Έκφραση ανθρώπινης Άλφα Defensin 5 στον ανθρώπινο νεφρό και το ουροποιητικό σύστημα
Mar 16, 2022
Για περισσότερες πληροφορίες: ali.ma@wecistanche.com
Ο John David Spencer et al
Αφηρημένη
Ιστορικό:Οι μηχανισμοί που διατηρούν τη στειρότητα στο ουροποιητικό σύστημα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Πρόσφατες μελέτες έχουν ενοχοποιήσει τη σημασία των αντιμικροβιακών πεπτιδίων (AMP) στην προστασία του ουροποιητικού συστήματος από λοιμώξεις. Εδώ, χαρακτηρίζουμε την έκφραση και τη συνάφεια της AMP ανθρώπινης άλφα-ντεφενσίνης 5 (HD5) στον άνθρωπονεφρόκαι του ουροποιητικού συστήματος σε φυσιολογικά και μολυσμένα άτομα.
Μεθοδολογία/Κύρια ευρήματα:Χρησιμοποιώντας RNA που απομονώθηκε από άνθρωπονεφρό, του ουρητήρα και του ιστού της ουροδόχου κύστης, πραγματοποιήσαμε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο για να δείξουμε ότι το DEFA5, το γονίδιο που κωδικοποιεί το HD5, εκφράζεται συστατικά σε όλο το ουροποιητικό σύστημα. Με την πυελονεφρίτιδα, η έκφραση DEFA5 αυξήθηκε σημαντικά στονεφρό. Χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοστύπωσης, η παραγωγή HD5 αυξήθηκε επίσης με την πυελονεφρίτιδα. Ανοσοχρώση εντοπισμένη HD5 στο ουροθήλιο της ουροδόχου κύστης και του ουρητήρα. Στο νεφρό, το HD5 παρήχθη κυρίως στον περιφερικό νεφρώνα και στα συλλεκτικά σωληνάρια. Χρησιμοποιώντας δοκιμές ανοσοστύπωσης και ELISA, το HD5 δεν ανιχνεύτηκε συστηματικά σε μη μολυσμένα δείγματα ανθρώπινων ούρων, ενώ σημαίνει ότι η παραγωγή HD5 στα ούρα αυξήθηκε με τη μόλυνση του ουροποιητικού συστήματος E.coli.
Συμπεράσματα/Σημασία:Το DEFA5 εκφράζεται σε όλο το ουροποιητικό σύστημα σε μη μολυσμένα άτομα. Συγκεκριμένα, η HD5 εκφράζεται σε όλο το ουροθήλιο του κατώτερου ουροποιητικού συστήματος και στα συλλεκτικά σωληνάρια τουνεφρό. Με τη μόλυνση, η έκφραση HD5 αυξάνεται στονεφρόκαι τα επίπεδα γίνονται ανιχνεύσιμα στα ούρα. Από όσο γνωρίζουμε, τα ευρήματά μας αντιπροσωπεύουν τα πρώτα που ποσοτικοποιούν την έκφραση και την παραγωγή HD5 στον ανθρώπινο νεφρό. Επιπλέον, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που ανιχνεύει την παρουσία HD5 σε μολυσμένα δείγματα ούρων. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το HD5 μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της στειρότητας του ουροποιητικού συστήματος.
Εισαγωγή
Το ουροποιητικό σύστημα, εκτός από το κρέας της ουρήθρας, είναι συνήθως στείρο παρά τη γειτνίασή του με την χλωρίδα των κοπράνων. Οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους το ουροποιητικό σύστημα διατηρεί τη στειρότητά του δεν είναι καλά κατανοητοί. Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί που συμβάλλουν στην άμυνα του ουροποιητικού συστήματος περιλαμβάνουν τη ροή των ούρων, τις αλλαγές στο pH και την ωσμωτικότητα των ούρων, την τακτική κένωση της ουροδόχου κύστης, τα χημικά αμυντικά συστατικά του ουροεπιθηλίου και την επιθηλιακή αποβολή/εισροή τελεστικών ανοσοκυττάρων με βακτηριακή διέγερση [1]. Επιπλέον, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι τα αντιμικροβιακά πεπτίδια (AMPs) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της στειρότητας του ουροποιητικού συστήματος [2]. Τα AMPs, τα οποία χρησιμεύουν ως φυσικά αντιβιοτικά που παράγονται σχεδόν από όλους τους οργανισμούς, είναι ένα πανταχού παρόν συστατικό του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Τα AMP είναι κατιονικά μόρια που εκφράζονται από φαγοκυτταρικά λευκά αιμοσφαίρια και επιθηλιακά κύτταρα. Στους ανθρώπους και άλλα θηλαστικά, οι ντεφενσίνες είναι μια κύρια οικογένεια AMP. Οι άμυνες έχουν συνήθως ευρέως φάσματος αντιμικροβιακή δράση έναντι gram-θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων, ιών, μυκήτων και πρωτόζωων [2,3]. Οι άμυνες αρχικά συντίθενται ως προπρωτεΐνες και υφίστανται επεξεργασία για να γίνουν ώριμα, βιολογικά ενεργά πεπτίδια [4]. Στον άνθρωπο, οι ντεφενσίνες ταξινομούνται σε μία από τις δύο οικογένειες ανάλογα με το δισουλφιδικό μοτίβο γεφύρωσής τους – τις άλφα-ντεφενσίνες ή τις βήτα-αμυνσίνες [5].
