριακούς μηχανισμούς τους,δεν έχουν ακόμη εξεταστεί. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίσαμε την αντιμελανογένεση και την τυροσινάσηανασταλτικές δραστηριότητες του IPA, μιας φθοροταννίνης που απομονώθηκε από IO και IOE, σε ένα μοντέλο σπονδυλωτών ζέβραin vivo και σε κύτταρα μελανώματος B16F10 in vitro, μετά από επαγωγή με -MSH.


Θεραπεία με -Η MSH είναι γνωστό ότι επάγει τη σύνθεση μελανίνης και τη δραστηριότητα τυροσινάσης [20]. Επιπλέον, η τυροσινάση έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για τη μελανογένεση [29]. Προηγούμενες μελέτεςέχουν δείξει ότι η μοριακή σύνδεση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της ανασταλτικής δραστηριότητας της τυροσινάσης [30,31]. Έτσι, πραγματοποιήθηκαν υπολογισμοί μοριακής σύνδεσης για την κατανόηση του μοντέλου δέσμευσης του IPAκαι DPHC, μια γνωστή πολυφαινόλη που απομονώθηκε από IO, η οποία έχει αποκαλύψει υψηλότερη ενέργεια δέσμευσης στοδράση κατά της μελανογένεσης από την αρμπουτίνη, ως θετικό μάρτυρα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα (Εικόνα1), Το IPA αποκάλυψε τις χαμηλότερες βαθμολογίες σύνδεσης, οι οποίες έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση του IPA με τον στόχοΗ πρωτεϊνική τυροσινάση ήταν ισχυρότερη από τις άλλες δύο ενώσεις, την DPHC και την αρβουτίνη. Ωστόσο,υπάρχει περιορισμός στη συσχέτιση της αναστολής της δραστηριότητας της τυροσινάσης μανιταριού με αυτή της κυτταρικήςπαραγωγή τυροσινάσης ή μελανίνης σε καλλιεργημένα μελανοκύτταρα [32]. Έτσι, τα ανασταλτικά αποτελέσματατου ΜΠΒ στιςΗ δραστηριότητα της τυροσινάσης και η μελανογένεση εξετάστηκαν σε ζέβραin vivoμοντέλο και B16F10 ποντικούκύτταρα μελανώματος.


Οι χρωστικές μελανίνης συσσωρεύονται στην επιφάνεια του ψαριού ζέβρα, επιτρέποντας τη μικροσκοπική παρατήρηση τουδιαδικασία μελάγχρωσης χωρίς περίπλοκες πειραματικές διαδικασίες, καθιστώντας τα ένα κατάλληλο μοντέλογια τον έλεγχο αναστολέων μελανογένεσης [33,34]. Αξιολογήσαμε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της μελανίνηςκαι IOE σε μοντέλο προνύμφης ζέβρα που διεγείρεται από -MSH μέσω προσδιορισμού περιεκτικότητας σε μελανίνη.Όλα τα δείγματα που δοκιμάστηκαν άσκησαν βαθιά ανασταλτικά αποτελέσματαστη μελάγχρωση του ψαριού zebra χωρίς σημαντικήτοξικότητα (Εικόνα S2). Οι ανασταλτικές επιδράσειςτης μελάγχρωσης παρατηρήθηκαν μέσω μορφολογικής ανάλυσης τωνπρονύμφες zebrafish που σχετίζονται με το διαφορετικόθεραπείες (Εικόνα2). Επιπλέον, η χρήση προνυμφών πρώιμου σταδίουπαρά το στάδιο του ενήλικα παρέχει ένα άλλο πλεονέκτημα στη δοκιμή των διαδερμικών επιδράσεωντων φαρμακευτικώνή καλλυντικές ενώσεις [33,35]. Σε αυτή την περίπτωση, επιλέξαμε -MSH ως επαγωγέας τόσο σε zebrafish in vivoκαι σε κύτταρα μελανώματος B16F10in vitro. Σύμφωνα με τα δύο αποτελέσματα σε έμβρυα ψαριών ζέβρα και B16F10κύτταρα μελανώματος, η περιεκτικότητα σε μελανίνη αυξήθηκε κατά - Διέγερση MSH.


