Cistancheέχει επίσης τη λειτουργία τουπροώθηση της παραγωγής κολλαγόνου, που μπορεί να αυξήσει την ελαστικότητα και τη λάμψη του δέρματος και να βοηθήσειεπισκευάσει τα κατεστραμμένα κύτταρα του δέρματος. CistancheΓλυκοζίτες φαινυλαιθανόληςέχουν σημαντική ρυθμιστική επίδραση στη δραστηριότητα της τυροσινάσης και η επίδραση στην τυροσινάση αποδεικνύεται ότι είναι ανταγωνιστική και αναστρέψιμη αναστολή, η οποία μπορεί να προσφέρει μια επιστημονική βάση για την ανάπτυξη και τη χρήση των λευκαντικών συστατικών στο Cistanche. Ως εκ τούτου, το κιστανάκι έχει βασικό ρόλο στο δέρμαλεύκανση. Μπορείαναστέλλουν την παραγωγή μελανίνηςγια τη μείωση του αποχρωματισμού και της θαμπάδας. και προωθεί την παραγωγή κολλαγόνου για τη βελτίωση της ελαστικότητας και της λάμψης του δέρματος. Λόγω της ευρείας αναγνώρισης αυτών των επιδράσεων του cistanche, πολλά προϊόντα λεύκανσης δέρματος έχουν αρχίσει να εγχύουν φυτικά συστατικά όπως το Cistanche για να καλύψουν τη ζήτηση των καταναλωτών, αυξάνοντας έτσι την εμπορική αξία του Cistanche σε προϊόντα λεύκανσης δέρματος. Εν ολίγοις, ο ρόλος του κιστάνου στη λεύκανση του δέρματος είναι καθοριστικός. Τουαντιοξειδωτικόαποτέλεσμα καιαποτέλεσμα παραγωγής κολλαγόνουμπορεί να μειώσει τον αποχρωματισμό και τη θαμπάδα, να βελτιώσει την ελαστικότητα και τη λάμψη του δέρματος και έτσι να επιτύχει ένα αποτέλεσμα λεύκανσης. Επίσης, η ευρεία εφαρμογή του Cistanche σε προϊόντα λεύκανσης δέρματος αποδεικνύει ότι ο ρόλος του στην εμπορική αξία δεν μπορεί να υποτιμηθεί.

Κάντε κλικ στο Organic Cistanche για λεύκανση

Για περισσότερες πληροφορίες:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Η τυροσινάση είναι το ένζυμο που περιορίζει τον ρυθμό παραγωγής μελανίνης και, κατά συνέπεια, είναι ο πιο σημαντικός στόχος για την αναστολή της υπερμελάγχρωσης. Έχουν εντοπιστεί πολυάριθμοι αναστολείς τυροσινάσης, αλλά οι περισσότεροι από αυτούς στερούνται κλινικής αποτελεσματικότητας επειδή ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ως στόχο την τυροσινάση μανιταριού. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη τυροσινάση για να εξετάσουμε μια βιβλιοθήκη 50,000 ενώσεων και συγκρίναμε τα ενεργά αποτελέσματα διαλογής με γνωστά λευκαντικά συστατικά. Η υδροκινόνη και το παράγωγό της η αρβουτίνη ανέστειλαν μόνο ασθενώς την ανθρώπινη τυροσινάση με ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) στο millimolar εύρος και το κοζικό οξύ έδειξε ασθενή αποτελεσματικότητα (IC50 > 500 mmol/L). Οι πιο ισχυροί αναστολείς της ανθρώπινης τυροσινάσης που εντοπίστηκαν σε αυτή τη διαλογή ήταν τα παράγωγα ρεσορκινόλης-θειαζόλης, ειδικά η πρόσφατα ταυτοποιημένη Thiamidol (Beiersdorf AG, Αμβούργο, Γερμανία) (ισοβουτυλ αμιδοθειαζολυλ ρεσορκινόλη), η οποία είχε IC50 1,1 mmol/L. Αντίθετα, η θειαμιδόλη ανέστειλε μόνο ασθενώς την τυροσινάση των μανιταριών (IC50 =108 mmol/L). Σε καλλιέργειες μελανοκυττάρων, η θειαμιδόλη ανέστειλε έντονα αλλά αναστρέψιμα την παραγωγή μελανίνης (IC50 =0.9 mmol/L), ενώ η υδροκινόνη ανέστειλε μη αναστρέψιμα τη μελανογένεση (IC 50 = 16.3 mmol/L). Κλινικά, το Thiamidol μείωσε εμφανώς την εμφάνιση των κηλίδων ηλικίας εντός 4 εβδομάδων και μετά από 12 εβδομάδες, ορισμένες κηλίδες ηλικίας δεν διακρίνονταν από το κανονικό γειτονικό δέρμα. Η πλήρης δυνατότητα του Thiamidol να μειώνει την υπερμελάγχρωση του ανθρώπινου δέρματος πρέπει να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το μέλασμα, οι ακτινικές και γεροντικές φακίδες και η μεταφλεγμονώδης υπερμελάγχρωση είναι σημαντικά αισθητικά προβλήματα για τα οποία πολλοί ασθενείς αναζητούν ιατρική συμβουλή. Γενικά, αυτές οι διαταραχές επηρεάζουν πληθυσμούς με πιο σκούρα δέρματα με μεγαλύτερη συχνότητα και σοβαρότητα (Στρατηγός και Κατσαμπάς, 2004). Πολλά τοπικά προϊόντα είναι διαθέσιμα για τη θεραπεία υπερμελάγχρωσης διαταραχών και περιέχουν ποικίλα δραστικά συστατικά για τη μείωση της παραγωγής και/ή της διανομής μελανίνης. Αν και η υπερμελάγχρωση του δέρματος μπορεί να μειωθεί με διάφορους μηχανισμούς (Briganti et al., 2003), η τυροσινάση, το ένζυμο που περιορίζει τον ρυθμό παραγωγής μελανίνης, είναι ο προφανής στόχος για τους αναστολείς της υπερμελάγχρωσης (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014· Ramsden and Riley, 2014). Πολλές ουσίες έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία ως αναστολείς της τυροσινάσης, αλλά οι περισσότερες από αυτές στερούνται κλινικής αποτελεσματικότητας και μόνο λίγες ενώσεις χρησιμοποιούνται επί του παρόντος σε τοπικά δερματολογικά προϊόντα (Chang, 2009; Kim and Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002 ). Μεταξύ αυτών, το κοτζικό οξύ, η υδροκινόνη και η αρβουτίνη είναι τα πιο κοινά (Solano et al., 2006).

