Επίδραση της πρόσληψης χαμηλής πρωτεΐνης κατά την κύηση στην έκφραση του εμβρυϊκού νεφρού MicroRNA και στα προγονικά κύτταρα νεφρώνα του αρσενικού εμβρύου
Mar 08, 2022
Εισαγωγή
Η έλλειψη θρεπτικών συστατικών μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές σηματοδότησης στις κεντρικές οδούς κατά τη διάρκεια διαφόρων σταδίων της εμβρυϊκής ανάπτυξης, οι οποίες μπορεί να προκαλέσουν μη αναστρέψιμες διαταραχές οργάνων και συστημάτων στην ενήλικη ζωή [1]. Ο εμβρυϊκός προγραμματισμός αναφέρεται σε οποιαδήποτε προσβολή κατά την ανάπτυξη, η οποία προκαλεί μακροπρόθεσμες επιπτώσεις στη δομή ή τη λειτουργία ενός οργανισμού [2]. Οι διαταραχές στον προγραμματισμό του εμβρύου έχουν ως αποτέλεσμα χαμηλό βάρος γέννησης, λιγότερους νεφρώνες και αυξημένο κίνδυνο καρδιαγγειακών καινεφρώνδιαταραχές στην ενήλικη ζωή [3-6]. Μελέτες από άλλους συγγραφείς και εμάς έχουν δείξει χαμηλότερο βάρος γέννησης, 28 τοις εκατό λιγότερους νεφρώνες, μειωμένονεφρώναπέκκριση αλατιού, χρόνιαΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑκαι την αρτηριακή υπέρταση στην πρόσληψη χαμηλής πρωτεΐνης (LP) κατά την κύηση σε σύγκριση με την τυπική πρόσληψη πρωτεΐνης (NP) στην ενήλικη ζωή [3-7]. Η νεφρογένεση περιλαμβάνει αυστηρό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης, της πρωτεϊνικής σύνθεσης και της αναδιαμόρφωσης των ιστών. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο αριθμός των νεφρώνων καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του οφθαλμού του ουρητήρα (UB) και των προγονικών κυττάρων του μεσεγχύματος του μετανέφρου (MM) [8-10]. Τα σήματα από το MM προκαλούν διεγερμένη από το UB ανάπτυξη και διακλάδωση του συστήματος των σωληναρίων. Με τη σειρά του, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των ΜΜ, που αποτελούν ένα μεσεγχυματικό κάλυμμα (CM), διαμεσολαβείται από τα άκρα UB [11].
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ
Υπήρξε σοβαρό ενδιαφέρον για τον ρόλο των επιγενετικών αλλαγών, σχετικά με τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις του προγεννητικού στρες, στην ανάπτυξη του εμβρύου [12]. Τα MicroRNA (miRNAs) είναι κωδικοποιημένα από το γονιδίωμα μικρά μη κωδικοποιητικά RNA μήκους περίπου 22 νουκλεοτιδίων και παίζουν ουσιαστικό ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου στόχου [13-16]. Τα miRNA ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά ρυθμίζοντας τη μετάφραση ή τη σταθερότητα του mRNA στο κυτταρόπλασμα [17, 18]. Λειτουργικές μελέτες δείχνουν ότι τα miRNA εμπλέκονται σε κρίσιμες βιολογικές διεργασίες κατά την ανάπτυξη και στην κυτταρική φυσιολογία [13, 16]. Αλλαγές στην έκφρασή τους έχουν παρατηρηθεί σε αρκετές παθολογίες [16, 19]. Έτσι, ο χαρακτηρισμός των miRNAs βοήθησε στην κατανόηση της γονιδιακής ρύθμισης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης και στην εξήγηση των διαταραχών παθοφυσιολογίας, όπωςνεφρόδιαταραχές [20-22]. Μελέτες έχουν αναφέρει ότι κατά τη διάρκειανεφρότα miRNA της οντογένεσης είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη νεφρώνων [23-26]. Επιπλέον, η υποέκφραση ορισμένων miR NAs σε προγονικά κύτταρα ΜΜ μειώνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, με αποτέλεσμα την πρώιμη διαφοροποίηση και κατά συνέπεια, μειώνει τον αριθμό των νεφρώνων [27, 28]. Αυτό το φαινόμενο χαρακτηρίζεται από αυξημένη απόπτωση και υψηλή έκφραση Bim στα προγονικά κύτταρα [27]. Έτσι, τα miRNA ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ της απόπτωσης και του πολλαπλασιασμού αυτών των μετανεφρικών πρωτογενών κυττάρων [29].
Υποθέσαμε ότι οι άγνωστες επιγενετικές αλλαγές και το προφίλ έκφρασης miRNA σχετίζονται μενεφρόαναπτυξιακές διαταραχές σε απογόνους με περιορισμένη πρωτεΐνη της μητέρας. Έτσι, στοχεύσαμε να αξιολογήσουμε τα πρότυπα του miRNA και να προβλέψουμε την έκφραση γονιδίων στο έμβρυονεφρόστις 17 ημέρες κύησης (17-DG) περιορισμένης πρωτεΐνης αρσενικών απογόνων για τον εντοπισμό μοριακών οδών και διαταραχών που εμπλέκονται σενεφρώνκυτταρικός πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση κατά τη διάρκειανεφρόανάπτυξη.
