Η υποθερμία που προκαλείται από την οξκαρβαζεπίνη μετά από παροδική ισχαιμία του πρόσθιου εγκεφάλου Ασκεί θεραπευτική νευροπροστασία μέσω του δυνητικού παροδικού υποδοχέα βανιλλοειδούς τύπου 1 και 4 στα γερβίλια Μέρος 3

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Πειραματικά Ζώα

Αρσενικοί γερβίλοι (συνολικός αριθμός=252) χρησιμοποιήθηκαν σε ηλικία 6 μηνών (σωματικό βάρος, 63–78 g). Οι γερβίλοι εκτράφηκαν στο Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Εθνικού Πανεπιστημίου Kangwon (Chuncheon, Κορέα).

Τα Gerbil είναι πολύ χαριτωμένα ζωάκια. Ζουν σε ερημικές περιοχές, είναι καλοί στο σκάψιμο σπηλαίων και έχουν ισχυρά ένστικτα για την αποθήκευση και τον εντοπισμό τροφής. Μεταξύ αυτών των μικρών παιδιών, οι αρσενικοί γερβίλοι έχουν ιδιαίτερα καλή μνήμη, κάτι που κάνει τους ανθρώπους να θέλουν να μάθουν τα μυστικά τους.

Πρώτον, όταν οι αρσενικοί γερβίλοι αναζητούν τροφή, χρησιμοποιούν μια σειρά από σήματα, όπως ορόσημα και έδαφος για να καθορίσουν την κατεύθυνση. Μέσα από μακροχρόνια παρατήρηση και πρακτική, έχουν δημιουργήσει το δικό τους «γεωγραφικό σύστημα πληροφοριών». Αντίθετα, οι θηλυκοί γερβίλοι έχουν χειρότερη μνήμη για αυτά τα σήματα, ειδικά σε ένα συνεχώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον.

Δεύτερον, οι αρσενικοί γερβίλοι δείχνουν επίσης ισχυρή μνήμη όταν πολεμούν τους φυσικούς εχθρούς. Σύμφωνα με τους επιστήμονες, όταν οι γερβίλοι απειλούνται, θα μπουν γρήγορα στο λαγούμι και θα προσπαθήσουν να ξεφύγουν. Αλλά όταν αντιμετωπίζουν την ίδια απειλή, οι αρσενικοί γερβίλοι θα θυμούνται τον τρόπο επίθεσης των φυσικών εχθρών και θα τους αποφεύγουν, αυξάνοντας τις πιθανότητές τους να επιβιώσουν.

Τέλος, η μνήμη των αρσενικών γερβίλων βρίσκεται και στην κοινωνική συμπεριφορά τους μεταξύ τους. Κάθε γερβίλος έχει τη μοναδική του μυρωδιά. Όταν συναντούν άλλους γερβίλους, θα χρησιμοποιήσουν την όσφρησή τους για να αναγνωρίσουν ο ένας την ταυτότητα και την κατάσταση του άλλου. Αυτή η ικανότητα μνήμης όχι μόνο επιτρέπει στους γερβίλους να δημιουργήσουν μια σχετικά σταθερή κοινωνική σύνδεση αλλά είναι επίσης μια σημαντική εγγύηση για την αναπαραγωγή τους.

Συνοψίζοντας, η σχέση μεταξύ των αρσενικών γερβίλων και της μνήμης είναι άρρηκτη. Στη διαδικασία αναζήτησης της επιβίωσης και της αναπαραγωγής στη φύση, βασίζονται στην ισχυρή μνήμη τους για να προσαρμόζονται συνεχώς στο περιβάλλον και να βελτιώνονται. Ως άνθρωποι, θα πρέπει να μαθαίνουμε από αυτά τα μικρά παιδιά και να ακονίζουμε συνεχώς τη μνήμη μας για να προσαρμοστούμε καλύτερα σε αυτόν τον συνεχώς μεταβαλλόμενο κόσμο. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας και το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη επειδή μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων ακετυλοχολίνης και αυξητικών παραγόντων, που είναι πολύ σημαντικοί για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το Cistanche μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος αποκτά επαρκή διατροφή και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στο Know για να αυξήσετε την ισχύ της μνήμης

Για αυτήν τη μελέτη, το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε (αρ. έγκρισης KW-200113-1· ημερομηνία έγκρισης, 18 Φεβρουαρίου 2020) από την Επιτροπή περίθαλψης και χρήσης ζώων του ιδρύματος.