Η μη ικανοποιητική κλινική αποτελεσματικότητα των επί του παρόντος χρησιμοποιούμενων αναστολέων τυροσινάσης είναι μεγάλη επειδή αυτές οι ενώσεις δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας μόνο τυροσινάση που απομονώθηκε από το μανιτάρι Agaricus bisporus (mTyr) (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005), το οποίο είναι το μόνο ενεργή τυροσινάση άμεσα διαθέσιμη στο εμπόριο. Οι καταλυτικές δραστηριότητες και οι ειδικότητες υποστρώματος του mTyr είναι σημαντικά διαφορετικές από το ένζυμο των θηλαστικών (Hearing et al., 1980). Οι τρισδιάστατες δομές πολλών τυροσινασών επιλύθηκαν πρόσφατα, μεταξύ των οποίων οι δομές του mTyr (Ismaya et al., 2011) και δύο βακτηριακών ενζύμων από Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba et al., 2006) και Bacillus megaterium (Sendovski . , 2011). Αντίθετα, πολύ λίγες κινητικές ή δομικές πληροφορίες είναι διαθέσιμες για την ανθρώπινη τυροσινάση (hTyr), κυρίως λόγω των ουσιαστικών δυσκολιών στη λήψη επαρκών ποσοτήτων hTyr από φυσικές πηγές ή από ετερόλογη έκφραση. Το hTyr έχει εκφραστεί παροδικά σε διάφορες ζωικές κυτταρικές σειρές (Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt, 2006), αλλά οι αποδόσεις ήταν πάντα πολύ χαμηλές για έναν λεπτομερή χαρακτηρισμό του προκύπτοντος Παρασκευάσματα hTyr. Πιο πρόσφατα, αρκετές ομάδες έχουν αναπτύξει πιο αποτελεσματικά συστήματα έκφρασης για το hTyr (Cordes et al., 2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016), αλλά δεδομένα σχετικά με την τρισδιάστατη δομή του hTyr ή τα κινητικά δεδομένα του Οι αναστολείς hTyr εξακολουθούσαν να λείπουν.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Αναστολή του hTyr

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1.200 mmol/L (Εικόνα 2α).

Μια λεπτομερής κινητική ανάλυση της αναστολής του hTyr από τη Θειαμιδόλη έδωσε έναν αυστηρά ανταγωνιστικό τύπο αναστολής με σταθερά αναστολέα (Ki) 0,25 mmol/L (Εικόνα 2b, Πίνακας 1). Αυτή η τιμή συμφωνεί με την τιμή IC50 που εκτιμάται από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης (1,1 mmol/L) (βλ. Σχήμα 2a), η οποία, για ανταγωνιστική αναστολή, θα πρέπει να είναι περίπου 3 φορές υψηλότερη από το Ki. Οι τιμές Ki για τη 4-βουτυλρεζορκινόλη (9 mmol/L), την 4-εξυλρεσορκινόλη (39 mmol/L) και την 4- φαινυλαιθυλορεσορκινόλη (24 mmol/L) ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερες από τις Τιμή Ki της θειαμιδόλης (Πίνακας 1). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το τμήμα θειαζολυλαμιδίου της θειαμιδόλης μεταφέρει πολύ καλύτερη αναστολή του hTyr από τις πλευρικές αλυσίδες υδρογονάνθρακα που υπάρχουν σε τρία άλλα παράγωγα της ρεσορκινόλης (4-βουτυλ-, 4-εξυλ- και {{ 21}}φαινυλαιθυλική ρεσορκινόλη). Όπως σημειώθηκε, η αποτελεσματικότητα είναι σαφώς διαφορετική στο mTyr, όπου η 4-βουτυλική ρεσορκινόλη, 4-εξυλρεσορκινόλη και 4-φαινυλαιθυλορεσορκινόλη, ακόμη και το κοζικό οξύ, είναι ανώτερα από την θειαμιδόλη στην αναστολή του ενζύμου (Πίνακας 1). Επομένως, η θειαμιδόλη δεν θα είχε αναγνωριστεί ως θετική σε μια διαλογή με χρήση mTyr και η αποτελεσματικότητα της 4-φαινυλαιθυλορεσορκινόλης θα είχε υπερεκτιμηθεί κατάφωρα.

Garcia-Jimenez et al. (2016) ανέφερε πρόσφατα ότι το mTyr οξειδώνει αργά ορισμένες ρεσορκινόλες, με την προϋπόθεση ότι η επικρατούσα μέθοδος του ενζύμου έχει προηγουμένως μετατραπεί είτε σε οξυ είτε σε δεοξυ-μορφή από πρόσθετα όπως το H2O2 και το ασκορβικό και ότι η αντίδραση διατηρείται από ο-διφαινόλες . Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε ποσοτική ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (Ito and Wakamatsu, 2015) για να εξακριβώσουμε εάν το Thiamidol μπορεί επίσης να είναι υπόστρωμα του hTyr. Στις κανονικές συνθήκες της δοκιμασίας μας (δηλ. απουσία των προσθέτων που αναφέρονται από τους Garcia-Jimenez et al., 2016), δεν έλαβε χώρα ανιχνεύσιμη οξείδωση της θειαμιδόλης μέσα σε αρκετές ώρες από την επώαση με hTyr, ενώ το ροδόδενδρο οξειδώθηκε εύκολα εντός αυτού του χρονικού πλαισίου (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα S1 online). Έτσι, υποθέτουμε ότι η αντίδραση που περιγράφεται από τους Garcia-Jimenez et al. δεν έχει σημασία για το Thiamidol και το hTyr σε φυσιολογικές συνθήκες.

