Η In Vivo χορήγηση βακτηριακών κοινοπραξιών εντέρου αναπαράγει τους μεταβοτύπους Α και Β της ουρολιθίνης σε ένα μοντέλο αρουραίου που δεν παράγει ουρολιθίνηⅠ

Για δεκαετίες, η κατανάλωση ελλαγιταννινών (ETs) και ελλαγικού οξέος (EA) έχει συσχετιστεί με πολυάριθμες βιολογικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων αντιοξειδωτικών, αντικαρκινικών, αντιφλεγμονωδών, αντιβακτηριακών και αντι-HIV δράσεων αντιγραφής.1 Ωστόσο, η απορρόφηση και η βιοδιαθεσιμότητα των ETs και EA είναι πολύ φτωχές. Προηγούμενες μελέτες σε ανθρώπους διαπίστωσαν ότι η απέκκριση στα ούρα της ΕΑ και ενός γλυκουρονιδίου ΕΑ-Ο είναι μικρότερη από το 1% της πρόσληψης.2,3 Ωστόσο, ενώ η απορρόφηση ΕΤ και ΕΑ είναι χαμηλή, μεταβολίζονται περαιτέρω από τη μικροχλωρίδα του παχέος εντέρου σε ουρολιθίνες (Uros), οι οποίες ευθύνονται, τουλάχιστον εν μέρει, για τις ευεργετικές επιδράσεις των τροφίμων πλούσιων σε ET και (ή) EA.1,4

Κάντε κλικ για καθαρτικό

Πρώτον, το EA απελευθερώνεται μέσω της υδρόλυσης των εστερικών δεσμών του ET από το ένζυμο γνωστό ως ελλαγιταννάση.5 Το EA υφίσταται περαιτέρω αποικοδόμηση, παράγοντας 6H-dibenzo[b,d]pyran-6-ένα παράγωγο που ονομάζεται Uros. Αυτός ο καταρράκτης αντιδράσεων ξεκινά με μια διάσπαση δακτυλίου λακτόνης από ένα ένζυμο λακτονάσης, με αποτέλεσμα το λουτεϊκό οξύ, το οποίο στη συνέχεια αποκαρβοξυλιώνεται σε πενταϋδροξυ-Uro (Uro-M5). Η διαδοχική αφυδροξυλίωση το μετατρέπει σε τετραϋδροξυ-Uros (Uro-D, Uro-E, και Uro-M6) και τριυδροξυ-Uros (Uro-C, UroM7 και Uro-G), για να δώσουν τελικά διυδροξυ-Uros (Uro-A andisoUro-A) και μονοϋδροξυ-Uro (Uro-B), τα τελευταία γενικά ανιχνεύονται όταν παράγεται και το isoUro-A.1

Η ευρεία ποικιλία των μεταβολικών προφίλ του Uro που ανιχνεύεται στους ανθρώπους μετά την κατανάλωση τροφών πλούσιων σε ET υποδηλώνει διαφορές μεταξύ των ατόμων στη μικροχλωρίδα του παχέος εντέρου που είναι υπεύθυνη για την υποβάθμιση της ΕΤ. )φαινόλες.6,9 Αυτή η αμφίδρομη αλληλεπίδραση μεταξύ της μικροχλωρίδας του εντέρου και των (πολυ)φαινολών ώθησε την επιστημονική κοινότητα να ομαδοποιήσει τον πληθυσμό με βάση τουςμεταβολικός φαινότυπος (μεταλλικός τύπος) για να εξηγήσει τις διαφορές στις επιδράσεις των πολυφαινολών.10,11 Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με το μεταβολισμό του ET και του EA, τα άτομα μπορούν να διαστρωματωθούν σε Urometabotypes (UMs) που σχετίζονται με τη σύνθεση και τη λειτουργικότητα του μικροβιώματος του εντέρου.7,8,12