Το ερευνητικό πρωτόκολλο τηρούσε τις κατευθυντήριες γραμμές που προτείνονται στους «Τρέχοντες Διεθνείς Νόμους και Πολιτικές» του Οδηγού για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Εργαστηριακών Ζώων που δημοσιεύτηκε από το The National Academies Press (8th Ed., 2011).

4.2. Πειραματικές Ομάδες, Επαγωγή tFI και Θεραπείες HyT και OXC

Για να αποδειχθούν οι προστατευτικές επιδράσεις του OXC έναντι του ισχαιμικού τραυματισμού μετά από FI σε γερβίλους, οι γερβίλοι χωρίστηκαν σε έξι ομάδες: (1) ομάδα εικονικού οχήματος (n=24)· (2) tFI + ομάδα οχήματος (n {{5 }}); (3) ομάδα sham+HyT (n=24); (4) tFI+HyT ομάδα (n=60)· (5) sham+OXC (200 mg/kg) ομάδα (n=24); και (6) ομάδα tFI+OXC (n=60).

Επτά και πέντε γερβίλοι στις τρεις ομάδες tFI χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση Western blot και ιστολογική εξέταση, αντίστοιχα, στα 30 λεπτά, 12 ώρες, 1 ημέρα, 2 ημέρες και 4 ημέρες μετά την επέμβαση tFI, και στις τρεις ψευδείς ομάδες, επτά και πέντε γερβίλοι χρησιμοποιήθηκαν στα 30 λεπτά και 4 ημέρες μετά την εικονική επέμβαση για να ελαχιστοποιηθούν οι αριθμοί. Σε αυτό το πείραμα, το tFI αναπτύχθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

Εν ολίγοις, οι γερβίλες αναισθητοποιήθηκαν με 2,5% ισοφλουράνιο (σε 32% οξυγόνο και 68% οξείδιο του αζώτου). Υπό αναισθησία, και οι δύο κοινές καρωτιδικές αρτηρίες απομονώθηκαν από το θηκάρι της καρωτίδας και αποφράχθηκαν με συνδετήρες ανευρύσματος (Yasargil FE 723K, Γερμανία) ) για πέντε λεπτά.

Η τέλεια διακοπή της παροχής αίματος στον εγκέφαλο επιβεβαιώθηκε μέσω της παρατήρησης της αρτηριακής ροής του αίματος και στις δύο αρτηρίες του αμφιβληστροειδούς (κλαδιά εσωτερικών καρωτιδικών αρτηριών) χρησιμοποιώντας ένα οφθαλμοσκόπιο (HEINE K180®) από τη Heine Optotechnik (Herrsching, Γερμανία).

Η θερμοκρασία του σώματος πριν και κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης σε όλες τις ομάδες ελεγχόταν σε φυσιολογική θερμοκρασία (37 ± 0,2 ◦C) χρησιμοποιώντας μια θερμομετρική κουβέρτα. Μετά από πέντε λεπτά απόφραξης, τα κλιπ αφαιρέθηκαν.

Σε αυτή τη μελέτη, έγινε μια εικονική επέμβαση υποβάλλοντάς τους στην ίδια χειρουργική επέμβαση tFI χωρίς απόφραξη των κοινών καρωτιδικών αρτηριών. Το HyT στις δύο ομάδες sham+HyT και tFI+HyT ελεγχόταν (παρόμοιο με τη μεταβολή της θερμοκρασίας του σώματος στο tFI+ ομάδα OXC) με ψύξη ολόκληρου του σώματος με παγοκύστη για έξι ώρες.

Η θερμοκρασία σώματος των δύο ομάδων sham+OXC και tFI+OXC καταγράφηκε για έξι ώρες μετά την άμεση ενδοπεριτοναϊκή ένεση 200 mg/kg OXC (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) μετά την επέμβαση tFI.

Η δόση του OXC επιλέχθηκε με βάση προηγούμενη μελέτη που ανέφερε ότι τα 200 mg/kg OXC προστάτευαν αποτελεσματικά από τον κυτταρικό θάνατο στον εγκέφαλο μετά την [36]. Για να καταγραφεί η μεταβολή της θερμοκρασίας του σώματος, η θερμοκρασία του σώματος μετρήθηκε στο ορθό μία ώρα μετά το tFI, πάνω από περίοδο 6 ωρών, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (περίπου 22 ◦C).