Αναστολή παραγωγής μελανίνης

Στη συνέχεια δοκιμάσαμε τις πιθανές ανασταλτικές επιδράσεις αυτών των ενώσεων χρησιμοποιώντας ένα τρισδιάστατο μοντέλο για το ανθρώπινο δέρμα. Όπως παρατηρήθηκε με το καθαρισμένο hTyr, η αρβουτίνη έδειξε μόνο αμελητέα αποτελεσματικότητα στην αναστολή της παραγωγής μελανίνης σε μοντέλα δέρματος MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) (IC50 > 4,000 mmol/L) (Εικόνα 2γ) . Το Kojic acid ανέστειλε την παραγωγή μελανίνης με IC50 w400 mmol/L, δείχνοντας μια εκπληκτικά απότομη καμπύλη δόσης-απόκρισης, με συγκεντρώσεις κάτω από 200 mmol/L να αναστέλλουν ελαφρώς μόνο την παραγωγή μελανίνης (δηλ. κατά 5 τοις εκατό στα 150 mmol/L). Το Rhododendron έδειξε μόνο οριακές επιδράσεις στη μελανογένεση, με εμφανή IC50 για αναστολή w1.200 mmol/L. Η υδροκινόνη ανέστειλε την παραγωγή μελανίνης σε μοντέλα δέρματος MelanoDerm με IC50 15 mmol/L, υποδηλώνοντας ότι έχει μηχανισμό διαφορετικό από την αναστολή της τυροσινάσης. 4-Η βουτυλρεσορκινόλη ανέστειλε τη σύνθεση μελανίνης με IC50 13,5 mmol/L. Και πάλι, η Thiamidol ήταν, μακράν, ο πιο ισχυρός αναστολέας της παραγωγής μελανίνης σε μοντέλα δέρματος MelanoDerm, με IC50 0,9 mmol/L, και σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας, η Thiamidol μείωσε ορατά το σχηματισμό μελανίνης (Εικόνα 3α).

Στη συνέχεια, η υδροκινόνη και η θειαμιδόλη δοκιμάστηκαν σε μακροχρόνιες καλλιέργειες μονοστοιβάδας μελανοκυττάρων για να ελεγχθεί η πιθανή αναστρεψιμότητα της αναστολής. Αν και 1 mmol/L θειαμιδόλης μείωσε την παραγωγή μελανίνης σε λιγότερο από 60 τοις εκατό μετά από 2 εβδομάδες, 1 mmol/L υδροκινόνης μείωσε την παραγωγή μελανίνης μόνο σε περίπου 85 τοις εκατό (Εικόνα 3β). Ωστόσο, μετά από περαιτέρω καλλιέργεια χωρίς τις δραστικές ενώσεις, τα μελανοκύτταρα που είχαν ανασταλεί από το Thiamidol επανάρχισαν γρήγορα την παραγωγή μελανίνης, φτάνοντας τα επίπεδα προεπεξεργασίας εντός 1 εβδομάδας. Αντίθετα, τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με υδροκινόνη δεν ανέκτησαν την πλήρη ικανότητά τους για παραγωγή μελανίνης εντός της περιόδου καλλιέργειας 2-εβδομάδων και η παραγωγή μελανίνης συνεχίστηκε στο 85 τοις εκατό των επιπέδων προεπεξεργασίας.

Μοριακή μοντελοποίηση

Οι πιθανοί τρόποι δέσμευσης της θειαμιδόλης στο hTyr εξετάστηκαν με μελέτες εικονικής σύνδεσης. Το Σχήμα 4α δείχνει την ενεργή θέση του μοντέλου ομολογίας του hTyr στη μετ-μορφή, με έναν συνδεδεμένο συνδέτη Thiamidol σε μια διαμόρφωση χαμηλότερης ενέργειας. Το κέντρο διχάλκινου με το οξυγόνο γεφύρωσης είναι ορατό στα αριστερά. Δείχνονται μόνο υπολείμματα αμινοξέων αμέσως δίπλα στον δεσμευμένο αναστολέα. (Η αρίθμηση υπολειμμάτων περιλαμβάνει το πεπτίδιο σήματος). Η εσωτερική επιφάνεια της θήκης δεσίματος χρωματίζεται σύμφωνα με την υδροφοβικότητα σε μια κλίμακα από μπλε για υδρόφιλο έως καφέ για υδρόφοβο. Αν και το περιβάλλον του διχαλκού κέντρου είναι ευδιάκριτα υδρόφιλο, ένας ισχυρά υδρόφοβος υποθύλακος σχηματίζεται κυρίως από τις πλευρικές αλυσίδες των I368, V377 και F347. Στον χωρικό προσανατολισμό που φαίνεται, η 1-υδροξυ ομάδα του αρωματικού δακτυλίου του συνδέτη κάνει εκτεταμένες επαφές με το κέντρο διχαλκού και η 3-υδροξυ ομάδα εμπλέκεται σε δεσμούς υδρογόνου με την πλευρική αλυσίδα του S380 και το καρβονύλιο κορμού του M374. Ο θειαζολυλ δακτύλιος συγκρατείται στη θέση του με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τον μη πολικό θύλακα (Εικόνα 4β), που σχηματίζεται από πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων, τα περισσότερα από τα οποία διαφέρουν μεταξύ mTyr και hTyr (Εικόνα 4γ).

Συγκρίσιμα αποτελέσματα λήφθηκαν όταν η Thiamidol προσαρτήθηκε στην πρόσφατα δημοσιευμένη δομή ακτίνων Χ του δομικά παρόμοιου TRP1, ενός μελανογόνου ενζύμου που περιέχει Zn2þ με ακόμη άγνωστη λειτουργία στους ανθρώπους (Ghanem and Fabrice, 2011· Lai et al., 2017), υποδηλώνοντας ότι το ένζυμο TYRP1 αναστέλλεται επίσης από τη θειαμιδόλη (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα S2 online).