Λέξεις-κλειδιά:ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ; νεφρική σωληναριακή? νεφρικές διαταραχές? ανάπτυξη των νεφρών? νεφρό
Υλικό και μεθοδολογία
Ζώα και δίαιτεςΤα πειράματα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε λεπτομερώς προηγουμένως [5, 6] σε θηλυκούς και αρσενικούς αρουραίους που ταιριάζουν με την ηλικία των αρουραίων Wistar HanUnib (250–300 γρ.) που προέρχονται από ένα απόθεμα αναπαραγωγής που παρέχεται από την CEMIB/UNICAMP , Campinas, SP, Βραζιλία. Το περιβάλλον και η στέγαση παρουσίασαν τις κατάλληλες συνθήκες για τη διαχείριση της υγείας και της ευημερίας τους κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. Αμέσως μετά τον απογαλακτισμό σε ηλικία τριών εβδομάδων, τα ζώα διατηρήθηκαν υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία (25˚C) και συνθήκες φωτισμού (07:00–19:00h) με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό βρύσης και τυπική εργαστηριακή τροφή τρωκτικών (Purina Nuvital , Curitiba, PR, Βραζιλία: Περιεκτικότητα σε Na plus: 135 ± 3μEq/g· περιεκτικότητα σε K συν: 293 ± 5μEq/g), για 12 εβδομάδες πριν από την αναπαραγωγή. Η Θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας για τη Χρήση σε Ζώα στο Κρατικό Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο (#446-CEUA/UNESP) ενέκρινε το πειραματικό πρωτόκολλο και οι γενικές κατευθυντήριες γραμμές που καθορίστηκαν από το Κολλέγιο Πειραματισμού Ζώων της Βραζιλίας ακολουθήθηκαν καθ' όλη τη διάρκεια της έρευνας. Ορίστηκε η ημέρα 1 της εγκυμοσύνης ως η ημέρα κατά την οποία το κολπικό επίχρισμα παρουσίασε σπέρμα. Κατόπιν, οι φυλές διατηρήθηκαν κατά βούληση καθ' όλη τη διάρκεια της εγκυμοσύνης σε ισοθερμιδική εργαστηριακή τροφή τρωκτικών είτε με τυπική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη [NP, n=36] (17 τοις εκατό πρωτεΐνη) είτε χαμηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη [LP, n=51 ] (6 τοις εκατό πρωτεΐνη). Η μητρική κατανάλωση τροφής NP και LP προσδιορίστηκε καθημερινά (στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε για το σωματικό βάρος) και το σωματικό βάρος των μητέρων καταγράφηκε εβδομαδιαία και στις δύο ομάδες. Στις 17 ημέρες κύησης (17-DG), οι μητέρες αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη (75 mg/kg) και ξυλαζίνη (10 mg/kg) και η μήτρα εκτέθηκε. Τα έμβρυα αφαιρέθηκαν και ευθανατίστηκαν αμέσως με αποκεφαλισμό. Τα έμβρυα ζυγίστηκαν και η ουρά και τα άκρα συλλέχθηκαν για φύλο. Το metanephros συλλέχτηκε για αναλύσεις αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS), RT-qPCR και ανοσοϊστοχημείας.
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ
Αποφασιστικότητα για το φύλοΗ παρούσα μελέτη διεξήχθη μόνο σε αρσενικούς απογόνους 17-DG και το φύλο προσδιορίστηκε με ανάλυση αλληλουχίας Sry συμβατικής PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης). Το DNA εκχυλίστηκε με ενζυματική λύση με πρωτεϊνάση Κ και φαινόλη-χλωροφόρμιο. Για αντίδραση, χρησιμοποιήθηκε το Master Mix Colorless—Promega, με τις συνθήκες ποδηλασίας του κατασκευαστή. Η Integrated DNA Technologies (IDT) συνέθεσε τον εκκινητή που ακολουθεί τις ακόλουθες αλληλουχίες: Εμπρός: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Reverse: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Ολική εξαγωγή RNAΤο RNA εξήχθη από NP (n=4) και LP (n=4) ολόκληρονεφράχρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Trizol (Invitrogen), σύμφωνα με τις οδηγίες που καθορίζονται από τον κατασκευαστή. Η συνολική ποσότητα RNA προσδιορίστηκε με την απορρόφηση στα 260 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο nanoVue (GE Healthcare, USA). Η ακεραιότητα RNA εξασφαλίστηκε με τη λήψη ενός αριθμού ακεραιότητας RNA—RIN > 8 με Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Γερμανία) [30].
miRNA-Seq και ανάλυση δεδομένωνΗ αλληλουχία πραγματοποιήθηκε στην πλατφόρμα MiSeq (Illumina). Το πρωτόκολλο ακολούθησε τις οδηγίες του κατασκευαστή που διατίθενται στοΕν συντομία, η αλληλουχία περιλαμβάνει κατασκευή βιβλιοθήκης και χρησιμοποιήθηκε 1 μg ολικού RNA. Σε αυτό το βήμα, συνδέονται οι προσαρμογείς, τα 3 'και 5'. Μετά την απολίνωση των προσαρμογέων, πραγματοποιήθηκε μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής για τη δημιουργία cDNA. Στη συνέχεια ενισχύθηκε με μια τυπική αντίδραση PCR, η οποία χρησιμοποιεί εκκινητές που περιέχουν έναν δείκτη αλληλουχίας για την αναγνώριση του δείγματος - αυτή η βιβλιοθήκη cDNA, που υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης για απομόνωση miRNA. Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό, η συγκέντρωση της βιβλιοθήκης κανονικοποιήθηκε στα 2 ηΜ χρησιμοποιώντας 10 ηΜ Tris-HCl, ρΗ 8,5, και η αλληλουχία μεταγραφώματος πραγματοποιήθηκε με MiSeq Reagent Kit v2 (50 κύκλοι).
Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με τον Tao Chen, Ph.D. από το Division of Genetic and Molecular Toxicological, National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR, Η.Π.Α. Τα δεδομένα από το Next Generation Sequencing (NGS) των miRNAs δημιουργήθηκαν σε μορφή FASTA και εισήχθησαν στο BaseSpace.com (Illumina, ΗΠΑ). Η ποιότητα των δεδομένων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το βασικό λογισμικό CASAVA που αναπτύχθηκε από τον κατασκευαστή (Illumina). Οι αναλύσεις έγιναν με το BaseSpace miRNA Analysis (από το Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Καναδάς) και η χαρτογράφηση αλληλουχίας διαφορετικών miRNA από Small RNA (Illumina, ΗΠΑ) για το γονιδίωμα του αρουραίου. Η διαφορικά εκφρασμένη μελέτη miRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, ΗΠΑ).