Οι γερβίλοι έλαβαν χρόνο ανάρρωσης τεσσάρων ημερών μετά το tFI επειδή τα πυραμιδικά κύτταρα που βρίσκονται στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου αρχίζουν να πεθαίνουν τέσσερις ημέρες μετά το tFI [30,34,62].

4.3. Δοκιμή SMA

Το τεστ SMA πραγματοποιήθηκε για να εξετάσει τις αλλαγές στην υπερκινητικότητα σε όλες τις ομάδες. Εν συντομία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [63], το τεστ SMA έγινε την Ημέρα 1 μετά τον tFI, καθώς η κινητική κινητικότητα φτάνει στο υψηλότερο σημείο την Ημέρα 1 μετά από ισχαιμικό τραυματισμό μετά από tFI.

Οι γερβίλοι όλων των ομάδων έλαβαν περιβαλλοντική προσαρμογή για δύο ώρες και τοποθετήθηκαν σε ανοιχτό κλουβί (πλάτος, 44 cm, μήκος, 44 cm, ύψος, 30) που ελήφθη από την Ugo Basile SRL (Gemonio, Ιταλία), στο οποίο δύο παράλληλες οριζόντιες Εγκαταστάθηκαν υπέρυθρες δέσμες 4 × 8 από το δάπεδο, για μία ώρα. Το SMA καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα Photobeam Activity System-Home Cagefrom San Diego Instruments (San Diego, CA, USA).

Η κίνηση (τροχιά και συνολική διανυθείσα απόσταση) ανιχνεύθηκε μέσω της διακοπής της συστοιχίας των υπέρυθρων ακτίνων που παράγονται από φωτοκύτταρα.

Η SMA παρακολουθούνταν συνεχώς για μία ώρα και τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή AMB από την IPC Electronics (Cumbria, UK).

Η συλλογή δεδομένων ξεκίνησε 15 λεπτά μετά την εξοικείωση στο ανοιχτό κλουβί. Τέλος, τα ληφθέντα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν ως η απόσταση (μέτρα) κίνησης στην περίοδο δοκιμής (μία ώρα).

4.4. Τεστ Γνωστικών Λειτουργιών

4.4.1. ΡΑΜΤ

Για να συγκριθεί η χωρική μνήμη σε όλες τις ομάδες, το RAMT πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [38,44]. Ένας ακτινωτός λαβύρινθος βραχίονα 8-από την Stoelting Co (Wood Dale, IL, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για αυτήν τη δοκιμή.

Το όργανο λαβύρινθου αποτελούνταν από μια κεντρική πλατφόρμα και οκτώ βραχίονες (πλάτος κάθε βραχίονα, 5 cm, ύψος, 9 cm, μήκος, 35 cm). Οι γερβίλοι εκπαιδεύονταν μία φορά την ημέρα για τρεις ημέρες πριν από το.

Συγκεκριμένα, η τροφοδοσία σφαιριδίων που ελήφθη από την DBL Co (Chungbuk, Κορέα) τοποθετήθηκε στο άκρο κάθε βραχίονα και κάθε γερβίλος τοποθετήθηκε στην κεντρική πλατφόρμα. Στη συνέχεια, ο γερβίλος αναζήτησε την τροφή.

Μετά την εικονική επέμβαση ή την επέμβαση tFI, το πραγματικό τεστ γινόταν μία φορά την ημέρα για τέσσερις ημέρες ξεκινώντας μία ημέρα μετά την επέμβαση.

Για την ανάλυση, αξιολογήθηκε ο αριθμός των σφαλμάτων, με ένα σφάλμα να εμφανίζεται κάθε φορά που ο γερβίλος εισέρχονταν σε βραχίονα που είχε ήδη επισκεφτεί στο παρελθόν. Η δοκιμή ολοκληρώθηκε όταν ο γερβίλος κατανάλωσε την τροφή.

4.4.2. ΕΛΑΦΡΟ ΚΤΥΠΗΜΑ

Για να συγκριθεί η βραχυπρόθεσμη μνήμη μεταξύ των ομάδων, το PAT διεξήχθη σύμφωνα με προηγούμενες μεθόδους [64,65] με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν ολίγοις, οι γερβίλοι δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας το Σύστημα Αποφυγής Gemini (GEM 392) από την San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), το οποίο αποτελείται από δύο (σκοτεινό και φωτεινό) διαμερίσματα που επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω μιας κάθετα συρόμενης πύλης.