Τρία ανθρώπινα UM (UM-A, UM-B και UM-0) που σχετίζονται με τρία διαφορετικά προφίλ παραγωγής Uro έχουν περιγραφεί σε Δυτικούς και Ανατολικούς πληθυσμούς.13–15 Από αυτή την άποψη, άτομα του μεταβοτύπου Α (UM-A) παράγουν πολλά ενδιάμεσα Uros αλλά μόνο την ουρολιθίνη Α(Uro-A), την κύρια απορροφούμενη Uro σε αυτό το UM, στο τέλος της μικροβιακής καταβολικής οδού. Τα άτομα του μεταβοτύπου Β (UM-B) παράγουν μερικά ενδιάμεσα Uros και τρία τελικά Uros, π.χ., urolithin B (Uro-B), urolithin A (IsoUro-A) και Uro-A, που είναι τα κύρια απορροφούμενα Uros στο UM-B. Επομένως, τα ενδιάμεσα Uros θα μπορούσαν να δράσουν κυρίως στο έντερο, ενώ τα τελικά θα μπορούσαν να έχουν τοπικά και συστηματικά αποτελέσματα.6 Αντίθετα, άτομα με μεταλλικό τύπο 0 (UM-0) δεν μπορούν να παράγουν αυτά τα τελικά Uros (μόνο τα μέχρι στιγμής έχει ανιχνευθεί πρόδρομη ουσία Urolithin-M5, η οποία δεν απορροφάται στο έντερο).

Διαφορές στα Ουροπροφίλ έχουν παρατηρηθεί μεταξύ των UM και κατά μήκος του παχέος εντέρου, δείχνοντας κυρίαρχη παραγωγή Uro στην περιοχή του άπω παχέος εντέρου. τον πληθυσμό των ΗΠΑ.13–15 Τα βακτηριακά γένη Gordonibacter και Ellagibacter έχουν αναγνωριστεί ως ικανά να μεταβολίζουν την ΕΑ σε μερικά Uros.20–23Ωστόσο, βρέθηκε ότι ορισμένα ενδιάμεσα (για παράδειγμα, Uro-D, Uro-E, Uro- Το M7 και το Uro-G) και το τελικό Uros (Uro-A και Uro-B) δεν παράγονται σε καθαρές καλλιέργειες αυτών των βακτηρίων, πράγμα που συνεπάγεται την ανάγκη για άλλα βακτήρια να ολοκληρώσουν το σύνολο Uros που διαμορφώνουν τόσο το UM-A όσο και το UM-B . Πρόσφατα, οι εντερικές κοινοπραξίες που εμπλέκονται στον μεταβολισμό της ΕΑ για την παραγωγή των Ουροπαραγωγικών μεταβότυπων (UM-A και UM-B) in vitro έχουν ταυτοποιηθεί.24

Βακτηριακές κοινοπραξίες που περιέχουν Gordonibacter plusEnterocloster genera και Ellagibacter plus Enterocloster παρήγαγαν in vitro τις ουρολιθίνες που σχετίζονται με το UM-A και το UM-B, αντίστοιχα.25 Ωστόσο, η ικανότητα αυτών των βακτηριακών κοινοπραξιών να αναπαράγουν ανθρώπινα προφίλ Uro που σχετίζονται με UM-A και UM-B in vivo είναι ακόμα άγνωστο. Επιπλέον, η ασφάλεια της κατανάλωσης αυτών των βακτηρίων που παράγουν Uro ως νέα προβιοτικά είναι ακόμα αβέβαιη, καθώς δεν έχει δοκιμαστεί προηγουμένως σε ζώα ή ανθρώπους. Στην παρούσα μελέτη, οι παραπάνω βακτηριακές κοινοπραξίες αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αποικίζουν το έντερο αρουραίων που δεν παράγουν Uro (όπως UM-0-) ​​και να τους μετατρέπουν σε Ουροπαραγωγούς που μιμούνται το UM-A και το UM-B, αντίστοιχα. Αξιολογήθηκε επίσης η ασφάλεια αυτών των βακτηριακών κοινοπραξιών. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν δύο νέες διαδικασίες ποσοτικής PCR (qPCR) σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του Ellagibacter και του Enterocloster σε δείγματα κοπράνων.

Υλικά και μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Τα Uros συντέθηκαν χημικά και καθαρίστηκαν από την VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Ισπανία). Η EA αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (St Louis, MO, ΗΠΑ). Αλατούχο διάλυμα φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) ελήφθη από τη FisherScientific (ΗΠΑ), ενώ η μεθανόλη, η αιθανόλη και το μυρμηκικό οξύ ήταν από την Panreac Química (Βαρκελώνη, Ισπανία). Διαλύτες ποιότητας υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC-MS) αγοράστηκαν από την JT Baker (Deventer, Ολλανδία). Το νερό UltrapureMilipore (Bedford, MA, USA) χρησιμοποιήθηκε σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. Όλα τα χημικά και τα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ποιότητας.