Στο ουροποιητικό σύστημα, οι β-αμυνσίνες εκφράζονται ευρέως σε όλο το ουροεπιθήλιο. Επιθηλιακά κύτταρα που καλύπτουν τονεφρόβρόχος Henle, άπω σωληνάριο και αγωγός συλλογής εκφράζουν συστατικά την ανθρώπινη βήτα-αμυντική 1 (hBD1). Αν και τα επίπεδα της hBD1 στα ούρα είναι ανεπαρκή για να σκοτώσουν τα εισβάλλοντα βακτήρια, η hBD1 παρέχει μια ταχείας δράσης αντιμικροβιακή επικάλυψη των σωληναριακών αυλών και αποτρέπει τη μόλυνση αναστέλλοντας την προσκόλληση βακτηρίων στο ουροθήλιο [6]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η οξειδοαναγωγική κατάσταση της hBD1 επηρεάζει σημαντικά την αντιμικροβιακή ισχύ, έτσι ώστε το ανηγμένο πεπτίδιο είναι πολύ πιο ισχυρό από την οξειδωμένη μορφή που συνδέεται με δισουλφίδιο [7]. Η σημασία αυτού στην ουροθηλιακή επιφάνεια δεν έχει προσδιοριστεί. Μια άλλη άμυνα, η ανθρώπινη βήτα-ντεφενσίνη 2 (hBD2) δεν εκφράζεται συστατικά σε υγιή νεφρικό ιστό. Ωστόσο, η έκφραση hBD2 προκαλείται από μόλυνση [8].
Σε αντίθεση με τις βήτα-αμυνσίνες, ο ρόλος των άλφα-αμυνσινών που προέρχονται από το επιθήλιο δεν περιγράφεται καλά στο ουροποιητικό σύστημα. Η έκφραση και η λειτουργία των άλφα-αμυνσινών HD5 και HD6 έχουν ως επί το πλείστον αναφερθεί στο λεπτό έντερο όπου εκκρίνονται από τα Panethcells στις εντερικές κρύπτες και συμβάλλουν στην ισορροπία της εντερικής μικροχλωρίδας [9]. Το HD5 έχει επίσης εντοπιστεί στην ανδρική και γυναικεία γεννητική οδό, με στοιχεία που υποδηλώνουν ότι είναι επαγώγιμη και σημαντική για την εξάλειψη της λοίμωξης [10,11,12]. Η HD5 των ούρων έχει ανιχνευθεί σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε ανακατασκευή της νεοκύστης του ειλεού και εκτροπή του ουροποιητικού αγωγού ειλεού, όπου η πηγή παραγωγής της HD5 πιστώθηκε κυρίως στα κύτταρα Paneth του ειλεού [13,14]. Το HD5 έχει αντιβακτηριακή δράση έναντι κοινών ουροπαθογόνων gram-θετικών βακτηρίων και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων [15]. Το HD5 έχει επίσης αντιμικροβιακή δράση έναντι των ουροπαθογόνων ιών όπως ο αδενοϊός και ο ιός ΒΚ [16,17,18]. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε την αρχική περιγραφή και ποσοτικοποίηση της έκφρασης HD5 στον άνθρωπονεφρόκαι να ορίσουν περαιτέρω την έκφρασή του στο κατώτερο ουροποιητικό σύστημα κατά τη διάρκεια της στειρότητας και της μόλυνσης.
Αποτελέσματα
Το DEFA5 mRNA εκφράζεται συστατικά στην ανθρώπινη ουροδόχο κύστη, ουρητήρα και νεφρό
Η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο καταδεικνύει ότι όλα τα ελεγμένα κύστη, ουρητήρα καινεφρόδείγματα χωρίς μόλυνση εκφράζουν συστατικά DEFA5. Η έκφραση DEFA5 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στο κατώτερο ουροποιητικό σύστημα από ότι στο ανώτερο ουροποιητικό (ρ= 0.014). Στην ουροδόχο κύστη (n=4), η μέση έκφραση DEFA5 ήταν 4,656637 μεταγραφές ανά 10 ng RNA και στον ουρητήρα (n=4) η μέση έκφραση DEFA5 ήταν 4,1126170 μεταγραφές ανά 10 ngRNA (Εικόνα 1Α) . Στο νεφρό (n=6), η μέση έκφραση DEFA5 ήταν 2.9376274 μεταγραφές ανά 10 ng RNA. Η έκφραση DEFA5 αναλύθηκε χωριστά στον νεφρικό φλοιό, το μυελό και τη λεκάνη. Η έκφραση DEFA5 δεν διέφερε σημαντικά ανά περιοχή του νεφρού (ρ= 0.45).
Η έκφραση DEFA5 και η έκφραση του πεπτιδίου HD5 αυξάνονται με την πυελονεφρίτιδα
Ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο που πραγματοποιήθηκε σειστούς νεφρών μεΗ πυελονεφρίτιδα έδειξε σημαντική αύξηση στην έκφραση DEFA5 σε σύγκριση με τους μη μολυσμένους ιστούς των νεφρών. Με την πυελονεφρίτιδα (n= 6), η μέση έκφραση DEFA5 αυξήθηκε σε 7.82961.052 μεταγραφές ανά 10 ng RNA (ρ= 0.019) (Εικόνα 2Α).