Οι πειραματικές συνεδρίες πραγματοποιήθηκαν σε δύο φάσεις: μια συνεδρία εκπαίδευσης και μια πραγματική συνεδρία δοκιμής που πραγματοποιήθηκε μια ημέρα πριν και τέσσερις ημέρες μετά την επέμβαση tFI ή εικονικής επέμβασης.

Η πραγματική δοκιμή πραγματοποιήθηκε 20 λεπτά μετά την προπόνηση μετρώντας τον χρόνο καθυστέρησης (δευτερόλεπτα) κατά τη διάρκεια της παραμονής στο σκοτεινό δωμάτιο. Δηλαδή, στην προπόνηση, ο γερβίλος αφέθηκε να εξερευνήσει τα δύο διαμερίσματα ελεύθερα για ένα λεπτό ενώ η πύλη άνοιγε .

Στη συνέχεια, όταν ο γερβίλος πήγε στο σκοτεινό διαμέρισμα, η πόρτα έκλεισε και ο γερβίλος υπέστη ηλεκτροπληξία στο πόδι (0,5 mA) από ένα χαλύβδινο πλέγμα στο πάτωμα για πέντε δευτερόλεπτα.

Στην πραγματική συνεδρία δοκιμής, την Ημέρα 4 μετά το tFI, ο γερβίλος τοποθετήθηκε στο φωτεινό διαμέρισμα και καταγράφηκε ο χρόνος καθυστέρησης στο φωτεινό διαμέρισμα πριν εισέλθει στο σκοτεινό διαμέρισμα.

4.5. Ανάλυση Western Blot για TRPV1 και TRPV4

Για να εξεταστούν τα επίπεδα έκφρασης των TRPV1 και TRPV4 στο CA1 του ιππόκαμπου γερβίλου, πραγματοποιήθηκε η τεχνική Western blot σύμφωνα με μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως [66,67].

Εν συντομία, σύμφωνα με το καθορισμένο πρόγραμμα (30 λεπτά, 12 ώρες, 1 ημέρα, 2 ημέρες και 4 ημέρες μετά από εικονική επέμβαση ή επέμβαση tFI), οι γερβίλοι (n=5 για κάθε ομάδα) έλαβαν αναισθησία για ευθανασία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 200 mg/kg πεντοβαρβιτάλη νατρίου (JW Pharm.Co., Ltd., Σεούλ, Κορέα).

Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοί τους συλλέχθηκαν και ομογενοποιήθηκαν με 50 mM ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS, pH 7,4) που περιείχε 0.1 mM αιθυλενογλυκόλη-δις (αμινοαιθυλαιθέρας)-N, N, N{{{ 11}}, Ν0-τετραοξικό οξύ (EGTA) (pH 8.0), 10 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) (pH 8,0), 0,2% Nonidet P{17 }}, 15 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 100 mM-γλυκεροφωσφορικό, 2 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mMφαινυλμεθυλσουλφονυλφθορίδιο (PMSF) και 1 mM διθειοθρεϊτόλη.

Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενα ελήφθησαν για να προσδιοριστούν τα επίπεδα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού aMicro BCA από την Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) με αλβουμίνη βοοειδούς ορού από την Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Δείγματα που περιλαμβάνουν 20 μg ολικής πρωτεΐνης βράστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης, 150 mM Tris (ρΗ 6,8) που περιείχε 6% θειικό νάτριο δωδεκυλεστέρα (SDS), 3 mM DTT, 0,3% μπλε βρωμοφαινόλης και 30% γλυκερίνη.

Τα δείγματα διαχωρίστηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE). Στη συνέχεια, οι πηκτές μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης από την Pall Co (East Hills, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) στα 350 mA και 4°C για 90 λεπτά.

Για να αποκλειστεί η μη ειδική χρώση, οι μεμβράνες επωάστηκαν σε 5% απολιπασμένο γάλα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, ανοσοαντίδρασαν με κάθε πρωτεύον αντίσωμα: κουνελιού αντι-TRPV1 (αραιωμένο 1:1000) (Abcam, Cambridge, UK), κουνελιού αντι-TRPV4 (αραιωμένο 1:1000) (Abcam) και αντι-κουνελιού- - ακτίνη (αραιωμένη 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) στους 4 ◦C για 7 ώρες.