Η περιεκτικότητα σε μελανίνη συσχετίζεται άμεσα με τη δραστηριότητα και τα επίπεδα πρωτεΐνης της τυροσινάσης.36]. Επομένως,προσδιορίσαμε τα ανασταλτικά αποτελέσματατου IPA και του IOE σχετικά με τη δραστηριότητα τυροσινάσης που προκαλείται από -MSH ενεργοποιημένοΚύτταρα B16F10. Βρήκαμε ότι η ομάδα που έλαβε IPA είχε μειωμένη δραστηριότητα τυροσινάσης και μελανίνηπεριεχόμενο που διεγείρεται από -MSH, με μείωση περίπου 35 τοις εκατό της δραστηριότητας τυροσινάσης και 40 τοις εκατόπεριεκτικότητα σε μελανίνη (Εικόνα4ΜΕΤΑ ΧΡΙΣΤΟΝ). Το IOE ανέστειλε τη δραστηριότητα της τυροσινάσης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο καισημαντικά μειωμένη μελανογένεση στα κύτταρα B16F10 (Εικόνα4Β, Δ). Σε σύγκριση με την αρμπουτίνη, το IPA καιΤο IOE έχει σημαντικές ανασταλτικές επιδράσειςσχετικά με την παραγωγή μελανίνης και τη δραστηριότητα τυροσινάσης, η οποία ήταν νατα αποτελέσματα προηγούμενων μελετών μοριακής σύνδεσης.


Να διερευνήσει τον μηχανισμό των ανασταλτικών επιδράσεωνεπί -Σύνθεση μελανίνης που προκαλείται από MSH σεκυττάρων, πραγματοποιήθηκε στύπωμα Western. Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανίνη, συμπεριλαμβανομένωνΤα ERK, JNK και p38, μετά από θεραπεία με IPA ή IOE, αξιολογήθηκαν. Ενεργοποιημένη φωσφορυλίωσητου ERK μπορεί να προάγει την αποδόμηση του MITF μέσω της οδού που εξαρτάται από την ουβικιτίνη-πρωτεάσωμα [28]. Αυτό υποδηλώνει ότι οι πιθανοί αναστολείς της μελανογένεσης μπορεί να καταστέλλουν τη σύνθεση μελανίνης προάγονταςη πρωτεασωμική αποδόμηση του MITF, η οποία σχετιζόταν με την ενεργοποίηση της σηματοδότησης ERKμονοπάτια [37]. Τα MAPK ERK, JNK και p38 ανήκουν στην οικογένεια MAPK [38–40]. Επιπλέον,ενεργοποίηση της έκφρασης MITF που προκαλείται από το μονοπάτι p38 MAPK [41]. Σε αυτή τη μελέτη, το Western blotΗ ανάλυση αποκάλυψε ότι το IPA προάγει τα p-JNK και p-p38 (Εικόνα5ΠΡΟ ΧΡΙΣΤΟΥ). Αντίθετα, τα επίπεδα της p-ERKδεν άλλαξε με τη θεραπεία του IPA και του IOE (Εικόνα5ΕΝΑ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματατου IPA και του IOE σχετικά με τη δραστηριότητα της τυροσινάσης και τη μελανογένεση μπορεί να σχετίζεται με το JNK και το p38μονοπάτια σηματοδότησης.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Χημικά και Αντιδραστήρια

Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT),L-DOPA, άλφα-μελανοκυτταρική ορμόνη ( -MSH) και ρυθμισμένο με φωσφορικάφυσιολογικό ορό (PBS)αγοράστηκαν από τη Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Η Dulbecco τροποποιήθηκεΤο μέσο Eagle (DMEM) και ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) ελήφθησαν από την Invitrogen–Gibco(Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Η εξωκυτταρική κινάση που ρυθμίζεται με σήμα (ERK1/2), φωσφορυλιωμένο ERK1/2 (ρ-ERK1/2), c-Jun N-τερματική κινάση (JNK), φωσφορυλιωμένη JNK (p-JNK), p38, φωσφορυλιωμένηp38 (p-p38), πρωτεΐνη δέσμευσης στοιχείων απόκρισης cAMP (CREB), φωσφορυλιωμένο CREB (p-CREB),μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF), πρωτεΐνη που σχετίζεται με τυροσινάση-1 (Trp-2),πρωτεΐνη που σχετίζεται με τυροσινάση-1 (Trp-1), τυροσινάση (TYR), αντισώματα IgG κατά ποντικού και κουνελιούαγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια, συμπεριλαμβανομένων -MSH, αγοράστηκαν από τη Sigma–Aldrich Chemical Co.