Κλινικές μελέτες

Η in vivo αποτελεσματικότητα της θειαμιδόλης εξετάστηκε στη συνέχεια σε κλινικές μελέτες όπου τα ηλικιωμένα άτομα αντιμετώπιζαν κηλίδες ηλικίας στο δέρμα τους δύο φορές την ημέρα με μια φόρμουλα που περιείχε {{0}},2 τοις εκατό θειαμιδόλη ή με το όχημα μόνο ως έλεγχο. Ήδη μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, οι κηλίδες ηλικίας που υποβλήθηκαν σε αγωγή ήταν σημαντικά ελαφρύτερες από τις κηλίδες ηλικίας που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Εικόνα 5α). Η βελτίωση συνεχίστηκε καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας και μετά από 12 εβδομάδες ορισμένες από τις κηλίδες ηλικίας δεν διακρίνονταν από το περιβάλλον κανονικά μελάγχρωση του δέρματος (Εικόνα 5β). Οι φωτογραφίες EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) έδειξαν ορατή βελτίωση στην εμφάνιση των κηλίδων ηλικίας και οι μη επεξεργασμένες ηλικιακές κηλίδες ελέγχου παρέμειναν αμετάβλητες (δεν φαίνονται). Μια μελέτη παρακολούθησης έδειξε ότι οι συγκεντρώσεις θειαμιδόλης τόσο χαμηλές όσο 0,1 τοις εκατό μείωσαν αποτελεσματικά την ορατότητα των κηλίδων ηλικίας (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα S3 στο διαδίκτυο).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ο ασφαλέστερος και πιο αποτελεσματικός τρόπος για τη θεραπεία της δερματικής υπερμελάγχρωσης είναι η μείωση της παραγωγής μελανίνης αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της τυροσινάσης. Ωστόσο, οι περισσότεροι αναστολείς τυροσινάσης που περιγράφονται στη βιβλιογραφία στερούνται κλινικής αποτελεσματικότητας όταν ενσωματώνονται σε τοπικά προϊόντα. Σχεδόν όλα αυτά δοκιμάστηκαν μόνο έναντι του mTyr (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005) και έτσι, αν και αποτελεσματικά έναντι του mTyr, αποδείχθηκαν φτωχοί αναστολείς του hTyr. Το εμπορικά διαθέσιμο mTyr δεν είναι ένα ομοιογενές παρασκεύασμα, αλλά μάλλον είναι ένα μείγμα πολλών ισοενζύμων τυροσινάσης και μικρών ποσοτήτων πρόσθετων ενζυμικών δραστηριοτήτων που μπορεί να επηρεάσουν τις μελέτες αναστολής με απρόβλεπτους τρόπους (Pretzler et al., 2017). Τα ισοένζυμα AbPPO3 και AbPPO4, τα κύρια συστατικά του εμπορικά διαθέσιμου mTyr, έχουν αλληλουχίες αμινοξέων στην περιοχή της ενεργού θέσης που διαφέρουν σημαντικά από το hTyr (Εικόνα 4γ). Και τα δύο ισοένζυμα mTyr περιέχουν επιπλέον βρόχους μεταξύ Asn371 (μία από τις θέσεις γλυκοζυλίωσης του hTyr) και Gly372. Αρκετά από τα υπολείμματα που αλληλεπιδρούν με Θειαμιδόλη στο hTyr (βλ. Εικόνα 4β) δεν διατηρούνται στο mTyr, για παράδειγμα, Ile368, Ser375 και Ser380. Το Phe207 διατηρείται δομικά στο mTyr, ενώ το Phe347 δεν είναι. Επειδή ακόμη και μικρές αλλαγές στις αλληλεπιδράσεις ενζύμου-προσδέματος μπορεί να έχουν δραματικά αποτελέσματα στις συγγένειες δέσμευσης, τα διαφορετικά προφίλ αναστολής των hTyr και mTyr (συνοψίζονται στον Πίνακα 1) δεν προκάλεσαν έκπληξη.

Ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν η σύγκριση των επιδράσεων της αρβουτίνης, της υδροκινόνης και του κοτζικού οξέος με διάφορα παράγωγα ρεσορκινόλης στην καταλυτική λειτουργία του hTyr και στην παραγωγή μελανίνης in vivo. Εκτός από το Thiamidol, όλες οι ουσίες που δοκιμάστηκαν έχουν περιγραφεί ως αναστολείς τυροσινάσης (Kim et al., 2012). Ωστόσο, οι αναφερόμενες ανασταλτικές τους δραστηριότητες είναι εξαιρετικά αποκλίνουσες. Στην ιατρική βιβλιογραφία, η υδροκινόνη θεωρείται το πρότυπο κριτήριο για τη θεραπεία της υπερμελάγχρωσης του δέρματος, αν και υπάρχουν σοβαρές ανησυχίες σχετικά με την ασφάλειά της. Η υδροκινόνη απαγορεύεται στην Ευρωπαϊκή Ένωση να χρησιμοποιείται σε καλλυντικά, αλλά εξακολουθεί να πωλείται στις Ηνωμένες Πολιτείες ως φάρμακο χωρίς ιατρική συνταγή σε σκευάσματα που περιέχουν έως και 2 τοις εκατό υδροκινόνη. Πρόσφατα, η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (2006) εξέφρασε ανησυχία για την υδροκινόνη. Ωστόσο, η τελική απόφαση εκκρεμεί ακόμη. Οι δημοσιευμένες τιμές IC50 για την αναστολή υδροκινόνης του mTyr καλύπτουν ένα εύρος από 1,1 mmol/L (Kang et al., 2003) έως 680 mmol/L (Abu Ubeid et al., 2009). Στην ανάλυσή μας, η υδροκινόνη ήταν αξιοσημείωτα αναποτελεσματική έναντι του hTyr, αναστέλλοντάς το μόνο ελαφρά, φτάνοντας μόλις το 50 τοις εκατό αναστολή σε περίπου 4,000 mmol/L. Αν και η υδροκινόνη θεωρείται αναστολέας τυροσινάσης από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 (Palumbo et al., 1991), τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι κυτταροτοξικές της ιδιότητες είναι πιο σημαντικές, όχι μόνο για τις δυσμενείς επιδράσεις της στα μελανοκύτταρα αλλά και για την αποτελεσματικότητά της ως αναστολέας της μελανογένεσης (Jimbow et al., 1974· Penney et al., 1984· Smith et al., 1988). Αυτή η άποψη τεκμηριώνεται όχι μόνο από τα αποτελέσματά μας με το hTyr και το γεγονός ότι η υδροκινόνη μείωσε σημαντικά την παραγωγή μελανίνης σε μοντέλα δέρματος αλλά και από τα πειράματά μας με καλλιέργειες μελανοκυττάρων. Εδώ, η υδροκινόνη μείωσε την παραγωγή μελανίνης, αλλά τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή δεν ανέκτησαν την πλήρη ικανότητα παραγωγής μελανίνης μετά την απομάκρυνση της δραστικής ουσίας.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) για την αρβουτίνη τόσο με καθαρισμένο hTyr όσο και με το μοντέλο δέρματος MelanoDerm. Έχουν δημοσιευθεί δεδομένα σχετικά με την αποτελεσματικότητα τόσο της α-αρβουτίνης όσο και της β-αρβουτίνης (Garcia-Jimenez et al., 2017). Ωστόσο, και οι δύο ενώσεις είναι προ-φάρμακα της υδροκινόνης, με τη βιολογική τους δράση να εξαρτάται από την απελευθέρωση υδροκινόνης από το μόριο (Briganti et al., 2003). Η Επιστημονική Επιτροπή της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα Καταναλωτικά Προϊόντα (2008) δημοσίευσε κριτική γνώμη για την αρμπουτίνη. Δεδομένης της απελευθέρωσης υδροκινόνης από το μόριο, θεωρεί ότι η χρήση της αρμπουτίνης σε καλλυντικά προϊόντα δεν είναι ασφαλής.