Στη συνέχεια, αντέδρασαν με IgG αντι-κουνελιού γαϊδουριού συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου (HRP) (αραιωμένο 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα.

Τέλος, χρησιμοποιήθηκε κιτ χημειοφωταύγειας με βάση την αλουμινόλη της Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, ΗΠΑ) για την ενίσχυση της οπτικοποίησης.

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [68], οι ανοσοκηλίδες των TRPV1 και TRPV4 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Scion Image από τη Scion Crop (Frederick, MD, ΗΠΑ). Οι ζώνες σαρώθηκαν και πραγματοποιήθηκε πυκνομετρική ανάλυση. Τα επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν έναντι του αντίστοιχου επιπέδου -ακτίνης.

4.6. Προετοιμασία Ιστολογικών Τομών

Για ανοσοϊστοχημικές και ιστοπαθολογικές εξετάσεις, γερβίλοι (n=7 για κάθε ομάδα) θυσιάστηκαν σύμφωνα με το καθορισμένο πρόγραμμα (30 λεπτά, 12 ώρες, 1 ημέρα, 2 ημέρες και 4 ημέρες μετά από tFI ή εικονική επέμβαση).

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34], οι γερβίλοι αναισθητοποιήθηκαν σε βάθος με πεντοβαρβιτάλη νάτριο (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Σεούλ, Κορέα). Υπό αναισθησία, οι γερβίλοι ξεπλύθηκαν διακαρδιακά με φυσιολογικό ορό φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος 0,1 Μ (ρΗ 7,4) και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ, ρΗ 7,4).

Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοί τους ελήφθησαν και διορθώθηκαν εκ των υστέρων χρησιμοποιώντας το ίδιο σταθεροποιητικό για έξι ώρες. Στη συνέχεια, οι ιστοί του εγκεφάλου κόπηκαν (πάχος 25 μm στεφανιαίων επιπέδων) σε ακρυοστάτη (Leica, Wetzlar, Γερμανία).

4.7. Ιστοχημική χρώση με χρήση βιογραφικού

Για να εξεταστεί η μορφολογική και νευρωνική βλάβη στον ιππόκαμπο κάθε ομάδας, πραγματοποιήθηκε χρώση με κρεζυλοβιολέτα (CV) όπως περιγράψαμε προηγουμένως [69]. Εν συντομία, οξικός ιώδες κρεζυλεστέρας (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) διαλύθηκε στο 1.0% (w/v) σε απεσταγμένο νερό και παγόμορφο οξικό οξύ (0).28 %) προστέθηκε σε αυτό το διάλυμα. Τα τμήματα βάφτηκαν και τοποθετήθηκαν με καναδικό βάλσαμο (Κάντο, Τόκιο, Ιαπωνία).

4.8. Χρώση FJ B

Πραγματοποιήθηκε χρώση FJ B για να εξεταστεί η νευρωνική εκφύλιση (θάνατος ή απώλεια). Σύμφωνα με τη δημοσιευμένη διαδικασία [34], οι παρασκευασμένες τομές εγκεφάλου εμποτίστηκαν σε 1% υδροξείδιο του νατρίου, μεταφέρθηκαν αμέσως σε 0.06% υπερμαγγανικό κάλιο και αντέδρασαν αμέσως με 0,0004% Fluoro-Jade B (Ιστοχημική , Jefferson, AR, ΗΠΑ).

Οι τομές πλύθηκαν για λίγο και τοποθετήθηκαν σε θερμαντήρα πλακών (περίπου 50 ◦C) για αντίδραση με το FJ B. Για να εκτιμηθεί το θεραπευτικό αποτέλεσμα του OXC έναντι του tFI, μετρήθηκαν οι αριθμοί των FJ B+ κυττάρων στην περιοχή CA1 σύμφωνα με μια μέθοδο που δημοσιεύτηκε στο [ 70].

Εν συντομία, λήφθηκαν ψηφιακές εικόνες FJ B+cells από πέντε τμήματα ανά γερβίλο χρησιμοποιώντας ένα επιφθορισμό μικροσκόπιο (Carl Zeiss) (Oberkochen, Γερμανία) σε μήκος κύματος 450–490 nm. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε 250 μm2, το οποίο περιελάμβανε το SP, στο κέντρο της περιοχής CA1 χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, ΑΖ, ΗΠΑ).