Επικύρωση έκφρασης miRNAΤέσσερις αρσενικοί απόγονοι από διαφορετικά γέννα χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα για το miRNA (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, έστω-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p και -199a-5p) ανάλυση έκφρασης. Εν συντομία, 450 ng RNA μεταγράφηκε αντίστροφα, χωρίς προενίσχυση, χρησιμοποιώντας το κιτ αντίστροφης μεταγραφής Micro RNA TaqMan1, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το συμπληρωματικό DNA (cDNA) ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) με TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) σε σύστημα PCR πραγματικού χρόνου StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας σχετική γονιδιακή έκφραση που αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής ποσοτικοποίησης (Pfaffl, 2001). Με βάση την ανάλυση σταθερότητας, το U6 snRNA και το U87 scaRNA χρησιμοποιήθηκαν ως γονίδιο αναφοράς. Όλες οι σχετικές ποσοτικοποιήσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό DataAssist, v 3.0, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCT. Τα δεδομένα miRNA έχουν δημιουργηθεί σύμφωνα με τις οδηγίες MIQE [31].
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ
RT-qPCR των προβλεπόμενων γονιδίων-στόχωνΓια τη σύνθεση cDNA, χρησιμοποιήθηκε το κιτ αντίστροφης μεταγραφής cDNA υψηλής χωρητικότητας (Life Technologies, ΗΠΑ). Οι αντιδράσεις RT-qPCR για Bax, Bim, Κασπάση-3, Κολλαγόνο 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c Το γονίδιο -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six{-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 και IGF1 πραγματοποιήθηκε από το SYBR Green Master Mix (Life Technologies, ΗΠΑ ) παρέχεται από την IDT1 Integrated DNA Technologies (Πίνακας 1). Οι αντιδράσεις έγιναν σε συνολικό όγκο 20 μL χρησιμοποιώντας 2 μL cDNA (αραιωμένο 1:30), 10 μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, ΗΠΑ) και 4 μL από κάθε συγκεκριμένο εκκινητή (5 nM). Η ενίσχυση και η ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο StepOnePlusTM (Applied BiosystemsTM). Οι τιμές Ct μετατράπηκαν σε σχετικές τιμές έκφρασης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με δεδομένα μετανέφρου απογόνων κανονικοποιημένα με GAPDH ως γονίδιο αναφοράς [32].
Ανοσοϊστοχημεία,Το έμβρυο (n {{0}} ανά ομάδα) αφαιρέθηκε και στερεώθηκε αμέσως σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (0,1 Μ φωσφορικό, ρΗ 7,4). Τα υλικά αφυδατώθηκαν, διαφανίστηκαν και συμπεριλήφθηκαν στο paraplast και τα μπλοκ κόπηκαν σε τμήματα πάχους 5-μm. Οι ιστολογικές τομές αποπαραφινώθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοφθορισμό και ανοσοϋπεροξειδάση. Τα τμήματα ήταν
επωάστηκε με ένα διάλυμα αποκλεισμού (8 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 2,5 τοις εκατό βόειο αλβουμίνη και 2 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη σε PBS). Στη συνέχεια, ρυθμίστε με το πρωτεύον αντίσωμα (anti-Six-2) αραιωμένο σε PBS που περιέχει 1 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα όλη τη νύχτα σε ψυγείο. Μετά από πλύση με PBS, οι τομές επωάστηκαν με ένα ειδικό δευτερεύον αντίσωμα, συζευγμένο με το φθοροφόρο Alexa 488, αραιωμένο στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, που περιείχε 1 τοις εκατό γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από διαδοχικές πλύσεις με PBS, οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετήθηκαν με καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας το μέσο συναρμολόγησης φθορισμού Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Ο φθορισμός στο δείγμα ανιχνεύθηκε με ομοεστιακή μικροσκοπία λέιζερ. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Focus Imagecorder Plus. Για τις πρωτεΐνες c-Myc, Ki{-67, Bcl{-2, TGF -1, - κατενίνη, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 που διασπάστηκαν, κυκλίνη Α και WT1, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες ενυδατώθηκαν και αφού πλύθηκαν σε PBS ρΗ 7,2 για 5 λεπτά, η αντιγονική ανάκτηση έγινε με κιτρικό ρυθμιστικό ρΗ 6.0 για 25 λεπτά στη χύτρα ταχύτητας. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν σε PBS. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε αποκλεισμός ενδογενούς υπεροξειδάσης με υπεροξείδιο του υδρογόνου και μεθανόλη για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Οι τομές εκπλύθηκαν σε PBS. Ακολούθησε η δέσμευση της μη ειδικής δέσμευσης και οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν με διάλυμα αποκλεισμού (5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη, σε PBS) για 1 ώρα. Οι τομές επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα (Πίνακας 2), αραιωμένο σε 1 τοις εκατό BSA όλη τη νύχτα στο ψυγείο. Μετά από πλύση με PBS, οι τομές εκτέθηκαν στο ειδικό δευτερεύον αντίσωμα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με PBS. Οι φέτες αποκαλύφθηκαν με DAB (3,3'-τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδίνη, Sigma-Aldrich CO1, ΗΠΑ). Μετά από διαδοχική πλύση σε τρεχούμενο νερό, οι αντικειμενοφόρες πλάκες βάφτηκαν με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν με καλυπτρίδα, χρησιμοποιώντας Entellan1. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το φωτομικροσκόπιο (Olympus BX51) ή ένα Zeiss LSM 780-NLO confocal σε μικροσκόπιο Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Γερμανία) από το Εθνικό Ινστιτούτο Επιστήμης και Τεχνολογίας για τη Φωτονική Εφαρμοσμένη στο Κύτταρο Βιολογίας (INFABIC) στο Κρατικό Πανεπιστήμιο του Campinas.
Μορφολογική ποσοτικοποίησηΠαραφίνη 5 μmνεφρόοι τομές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellSens Dimension από ένα φωτομικροσκόπιο (Olympus BX51). ονεφρόέγινε πρόσβαση σε φέτες για να προσδιοριστεί η νεφρογόνος περιοχή, η πρωτεΐνη CM και UB και ο αριθμός κυττάρων, η αιματοξυλίνη-ηωσίνη που χρωματίστηκε στο 17-DG LP fetus(n=5) σε σύγκριση με τους απογόνους NP που ταιριάζουν με την ηλικία (n {{4 }}) από διαφορετικές μητέρες. Ποσοτικοποιήσαμε όλα τα CM και UB κάθε μετανέφρου που αναλύθηκαν (4NP και 4LP από διαφορετικές μητέρες) και η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τεστ t και οι τιμές εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD. Το p�0.05 θεωρήθηκε σημαντικό. Το GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA, χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση και κατασκευή σχημάτων.