Προετοιμασία βακτηριακών κοινοπραξιών

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T και Enterocloster bolted CEBASS4A9, όλα απομονωμένα και ταυτοποιημένα στο εργαστήριό μας (CEBAS-CSL ανακαλλιεργημένα σε mWSPASIC5, -Σωλήνες αναερόβιου μέσου Chalgren (WAM, Oxoid) στους 37 βαθμούς για 48 ώρες σε αναερόβιο θάλαμο Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Νότια Ουαλία, UK) και επαναιωρημένοι σε PBS συμπληρωμένο με 10% γλυκερόλη και 0,05% L-cysteine ​​hydroac Química, Βαρκελώνη, Ισπανία). Μετά την αναερόβια επώαση, παρασκευάστηκαν κοινοπραξίες.24,25 Εν συντομία, η "βακτηριακή κοινοπραξία Α" περιείχε G. urolithinfaciens και στελέχη E. bolteae. Η "βακτηριακή κοινοπραξία Β" περιείχε καλλιέργειες Ε. isourolithinifaciens και Ε. bolteae. και "κοκτέιλ ελέγχου" περιείχε στείρο PBS με 10% γλυκερίνη και 0,05% υδροχλωρική L-κυστεΐνη. Πριν από τη χορήγηση, όλα τα κοκτέιλ κατανεμήθηκαν σε κλάσματα των 3,5 mL και διατηρήθηκαν στους -80 βαθμούς.

Ζώα, δίαιτες και πειραματικός σχεδιασμός

Το πειραματικό πρωτόκολλο (αναφορά 624/2020) εγκρίθηκε από την τοπική κυβέρνηση, την Επιτροπή Βιοηθικής του Ισπανικού Εθνικού Ερευνητικού Συμβουλίου (Μαδρίτη, Ισπανία) και την Επιτροπή Δεοντολογίας Πειραμάτων σε Ζώα από το Πανεπιστήμιο της Μούρθια (Ισπανία). Τα πειράματα ακολούθησαν τις συστάσεις της Ευρωπαϊκής Ένωσης σχετικά με τα πειράματα σε ζώα (Οδηγία 2010/63/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου για την προστασία των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς). Αρουραίοι Wistar (n=18· 9 θηλυκά και 9 αρσενικά) βάρους 240 ± 31 g ελήφθησαν από την Envigo (Βαρκελώνη, Ισπανία). Αυτό το μοντέλο αρουραίου επιλέχθηκε με βάση την αδυναμία του να παράγει Uros που παρατηρήθηκε στις προκαταρκτικές μας μελέτες, στις οποίες δοκιμάστηκαν δείγματα κοπράνων από διαφορετικά μοντέλα αρουραίων. Σχηματίστηκαν τρεις ομάδες (Α, Β και Γ) με τυχαία αντιστοίχιση 6 ζώων η καθεμία (3 θηλυκά και 3 αρσενικούς αρουραίους ) ανά ομάδα (Εικ. 1).