Για να αξιολογήσουμε περαιτέρω αυτή την αύξηση της έκφρασης με πυελονοφρίτιδα, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ανοσοστύπωσης στο ίδιονεφρόιστός που χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο για την αξιολόγηση ταυτόχρονων αυξήσεων στην παραγωγή πεπτιδίου HD5 (Εικόνα 2Β, μεσαίο πλαίσιο). Ανάλυση ανοσοστυπώματος, χρησιμοποιώντας πολυκλωνικούς αντιορούς HD5, έδειξε σημαντικά μεγαλύτερη παραγωγή πεπτιδίου HD5 σε ιστούς νεφρών με πυελονεφρίτιδα (n {{5} }) σε σύγκριση με μη μολυσμένανεφρόιστούς(n=6). Μη μολυσμένονεφρόοι ιστοί εξέφρασαν 300625 ng HD5/γραμμάριο βάρους υγρού ιστού ενώνεφρόιστός με πυελονεφρίτιδα που εκφράζεται 600621 ng HD5/γραμμάριο βάρους υγρού ιστού (ρ, 0,0001). Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν εκ νέου με GAPDH για να χρησιμεύσουν ως έλεγχος φόρτωσης (Εικόνα 2Β, μεσαίο πλαίσιο) και πραγματοποιήθηκε επίσης χρώση αργύρου για να επιβεβαιωθεί η ίση φόρτωση πρωτεΐνης (Εικόνα 2Β, επάνω πλαίσιο).
Το πεπτίδιο HD5 παράγεται σε όλο το ανθρώπινο νεφρό και το ουροποιητικό σύστημα
Πραγματοποιήθηκε ανοσοχρώση για τον εντοπισμό της παραγωγής HD5 στο ουροποιητικό σύστημα. Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) έδειξε ότι η HD5 ανοσοαντιδραστικότητα ήταν παρούσα σε όλο το ουροθήλιο του ουρητήρα και της ουροδόχου κύστης όλων των δειγμάτων που ερευνήθηκαν (n=4, Εικόνα 3). Η IHC έδειξε επίσης ότι η HD5 παρήχθη σε σωληνάρια του νεφρικού φλοιού και του μυελού όλων δείγματα (n= 6, Εικόνα 4). Ο ανοσοφθορισμός (IF) έδειξε ότι η έκφραση HD5 ήταν μεγαλύτερη στον περιφερικό νεφρώνα και στα σωληνάρια συλλογής (Εικόνα 5). Το διάμεσο και τα σπειράματα δεν έδειξαν ανοσοαντιδραστικότητα HD5. Η ανοσοχρώση που φαίνεται στα Σχήματα 3, 4 και 5 διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Ηϋ5 ποντικού (8C8) που αναγνωρίζει το προπεπτίδιο HD5 (Abcam, Cambridge, ΜΑ). Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια όταν χρησιμοποιήθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-HD5 κουνελιού που αναγνωρίζει το προπεπτίδιο HD5 και το ώριμο πεπτίδιο (τα δεδομένα δεν φαίνονται) – υποδηλώνοντας ότι το HD5 αποθηκεύεται ως προπεπτίδιο.
Με την πυελονεφρίτιδα, η ανοσοχρώση HD5 αυξήθηκε σημαντικά. Η ανοσοαντιδραστικότητα HD5 αυξήθηκε σε όλο τον εγγύς νεφρώνα, τον περιφερικό νεφρώνα και τα σωληνάρια συλλογής (Εικόνα 4 και Σχήμα 5). Όπως και στα μη μολυσμένα δείγματα, τα σπειράματα και το διάμεσο δεν έδειξαν έκφραση HD5 με μόλυνση. Οι αρνητικοί έλεγχοι δεν έδειξαν ανοσοαντιδραστικότητα HD5.
Τα μολυσμένα ανθρώπινα ούρα περιέχουν μετρήσιμες συγκεντρώσεις πεπτιδίου HD5
Η ανάλυση ανοσοστύπωσης, χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντιορό κουνελιού που ανιχνεύει τον πρόδρομο proHD5 και περαιτέρω επεξεργασμένες μορφές εντόπισε μετρήσιμα επίπεδα HD5 σε 13 από τα 15 δείγματα ούρων που δοκιμάστηκαν μολυσμένα με ουροπαθογόνο E.coli (Εικόνα 6Α και Β). Όταν υπάρχουν, τα επίπεδα HD5, κανονικοποιημένα σε κρεατινίνη ούρων, κυμαίνονταν από 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr ούρων (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), που αντιστοιχεί σε 11,10–27,67 nmol/L. Μη μολυσμένα δείγματα ούρων (n=15), το HD5 ήταν στο ή κάτω από το όριο ανίχνευσης των (,50 ng). Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) στα ίδια δείγματα ούρων, χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (8C8) που ανιχνεύει μόνο τον πρόδρομο proHD5, ανίχνευσε μετρήσιμα επίπεδα proHD5 σε 13 από τα 15 μολυσμένα δείγματα που δοκιμάστηκαν. Οι συγκεντρώσεις proHD5 στα ούρα κυμαίνονταν από 122,78–490,060,03 ng HD5/mg Cr ούρων (30,02 ng/mL–200,5 ng/mL) όταν υπήρχε (Εικόνα 7).
Συζήτηση
Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε τον αρχικό χαρακτηρισμό του HD5 στον άνθρωπονεφρό, ουρητήρα και ουροδόχο κύστη. Το HD5 έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα σημαντικό AMP που αποτρέπει την επεμβατική λοίμωξη στο έντερο και ρυθμίζεται προς τα πάνω στο γεννητικό σύστημα κατά τη διάρκεια της μόλυνσης[11,18,19,20,21]. Τα AMP που προέρχονται από επιθηλιακά άλατα, όπως το HD5, έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντικά για τη διατήρηση της στειρότητας στο ουροποιητικό σύστημα[8,22,23,24]. Οι ελλείψεις σε αυτές τις έμφυτες άμυνες του βλεννογόνου μπορεί να οδηγήσουν σε οξεία ή/και χρόνια μόλυνση [25,26].