Στατιστική ανάλυσηΧρησιμοποιήθηκε το τεστ t και οι τιμές εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Το P�0.05 θεωρήθηκε σημαντικό. Το λογισμικό GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., USA) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση και κατασκευή σχημάτων.
Αποτελέσματα
Έκφραση miRNAs από miRNA-SeqΓια να κατανοήσετε τις αλλαγές στο microRNA που σχετίζονται με τη μητρική χαμηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνεςνεφρώνπρογραμματισμού, πραγματοποιήσαμε την έκφραση μιας συνολικής ανάλυσης προφίλ miRNA. Εντοπίστηκαν 44 απορυθμισμένα miRNA (p � 0.05), από τα οποία 19 και 25 miRNA, αντίστοιχα, ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω ή προς τα κάτω (Πίνακας 3). Τα miRNA που εκφράζονται με την κορυφή και οι λειτουργίες, τα μονοπάτια και τα δίκτυά τους αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ingenuity (Πίνακας 4).
Επικύρωση έκφρασης miRNAΣτα ζώα της ομάδας LP, το Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p ρυθμίστηκε προς τα πάνω, ενώ τα miR-127-3p, miR-144-3p και miR-199a-5p υποβαθμίστηκαν σε σχέση με τα ζώα NP. Τα αποτελέσματα δεν δείχνουν καμία διαφορά στην έκφραση miR{10}}, συγκρίνοντας και τις δύο ομάδες (Εικ. 1). Ο Πίνακας 5 αποκάλυψε τις τιμές που ελήφθησαν από την αλληλουχία miRNAs με τα δεδομένα επικύρωσης RT-qPCR. Αν και παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά έκφρασης miRNA στο LP σε σχέση με τους απογόνους NP, η αλλαγή πτυχής (FC) των επικυρωμένων miRNA ήταν παρόμοια και με τις δύο τεχνικές.
στόχοι γονιδίων miRNA
Τα γονίδια έκφρασης προβλεπόμενων στόχων διαφορετικών miRNA όπως Six-2, Bcl-2, PRDM1, κυκλίνη Α, PCNA, GDNF, Κολλαγόνο 1, Κασπάση 3 και Bim στο LP δεν διέφεραν σημαντικά από το NP έμβρυο. Ωστόσο, η έκφραση των γονιδίων Bax, TGF -1 Bcl{-6, c-ret, Map2k2, Ki{-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 και IGF1 ρυθμίστηκε προς τα πάνω στο {{15 }}Ομάδα DG LP σε σύγκριση με μάρτυρες αντιστοίχισης ηλικίας. Αντίστροφα, τα c-Myc και NOTHC1 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε απογόνους περιορισμένους σε πρωτεΐνες της μητέρας (Εικόνα 2).
Μάζα σώματος εμβρύου και μορφομετρία μετανέφρουΗ μάζα σώματος 17-DG LP δεν διέφερε από τους απογόνους NP που ταιριάζουν με την ηλικία. Ωστόσο, το μεσέγχυμα metanephros του LP έδειξε 7,6 τοις εκατό μειωμένη περιοχή και 29 τοις εκατό μείωση στο πάχος του φλοιού από την ομάδα NP (Εικόνα 3).ΑνοσοϊστοχημείαΣτην παρούσα μελέτη, το έμβρυο LP εμφάνισε σημαντική μείωση (περίπου 69 τοις εκατό ) του φθορισμού Six-2 σε σύγκριση με τους απογόνους NP (Εικ. 4).
Η ανάλυση Six-2 ανοσοϋπεροξειδάσης έδειξε μειωμένο αριθμό κυττάρων (14 τοις εκατό ) σε LP CM από συσχετισμένα με 28 τοις εκατό μειωμένα Six-2 συν κύτταρα σε σχέση με την περιοχή του καλύμματος σε σύγκριση με τους απογόνους NP (Εικόνα 4). Η παρούσα μελέτη έδειξε επίσης σημαντική ποσοστιαία μείωση των ανοσοχρωματισμένων κυττάρων c-Myc CM και UB (λιγότερο 14 τοις εκατό) στο LP σε σχέση με τους απογόνους NP (Εικόνα 4). Επιπλέον, το ποσοστό της επισημασμένης περιοχής Ki-67 στο CM ήταν 48 τοις εκατό μικρότερο στο LP σε σύγκριση με το NP έμβρυο, ενώ η ανοσοαντιδραστικότητα Bcl{-2 και διασπασμένης κασπάσης-3 δεν ήταν διαφορετική και από τις δύο ομάδες (Εικ. 5 και 6). Η παρούσα μελέτη έδειξε επίσης σημαντική ποσοστιαία μείωση των ανοσοχρωματισμένων κυττάρων c-Myc CM και UB (λιγότερο 14 τοις εκατό) στο LP σε σχέση με τους απογόνους NP (Εικόνα 4). Επιπλέον, το ποσοστό της επισημασμένης περιοχής Ki-67 στο CM ήταν 48 τοις εκατό μικρότερο στο LP σε σύγκριση με το NP έμβρυο, ενώ η ανοσοαντιδραστικότητα Bcl{-2 και διασπασμένης κασπάσης-3 δεν ήταν διαφορετική και από τις δύο ομάδες (Εικ. 5 και 6). Από την άλλη πλευρά, στο LP, οι περιοχές με επισήμανση CM και UB-κατενίνης αυξήθηκαν κατά 154 και 85 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε σύγκριση με αυτές που είναι διαθέσιμες στους απογόνους NP (Εικόνα 7). Ταυτόχρονα, η κατανομή ανοσοαντιδραστικότητας mTOR κατέλαβε επίσης μια σημαντικά πιο εκτεταμένη περιοχή στο LP CM (139 τοις εκατό) και στο UB (104 τοις εκατό) από ό,τι στο έμβρυο NP (Εικόνα 7). Στους απογόνους LP, ο TGF -1 στη χρώση των κυττάρων UBS αυξήθηκε (περίπου 30 τοις εκατό), ενώ στο CM, τα ανοσοχρωματισμένα κύτταρα δεν ήταν διαφορετικά σε σχέση με την ομάδα NP (Εικόνα 8). Το χρωματισμένο με ZEB1 metanephros, που βρίσκεται στα κύτταρα πυρήνων CM, ενίσχυσε 30 τοις εκατό στο LP σε σύγκριση με το έμβρυο NP (Εικόνα 8). Ταυτόχρονα, ο ανοσοφθορισμός ZEB2, αν και υπάρχει σε ολόκληρες δομές του μετανέφρου, ήταν παρόμοιος και στις δύο πειραματικές ομάδες (Εικόνα 8). Η τρέχουσα μελέτη, λαμβάνοντας υπόψη την έκφραση και τις πρωτεΐνες miRNA και mRNA
Συζήτηση