Οι δημοσιευμένες τιμές IC50 για την αναστολή της τυροσινάσης από το kojic acid κυμαίνονται από 6 mmol/L (Curto et al., 1999) έως περισσότερα από 100 mmol/L (Jeon et al., 2005). Ως αναστολέας του hTyr, το κοζικό οξύ είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματικό, με IC50 περίπου 500 mmol/L. Το Kojic acid εμφανίζει έναν μικτό τύπο αναστολής, με Ki 145 mmol/L, υποδεικνύοντας ότι συνδέεται με τη δεοξυ μορφή της τυροσινάσης (Sun et al., 2014). Όταν χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του μοντέλου MelanoDerm, το kojic acid εμφανίζει μια εξαιρετικά απότομη καμπύλη δόσης-απόκρισης, με σχετική αναστολή να αυξάνεται από 5 τοις εκατό στα 150 mmol/L σε περισσότερο από 75 τοις εκατό αναστολή στα 900 mmol/L (βλ. Εικόνα 2γ). Αυτό το γεγονός μπορεί να είναι ο κύριος λόγος για την πολύ περιορισμένη αποτελεσματικότητα του kojic acid in vivo. Όσον αφορά την ασφάλεια του kojic acid, η Ευρωπαϊκή Επιστημονική Επιτροπή για την Ασφάλεια των Καταναλωτών (2012) θεωρεί πλέον το κοζικό οξύ σε συγκεντρώσεις έως και 1,0% ως ασφαλές για καλλυντικά προϊόντα όταν εφαρμόζεται σε υγιές δέρμα, μια άποψη που συμμερίζεται η Ομάδα Εμπειρογνωμόνων Cosmetic Ingredient Review ( Burnett et al., 2010).

Το Rhododendron έλαβε καθεστώς οιονεί ναρκωτικού στην Ιαπωνία το 2008 και χρησιμοποιήθηκε ως συστατικό λεύκανσης σε καλλυντικά προϊόντα. Θεωρήθηκε ότι ήταν ένας ανταγωνιστικός αναστολέας της τυροσινάσης. Ωστόσο, το 2013, προϊόντα που περιέχουν ροδόδενδρο ανακλήθηκαν σε 10 ασιατικές χώρες όταν σχεδόν 20,000 καταναλωτές εμφάνισαν λευκοδερμία μετά τη χρήση των προϊόντων. Αποδείχθηκε ότι το ροδόδενδρο δεν είναι μόνο ένας αναστολέας αλλά είναι επίσης ένα υπόστρωμα τόσο του hTyr (Ito et al., 2014a) όσο και του mTyr (Ito et al., 2014b). Η εξαρτώμενη από την τυροσινάση συσσώρευση του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου και/ή η ενεργοποίηση της αποπτωτικής οδού μπορεί να συμβάλει στην κυτταροτοξικότητα των μελανοκυττάρων του ροδόδεντρου (Sasaki et al., 2014).

Το μοτίβο 4-υποκατεστημένης ρεσορκινόλης είναι γνωστό εδώ και αρκετό καιρό ως αποτελεσματικό χημικό τμήμα που αναστέλλει την τυροσινάση (Khatib et al., 2005). Πολλές φυσικές ενώσεις που έχουν αναγνωριστεί ως λευκαντικοί παράγοντες, κυρίως φλαβονοειδή, περιέχουν αυτό το μοτίβο (Shimizu et al., 2000, 2011). Επειδή η βιοδιαθεσιμότητα των φλαβονοειδών είναι γενικά χαμηλή, στόχος μας ήταν να εντοπίσουμε παράγωγα ρεσορκινόλης με καλύτερη αποτελεσματικότητα και βιοδιαθεσιμότητα. 4-Η βουτυλρεσορκινόλη είχε ήδη αναγνωριστεί ως αναστολέας της τυροσινάσης ποντικού και ανθρώπου (Kim et al., 2005; Kolbe et al., 2013) και της δραστικότητας της οξειδάσης διυδροξυ ινδόλης καρβοξυλικού οξέος TYRP1 ποντικού (Katagiri et al. , 2001), και είναι εμπορικά διαθέσιμο για την ιατρική και καλλυντική θεραπεία της υπερμελάγχρωσης (Bohnsack et al., 2012; Jimenez and Garcia-Carmona, 1997; Kim et al., 2005). Ωστόσο, εξακολουθούσαν να λείπουν λεπτομερή κινητικά δεδομένα της 4-βουτυλορεσορκινόλης. Στην ανάλυση hTyr, βρήκαμε έναν αυστηρά ανταγωνιστικό τύπο αναστολής από τη 4-βουτυλική ρεσορκινόλη με Ki 9,1 mmol/L, η οποία συμφωνεί εξαιρετικά με την τιμή IC50 που προσδιορίστηκε (Πίνακας 1).

Στα in vitro πειράματά μας, το Thiamidol, με IC50 1,1 mmol/L στον προσδιορισμό ενζύμου hTyr και 0,9 mmol/L στο μοντέλο δέρματος MelanoDerm, ήταν μακράν η πιο αποτελεσματική από όλες τις ουσίες που δοκιμάστηκαν. Περαιτέρω πειράματα επιβεβαίωσαν ότι η θειαμιδόλη είναι ένας αυστηρά ανταγωνιστικός αναστολέας (Εικόνα 2β) και όχι υπόστρωμα για την τυροσινάση (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα S1) και, επομένως, η θειαμιδόλη δεν μετατρέπεται σε τοξική και δυνητικά επάγουσα λευκοδερμία κινόνη. Ως εκ τούτου, το Thiamidol επιλέχθηκε για κλινικές μελέτες για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητάς του in vivo. Μια μελέτη της θειαμιδόλης με χρήση συσκευής εφαρμογής σημείων έδειξε συνεχή βελτίωση στην εμφάνιση των κηλίδων ηλικίας καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας 12-εβδομάδων, φθάνοντας σε στατιστική σημασία ήδη από τις 4 εβδομάδες. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια ισχυρή αποτελεσματικότητα μείωσης της χρωστικής του προϊόντος δοκιμής Thiamidol και ένα σαφές κλινικό όφελος στη διαχείριση της υπερμελάγχρωσης του δέρματος.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Ανθρώπινη τυροσινάση

Μια περικομμένη, επισημασμένη με His μορφή του hTyr (hTyr-DHis) που περιλαμβάνει την καταλυτική περιοχή του hTyr εκφράστηκε σε κύτταρα HEK 293 και καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας μετάλλου σε Ni2þ-Sepharose (GE Healthcare, Μόναχο, Γερμανία) όπως περιγράφεται αλλού ( Cordes et al., 2013). Το παρασκεύασμα που προέκυψε είχε τις ίδιες καταλυτικές ιδιότητες με το άγριου τύπου hTyr.