4.2. Μοριακή σύνδεση της Τυροσινάσης

Για τη μελέτη ελλιμενισμού, η κρυσταλλική δομή της τυροσινάσης (PDB: 3NM8) ελήφθη από τοΤράπεζα Δεδομένων Πρωτεϊνών. Οι μελέτες σύνδεσης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας CDOCKERστο Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA). Όταν ένα ολόκληρο νουκλεοτίδιοΗ αλληλουχία καλύπτεται από το πλέγμα του υποδοχέα, οι συνδέτες θεωρείται ότι επιλέγουν την καλύτερη θέση σύνδεσης [42]. Η διαδικασία σύνδεσης αναφέρθηκε στην προηγούμενη μελέτη. Εν συντομία, ακολουθήθηκαν τρία βήματα: (1)μετατροπή της δισδιάστατης δομής σε τρισδιάστατη δομή. (2) υπολογισμός των χρεώσεων. και (3) προσθήκη τουάτομα υδρογόνου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ευέλικτης σύνδεσης [31,43]. 

4.3. Προετοιμασία IOE και Απομόνωση IPA

Το IO συγκομίστηκε τον Ιούνιο του 2018 κατά μήκος της ανατολικής ακτής του νησιού Jeju, Κορέα. Το φύκι πλύθηκε δύο φορέςμε νερό βρύσης για να αφαιρέσετε το αλάτι, τα επίφυτα και την άμμο που έχουν προσκολληθεί στην επιφάνεια. Στη συνέχεια, ήταν προσεκτικάξεπλύθηκε με γλυκό νερό και διατηρήθηκε σε ιατρικό ψυγείο στο−20 ◦Γ. Στη συνέχεια, το κατεψυγμένοΗ άλγη λυοφιλοποιήθηκε και ομογενοποιήθηκε με μύλο πριν από την εκχύλιση. Το IOE εξήχθη κατά 50 τοις εκατόαιθανόλη (v/v, σε νερό) υπό ανάδευση για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια διηθήθηκε. Το διήθημαΤο εκχύλισμα συμπυκνώθηκε υπό αποσυμπίεση και λυοφιλοποιήθηκε σε σκόνη (IOE). Αιθανόλη 50 τοις εκατόΤο εκχύλισμα του IO διεξήχθη από την Shinwoo Co. Ltd. (Αρ. παρτίδας SW9E29SA, Gyeonggi-do, Κορέα). IPA ήταναπομονώθηκε από IOE όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Εν συντομία, το IOE κλασματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φυγόκεντροχρωματογραφία κατάτμησης. Όλα τα κλάσματα συλλέχθηκαν και η ΙΡΑ τελικά καθαρίστηκε με αστήλη ημι-παρασκευαστικής HPLC (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). Το IPA καθορίστηκε ως αΗ πολυφαινόλη και η χημική της δομή (Εικόνα S1, Συμπληρωματικά Υλικά) αναγνωρίστηκε μέσω LC/Κυρίαανάλυση με μάζαm/z του 992.1315, υποδεικνύοντας έτσι έναν μοριακό τύπο του C96H66O48 (1986.26 τουυπολογισμένο μοριακό βάρος,∆0.6, [M − 2H] 2−). 

4.4. Προέλευση και συντήρηση του γονικού ψαριού ζέβρα

Τα ενήλικα ζέβρα ελήφθησαν από έναν εμπορικό αντιπρόσωπο (Seoul Aquarium, Seoul, Korea) και 10τα ψάρια διατηρήθηκαν σε ακρυλική δεξαμενή 3-L στους 28,5◦C, με κύκλο φωτός: σκοτάδι 14:10 ωρών. Ζέβρα ήταντρέφονται δύο φορές την ημέρα, για 6 ημέρες⁄εβδομάδα, με συμπληρωματική τροφή νιφάδας Tetramin (SEWHAPET Food Co.,Σεούλ, Κορέα). Τα έμβρυα συλλέχθηκαν μέσα σε 30 λεπτά με φυσική ωοτοκία και προκλήθηκαν το πρωίανάβοντας το φως. Το πείραμα με ψάρι ζέβρα έλαβε έγκριση από το Animal Care and UseΕπιτροπή του Εθνικού Πανεπιστημίου Jeju (Αρ. Έγκρισης 2017-0001).