Η γνώση σχετικά με τους κυτταρικούς και μοριακούς μηχανισμούς νεφρογένεσης έχει αυξηθεί [33-37]. Ωστόσο, εμπλέκονται πολλοί ρυθμιστικοί παράγοντες και μονοπάτια σηματοδότησηςνεφρώνη οντογένεση παραμένει ασαφής [38]. Τα miRNA παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκειανεφρώνανάπτυξη [25, 39-41]. Από ό,τι γνωρίζουμε, δεν έχουν πραγματοποιηθεί αναλύσεις έκφρασης miRNA και mRNA σε μητρικά κύτταρα μεσεγχύματος 17-DG μητρικής πρόσληψης LP. Προτείνουμε έναν νέο μοριακό μηχανισμό που εμπλέκεται στην αναστολή της πρώιμης νεφρογένεσης, με αποτέλεσμα μειωμένο αριθμό νεφρώνων. Χρησιμοποιήσαμε το NGS για να αξιολογήσουμε την έκφραση miRNA και βρήκαμε ότι 19 miRNA ήταν προς τα πάνω και 25 προς τα κάτω στο 17-DG LP σε σύγκριση με το NP metanephros. Μεταξύ των κορυφαίων 10 απορυθμισμένων miRNAs, επιλέξαμε 7 miRNA με βιολογικούς στόχους που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την κυτταρική απόπτωση. Τόσο η ανάλυση δεδομένων miRNA-Seq όσο και TaqMan αποκάλυψε συνεπείς και συγκεκριμένες αλλαγές στην έκφραση miRNA σε ζώα LP σε σχέση με τα ζώα ελέγχου NP που ταιριάζουν με την ηλικία.
Η οικογένεια miR-181 αποτελείται από τέσσερα εξαιρετικά διατηρημένα μέλη, συγκεκριμένα miR-181a, miR-181b, miR-181c και miR-181d [ 42]. Στα νεοπλασματικά κύτταρα, το miR-181a δρα ως κατασταλτικός όγκος, αναστέλλοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση και προκαλώντας κυτταρική απόπτωση [43]. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε αυξημένη έκφραση του miR-181a-5p στο 17-DG LP σε σχέση με τους απογόνους NP που ταιριάζουν με την ηλικία. Αν και η έκφραση του mRNA της κασπάσης ήταν αμετάβλητη, μια διπλάσια αύξηση της αναλογίας Bax/Bcl-2 mRNA στο LP σε σύγκριση με τους απογόνους NP υποδηλώνει αυξημένη απόπτωση στο CM, υποδεικνύοντας ότι η απόπτωση ρυθμίζεται μετα-μεταγραφικά. Μελέτες έχουν δείξει ότι η οικογένεια BCL προάγει την απελευθέρωση κυτοχρώματος από τα μιτοχόνδρια και στη συνέχεια αναστέλλει την ενεργοποίηση του Casp3, αναστέλλοντας έτσι την κυτταρική απόπτωση [44]. Li et al. χρησιμοποίησε ένα μοντέλο οξείας πνευμονικής βλάβης για να αποκαλύψει ότι η υπερέκφραση miR-181a σχετίζεται με μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης Bcl-2. αντίστροφα, η αναστολή του miR{19}}αύξησε τα επίπεδα Bcl-2 [45]. Αυτή η μελέτη επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα των Lv et al., οι οποίοι απέδειξαν ότι το miR{-181c ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση της έκφρασης Six{{-2 και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, παράλληλα με την απώλεια του φαινοτύπου των μεσεγχυματικών κυττάρων κατά τη διάρκειανεφρόανάπτυξη σε απογόνους LP 17-DG [25].
Οι Xiang et al. έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση miR-144 καταστέλλεινεφρώνπολλαπλασιασμός καρκινώματος, με αποτέλεσμα μια βραχύτερη φάση G2/M. Επιπλέον, οι Xiang et al. αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση του miR-144 αναστέλλει την έκφραση του γονιδίου mTOR και της πρωτεΐνης [46]. Οι Nijland et al. έδειξε ότι η αύξηση της σηματοδότησης mTOR είναι ζωτικής σημασίας για τον προσδιορισμό του αριθμού των νεφρώνων σε έμβρυα των οποίων οι μητέρες υποβλήθηκαν σε περιορισμό θρεπτικών συστατικών [47]. Ο στόχος των θηλαστικών του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1 (mTORC1) είναι απαραίτητος για την ανάπτυξη του εμβρύου. Ωστόσο, το πώς αυτό το σύμπλεγμα ρυθμίζει την ισορροπία μεταξύ της ανάπτυξης και της αυτοφαγίας υπό φυσιολογικές συνθήκες και το περιβαλλοντικό στρες παραμένει άγνωστο [48]. Επομένως, η σηματοδότηση mTOR μπορεί να εμπλέκεται σε κυτταρικές αποκρίσεις σε ζώα που εκτίθενται σε πρόσληψη LP κατά τη διάρκεια της κύησης. στην αντίληψη, την επαγωγή και τον τερματισμό της αυτοφαγίας. και ως απόκριση στην ενδοκυτταρική διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών [46]. Υποθετικά, κατά τη διάρκεια σοβαρού περιορισμού της πρωτεΐνης, η μειωμένη έκφραση του miR-144-3p μπορεί να συσχετιστεί με αυξημένη έκφραση mTOR, περίπου 139 τοις εκατό και 104 τοις εκατό στα κύτταρα CM και UB, αντίστοιχα, για να αντισταθμιστεί η απώλεια νεφρώνων στο {{ 11}}DG LP απόγονοι Chen et al. όρισε το miR-127 ως νέο ρυθμιστή της γήρανσης των κυττάρων μέσω του Bcl-6 [49]. Οι Pan et al. ανέφερε ότι η υποέκφραση του miR-127 συσχετίζεται με αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό στα ηπατικά κύτταρα [50]. Αυτή η μελέτη έδειξε μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και σημαντική μείωση των κυττάρων που σημείωσαν θετικά για Ki{-67 στο CM ζώων με περιορισμό πρωτεΐνης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση της νεφρογενούς περιοχής και πολλαπλασιασμός στους απογόνους της LP, κάτι που ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα των Menendez-Castro et al. σε 8,4 τοις εκατό απογόνους περιορισμένους σε πρωτεΐνες [51, 52]. Έτσι, η αυξημένη έκφραση του Ki-67 και του Bcl-6 mRNA, συνοδευόμενη από μειωμένη έκφραση miR-127-3p στο 17-καπάκι της DG LP θα μπορούσε να συσχετιστεί με αντιρυθμιστικούς μηχανισμούς για τη διατήρηση πολλαπλασιασμός.