Τα ποσοτικά μας αποτελέσματα PCR σε πραγματικό χρόνο δείχνουν ότι το DEFA5 εκφράζεται συστατικά στον άνθρωπονεφρά, ουρητήρες και κύστη. Η έκφραση DEFA5 αυξάνεται από το ανώτερο ουροποιητικό σύστημα στο κατώτερο ουροποιητικό σύστημα – μετά τη ροή του ουροποιητικού ρεύματος και την αυξανόμενη εγγύτητα στο σημείο εισβολής της μικροχλωρίδας. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που ποσοτικοποιεί την έκφραση DEFA5 στον ανθρώπινο νεφρό και στην ουροδόχο κύστη. Πρόσφατα, οι Townes et al απέδειξαν ότι ο φυσιολογικός περιφερικός ουρητήρας μπορεί να εκφράσει DEFA5 [14]. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν επίσης ότι το DEFA5 εκφράζεται συστατικά από τον περιφερικό ουρητήρα. Παρόλο που η έκφραση DEFA5 στο ουροποιητικό σύστημα είναι σχεδόν 100-πλάσια χαμηλότερη από αυτή που βρίσκεται στους γαστρεντερικούς ιστούς, η βασική ουροεπιθηλιακή έκφραση της DEFA5 είναι συγκρίσιμη με την έκφραση των ενισχυτών ουρικής τροχιάς που περιγράφηκαν προηγουμένως όπως η καθελικιδίνη, hBD-1, hBD -2 και ριβονουκλεάση 7[6,8,22,24,27].
Σε αντίθεση με την ώριμη γαστρεντερική οδό όπου η DEFA5 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα τόσο σε καταστάσεις υγείας όσο και σε καταστάσεις λοίμωξης/φλεγμονής, τα ποσοτικά μας δεδομένα PCR σε πραγματικό χρόνο δείχνουν ότι η έκφραση της DEFA5 στηννεφρόρυθμίζεται σημαντικά προς τα πάνω με μόλυνση [27,28,29]. Αυτό το επαγώγιμο πρότυπο έκφρασης είναι ανάλογο με την έκφραση DEFA5 στη γυναικεία αναπαραγωγική οδό, όπου η έκφραση DEFA5 αυξάνεται με τη σαλπιγγίτιδα [30]. Στο ουροποιητικό σύστημα, οι Townes et al έχουν δείξει μια τάση προς μεγαλύτερη έκφραση του DEFA5 στον ουρητήρα σε ασθενείς με ουρολοίμωξη που έχουν υποβληθεί σε εκτροπή του ουροποιητικού αγωγού του ειλεού [14]
Η ανάλυσή μας ανοσοστυπώματος συμπληρώνει τα δεδομένα PCR σε πραγματικό χρόνο αποδεικνύοντας ότι η παραγωγή πεπτιδίου HD5 αυξάνεται με την πυελονεφρίτιδα. Αυτό το επαγώγιμο μοτίβο παραγωγής HD5 είναι παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται σε ορισμένα μέλη της οικογένειας της βήτα-ντεφενσίνης. Η hBD2 δείχνει επαγώγιμη μορφή παραγωγής με λοίμωξη του ουροποιητικού συστήματος και/ή χρόνια πυελονεφρίτιδα [8,31,32]. Η παραγωγή πεπτιδίου HD5 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνεται στην ανώτερη γυναικεία γεννητική οδό και στην ανδρική ουρήθρα με φλεγμονή [11,30].
Χρησιμοποιώντας ανοσοχρώση, αποδεικνύουμε ότι το HD5 παράγεται ομοιόμορφα σε όλο το ουροθήλιο του ουρητήρα και της ουροδόχου κύστης. Επειδή η συντριπτική πλειονότητα των ουρολοιμώξεων προέρχεται από χλωρίδα των κοπράνων που ανεβαίνει στην ουροδόχο κύστη, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση HD5 είναι παρούσα σε τοποθεσίες όπου η μικροβιακή έκθεση εμφανίζεται πιο συχνά [33]. Ως εκ τούτου, το HD5 είναι ιδανικά τοποθετημένο για την πρόληψη μιας ανιούσας μικροβιακής μόλυνσης. Στονεφρό, το HD5 παράγεται κυρίως στον περιφερικό νεφρώνα και στο συλλεκτικό σωληνάριο. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το HD5 παράγεται σε τοποθεσίες όπου θα τοποθετηθεί ώστε να έχει βέλτιστη αντιμικροβιακή δράση. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι αντιμικροβιακές ιδιότητες των defensins εξαρτώνται από τη συγκέντρωση αλατιού – με υψηλότερες συγκεντρώσεις αλατιού να μειώνουν την αντιμικροβιακή δράση [23,34,35]. Υποθέτουμε ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις άλατος του περιφερικού νεφρώνα και των σωληναρίων συλλογής παρέχουν ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την αντιμικροβιακή δράση HD5.
Η ανοσοστύπωση και η ανάλυση ELISA καταδεικνύουν επίσης ότι το HD5 εκκρίνεται στα ούρα σε χαμηλά επίπεδα. Δεδομένου του μεγέθους (8,1 kDa και 3,7 kDa) και του θετικού φορτίου του proHD5 και του πλήρως επεξεργασμένου HD5, είναι πιθανό κάποιο πεπτίδιο HD5 των ούρων να προέρχεται, τουλάχιστον εν μέρει, από διήθημα πλάσματος. Ωστόσο, υπάρχουν λίγα στοιχεία που υποδηλώνουν ότι το HD5 επιμένει στο πλάσμα [27]. Επιπλέον, για να εμφανιστεί στα ούρα, το HD5 θα πρέπει να ξεφύγει από τους αποτελεσματικούς μηχανισμούς απορρόφησης πεπτιδίων στο εγγύς σωληνάριο [6,36]. Τέλος, τα δείγματα ούρων που χρησιμοποιήθηκαν υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση πριν από τη διεξαγωγή των αναλύσεων, αφαιρώντας τις κυτταρικές πηγές HD5.