Κάθε ομάδα αρουραίων στεγάστηκε σε δύο διαφορετικά κλουβιά, χωρισμένα ανά φύλο, σε ένα δωμάτιο με περιβάλλον ελεγχόμενης θερμοκρασίας (22±2 βαθμούς) με σχετική υγρασία 55 ± 10% και ελεγχόμενο κύκλο φωτός-σκότους (12 ώρες). Οι αρουραίοι έλαβαν μια τυπική δίαιτα τροφής (Teklad, Βαρκελώνη, Ισπανία) που περιείχε (%/100 g φρέσκου βάρους) 14,3% πρωτεΐνες (άλευρο γλουτένης καλαμποκιού), 48% υδατάνθρακες (μωρά από σιτάρι, αλεσμένο σιτάρι, αλεσμένο καλαμπόκι) και 4% λίπος (έλαιο σόγιας). ), 2,9 kcal g−1 ενεργειακή πυκνότητα και 4,1% ακατέργαστες ίνες, συμπληρωμένες με σκόνη EA Μεγαλύτερη ή ίση με 95% καθαρότητα (3,6 mg ανά 100 g τροφής). Η ΕΑ αναμίχθηκε ομοιογενώς με αλεσμένη πρότυπη τροφοδοσία, επανασφαιροποιήθηκε και λυοφιλοποιήθηκε. Η εμπλουτισμένη με EA δίαιτα αποθηκεύτηκε μακριά από την υγρασία και το φως. Η δόση ΕΑ που δόθηκε στοοι αρουραίοι στη δίαιτα ήταν περίπου 0.72 mg ανά αρουραίο ανά ημέρα (διατροφή EA1×), μια ανθρώπινη ισοδύναμη δόση 41 mg ημερησίως-1,26 Όλες οι ομάδες έλαβαν τη δίαιτα EA 1× και το νερό της βρύσης κατά βούληση σε όλο το πείραμα ( 5 εβδομάδες). Δεδομένου ότι το EA που ανιχνεύθηκε στα δείγματα κοπράνων ήταν χαμηλό κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας, προστέθηκε κάποια επιπλέον EA τις επόμενες ημέρες. Την εβδομάδα 3, μια επιπλέον δόση 1,5 mgEA ανά αρουραίο ανά ημέρα, διαλυμένη σε νερό, χορηγήθηκε από το στόμα με καθετήρα στα ζώα (συνολική δίαιτα=EA 3×), η οποία χορηγήθηκε μόνο για 1 εβδομάδα. Τέλος, την εβδομάδα 4, ≈5 g καρύδια ανά αρουραίο ανά ημέρα (άλλη πηγή EA) προστέθηκαν στη δίαιτα EA 1× και διατηρήθηκαν μέχρι το τέλος της μελέτης για να αξιολογηθεί ο αντίκτυπος της τροφικής μήτρας που περιέχει ΕΑ στην ικανότητα των βακτηρίων να παράγει Uros. Το βάρος, η πρόσληψη τροφής και νερού μετρούνταν κάθε μέρα. Οι βακτηριακές κοινοπραξίες του εντέρου χορηγούνταν από το στόμα με γαστρεντερική κοιλότητα. Η ομάδα Α έλαβε 500 μL βακτηριακού κοκτέιλ Α, η ομάδα Β έλαβε 500 μL βακτηριακού κοκτέιλ Β και η ομάδα C (μάρτυρας) έλαβε 500 μL PBS. Ο στοματικός καθετήρας γινόταν κάθε 2 ημέρες κατά τις δύο πρώτες εβδομάδες και κάθε μέρα κατά τις επόμενες 2 εβδομάδες. Την τελευταία εβδομάδα (ημέρες 28 έως 32), τα ζώα συνέχισαν με την ίδια δίαιτα συμπληρωμένη με EA και καρύδια αλλά χωρίς χορήγηση βακτηρίων από το στόμα. Στο τέλος της μελέτης, τα ζώα θυσιάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο CO2.

Διαδικασίες δειγματοληψίας

Δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης για ανάλυση Uro με UPLC-ESI-QTOF-MS/MS και μικροχλωρίδα του εντέρου με αλληλούχιση του 16S rRNAgene και qPCR. Το αίμα ελήφθη σε διαφορετικά χρονικά σημεία (βασική γραμμή, ημέρα 28 και τέλος της μελέτης) για αιματολογικές και βιοχημικές αναλύσεις ορού. Λήφθηκαν δείγματα αίματος από την ουραία φλέβα (≈500 µL) και συλλέχθηκαν σε σωλήνες που περιείχαν ηπαρίνη στην αρχή και στις ημέρες 28 και 32 (Εικ. 1). Ο διαχωρισμός πλάσματος πραγματοποιήθηκε αμέσως με φυγοκέντρηση στα 3000 g για 10 λεπτά στους 4 βαθμούς και καταψύχθηκε στους - 80 μοιρών μέχρι τον περαιτέρω προσδιορισμό των οροβιοχημικών μεταβλητών. Το ήπαρ, τα νεφρά και ο σπλήνας συλλέχθηκαν, ζυγίστηκαν και εξετάστηκαν για να εντοπιστούν τυχόν μορφολογικές διαφορές κατά τη θυσία.