4.5. Μέτρηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη σε προνύμφες Zebrafish

IPA και IOE και διεγερτικό -Συγκεντρώσεις MSH χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των επιδράσεωντουσυγκέντρωση στην ανάπτυξη του εμβρύου. Δεκαπέντε έμβρυα zebrafish (3–4 hpf) σπάρθηκαν σε καθέναφρεάτιο, που περιλαμβάνει 1,9 mL εμβρυϊκού μέσου, σε 12-πλάκα σποράς φρεατίου. Τα δείγματα δοκιμής διαλύθηκανσε 1 τοις εκατό DMSO με 1× PBS και ανακατεύουμε καλά. Κάθε πρωί για τα πρώτα 5 pdf, ήταν βιώσιμα έμβρυααπαριθμούνται για να λάβουν ένα μέτρο επιβίωσης. Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε μελανίνη, τα έμβρυα στο7–9 hpf σπάρθηκαν σε μια 6-πλάκα με 30 έμβρυα σε κάθε φρεάτιο σε ένα εμβρυϊκό μέσο 2,7-mL.Μετά από 3 ημέρες, οι προνύμφες ξεπλύθηκαν δύο φορές με 1× PBS για την αφαίρεση τυχόν υπολειμματικών αντιδραστηρίων ήσωματίδια και παρόμοιες ποσότητες προνυμφών τοποθετήθηκαν στα e-tubes. Πριν τη μέτρηση της μελανίνηςπεριεχόμενο, αρκετές προνύμφες από κάθε ομάδα συλλήφθηκαν με μικροσκόπιο και οι υπόλοιπες φυγοκεντρήθηκαν.


Μετά τη φυγοκέντρηση, το ίζημα διαλύθηκε σε 1 mL NaOH 1 Ν στους 90°C◦C για 60 λεπτά. Το μίγμαστη συνέχεια στροβιλίστηκε έντονα για να διαλυτοποιηθεί η χρωστική μελανίνη. Η απορρόφηση του υπερκειμένου ήτανμετρήθηκε στα 490 nm. Το αποτέλεσμα συγκρίθηκε με τον έλεγχο που θεωρήθηκε ότι αντιπροσωπεύει έναεκατό. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη βαθμονομήθηκε κατά ποσότητα πρωτεΐνης και οι παρατηρήσεις επαναλήφθηκανεις τριπλούν.

4.6. Κυτταροτοξικότητα IPA και IOE σε κύτταρα B16F10

Κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 ελήφθησαν από την ATCC (American Type Culture Collection,Manassas, VA, ΗΠΑ). Τα κύτταρα B16F10 καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 100 U/mL πενικιλίνης,100 µg/mL στρεπτομυκίνης και 10 τοις εκατό FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 στο37 ◦C και στη συνέχεια υποκαλλιεργούνταν κάθε 3-5 ημέρες. Η κυτταροτοξικότητα του IPA και του IOE έναντι του B16F10Τα κύτταρα διερευνήθηκαν μέσω χρωματομετρικής ανάλυσης ΜΤΤ. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24-πλάκες φρεατίου στο α

συγκέντρωση 2× 104κύτταρα/mL. Περίπου 16 ώρες μετά τη σπορά, τα κύτταρα επωάστηκαν με IPA και IOEσε διαφορετικάσυγκεντρώσεις για 72 ώρες και προσδιορίστηκε η βιωσιμότητά τους.

4.7. Προσδιορισμός Περιεκτικότητας Κυτταρικής Μελανίνης

Η περιεκτικότητα σε κυτταρική μελανίνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Τα κύτταρα(2 × 104 κύτταρα/mL) επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις IPA και IOE για 72 ώρες. επομένως,πλύθηκαν σε παγωμένο PBS. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 80°C◦C για 1 ώρα σε 1 mL 1 NNaOH/10 τοις εκατό DMSO και στη συνέχεια στροβιλίστηκαν για να διαλυτοποιηθεί η μελανίνη: η απορρόφηση μετρήθηκε σε450 nm. Η οπτική πυκνότητα της αναστολής στον έλεγχο θεωρήθηκε ότι είναι 100 τοις εκατό. Τα δεδομένα είναιπαρουσιάστηκαν με τη μορφή μέσων ποσοστών και τα αποτελέσματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν.

















Μπορεί επίσης να σας αρέσει