Στις ανιχνευθείσες συγκεντρώσεις, η HD5 των ούρων είναι απίθανο να είναι άμεσα αντιμικροβιακή έναντι των ουροπαθογόνων μικροοργανισμών, καθώς η πλήρως επεξεργασμένη HD5 έχει ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) μεταξύ 6-10 mg/mL έναντι κοινών gram-αρνητικών ουροπαθογόνων βακτηρίων [15]. Ωστόσο, οι συγκεντρώσεις στην επιφάνεια του βλεννογόνου είναι πιθανό να είναι υψηλότερες. Επιπλέον, η ανάλυση ανοσοστύπωσης καταδεικνύει ότι οι συγκεντρώσεις HD5 είναι σημαντικά μεγαλύτερες στονεφρό. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το HD5 εμπλέκεται στην άμυνα του βλεννογόνου του ουροποιητικού συστήματος. Ένα ανάλογο μοτίβο παρατηρείται με το hBD1, όπου οι συγκεντρώσεις της hBD1 στα ούρα είναι ανεπαρκείς για να επιδείξουν αντιμικροβιακή δράση, αλλά υψηλότερες συγκεντρώσεις πεπτιδίων ανιχνεύονται κοντά στα νεφρικά σωληνάρια [6,31].
Επειδή το IHC αποδεικνύει ότι το proHD5 είναι μια κύρια μορφή HD5 στονεφρόΚαι επειδή τόσο το ώριμο όσο και το proHD5 ανιχνεύονται στα ούρα, υποθέτουμε ότι το HD5 εκκρίνεται κυρίως ένα πρόδρομο μόριο και στη συνέχεια υφίσταται πρωτεολυτική επεξεργασία για να δημιουργήσει ώριμες μορφές - παρόμοιες με το γαστρεντερικό και το ουρογεννητικό σύστημα [11,30,37]. Στο λεπτό έντερο, τα κύτταρα Paneth παράγουν θρυψίνη, η οποία διασπά το προπεπτίδιο HD5, έτσι ώστε το πλήρως επεξεργασμένο πεπτίδιο να είναι η κυρίαρχη μορφή στον εντερικό αυλό [37]. Στην ανδρική ουρήθρα, τα βασικά ένζυμα επεξεργασίας και ενεργοποίησης για το HD5 είναι οι πρωτεάσες ουδετερόφιλων που συνεισφέρονται από ουδετερόφιλα που στρατολογούνται στο σημείο της μόλυνσης [11]. Οι συνεισφορές του επιθηλιακού θρυψινογόνου, της θρυψίνης των ούρων και/ή των πρωτεασών ουδετερόφιλων στην επεξεργασία HD5 στο ουροποιητικό σύστημα κατά τη διάρκεια της λοίμωξης πρέπει να προσδιοριστούν. Επιπλέον, οι επιπτώσεις των αλλαγών στο ουροποιητικό περιβάλλον στη λειτουργία HD5 (αλλαγές στην ωσμωτικότητα, το pH και τις κατιονικές συγκεντρώσεις) μένουν επίσης να προσδιοριστούν.
Συμπερασματικά, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που προσδιορίζει και ποσοτικοποιεί την έκφραση και την παραγωγή του HD5 στο ουροποιητικό σύστημα. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι το HD5 είναι ένα AMP προερχόμενο από επιθήλιο που μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην έμφυτη ανοσία του ανθρώπινου ουροεπιθίου lium, αποτρέποντας τη μετατόπιση των παθογόνων που εισβάλλουν στην κυκλοφορία. Η αποσαφήνιση των παραγόντων που ρυθμίζουν την παραγωγή HD5 μπορεί να προσφέρει νέες γνώσεις για την παθογένεση των ουρολοιμώξεων σε ασθενείς που διατρέχουν κίνδυνο για ουρολοίμωξη και ασθενείς με χρόνιες λοιμώξεις.
Μέθοδοι
Έγκριση μελέτης
Ελήφθη ενημερωμένη γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. Για άτομα ηλικίας κάτω των 18 ετών, ελήφθη γραπτή συγκατάθεση γονέα/κηδεμόνα. Η Επιτροπή Ιδρυματικής Αναθεώρησης του NationwideChildren's Hospital (NCH) ενέκρινε αυτήν τη μελέτη μαζί με τη διαδικασία συναίνεσης και τα έγγραφα (IRB07-00383).
Δείγματα ανθρώπινου ιστού και ούρων
Ο μη μολυσμένος ιστός του περιφερικού ουρητήρα και της ουροδόχου κύστης (n= 4) ελήφθη από παιδιά που υποβλήθηκαν σε επανεμφύτευση ουρητήρα για άλλους λόγους εκτός από την υποτροπιάζουσα λοίμωξη. Μη μολυσμένονεφρόελήφθησαν δείγματα (n=6) από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε νεφρεκτομή για νεφρικούς όγκους. Τα δείγματα ιστών ήταν απαλλαγμένα από μακροσκοπικά σημάδια ασθένειας ή φλεγμονής.Νεφρόιστός από ασθενείς με χρόνια πυελονεφρίτιδα παρασχέθηκε από το Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Δύο ανεξάρτητοι παθολόγοι επιβεβαίωσαν την ιστοπαθολογική διάγνωση της πυελονεφρίτιδας. Τα δείγματα ιστών καταψύχθηκαν γρήγορα ή διατηρήθηκαν ως τμήματα ουδέτερης φορμαλίνης ενσωματωμένα σε παραφίνη. Τομές μη μολυσμένου νεφρικού ιστού ανατέμθηκαν σε φλοιό, μυελό ή νεφρική λεκάνη πριν από την αποθήκευση (n=4).