Σχεδιασμός και βελτιστοποίηση των εκκινητών και του ανιχνευτή για ποσοτικοποίηση του Ellagibacter και του Enterocloster με qPCR

Αλληλουχίες των γονιδίων 16S rRNA του Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T και E. bolted CEBAS S4A9 ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων GenBank (βάση δεδομένων EMBL). Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με το φυλογενετικά κοντινό βακτηρίδιο που δημιουργεί το λογισμικό Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 11) και επιθεωρήθηκαν για περιοχές διατηρημένων και μεταβλητών αλληλουχιών για τον σχεδιασμό των εκκινητών και του ανιχνευτή για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του Ellagibacter και του Enterocloster (Πίνακας 1). Οι εκκινητές και ανιχνευτής σχεδιάστηκαν και επικυρώθηκαν με τα εργαλεία Primer Questand Oligo Analyzer, αντίστοιχα (Integrated DNATechnologies, Inc., Βέλγιο). Ο ανιχνευτής TaqMan επισημάνθηκε στα άκρα 5' και 3' με μια6-ομάδα καρβοξυ-φθοροσκεΐνης (6FAM) και σβήσιμο βατόμουρου (BBQ), αντίστοιχα. Η qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ακολουθιών ABI 7500. Οι τελικές συγκεντρώσεις κάθε εκκινητή και ανιχνευτή ήταν 300 και 375 nM για το Ellagibacter και 200 ​​και 500 nM για το Enterocloster. Ένα συμβατικό πρωτόκολλο qPCR διεξήχθη για την ενίσχυση DNA του Ellagibacter καιΕντεροκλόστερ, αντίστοιχα. Το προφίλ ράμπας για την ενίσχυση του Ellagibacteramplification ήταν 1 κύκλος στις 95 μοίρες για 5 λεπτά, ακολουθούμενος από 45 κύκλους 95 μοιρών για 15 δευτερόλεπτα, 50 μοίρες για 40 δευτερόλεπτα και 72 μοίρες για 31 δευτερόλεπτα. Τέλος, προστέθηκε 1 κύκλος στους 72 βαθμούς για 5 λεπτά . Το προφίλ ράμπινγκ για την ενίσχυση Enterocloster ήταν 1 κύκλος στις 95 μοίρες για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους 95 μοιρών για 15 δευτερόλεπτα, 65 μοιρών για 40 δευτερόλεπτα και 72 μοιρών για 31 δευτερόλεπτα. Τέλος, προστέθηκε 1 κύκλος στους 72 βαθμούς για 5 λεπτά.

Εξαγωγή DNA κοπράνων και μικροβιακές αναλύσεις εντέρου

Η εξαγωγή DNA από δείγματα κοπράνων πραγματοποιήθηκε με το κιτ καθαρισμού ιστού DNA NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με ορισμένες τροποποιήσεις. Το DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά με φθορισμομέτρηση (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK) και η καθαρότητα μετρήθηκε από την αναλογία απορρόφησης σε μήκος κύματος 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK, UK, UK) ). Η σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου προσδιορίστηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας των μεταβλητών περιοχών V3 και V4 του γονιδίου 16S rRNA σύμφωνα με τα πρωτόκολλα Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) με μήκος ανάγνωσης 2 × 300 bp σε ζεύγη εκτέλεσης (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Η μεταγονιδιωματική αλληλουχία πραγματοποιήθηκε σε πλατφόρμα MiSeq-Illumina (FISABIO sequencingservice, Ισπανία). Η επεξεργασία δεδομένων, η αφαίρεση χιμαιρικής αλληλουχίας, η ευθυγράμμιση αλληλουχίας και η ομαδοποίηση της γονιδιακής αλληλουχίας 16S rRNA εκτελέστηκαν όπως περιγράφεται αλλού για να ληφθεί η ταξινομική ταξινόμηση. Ειδικοί εκκινητές και ανιχνευτές που σχεδιάστηκαν στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο qPCR που περιγράφεται παραπάνω. Για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκαν οι τυπικές καμπύλες DNA του γονιδιώματος των Gordonibacter, Enterocloster και Ellagibacter. Όλα τα δείγματα κοπράνων αναλύθηκαν εις τριπλούν.