4.9. Ανοσοϊστοχημεία

Για τη διερεύνηση των αλλαγών στην ανοσοαντιδραστικότητα NeuN, TRPV1 και TRPV4 στην περιοχή CA1, πραγματοποιήθηκε γενική ανοσοϊστοχημεία. Εν συντομία, σύμφωνα με μια δημοσιευμένη μέθοδο [34], οι προετοιμασμένες τομές εγκεφάλου επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα-αντι-NeuN ποντικού (αραιωμένο, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, USA), ποντικού anti-TRPV1 (αραιωμένο, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK) και κουνελιού anti-TRPV4 (αραιωμένο, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK).

Στη συνέχεια, αυτές οι επωασμένες τομές επωάστηκαν στα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα (αραιωμένα, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας Vectastain ABC (αραιωμένο, 1:250) (Vector Laboratories, CA, , ΗΠΑ). Τέλος, αυτές οι ανοσοαντιδράσεις τομές είχαν χρώμα μετά από οπτικοποίηση με 3,3'-διαμινοβενζιδίνη.

Οι αριθμοί των κυττάρων NeuN+ μετρήθηκαν ως εξής. Ψηφιακές εικόνες κυττάρων NeuN+ καταγράφηκαν από πέντε τομές ανά γερβίλο χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός (AxioM1) (Carl Zeiss, Γερμανία).

Τα κύτταρα μετρήθηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως ο αριθμός FJ B+cell. Για την αξιολόγηση της πυκνότητας των δομών TRPV1+ και TRPV4+, χρησιμοποιήθηκαν οι αντίστοιχες περιοχές στην περιοχή CA1 σε πέντε τομείς ανά ζώο. Οι εικόνες των δομών TRPV1+ και TRPV4+λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φωτός AxioM1 (Carl Zeiss) (Γερμανία).

Οι πυκνότητες των δομών TRPV{{0}} και TRPV4+ αξιολογήθηκαν ως η σχετική οπτική πυκνότητα (ROD). Για το σκοπό αυτό, οι εικόνες μετατράπηκαν στο μέσο επίπεδο γκρι. Το ROD παρουσιάστηκε ως ποσοστό χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop (έκδοση 8.0) και το λογισμικό NIH Image J (NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD, ΗΠΑ).

4.10. Στατιστική ανάλυση

Παρουσιάσαμε τα δεδομένα ως μέσο όρο ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη βοήθεια του GraphPad Prism (έκδοση 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Οι διαφορές στους μέσους όρους μεταξύ των πειραματικών ομάδων αναλύθηκαν στατιστικά με αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με ένα τεστ πολλαπλής σύγκρισης post hocBonferroni για να διαλευκανθούν οι διαφορές που σχετίζονται με το tFI μεταξύ όλων των ομάδων. Η στατιστική σημασία λήφθηκε υπόψη στο p < 0. 05.

Συνεισφορές του συγγραφέα: Εννοιολόγηση: M.-HW and T.-KL; Methodology, J.-CL, and DWK;Software, H.-IK, and MCS; Επικύρωση, JHA, IJK και JHP. Investigation, J.-CL, H.-IK, andM.CS; Επιμέλεια δεδομένων, JHC, IJK και JHP. Writing-Original Draft Preparation, H.-IK, andJ.-CL; Συγγραφή-Επιθεώρηση και Επιμέλεια, M.-HW; Supervision, S.-SL; Project Administration, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL και T.-KL Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση: Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities forResearch (FOUR, 4220200913807) που χρηματοδοτείται από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών (NRF) της Κορέας και από το Πρόγραμμα Βασικής Επιστήμης Έρευνας μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF) χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Δήλωση Επιτροπής Θεσμικής Αναθεώρησης: Οι γερβίλοι εκτράφηκαν στο Κέντρο Πειραματικών Ζώων του Εθνικού Πανεπιστημίου Kangwon (Chuncheon, Κορέα). Για αυτήν τη μελέτη, το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε (αρ. έγκρισης, KW-200113-1· ημερομηνία έγκρισης, 18 Φεβρουαρίου 2020) από την Επιτροπή περίθαλψης και χρήσης ζώων του ιδρύματος.