Δείγματα μη μολυσμένων και μολυσμένων ούρων ελήφθησαν από παιδιά που προσήλθαν στο τμήμα επειγόντων περιστατικών του NCH ή στην τότενεφρολογική κλινική. Η διάγνωση της ουρολοίμωξης έγινε με μια θετική καλλιέργεια ούρων σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες της Αμερικανικής Ακαδημίας Παιδιατρικής [39]. Όλα τα μολυσμένα δείγματα ούρων είχαν 0,106 CFU/mL E.coli. Οι τιμές του pH των ούρων κυμαίνονταν από 5,5 έως 8,5 (μέση τιμή ούρων 6,9). Η ιοντική σύνθεση των ούρων δεν μετρήθηκε. Δείγματα ούρων φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθεί το ίζημα ούρων και προστέθηκε κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Απομόνωση ριβονουκλεϊκού οξέος και αντίστροφη μεταγραφή
Ολικό RNA απομονώθηκε από κατεψυγμένο ιστό χρησιμοποιώντας το PromegaTotal RNA Isolation System (Promega, Madison, WI, USA). Σύνθεση ForcDNA, 4-8 mg ολικού RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα με την αντίστροφη μεταγραφάση Superscript III χρησιμοποιώντας έναν ολιγο-(dT)12-18 εκκινητή σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Κλωνοποίηση πλασμιδίων ειδικών γονιδίων για τυπικές καμπύλες
Το cDNA που κωδικοποιεί τα DEFA5 και GAPDH κλωνοποιήθηκαν σε 4-Topo πλασμιδιακό φορέα (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πλασμίδια αλληλουχήθηκαν για να επιβεβαιωθεί ότι το σωστό
ελήφθησαν κατασκευές. Σειριακές αραιώσεις πλασμιδίων ειδικών για γονίδιο ποσοτικοποιήθηκαν (με φασματοφωτομετρική απορρόφηση στους 260°C και ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου) και χρησιμοποιήθηκαν σε PCR πραγματικού χρόνου για τη δημιουργία τυπικών καμπυλών για κάθε αντίδραση.
Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο
Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας μονόκλωνο cDNA από άνθρωπονεφρόιστός ουρητή και ουροδόχου κύστης με συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών ολιγονουκλεοτιδίων χρησιμοποιώντας το Σύστημα PCR 7500 Real-Time (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Σχεδιάστηκαν εκκινητές σύνδεσης εξονίων PCR και επιβεβαιώθηκαν οι αλληλουχίες χρησιμοποιώντας DNAstarH Laser Gene SeqBuilder : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 και DEFA5 reverse primer 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
Εν συντομία, το cDNA που αντιστοιχεί σε 10 ng RNA χρησίμευσε ως υπόδειγμα σε μια αντίδραση 25 ml που περιείχε 2,0 mM από κάθε εκκινητή και μίγμα 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green. Οι συνθήκες PCR ήταν: αρχική μετουσίωση στους 95 oC για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους με κάθε κύκλο να αποτελείται από μετουσίωση στους 94 oC για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 64 oC για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 oC για 30 δευτερόλεπτα. Η εκπομπή φθορισμού από κύκλο σε κύκλο παρακολουθήθηκε στα 530 nm και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Τα γονιδιακά ειδικά πρότυπα πλασμιδίου συμπεριλήφθηκαν με κάθε σύνολο αντιδράσεων. Ως θετικός έλεγχος, το τελικό RNA του ειλεού συμπεριλήφθηκε σε κάθε σύνολο αντιδράσεων και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με προηγούμενα δημοσιευμένα πρότυπα [27].
Για να επιβεβαιωθεί η ενίσχυση PCR του επιδιωκόμενου προϊόντος, το αντιπροσωπευτικό δείγμα αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 τοις εκατό. Τα προϊόντα οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου και συγκρίθηκαν με πρότυπα μεγέθους DNA με το αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος (δεν φαίνεται). Επιπλέον, προσδιορίστηκε μια καμπύλη προφίλ θερμοκρασίας τήξης για κάθε αντίδραση PCR στο τέλος κάθε αντίδρασης.
Αντισώματα HD5
Το προπεπτίδιο HD5 (AA20-94) και οι μερικώς επεξεργασμένες μορφές (AA36-94 και 56–94) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο μονοκλωνικό (8C8) αντίσωμα αντι-HD5 ποντικού (Abcam). Το προπεπτίδιο HD5 και το ώριμο πεπτίδιο (ΑΑ63-94) αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφέντα πολυκλωνικό αντιορό κουνελιού[13,40].
Ανοσοκηλίδα
Τμήματα του ίδιουνεφρόδείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο (3–6 mg υγρού βάρους) κονιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας γουδί και γουδοχέρι σε υγρό άζωτο και διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με αναστολείς πρωτεάσης. Οι πρωτεΐνες ούρων εξήχθησαν από δείγματα ούρων χρησιμοποιώντας το κιτ ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Καναδάς). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα νεφρά και στα ούρα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη δοκιμασία Bradford και επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας μέτρηση anOD280 nm. Ίσες συγκεντρώσεις νεφρικού ιστού ή πρωτεΐνης ούρων φορτώθηκαν σε πηκτώματα βαθμίδωσης δωδεκυλοθειικού νατρίου 18 τοις εκατό και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση. Για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε χρώση αργύρου.
Μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά από σταθεροποίηση με 0,05 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη σε TBS, οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε γάλα 5 τοις εκατό χωρίς λιπαρά για 30 έως 60 λεπτά και επωάστηκαν σε αραίωση 1:1,000 πολυκλωνικού αντιορού κουνελιού HD5 όλη τη νύχτα . Μετά το πλύσιμο, το δευτερεύον αντίσωμα, ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση κουνελιού αντι-κουνελιού IgG αραιωμένο 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ΗΠΑ), εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ανοσοκηλίδες απόνεφρόΟι ιστοί διερευνήθηκαν επίσης με αντίσωμα αντι-GAPDH (Sigma Aldrich) για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερεύον αντίσωμα που περιγράφηκε παραπάνω. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης ECL και φιλμ χημειοφωταύγειας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BioExpress, Kaysville, UT, USA).
Το HD5 ποσοτικοποιήθηκε συγκρίνοντας τις προκύπτουσες εντάσεις ζώνης με μια σειριακή αραίωση ανασυνδυασμένης τυπικής πρωτεΐνης proHD5 (Peptides International, Louisville, KY, USA).ΝεφρόΟι συγκεντρώσεις HD5 τυποποιήθηκαν σε βάρος υγρού ιστού. Οι συγκεντρώσεις UrinaryHD 5 διαιρέθηκαν με την κρεατινίνη ούρων για να καθοριστούν οι τυποποιημένες αναλογίες HD5-προς κρεατινίνη ούρων (mg/mg) για να ληφθεί υπόψη η αραίωση των ούρων. Οι συγκεντρώσεις κρεατινίνης στα ούρα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μικροπλάκας κρεατινίνης της Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, ΗΠΑ).
Ανοσοϊστοχημεία
Μετά την αποπαραφίνη, την επανυδάτωση και την ανάκτηση αντιγόνου, πραγματοποιήθηκε αποκλεισμός βιοτίνης και πρωτεϊνικός αποκλεισμός χωρίς ορό (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, ΗΠΑ). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4uC με μονοκλωνικό αντίσωμα HD5(8C8) ποντικού (1:2{{1{{0}}0· Abcam) ή πολυκλωνικό αντιορό κουνελιού (1:500) ακολουθούμενο από νοθευμένο αντι-πολυσθενές βιοτινυλιωμένο αντίσωμα Στρεπταβιδίνη/HRP (ScyTek Laboratories). Οι τομές αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας 0,1 τοις εκατό τετραχλωριούχο διαμινοβενζιδίνη με 0,02 τοις εκατό υπεροξείδιο του υδρογόνου και αντιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Τομές αρνητικών μαρτύρων επωάστηκαν με μη άνοσο ορό στη θέση του αντισώματος HD5.
Ανοσοφθορισμός
Διεξήχθη διπλά επισημασμένος ανοσοφθορισμός για να βοηθήσει στον εντοπισμό της έκφρασης HD5 στονεφρό. Ο αγωγός συλλογής επισημάνθηκε διπλά για τα κύρια κύτταρα με πολυκλωνικό αντίσωμα κατσίκας κατά της ανθρώπινης ακουαπορίνης-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) [41]. Ο βρόχος του Henle επισημάνθηκε διπλά με πολυκλωνικό αντίσωμα κατά της ανθρώπινης ουρομοντουλίνης ποντικού (Sigma-Aldrich) και το εγγύς σωληνάριο επισημάνθηκε διπλά με πολυκλωνική ακουαπορίνη κατσίκας-1 (Santa Cruz) [41,42]. Ροδαμίνη πολυκλωνικό αντι-κατσίκα γαϊδουριού (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, Η.Π.Α.), ροδαμίνη κατσίκα αντι-ποντίκι (JacksonImmunoResearch Laboratories) και FITC γαϊδουράγκαθο πολυκλωνικό αντι-κουνέλι (Santa Cruz) χρησίμευσαν ως τα δευτερεύοντα αντισώματα.
Όλες οι ενότητες προετοιμάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Επωάστηκαν με ένα μείγμα αντιορών ποντικού κατά HD5 (1:200) (Abcam), AQP-2 (1:500), uromodulin (1:500), AQP-1 (1:400) στο δωμάτιο θερμοκρασία για 90 λεπτά. Το δευτερεύον αντίσωμα εφαρμόστηκε για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και οι τομές τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας μέσα στερέωσης με DAPI. Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε μη άνοσος ορός. Οι διαφάνειες εξετάστηκαν με μικροσκόπιο aLeica DM4000B και φωτογραφήθηκαν ψηφιακά χρησιμοποιώντας κάμερα/λογισμικό Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, ΗΠΑ).
ELISA
Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκε στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση ραπανάκι (Biolegend, San Diego CA, USA) για 30 λεπτά. Μετά από επώαση με διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ για 15 λεπτά (Kem-En-Tec Diagnostics), η αντίδραση τερματίστηκε με διάλυμα STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ) και διαβάστηκε σε μήκος κύματος 450 nm. Οι συγκεντρώσεις HD5 από τον προσδιορισμό ELISA διαιρέθηκαν με την κρεατινίνη ούρων για να καθοριστούν οι τυποποιημένες αναλογίες HD5-προς κρεατινίνη ούρων (mg/mg) για να ληφθεί υπόψη η αραίωση των ούρων όπως περιγράφεται παραπάνω.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Weichhart T, Haidinger M, Horl WH, Saemann MD (2008) Τρέχουσες έννοιες των μηχανισμών μοριακής άμυνας που λειτουργούν κατά τη διάρκεια της ουρολοίμωξης. Ευρωπαϊκό περιοδικό κλινικής έρευνας 38 Suppl 2: 29–38.