Πηγές αναστολέων

Από τη βιβλιοθήκη ενώσεων Evotec (Evotec, Αμβούργο, Γερμανία), 50,000 ενώσεις, που καλύπτουν ένα ευρύ χημικό χώρο, επιλέχθηκαν για τη διεξαγωγή ενός HTS για αναστολείς hTyr, που αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό Tyr που περιγράφεται στην επόμενη ενότητα. Στη συνέχεια συντέθηκαν παράγωγα υποσχόμενων ενώσεων μολύβδου για περαιτέρω βελτιστοποίηση. Οι άλλοι αναστολείς αγοράστηκαν από διάφορους προμηθευτές (βλ. Συμπληρωματικά Υλικά στο διαδίκτυο για λεπτομέρειες).

Δοκιμασία τυροσίνης και διαδικασία HTS

Πλήρεις λεπτομέρειες για τη δράση της οξειδάσης L-dopa και τις διαδικασίες διαλογής HTS που χρησιμοποιούνται μπορούν να βρεθούν στα Συμπληρωματικά Υλικά.

Μοριακή μοντελοποίηση

Η σύνδεση στο silico βασίστηκε σε ένα νέο μοντέλο ομολογίας του hTyr, που περιγράφεται αλλού (Mann et al., 2017). Οι προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Molegro Virtual Docker (Molegro, Aarhus, Δανία). Το Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση και παρουσίαση οπτικών δεδομένων. Οι ακολουθίες ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων UniProt (UniProt Consortium, 2017).

Δοκιμασίες μοντέλων δέρματος

Πλήρεις λεπτομέρειες για τους ιστούς MelanoDerm που χρησιμοποιούνται ως μοντέλο δέρματος και την ποσότητα n της περιεκτικότητάς τους σε μελανίνη μπορείτε να βρείτε στα Συμπληρωματικά Υλικά.

Καλλιέργειες μελανοκυττάρων

Πλήρεις λεπτομέρειες για τις καλλιέργειες μελανοκυττάρων και την ποσοτικοποίηση της περιεκτικότητάς τους σε μελανίνη μπορείτε να βρείτε στα Συμπληρωματικά Υλικά.

Κλινικές μελέτες

Διεξήχθησαν δύο τυχαιοποιημένες in vivo μελέτες (τυφλές για τα προϊόντα δοκιμής, ανοιχτές για τον μάρτυρα χωρίς θεραπεία). Σε μία μελέτη συμμετείχαν 18 γυναίκες (56-71 ετών), με 17 άτομα να ολοκλήρωσαν τη μελέτη. Η δεύτερη μελέτη πραγματοποιήθηκε με 19 άτομα (18 γυναίκες, 1 άνδρας, ηλικίας 58e7{{1{0}} ετών), και τα 19 άτομα ολοκλήρωσαν τη μελέτη. Κάθε υποκείμενο εφάρμοζε δύο διαφορετικά σκευάσματα δύο φορές την ημέρα σε κηλίδες γήρανσης στους βλαστούς πήχεις του χρησιμοποιώντας έναν εφαρμοστή κηλίδων. Τα σκευάσματα διέφεραν μόνο ως προς το δραστικό συστατικό: 0,2 τοις εκατό θειαμιδόλη έναντι φορέα στην πρώτη μελέτη και 0,1 τοις εκατό θειαμιδόλη έναντι φορέα στη δεύτερη μελέτη. Μία κηλίδα ηλικίας ανά άτομο υποβλήθηκε σε θεραπεία με μια φόρμουλα που περιείχε το δραστικό συστατικό και ένα σημείο ελέγχου υποβλήθηκε σε θεραπεία μόνο με το όχημα. Η μελάγχρωση των κηλίδων ηλικίας αναλύθηκε όπως περιγράφεται στα Συμπληρωματικά Υλικά. Οι in vivo μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις της τρέχουσας έκδοσης της Διακήρυξης του Ελσίνκι και τις κατευθυντήριες γραμμές της Διεθνούς Διάσκεψης για την Εναρμόνιση της Ορθής Κλινικής Πρακτικής. Όλοι οι συμμετέχοντες σε αυτές τις μελέτες παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Επιπλέον, οι μελέτες εγκρίθηκαν και εγκρίθηκαν από το θεσμικό συμβούλιο αναθεώρησης της Beiersdorf AG (Αμβούργο, Γερμανία).

ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

Το συμπληρωματικό υλικό συνδέεται με την ηλεκτρονική έκδοση της εργασίας.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1.Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Ολιγοπεπτίδια βραχείας αλληλουχίας με ανασταλτική δράση έναντι μανιταριών και ανθρώπινης τυροσινάσης. J Invest Dermatol 2009;129:2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Αποτελεσματικότητα και ανεκτότητα μείωσης της μελάγχρωσης έξι νέων σκευασμάτων περιποίησης προσώπου που περιέχουν 4-n-βουτυλική ρεσορκινόλη, αφίσα αρ. P864. Αφίσα που παρουσιάστηκε στο 21ο Συνέδριο EADV, Σεπτέμβριος 27-30, 2012. Πράγα, Τσεχία.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Χημικές και ενόργανες προσεγγίσεις για τη θεραπεία της υπερμελάγχρωσης. Pigment Cell Res 2003; 16:101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC, et al. Τελική έκθεση της αξιολόγησης ασφάλειας του Kojic acid όπως χρησιμοποιείται στα καλλυντικά. Int J Toxicol 2010; 29 (6 Suppl.). 244Se73.

5. Τσανγκ ΤΣ. Μια ενημερωμένη ανασκόπηση των αναστολέων τυροσινάσης. Int J Mol Sci 2009; 10: 2440e75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. Ανασταλτικές επιδράσεις εξυλρεσορκινόλης και δωδεκυλορεζορκινόλης στην τυροσινάση μανιταριού (Agaricus bisporus). Protein J 2004;23:135e41.