Sun et al. έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-199a-5p μειώνει τον πολλαπλασιασμό των κυστικών κυττάρων και προκαλεί απόπτωση, επιπλέον του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [53]. Σε αυτήν τη μελέτη, η έκφραση του miR-199a-5p μειώνεται στο 17-DG LP συνοδεύεται από την αυξημένη μεταγραφή του Ki-67, ενός δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και του Map2k2 σχετίζεται με μειωμένη αντιδραστικότητα Ki-67 στο LP 17-DG metanephros. Έτσι, ο υποσιτισμός της κύησης προάγει τη διαφοροποίηση μέσω ενός μετα-μεταγραφικού μηχανισμού. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν έναν κατασταλτικό ρόλο του homeobox 1 (ZEB1) που δεσμεύει το κουτί ψευδαργύρου-δάχτυλου Ε, ενός επαγωγέα EMT, ο οποίος διατηρεί την πολυδυναμία των βλαστοκυττάρων κατά τη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων. Η -κατενίνη είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί την πυρηνική μεταγραφή ZEB1 με αποτέλεσμα την έκφραση ZEB1 [34]. Το μονοπάτι σηματοδότησης TGF, ένα από τα καλύτερα μελετημένα μονοπάτια, μπορεί να προκαλέσει EMT κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Αρκετοί συνδέτες τύπου TGF απαιτούνται για την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Ωστόσο, δεν εξαρτώνται όλες οι επιδράσεις με τη μεσολάβηση του TGF στο EMT από το ZEB1/2, τα κύτταρα νοκ-άουτ μπορούν να προκαλέσουν την έκφραση των μεσεγχυματικών γονιδίων φιμπρονεκτίνη και Ν-καντερίνη. Ωστόσο, η Ε-καντερίνη δεν ρυθμίζεται πλέον προς τα κάτω και σχηματίζονται επίσης ίνες ακτίνης [54]. Οι Karner et al. ανέφερε ότι κατά τη διάρκειανεφρώνανάπτυξη, το Wnt9b/ -catenin
Το μονοπάτι σηματοδότησης, που εκφράζεται τόσο στο UB όσο και στο CM, απαιτείται τόσο για την ανανέωση και διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων του νεφρώνα, καθώς είναι απαραίτητο για το σχηματισμό νεφρώνων κατά την εμβρυογένεση [55]. Η εξελικτικά διατηρημένη οδός Wnt9b/-κατενίνης παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη οργάνων, ιστών και στην αποκατάσταση τραυματισμών σε πολυκυτταρικούς οργανισμούς. Μια μελέτη έδειξε ότι το c-Myc είναι ένας μεταγραφικός στόχος της -κατενίνης, ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση τωννεφρώνσωληναριακό επιθήλιο [56]. Η έκφραση της -κατενίνης σε επίπεδο γονιδίου και πρωτεΐνης αυξήθηκε κατά τις περιόδους που μελετήθηκαννεφρώνανάπτυξη στο έμβρυο 17-DG LP. Οι Pan et al. ανέφερε ότι το Myc συνεργάζεται με την -κατενίνη για την προώθηση της ανανέωσης των προγονικών κυττάρων του νεφρώνα [10]. Εδώ σε σύγκριση με τους απογόνους NP που ταιριάζουν με την ηλικία, το LP έδειξε χαμηλότερη έκφραση c-Myc. Επομένως, αυτά τα ζώα μπορεί να έχουν χαμηλότερο απόθεμα ανανεώσιμων κυττάρων που είναι απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση και μπορεί να αντικατοπτρίζουν τον μικρότερο αριθμό νεφρώνων στο μοντέλο LP. Εξάλλου,
Τα μονοπάτια σημάτων Wnt/ -κατενίνης και Notch μπορεί να συντονίζουν τη ρύθμιση της έκφρασης Six-2 και εμπλέκονται στην καθοδική ρύθμιση της έκφρασης Six-2 σε προγονικά κύτταρα νεφρώνα. Μελέτες έχουν δείξει ότι μπορεί να απαιτούνται χαμηλά επίπεδα -κατενίνης για τη διατήρηση της έκφρασης Six-2 και των προγονικών κυττάρων CM σε αδιαφοροποίητη κατάσταση. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα κατενίνης καθορίζουν τη μοίρα των προγονικών κυττάρων του νεφρώνα [57, 58]. Έτσι, υποθέτουμε ότι μειωμένη σηματοδότηση cMyc και Notch, συνοδευόμενη από αυξημένη έκφραση -κατενίνης, μειωμένη έκφραση Six-2 κατά 28 τοις εκατό στους απογόνους 17-DG LP και συσχετίζεται με πρώιμη διαφοροποίηση κυττάρων CM και μειωμένα βλαστοκύτταρα και αριθμός νεφρώνων στην ενήλικη ζωή. Επιπλέον, τα δεδομένα μας μπορεί να υποστηρίξουν ότι, σε κύτταρα MM απογόνους LP, η αυξημένη έκφραση Let{-5a-5p και -catenin και το μειωμένο σήμα Notch μπορεί να διαμορφώνουν το c-Myc, Six-2, και έκφραση Ki-67, που οδηγεί σε μείωση της αυτοανανέωσης των προγονικών κυττάρων. Η εξάντληση των υπολοίπων προγονικών κυττάρων CM οδηγεί σε μείωση του αριθμού των νεφρώνων και στην ανάπτυξη αρτηριακής υπέρτασης καινεφρώνδιαταραχές στην ενήλικη ζωή (Εικ. 10). Σε συμφωνία με αυτό των Boivin et al., τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αυξημένη CM-κατενίνη διαταράσσει την ανάπτυξη και τη νεφρογένεση της UB [59]. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από γλοιακό παράγοντα (GDNF), ένας κρίσιμος ρυθμιστής της ανάπτυξης της UB, σηματοδοτεί μέσω του υποδοχέα τυροσινικής κινάσης c-Ret και του συν-υποδοχέα Gfra1 [60, 61]. Στους απογόνους του 17-DG LP, ένα σημαντικό