2. Zasloff M (2007) Αντιμικροβιακά πεπτίδια, έμφυτη ανοσία και φυσιολογικά αποστειρωμένο ουροποιητικό σύστημα. J Am Soc Nephrol 18: 2810–2816.
3. Lehrer RI, Lichtenstein ΑΚ, Ganz Τ (1993) Defensins: αντιμικροβιακά και κυτταροτοξικά πεπτίδια κυττάρων θηλαστικών. Annu Rev Immunol 11: 105-128.
4. Valore EV, Ganz Τ (1992) Posttranslational processing of defensins σε ανώριμα ανθρώπινα μυελοειδή κύτταρα. Blood 79: 1538–1544.
5. Liu L, Zhao C, Heng HH, Ganz T (1997) Η ανθρώπινη βήτα-ντεφενσίνη-1 και οι άλφα-ντεφενσίνες κωδικοποιούνται από γειτονικά γονίδια: δύο οικογένειες πεπτιδίων με διαφορετική τοπολογία δισουλφιδίου έχουν κοινή καταγωγή. Genomics 43: 316–320.
6. Valore EV, Park CH, Quayle AJ, Wiles KR, McCray PB, Jr., et al. (1998) Ανθρώπινη βήτα-ντεφενσίνη-1: ένα αντιμικροβιακό πεπτίδιο ουρογεννητικών ιστών. J Clin Invest 101: 1633–1642.
7. Schroeder ΒΟ, Wu Z, Nuding S, Groscurth S, Marcinowski Μ, et αϊ. (2011) Η μείωση των δισουλφιδικών δεσμών αποκαλύπτει την ισχυρή αντιμικροβιακή δραστηριότητα της ανθρώπινης βήτα-αμυνσινίνης 1. Nature 469: 419-423.
8. Lehmann J, Retz Μ, Harder J, Krams Μ, Kellner U, et αϊ. (2002) Έκφραση ανθρώπινων βήτα-αμυνσινών 1 και 2 σε νεφρούς με χρόνια βακτηριακή λοίμωξη. BMC Infect Dis 2: 20.
9. Bevins CL (2006) Paneth cell defensins: key effector molecules of intente immunity. Συναλλαγές Biochemical Society 34: 263–266.
10. Quayle AJ, Porter ΕΜ, Nussbaum AA, Wang YM, Brabec C, et al. (1998) Γονιδιακή έκφραση, ανοσοεντοπισμός και έκκριση ανθρώπινης άμυνας-5 στην ανθρώπινη γυναικεία αναπαραγωγική οδό. Am J Pathol 152: 1247–1258.
11. Porter Ε, Yang Η, Yavagal S, Preza GC, Murillo Ο, et αϊ. (2005) Διακεκριμένα προφίλ άμυνας σε Neisseria gonorrhoeae και Chlamydia trachomatis urethritis αποκαλύπτουν νέες αλληλεπιδράσεις επιθηλιακών κυττάρων-ουδετερόφιλων. Infect Immun 73: 4823-4833.
12. Com Ε, Bourgeon F, Evrard Β, Ganz Τ, Colleu D, et al. (2003) Έκφραση αντιμικροβιακών αμυνσινών στην αρσενική αναπαραγωγική οδό αρουραίων, ποντικών και ανθρώπων. Biology of reproduction 68: 95–104.
13. Porter ΕΜ, Poles MA, Lee JS, Naitoh J, Bevins CL, et αϊ. (1998) Isolation of human intestinal defensins from ileal neobladder urine. FEBS Letters 434: 272–276.
14. Townes CL, Ali A, Robson W, Pickard R, Hall J (2011) Η ανοχή της βακτηριουρίας μετά την εκτροπή των ούρων συνδέεται με την αντιμικροβιακή πεπτιδική δραστηριότητα. Urology 77: 509 e501-508.
15. Wang AP, Su YP, Wang S (2010) Αντιβακτηριακή δράση και μηχανισμός ανασυνδυασμένης ανθρώπινης άλφα defensin 5 έναντι κλινικών ανθεκτικών στα αντιβιοτικά στελεχών. Afr J Microbiol Res 4: 626-633.
16. Gropp R, Frye M, Wagner TO, Bargon J (1999) Οι επιθηλιακές άμυνες επηρεάζουν την αδενοϊική μόλυνση: επίπτωση για γονιδιακή θεραπεία με μεσολάβηση αδενοϊού. Ανθρώπινη γονιδιακή θεραπεία 10: 957-964.
17. Smith JG, Nemerow GR (2008) Mechanism of adenovirus neutralization by Human alpha-defensins. Κυτταρικός ξενιστής και μικρόβιο 3: 11–19.
18. Dugan AS, Maginnis MS, Jordan JA, Gasparovic ML, Manley Κ, et al. (2008) Οι ανθρώπινες άλφα-αμυνσίνες αναστέλλουν τη μόλυνση από τον ιό ΒΚ συσσωρεύοντας ιοσωμάτια και αποκλείοντας τη σύνδεση με τα κύτταρα ξενιστές. The Journal of biological chemistry 283: 31125–31132.
19. Zhang D, Liu ZH, Liao QP, Ma JM, Sun YF, et αϊ. (2009) Μελέτη τοπικής ανοσίας λοιμώξεων του κατώτερου γεννητικού συστήματος. Zhonghua fu chan ke za zhi 44: 13–15.
20. Quayle AJ (2002) Η έμφυτη και πρώιμη ανοσοαπόκριση στην πρόκληση παθογόνου στο γυναικείο γεννητικό σύστημα και ο κεντρικός ρόλος των επιθηλιακών κυττάρων. Journal of reproductive immunology 57: 61-79.