7. Cordes P, Sun W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨hm KH. Έκφραση σε μη μελανογόνα συστήματα και καθαρισμός διαλυτών παραλλαγών ανθρώπινης τυροσινάσης. Biol Chem 2013; 394:685e93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer Η, Glatt Η, Santis C, Virador V, et al. Αναστολείς της τυροσινάσης μελανοκυττάρων θηλαστικών: in vitro συγκρίσεις αλκυλ εστέρων του γεντισικού οξέος με άλλους πιθανούς αναστολείς. Biochem Pharmacol 1999, 57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert ΜΑ, Garcia-Ruiz ΡΑ, Tudela J, et al. Κινητικός χαρακτηρισμός της εξειδίκευσης του υποστρώματος και του μηχανισμού της τυροσινάσης μανιταριού. Eur J Biochem 2000;267:1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Ανθρώπινη τυροσινάση που παράγεται σε κύτταρα εντόμων: ορόσημο για τον έλεγχο νέων φαρμάκων που αντιμετωπίζουν τη δραστηριότητά της. ΜοΙ Biotechnol 2015; 57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Δράση της τυροσινάσης σε άλφα και βήτα-αρβουτίνη: Μια κινητική μελέτη. PLoS One 2017;12:e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. Χαρακτηρισμός της δράσης της τυροσινάσης στις ρεσορκινόλες. Bioorg Med Chem 2016; 24:4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F, et al. Τυροσινάση μανιταριού: δραστηριότητα καταλάσης, αναστολή και απενεργοποίηση αυτοκτονίας. J Agric Food Chem 2005;53:3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. Tyrosinase-related protein 1 (tyrp1/gp75) σε ανθρώπινο δερματικό μελάνωμα. Mol Oncol 2011; 5:150e5.

15. Hearing VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. Τυροσινάση θηλαστικών. Στοιχειομετρία και μέτρηση προϊόντων αντίδρασης. Biochim Biophys Acta 1980, 611:251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Κρυσταλλική δομή της τυροσινάσης μανιταριού Agaricus bisporus: η ταυτότητα των τετραμερών υπομονάδων και η αλληλεπίδραση με την τροπολόνη. Biochemistry 2011; 50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika Μ, Wakamatsu Κ. Η ανθρώπινη τυροσινάση μπορεί να οξειδώσει και τα δύο εναντιομερή του ροδόδεντρου. Pigment Cell Melanoma Res 2014a;27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. Η οξείδωση του ροδόδεντρου που καταλύεται από τυροσινάση παράγει 2-μεθυλοχρωμάνιο-6,7-διόνη, τον υποτιθέμενο τελικό τοξικό μεταβολίτη: επιπτώσεις για την τοξικότητα των μελανοκυττάρων . Pigment Cell Melanoma Res 2014b;27:744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Μια βολική μέθοδος διαλογής για τη διαφοροποίηση των φαινολικών αναστολέων λεύκανσης του δέρματος της τυροσινάσης από τις φαινόλες που προκαλούν λευκοδερμία. J Dermatol Sci 2015; 80:18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. Ανασταλτικές επιδράσεις της οξείδωσης l-Dopa της τυροσινάσης από λευκαντικούς παράγοντες του δέρματος. Bull Korean Chem Soc 2005;26:1135e7.

21. Jimbow Κ, Obata Η, Pathak ΜΑ, Fitzpatrick TB. Μηχανισμός αποχρωματισμού από υδροκινόνη. J Invest Dermatol 1974; 62:436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-υποκατεστημένες ρεσορκινόλες (θειούχες εναλλακτικές λύσεις) ως αναστολείς βραδείας δέσμευσης της δραστηριότητας κατεχολάσης τυροσινάσης. J Agric Food Chem 1997;45:2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Δραστηριότητα αποχρωματισμού και χαμηλή κυτταροτοξικότητα αλκοξυβενζοϊκών ή αλκοξυ κινναμιδικών σε καλλιεργημένα μελανοκύτταρα. Chem Pharm Bull (Τόκιο) 2003, 51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Συσχετίσεις δομής-λειτουργίας στις τυροσινάσες. Prot Sci 2015;24:1360e9.

25. Katagiri Τ, Okubo Τ, Oyobikawa Μ, Futaki Κ, Shaku Μ, Kawai Μ, et αϊ. Ανασταλτική δράση της 4-n-βουτυλ ρεσορκινόλης στη μελανογένεση και τη λεύκανση του δέρματος. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001; 35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Chalcones ως ισχυροί αναστολείς τυροσινάσης: η σημασία ενός υποκατεστημένου τμήματος 2,4- ρεσορκινόλης. Bioorg Med Chem 2005; 13:433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK, et al. Ανασταλτικές επιδράσεις της 4-n-βουτυλ ρεσορκινόλης στη δραστηριότητα της τυροσινάσης και στη σύνθεση μελανίνης. Biol Pharm Bull 2005; 28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Park KC. Τοπικοί υποχρωματισμένοι παράγοντες για χρωστικές διαταραχές και οι μηχανισμοί δράσης τους. Ann Dermatol 2012; 24:1e6.

29. Kim YJ, Uyama H. ​​Αναστολείς Τυροσινάσης από φυσικές και συνθετικές πηγές, δομή, μηχανισμός αναστολής και προοπτική για το μέλλον. Cell ΜοΙ Life Sci 2005;62:1707e23.

30. Kolbe L, Mann Τ, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C, et αϊ. 4-n-βουτυλική ρεσορκινόλη, ένας εξαιρετικά αποτελεσματικός αναστολέας τυροσινάσης για την τοπική θεραπεία της υπερμελάγχρωσης. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013;27: 19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez Μ, Wichers HJ, Dijkstra BW. Μεγάλης κλίμακας ανασυνδυασμένη έκφραση και καθαρισμός ανθρώπινης τυροσινάσης κατάλληλη για δομικές μελέτες. PLoS One 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez Μ, Dijkstra BW. Η δομή της πρωτεΐνης 1 που σχετίζεται με την ανθρώπινη τυροσινάση αποκαλύπτει μια διπυρηνική ενεργή θέση ψευδαργύρου σημαντική για τη μελανογένεση. Angew Chem Int Ed Engl 2017; 56:9812e5.

33. Lee SY, Baek Ν, Nam TG. Φυσικοί, ημισυνθετικοί και συνθετικοί αναστολείς τυροσινάσης. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;31:1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Isobutylamido thiazolyl resorcinol a new power inhibitor of human tyrosinase. Pigment Cell Melanoma Res 2017:e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Κρυσταλλογραφικές ενδείξεις ότι το διπυρηνικό κέντρο χαλκού της τυροσινάσης είναι FL εύκαμπτο κατά τη διάρκεια της κατάλυσης. J Biol Chem 2006, 281:8981e90.