Η αύξηση του mRNA του υποδοχέα c-Ret θα οδηγούσε θεωρητικά σε αύξηση της ανάπτυξης UB. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση του GDNF παρέμεινε αμετάβλητη, υποδηλώνοντας ότι παρά την αύξηση του mRNA του cRet, η διακλάδωση του UB μειώθηκε. Προηγουμένως, παρατηρήσαμε μείωση 28,3 τοις εκατό στους κλάδους των ουρητηρικών οφθαλμών μετά από 14,5 ημέρες περιορισμού της πρωτεΐνης κύησης [4], η οποία θα μπορούσε να συσχετιστεί με 28 τοις εκατό μείωση της επισήμανσης Six-2 των MM κυττάρων, παρά την καμία αλλαγή στο GDNF μεταγραφή. -η κατενίνη πιθανώς αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα c-ret και μεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου UB, προάγοντας την έκφραση του TGF -1 στα επιθηλιακά κύτταρα, αναστέλλοντας τη διακλάδωση της UB και προκαλώντας πρόωρη διαφοροποίηση του προγονικού κυττάρου CM, όπως φαίνεται στο {{11} }Απόγονοι DG LP [62– 64]. Επομένως, το GDNF μπορεί να μην είναι απαραίτητο για τη μεσολάβηση μεσεγχυματικών σημάτων στον ουρητηρικό οφθαλμό. Ωστόσο, ο μηχανισμός μένει να αποσαφηνιστεί. Πράγματι, έχουμε αποδείξει ότι το MM από τους απογόνους του 17-DG LP εμφάνισε μια συγκεκριμένη αύξηση στην έκφραση του Let-7 miRNA, με αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένηνεφρόανάπτυξη, επιβεβαιώνοντας έτσι τον ρυθμιστικό ρόλο αυτών των γονιδίων στον αναπτυξιακό χρόνο της νεφρογένεσης [65].
Σε αρχικές μελέτες παρόμοιου με την ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα (IGF), οι κυρίαρχοι ρόλοι του IGF-1 και του -2 στην εμβρυϊκή ανάπτυξη διευκρινίστηκαν με άφθονα, αλλά κυρίως έμμεσα, στοιχεία. Οι IGF βρέθηκαν να δρουν ως παράγοντες πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης σε καλλιεργημένα εμβρυϊκά κύτταρα και προεμφυτευτικά έμβρυα. Επιπλέον, οι IGFs βρέθηκαν να εκκρίνονται από καλλιεργημένα εμβρυϊκά κύτταρα και εκφυτεύματα in vitro [66]. Οι αυξητικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του IGF, μπορούν να προκαλέσουν μερική ή πλήρη επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση. Η ενεργοποίηση των οδών IGF έχει ως αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση του EMT επάγοντας την έκφραση ZEB1 [67]. Παρόλο που εμπλέκονται αρκετοί υποψήφιοι αυξητικοί παράγοντεςνεφρόανάπτυξη, αν εμπλέκονται στη νεφρογένεση είναι άγνωστο. Μπορεί να χρειαστούν διαφορετικοί αυξητικοί παράγοντες σε διαφορετικούς χρόνους. Ορισμένοι αυξητικοί παράγοντες μπορεί να είναι περιττοί σε αυτό το πλαίσιο. Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, απαιτούνται διαδοχικοί γύροι EMT και MET για να διαφοροποιηθούν οι εξειδικευμένοι τύποι κυττάρων και να δημιουργηθεί μια τρισδιάστατη δομή. Σε αυτή τη μελέτη, η διαμετατρεψιμότητα μεσεγχυματικού-επιθηλίου βρέθηκε ότι διατηρεί την πλαστικότητα των κυττάρων, υποδηλώνοντας την παρουσία ενός εξαιρετικά επαγώγιμου συστήματος σε συνθήκες LP για το έμβρυο. Η έκφραση της οικογένειας Let-7 miRNA έχει μελετηθεί εκτενώς σε διάφορους εμβρυϊκούς ιστούς. Η αύξηση στην έκφραση του Let{3}} miRNA σχετίζεται με μειωμένο πολλαπλασιασμό και πρώιμη αύξηση της διαφοροποίησης των κυττάρων ΜΜ και κατά συνέπεια με μειωμένους αριθμούς νεφρώνων [27, 15, 68-71]. Υψηλότερη έκφραση Let-7 έχει αποδειχθεί σε ανώτερους οργανισμούς κατά την τελευταία φάση της εγκεφαλικής εμβρυογένεσης σε τρωκτικά [72, 73]. Nagalakshmi et al. αποκάλυψε ότι η έκφραση του έστω{11}} miRNA άλλαξε τη μοίρα των επιθηλιακών κυττάρων UB από πρόδρομη σε διαφοροποιημένη κατάσταση [71]. Αντίθετα, οι Yermalovich et al. έδειξε ότι η υπερέκφραση του Lin28b, μιας πρωτεΐνης που δεσμεύει το RNA, σχετίζεται με κατασταλτικά Let-7 miRNAs. Αν και το lin28 και το Let-7 είναι γνωστοί ρυθμιστές του οντογενούς χρονισμού στα ασπόνδυλα, ο ρόλος τους στην