Εξαγωγή, ανίχνευση και ποσοτικοποίηση ουρολιθινών σε δείγματα κοπράνων

Δείγματα κοπράνων ({{0}}.2–0.5 g) εξήχθησαν, σε αναλογία 1: 10, με διάλυμα MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), οξινίστηκε με0,1% HCl, και ομογενοποιήθηκε με στροβιλισμό για 2 λεπτά και ανακίνηση στις 1500 rpm σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά σε θερμαντήρα φραγμού. Το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε σε 14 000g στους 4 βαθμούς για 10 λεπτά και το υπερκείμενο διηθήθηκε μέσω φίλτρου μεμβράνης PVDF 0,22 μm (Milipore Corp., Bedford, ΜΑ) και αραιώθηκε 3x με MeOH (0,1% μυρμηκικό οξύ ) πριν από την ένεση σε σύστημα UPLC-ESI-QTOF-MS. Ένα σύστημα UPLC (Agilent 1290Infinity) συνδεδεμένο με ένα τετραπολικό σύστημα χρόνου πτήσης (QTOF) LC/MS (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των μεταβολιτών των κοπράνων χρησιμοποιώντας μια μέθοδο έκλουσης με κλίση όπως προηγουμένως .29,30 Εν συντομία, ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη αντίστροφης φάσης aPoroshell 120 EC-C18, χρησιμοποιώντας νερό και ακετονιτρίλιο, αμφότερα οξινισμένα με 0,1% μυρμηκικό οξύ, ως κινητές φάσεις. Ο ρυθμός ροής ήταν 0,4 mL min−1 και ο όγκος έγχυσης ήταν 5 μL. Για την επεξεργασία δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Qualitative Analysis MassHunter (έκδοση B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Γερμανία). Όλοι οι μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν με άμεση σύγκριση με πρότυπα και επιβεβαιώθηκαν από τη μοριακή τους μάζα. Οι καμπύλες βαθμονόμησης λήφθηκαν για το EA και τα διαφορετικά Uros με καλή γραμμικότητα (R2 > 0,99).

Αιματολογία και κλινική χημεία

Οι αιματολογικές μεταβλητές προσδιορίστηκαν σε ηπαρινισμένο αίμα χρησιμοποιώντας έναν αυτοματοποιημένο αιματολογικό αναλυτή με ειδικό λογισμικό για δείγματα αίματος αρουραίου (AVDIA 120, Siemens, Μόναχο, Γερμανία). Οι μεταβλητές που αναλύθηκαν ήταν ο μέσος σωματιδιακός όγκος (MCV), η μέση σωματιδιακή αιμοσφαιρίνη (MCH), η μέση σωματιδιακή συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (MCHC), η κατανομή των ερυθροκυττάρων (RDW), ο μέσος όγκος των αιμοπεταλίων (MPV), ο αιμοπεταλιακός κρίτης (PCT), το πλάτος κατανομής των αιμοπεταλίων (PDW) , μέσο συστατικό αιμοπεταλίων (MPC), μέση μάζα αιμοπεταλίων (MPM), αριθμό αιμοπεταλίων (PLT), περιεκτικότητα δικτυοερυθροκυττάρων σε αιμοσφαιρίνη (CHr) και μέσος σωματιδιακός όγκος δικτυοερυθροκυττάρων (MCVr). Οι βιοχημικές μεταβλητές πλάσματος, το ασβέστιο (Ca) και ο φώσφορος (Ρ) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν χημικό και τοξικολογικό αναλυτή Olympus AU400 (Beckman Coulter, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Οι βιοχημικές μεταβλητές ήταν ολικές πρωτεΐνες (PROT), αλβουμίνη (ALBU), σφαιρίνη (GLOB), κρεατινίνη (CREA), γλυκόζη (GLUC), χοληστερόλη (CHOL), τριγλυκερίδια (TRIGL), αλκαλική φωσφατάση (ALP), γ-γλουταμυλοτρανπεπτιδάση ( GGT), ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST) και αμινοτρανσφεράση αλανίνης (ALT). Τέλος, τα επίπεδα θυροξίνης (Τ4) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανοσοδοκιμασίας IMMULITE® 1000 (Siemens).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS έκδοση 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) και διαφορές με < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Η κανονικότητα των δεδομένων αξιολογήθηκε με τη δοκιμή Shapiro-Wilk. Οι συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών ομάδων θεραπείας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας επαναλαμβανόμενη μετρημένη ανάλυση διακύμανσης (RM ANOVA) με το post hoc τεστ T3 του Tukey ή Dunnett, ανάλογα με το αν τα δεδομένα ακολούθησαν κανονική ή μη κανονική κατανομή αντίστοιχα. Οι διαφορές μεταξύ ανδρών και θηλυκών διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο Student's t-test, ή το Wilcoxon signedrank test όταν τα δεδομένα κατανεμήθηκαν κανονικά ή μη, αντίστοιχα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης γραμμικής διάκρισης χ-τετράγωνο (LEfSe) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση διαφορικών βακτηριακών χαρακτηριστικών μεταξύ ομάδων. Η συσχέτιση Pearson χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση πιθανών συσχετίσεων μεταξύ μεταβλητών σε κανονικά κατανεμημένα δεδομένα, ενώ η συσχέτιση Spearman εφαρμόστηκε σε μη κανονικά κατανεμημένα δεδομένα. Οι γραφικές παραστάσεις δεδομένων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA).