35. Nesterov Α, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe Ρ, et αϊ. 1-(2,4- διυδροξυ φαινυλ)-3-(2,4-διμεθοξυ-3-μεθυλφαινυλ)προπάνιο, ένας νέος αναστολέας τυροσινάσης με ισχυρά αποτελέσματα αποχρωματισμού. Chem Pharm Bull (Τόκιο) 2008, 56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Ταυτοποίηση υπολειμμάτων ενεργού θέσης που εμπλέκονται στη δέσμευση μεταλλικού συμπαράγοντα και στη στερεοειδική αναγνώριση υποστρώματος στην τυροσινάση θηλαστικών. Επιπτώσεις στον καταλυτικό κύκλο. Biochemistry 2002; 41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. Μηχανισμός αναστολής μελανογένεσης από υδροκινόνη. Biochim Biophys Acta 1991, 1073:85e90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. Η δράση αποχρωματισμού της υδροκινόνης εξαρτάται από τη διαταραχή των θεμελιωδών κυτταρικών διεργασιών. J Invest Dermatol 1984, 82:308e10.

39. Pretzler Μ, Bijelic Α, Rompel Α. Ετερολογική έκφραση και χαρακτηρισμός λειτουργικής τυροσινάσης μανιταριού (AbPPO4). Sci Rep 2017; 7:1810.

40. Ramsden CA, Riley PA. Τυροσινάση: οι τέσσερις καταστάσεις οξείδωσης της ενεργού θέσης και η σχέση τους με την ενζυματική ενεργοποίηση, την οξείδωση και την αδρανοποίηση. Bioorg Med Chem 2014; 22:2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. Tyrosinase inhibition, γενικές και εφαρμοσμένες πτυχές. J Enzyme Inhib Med Chem 2002, 17:207e18.

42. Sasaki Μ, Kondo Μ, Sato Κ, Umeda Μ, Kawabata Κ, Takahashi Υ, et αϊ. Το Rhododendron, μια φαινολική ένωση που προκαλεί αποχρωματισμό, ασκεί κυτταροτοξικότητα μελανοκυττάρων μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από την τυροσινάση. Pigment Cell Melanoma Res 2014;27:754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Ένα τρισδιάστατο μοντέλο ενεργού θέσης τυροσινάσης θηλαστικών που αντιπροσωπεύει την απώλεια λειτουργικών μεταλλάξεων. Pigment Cell Res 2007; 20: 394e401.

44. Επιστημονική Επιτροπή Καταναλωτικών Προϊόντων. Γνώμη για την β-αρβουτίνη. 2008 (πρόσβαση στις 21 Νοεμβρίου 2017).

45. Επιστημονική Επιτροπή για την Ασφάλεια των Καταναλωτών. Γνώμη για το kojic acid; 2012 (πρόσβαση στις 21 Νοεμβρίου 2017).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Οι πρώτες δομές μιας ενεργού βακτηριακής τυροσινάσης αποκαλύπτουν πλαστικότητα χαλκού. J ΜοΙ Biol 2011;405: 227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. Αναστολή της τυροσινάσης από φλαβονοειδή, στιλβένια και σχετικές 4-υποκατεστημένες ρεσορκινόλες: έρευνες δομής-δραστικότητας. Planta Med 2000;66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Arau´jo P, et al. Χαρακτηρισμός ενζύμου, απομόνωση και κλωνοποίηση cDNA της οξειδάσης πολυφαινόλης στις καρδιές της παλάμης τριών εμπορικά σημαντικών ειδών. Plant Physiol Biochem 2011;49:970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. Η εκλεκτική κυτταροτοξικότητα της υδροκινόνης για κύτταρα που προέρχονται από μελανοκύτταρα προκαλείται από τη δραστηριότητα της τυροσινάσης αλλά ανεξάρτητα από την περιεκτικότητα σε μελανίνη. Pigment Cell Res 1988, 1:386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hypopigmenting agents: an updated review on biological, chemical and κλινικές πτυχές. Pigment Cell Res 2006; 19:550e71.

51. Στρατηγός AJ, Κατσαμπάς Α.Δ. Βέλτιστη διαχείριση των ανυπόφορων διαταραχών της υπερμελάγχρωσης σε ασθενείς με σκουρόχρωμο δέρμα. Am J Clin Derm 2004; 5: 161e8.

52. Sugimoto Κ, Nomura Κ, Nishimura Τ, Kiso Τ, Sugimoto Κ, Kuriki Τ. Syntheses of a-arbutin-a-glycosides and their inhibitory effect on human tyrosinase. J Biosci Bioeng 2005;99:272e6.

53. Sun W, Wendt M, Klebe G, Ro¨hm KH. Σχετικά με την ερμηνεία της κινητικής αναστολής της τυροσινάσης. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29:92e9.

54. Tripathi RK, Hearing VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Μεταλλακτική χαρτογράφηση των καταλυτικών δραστηριοτήτων της ανθρώπινης τυροσινάσης. J Biol Chem 1992, 267: 23707e12.

55. Κοινοπραξία UniProt. UniProt: η καθολική βάση γνώσεων πρωτεϊνών. Nucleic Acids Res 2017;45:D158e69.

56. US Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services. Φαρμακευτικά προϊόντα λεύκανσης δέρματος για ανθρώπινη χρήση χωρίς ιατρική συνταγή. προτεινόμενος κανόνας. 71 Ομοσπονδιακό μητρώο 51146-5115521 (κωδικοποιημένο στο 21 CFR Part 310). 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs Κ, Franke Η, Lange S, Herrmann Μ, et αϊ. 4-(1-φαινυλμεθυλ)1,3-βενζολοδιόλη: ένας νέος, εξαιρετικά αποτελεσματικός παράγοντας λεύκανσης. Int J Cosmet Sci 2007;29:65e6. 58. Wendt M. Rationales design neuer tyrosinase-inhibitoren. Ph.D. ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ. Marburg, Γερμανία: University of Marburg Medical School; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC, et αϊ. Η αλοεσίνη και η αρμπουτίνη αναστέλλουν συνεργικά τη δραστηριότητα της τυροσινάσης μέσω διαφορετικού μηχανισμού δράσης. Arch Pharm Res 1999, 22:232e6.

Για περισσότερες πληροφορίες: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501