ανάπτυξη οργάνων των θηλαστικών δεν είναι κατανοητός [65]. Σε αυτή τη μελέτη, η αύξηση της έκφρασης Let{19}a{-5p miRNA στο έμβρυο LP θα μπορούσε να συσχετιστεί με μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων CM, θέτοντας σε κίνδυνο τη νεφρογένεση σε σχέση με την ομάδα NP. Έτσι, υποθέτουμε ότι η καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων CM και η πρώιμη παύση της νεφρογένεσης που προκαλείται από το αυξημένο Let-7 miRNA μπορεί να συμβεί άμεσα ή έμμεσα μέσω της παροδικά μειωμένης έκφρασης του Lin28b στο 17-DG LP. Αυτή η επίδραση μπορεί να επηρεάσει σημαντικάνεφρόανάπτυξη στο 17-DG LP, επιβεβαιώνοντας ότι αυτό το γονίδιο ρυθμίζει το χρόνο ανάπτυξης κατά τη διάρκεια της νεφρογένεσης. Σε αυτή τη μελέτη, η αυξημένη έκφραση του Let-7a-5p miRNA συμπίπτει με μια μείωση στην έκφραση c-Myc. Το Myc εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό, την ανάπτυξη, την απόπτωση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων κατά τη διάρκειανεφρώνοργανογένεση [74-76]. Στους απογόνους LP 17-DG, η έκφραση του γονιδίου MM c-Myc μειώθηκε και η περιοχή ανοσοαντιδραστικότητας CM c-Myc ήταν 14 τοις εκατό μικρότερη σε σύγκριση με αυτή στους απογόνους NP. Ταυτόχρονα, μια μείωση 14 τοις εκατό στον αριθμό των κυττάρων CM παρατηρήθηκε για μείωση της ανοσοαντιδραστικότητας Ki-67 κατά 48 τοις εκατό στο LP σε σχέση με τους απογόνους NP. Με συνέπεια, μελέτες έχουν δείξει ότι το c-Myc παίζει σημαντικό ρόλο στην τελική φάση της διακλάδωσης της UB και στη διέγερση του πολλαπλασιασμού των προγονικών κυττάρων CM [74].
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ
μειωμένο επίπεδο στα βλαστοκύτταρα, διατηρώντας τα σε αδιαφοροποίητη κατάσταση. Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, η ισχυρή έκφραση του Let{0}a-5p miRNA στο CM μείωσε την έκφραση c-Myc, μειώνοντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων και την πρώιμη κυτταρική διαφοροποίηση στο LP 17-DG απογόνους (Εικ. 10). Μελέτες για τηννεφράδιαγονιδιακών ποντικών c-Myc αποκάλυψαν ταυτόχρονη μείωση στα c-Myc και S-ix-2 ανοσοθετικά CM κύτταρα που σχετίζονται με μειωμένο πολλαπλασιασμό βλαστοκυττάρων [74]. Αυτή η μελέτη δείχνει μια σημαντική (28 τοις εκατό ) μείωση σε Έξι-2 θετικά κύτταρα, ένα συγκεκριμένονεφρώνδείκτης βλαστοκυττάρων, όπως και η μείωση που παρατηρείται στους αριθμούς των νεφρώνων, στο CM των απογόνων του 17-DG LP σε σύγκριση με αυτόν των απογόνων NP. Το 2009, οι Fogelgren et al. απέδειξε ότι η έκφραση του γονιδίου Six-2 μειώνεται κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής οντογένεσης όταν σχετίζεται με μειωμένο αριθμό νεφρώνων, υπέρταση και χρόνιαΝΕΦΡΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ[77]. Έτσι, η μειωμένη έκφραση γονιδίου Six-2 σε προγονικά κύτταρα CM υποδηλώνει καταστολή της επαγόμενης από το σήμα διαφοροποίησης κατά τη διάρκειανεφρώνανάπτυξη στους απογόνους του 17-DG LP. Παρόλα αυτά, ο πλεονασμός θα πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή—λεπτά ελαττώματα στη νεφρογένεση μπορεί να γίνουν εμφανή με πιο λεπτομερή ανάλυση ή υπό διαφορετικές συνθήκες. Τα επίπεδα mRNA του IGF1 ήταν υψηλότερα κατά την αρχική περίοδο της μετανεφρικής ανάπτυξης, με μεταγραφές να ανιχνεύονται σε όλο το ΜΜ, ενώ τα επίπεδά τους μειώθηκαν κατά την περαιτέρω ανάπτυξη. Ωστόσο, κατά τη διάρκειανεφρόΗ εμβρυογένεση, μια λεπτή ισορροπία μεταξύ αυξητικών παραγόντων διευκόλυνσης νεφρών (IGF1) και ανασταλτικών αυξητικών παραγόντων (TGF -1) ρυθμίζει τη διακλάδωση της UB.
συμπέρασμα
Αν και αρκετοί συγγραφείς έχουν μελετήσει τη νεφρογένεση [34, 37, 78], λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που καθορίζουν τον αριθμό των νεφρώνων. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι πολλά miRNA, mRNA και πρωτεΐνες προγονικών κυττάρων ΜΜ μεταβάλλονται στους απογόνους του 17-DG LP, γεγονός που οδηγεί σε μειωμένο πολλαπλασιασμό και πρώιμη κυτταρική διαφοροποίηση (Εικ. 11). Αυτή η λεπτή ισορροπία μεταξύ της ανανέωσης των προγονικών νεφρώνων και της διαφοροποίησης είναι απαραίτητη γιανεφρόανάπτυξη επειδή η αποτυχία επίτευξης επαρκούς αριθμού νεφρώνων αποτελεί παράγοντα κινδύνου για χρόνιανεφρώνδιαταραχή.