Το ερευνητικό πρωτόκολλο τηρούσε τις κατευθυντήριες γραμμές που προτείνονται στους «Τρέχοντες Διεθνείς Νόμους και Πολιτικές» του Οδηγού για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Εργαστηριακών Ζώων που δημοσιεύτηκε από το The National Academies Press (8th Ed., 2011).

Δήλωση συγκατάθεσης μετά από ενημέρωση: Δεν ισχύει.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων: Τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτήν τη μελέτη είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος από τον αντίστοιχο συγγραφέα.

Ευχαριστίες: Οι συγγραφείς εκτιμούν τους Hyun Sook Kim και Seung Uk Lee για την τεχνική βοήθεια τους σε αυτή τη μελέτη.

Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχει οικονομική σύγκρουση συμφερόντων.

Συντομογραφίες

CA1: υποπεδίο Cornu Ammonis 1; ΚΝΣ, κεντρικό νευρικό σύστημα; CV, cresyl violet; DG, οδοντωτή έλικα;FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, υποθερμία; NeuN, νευρωνικοί πυρήνες; OXC, οξκαρβαζεπίνη; PAT, τεστ παθητικής αποφυγής. ROD, σχετική οπτική πυκνότητα. SMA, αυθόρμητη κινητική δραστηριότητα. SO, στρώμα oriens;SP, στρώμα πυραμιδικό; SR, στρώμα ακτίνας; tFI, παροδική ισχαιμία πρόσθιου εγκεφάλου. TRPV1, βανιλλοειδές δυναμικό παροδικού υποδοχέα τύπου 1.

Αναφορές

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MY; Valdes, Ι.; Scheinberg, Ρ.; Ginsberg, MD Μικρές διαφορές στην ενδοισχαιμική εγκεφαλική θερμοκρασία καθορίζουν κρίσιμα την έκταση της ισχαιμικής νευρωνικής βλάβης. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1987, 7, 729-738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Η υποθερμία ως πιθανή θεραπεία για την εγκεφαλική ισχαιμία. Εγκεφαλοαγγειακό. Brain Metab. Rev. 1993, 5.277–300.

3. Nurse, S.; Corbett, D. Neuroprotection μετά από αρκετές ημέρες ήπιας, προκαλούμενης από φάρμακα υποθερμίας. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1996, 16.474–480. [CrossRef]

4. Fisher, Μ.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Ενημέρωση των προκλινικών συστάσεων της ακαδημαϊκής βιομηχανίας θεραπείας εγκεφαλικών επεισοδίων. Stroke 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Θεραπευτική υποθερμία: Νευροπροστατευτικοί μηχανισμοί. Εμπρός. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, Μ.; Dietrich, WD Θεραπευτική υποθερμία για οξύ εγκεφαλικό. Int. J. Stroke 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Θεραπευτική υποθερμία σε οξύ εγκεφαλικό. J. Neurosci. Νοσηλευτές. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenser, MA; Sung, GY; Mack, WJ Θεραπευτική υποθερμία σε οξύ ισχαιμικό εγκεφαλικό. Νευροχειρουργική. Focus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Γεωργιάδης, Δ.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Σκοπιμότητα και ασφάλεια της μέτριας υποθερμίας μετά από μαζικό έμφραγμα του ημισφαιρίου. Stroke 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Υ.; Park, K. Η ρυθμιζόμενη υποθερμία μειώνει το οξειδωτικό στρες του εγκεφάλου μετά από υποξική ισχαιμία. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Liu, Κ.; Khan, Η.; Geng, Χ.; Zhang, J.; Ding, Y. Φαρμακολογική υποθερμία: Υπάρχει δυνατότητα για μελλοντική θεραπεία εγκεφαλικού; Neurol. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Υ.; Wang, Ζ.; Li, Η.; Wang, Ζ.; Chen, G. Νευροπροστατευτικά αποτελέσματα της επαγόμενης από φάρμακα θεραπευτικής υποθερμίας σε ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος. Curr. Drug Targets 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Calabresi, Ρ.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Τα αντιεπιληπτικά φάρμακα ως πιθανή νευροπροστατευτική στρατηγική εγκεφαλική ισχαιμία. Αννα. Neurol. 2003, 53, 693-702. [CrossRef]

14. Tanaka, Τ.; Litofsky, NS Αντιεπιληπτικά φάρμακα σε παιδιατρική τραυματική εγκεφαλική βλάβη. Εμπειρογνώμονας Rev. Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com