Φυσικό Βοτανικό Φάρμακο για την Ανακούφιση από τη Δυσκοιλιότητα-Σκιστάνο

Το Cistanche είναι ένα γένος παρασιτικών φυτών που ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae. Αυτά τα φυτά είναι γνωστά για τις φαρμακευτικές τους ιδιότητες και χρησιμοποιούνται στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική (TCM) εδώ και αιώνες. Τα είδη Cistanche απαντώνται κυρίως σε άνυδρες και ερημικές περιοχές της Κίνας, της Μογγολίας και σε άλλα μέρη της Κεντρικής Ασίας. Τα φυτά Cistanche χαρακτηρίζονται από τους σαρκώδεις, κιτρινωπούς μίσχους τους και εκτιμώνται ιδιαίτερα για τα πιθανά οφέλη για την υγεία τους. Στο TCM, το Cistanche πιστεύεται ότι έχει τονωτικές ιδιότητες και χρησιμοποιείται συνήθως για τη θρέψη των νεφρών, την ενίσχυση της ζωτικότητας και την υποστήριξη της σεξουαλικής λειτουργίας. Χρησιμοποιείται επίσης για την αντιμετώπιση προβλημάτων γήρανσης, κόπωσης και γενικής ευεξίας. Ενώ το Cistanche έχει μακρά ιστορία χρήσης στην παραδοσιακή ιατρική, η επιστημονική έρευνα για την αποτελεσματικότητα και την ασφάλειά του είναι συνεχής και περιορισμένη. Ωστόσο, περιέχει διάφορες βιοδραστικές ενώσεις όπως φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, ιριδοειδή, λιγνάνες και πολυσακχαρίτες, οι οποίες μπορεί να συμβάλλουν στις φαρμακευτικές του επιδράσεις.

Το Wecistanche'sσκόνη cistanche, δισκία cistanche, κάψουλες cistanche,και άλλα προϊόντα αναπτύσσονται χρησιμοποιώνταςέρημοςκιστανάκιως πρώτες ύλες, που όλες έχουν καλή επίδραση στην ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός είναι ο εξής: Το Cistanche πιστεύεται ότι έχει πιθανά οφέλη για την ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα με βάση την παραδοσιακή χρήση του και ορισμένες ενώσεις που περιέχει. Ενώ η επιστημονική έρευνα ειδικά για την επίδραση του Cistanche στη δυσκοιλιότητα είναι περιορισμένη, πιστεύεται ότι έχει πολλαπλούς μηχανισμούς που μπορεί να συμβάλλουν στη δυνατότητά του να ανακουφίσει τη δυσκοιλιότητα. Υπακτικό αποτέλεσμα:Cistancheέχει χρησιμοποιηθεί από καιρό στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική ως θεραπεία για τη δυσκοιλιότητα. Πιστεύεται ότι έχει ένα ήπιο καθαρτικό αποτέλεσμα, το οποίο μπορεί να βοηθήσει στην προώθηση των κινήσεων του εντέρου και να προκαλέσει δυσκοιλιότητα. Αυτή η επίδραση μπορεί να αποδοθεί σε διάφορες ενώσεις που βρίσκονται στο Cistanche, όπως οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες και οι πολυσακχαρίτες. Ενυδάτωση των εντέρων: Με βάση την παραδοσιακή χρήση, το Cistanche θεωρείται ότι έχει ενυδατικές ιδιότητες, στοχεύοντας συγκεκριμένα στα έντερα. Η προώθηση της ενυδάτωσης και της λίπανσης των εντέρων μπορεί να βοηθήσει να μαλακώσουν τα εργαλεία και να διευκολύνουν το πέρασμα, ανακουφίζοντας έτσι τη δυσκοιλιότητα. Αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα: Η δυσκοιλιότητα μπορεί μερικές φορές να σχετίζεται με φλεγμονή στο πεπτικό σύστημα. Το Cistanche περιέχει ορισμένες ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων και των λιγνάνων, που πιστεύεται ότι έχουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Μειώνοντας τη φλεγμονή στα έντερα, μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της κανονικότητας των κινήσεων του εντέρου και στην ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα.