Πώς να προστατέψετε τα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα που επηρεάζονται από την απόπτωση που προκαλείται από τη γενταμικίνη;

Προστατευτικές επιδράσεις του Zhibai Dihuang Wan σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα που επηρεάζονται από απόπτωση που προκαλείται από γενταμυκίνη

Για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Λέξεις-κλειδιά: Οξύς νεφρόνόσος, Απόπτωση, Γενταμυκίνη,Σωληναριακό κύτταρο νεφρού, νεφρό.

Αφηρημένη

Εθνοφαρμακολογική συνάφεια: Το Zhibai Dihuang Wan (ZDW) είναι ένα αρχαίο παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο που αποτελείται από οκτώ φυτικά συστατικά και έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία χρόνιωννεφρόφλεγμονή και διαβήτη για χιλιάδες χρόνια. Ωστόσο, η επίδραση του ZDW στην οξείανεφρόο τραυματισμός είναι ακόμα άγνωστος. Σκοπεύαμε να προσδιορίσουμε την επίδραση του ZDW στην κυτταρική ανάπτυξη καιγενταμυκίνη-προκαλούμενη αποπτωτική βλάβη σενεφρικά σωληναριακά κύτταρα.

Υλικά και μέθοδοι: Εκχυλίσαμε το ZDW με τεχνητό εντερικό υγρό και υποβάλαμε αγωγή σε αρουραίονεφρικά σωληναριακά κύτταρα(NRK-52E) με διάφορες συγκεντρώσεις της εξαγωγής ZDW. Πολλαπλασιασμός κυττάρων καιγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσητων κυττάρων NRK-52Ε αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας παρακολούθηση πολλαπλασιασμού σε πραγματικό χρόνο και χρώση αννεξίνης V, αντίστοιχα. Το Western blotting χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης Bcl-2 και κασπάσης-3. Η επίδραση του ZDW σεγενταμυκίνη-προκλήθηκενεφρόΟ τραυματισμός παρακολουθήθηκε επίσης σε ποντίκια χρησιμοποιώντας την τελική δοκιμασία βιοτινυλιωμένης επισήμανσης άκρων UTP με τη μεσολάβηση της δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης (TUNEL) και τη μέτρηση της κρεατινίνης ορού και του αζώτου της ουρίας του αίματος.

Αποτελέσματα: Βρήκαμε ότι 30 μg/ml ZDW προώθησαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό του αρουραίουνεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Το ZDW εξέφρασε επίσης μια δοσοεξαρτώμενη προστατευτική δράση έναντιγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσηστα κύτταρα. Η προεπεξεργασία με 3 μ g/ml ή 30 μ g/ml ZDW αύξησε στο μέγιστο το Bcl-2 και μείωσε τη διάσπαση κασπάσης-3 στογενταμυκίνη-επεξεργασμένα κύτταρα NRK-52Ε. Μεταξύ των φυτικών συστατικών του ZDW, μόνο το Phellodendron amurense Rupr., ο φλοιός (Cortex Phellodendri) και το Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα ανέστειλαν και τα δύογενταμυκίνη-επαγόμενη μείωση του Bcl-2 και αύξηση της διασπασμένης κασπάσης-3. Το Phellodendron amurense Rupr., ο φλοιός και η Anemarrhena asphodeloides Bunge, το ρίζωμα επίσης ανέστειλεγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσησε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις· Ωστόσο, αυτά τα δύο συστατικά ήταν λιγότερο αποτελεσματικά από το ZDW. Στο μοντέλο του ποντικιού τουγενταμυκίνη-προκαλούμενη νεφροπάθεια, η θεραπεία ZDW μείωσε σημαντικά τα αποπτωτικά κύτταρα στον νεφρικό φλοιό και βελτίωσε τη νεφρική λειτουργία.

Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το ZDW σε επαρκείς δόσεις εξασθενείγενταμυκίνη-προκαλούμενη αποπτωτική βλάβη σενεφρικά σωληναριακά κύτταρακαι επίσης προστατεύεινεφράαπόγενταμυκίνη- προκληθείς τραυματισμός σε ποντίκια.

1. Εισαγωγή

Τα φυτικά φάρμακα έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών εδώ και πολλούς αιώνες, ειδικά στην κινεζική κοινωνία. Πρόσφατα, οι πιθανές παρενέργειες των βοτάνων στονεφρόέχουν αναφερθεί (Isnard Bagnis et al., 2004). Το 1991, νεφρολόγοι στο Βέλγιο ανέφεραν πολλές νεαρές γυναίκες που είχαν καταπιεί εκχυλίσματα κινεζικών βοτάνων που περιείχαν Aristolochia fang chi σε σχήματα διατροφής που παρουσίαζαν διαφορετικούς βαθμούς νεφρικής ανεπάρκειας (Vanherweghem et al., 1993). Η έκθεση στο φυτό Aristolochia που προστέθηκε ακούσια που περιέχει αριστολοχικό οξύ (AA) αποδείχθηκε ότι είναι η κύρια αιτία της νεφρικής βλάβης, της ατυπίας των ουροθηλιακών κυττάρων και του καρκινώματος (De Broe, 2012). Καθώς η παραδοσιακή κινεζική ιατρική εφαρμόζεται γενικά στην Ταϊβάν και την ηπειρωτική Κίνα, η νεφροπάθεια ΑΑ είναι διαδεδομένη σε αυτές τις περιοχές και αποτελεί πιθανό πρόβλημα δημόσιας υγείας (Grollman, 2013). Οι περισσότεροι νεφρολόγοι στην Ταϊβάν συνιστούν στους ασθενείς να αποφεύγουν την παραδοσιακή φυτική ιατρική. Ωστόσο, ορισμένα παραδοσιακά φυτικά φάρμακα έχουν δείξει πολλά υποσχόμενα για τη θεραπεία τουνεφρόασθένεια σε προκλινικές μελέτες ή κλινικές δοκιμές (Wojcikowski et al., 2006; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Ενώ η αποφυγή της χρήσης των φυτών Aristolochia σε φυτικά φάρμακα είναι απαραίτητη, τα φυτικά φάρμακα εξακολουθούν να είναι πιθανοί υποψήφιοι για τη θεραπεία ορισμένωννεφρόασθένειες.

Εφέ Cistanche για τα επινεφρίδια

Το Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), μια φόρμουλα με πολυβότανα, έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία χρόνιων χρόνωννεφρόφλεγμονή και διαβήτη για χιλιάδες χρόνια. Το ZDW παρασκευάζεται από Cornus officinalis Siebold & Zucc (13,8 τοις εκατό ), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο (Radix Rehmanniae preparata, 27,6 τοις εκατό ), Dioscorea oppositifolia L. (13,8 τοις εκατό ), Phellodensendron a. (Φλοιός Phellodendri, 6,9 τοις εκατό ), Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα (6,9 τοις εκατό ), Paeonia suffruticose Andrews, φλοιός ρίζας (Moutan Cortex, 10,3 τοις εκατό ), Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα (Rhizoma, 3 τοις εκατό, Alis) και Alisma10. (Schw.) Wolf (10,3 τοις εκατό ), και δεν περιέχει Aristolochia. Μεταξύ αυτών των συστατικών, είναι τα Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο, Phellodendron amurense Rupr., φλοιός και Poria cocos αναφέρεται ότι είναι ευεργετικά για τη διαβητική νεφροπάθεια ή τη χρόνια νεφρική βλάβη σε ζωικά μοντέλα (Yokozawa et al., 2004· Kim et al., 2008· Jiang et al., 2012· Zhao et al., 2013). Το ZDW χωρίς Anemarrhena asphodeloides Bunge και Phellodendron amurense Rupr., ο φλοιός είχε επίσης μερική προστατευτική επίδραση στην πρώιμη διαβητική νεφροπάθεια σε αρουραίους (He et al., 2007). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το ZDW έχει δυνητικά προστατευτικά αποτελέσματα έναντι νεφρικής βλάβης. Ωστόσο, η επίδραση του ZDW στην κυτταρική ανάπτυξη καιαπόπτωσητουνεφρικά σωληναριακά κύτταραείναι ακόμα ασαφές.

Γενταμυκίνηείναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιβιοτικό αμινογλυκοσίδης για τη θεραπεία gram-αρνητικών βακτηριακών λοιμώξεων, αλλά προκαλεί οξείεςνεφρότραυματισμό σε περίπου 30 τοις εκατό των ασθενών (Singh et al., 2012). Σε νεφρικά εγγύς σωληναριακά κύτταρα, επάγονταςαπόπτωσηείναι ένας βασικός κυτταροτοξικός μηχανισμός τηςγενταμυκίνη(Servais et al., 2006).Γενταμυκίνηπροκαλείαπόπτωσημέσω μιας διαμεσολαβούμενης από μιτοχόνδρια οδού σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης του Bcl-xL και της αύξησης της σχισμένης κασπάσης-3 και -9 (Ali, 2003; Juan et al., 2007). Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει ιδανική κλινική θεραπεία για την πρόληψηγενταμυκίνη-επαγόμενη οξείανεφρόβλάβη. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση του ZDW σεγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσησενεφρικά σωληναριακά κύτταραin vitro και in vivo. Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν την προστατευτική επίδραση του ZDW σεγενταμυκίνη-αντιμετωπίζεταινεφρικά σωληναριακά κύτταρακαι έδειξε περαιτέρω συνεισφορά των συστατικών του στην προστατευτική δράση του ZDW.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Αντιδραστήρια και παρασκευή ZDW

Το τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM), ο ορός εμβρύου μόσχου και τα αντιδραστήρια καλλιέργειας ιστών ελήφθησαν από την Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Όλες οι άλλες χημικές ουσίες βαθμού αντιδραστηρίου ελήφθησαν από τη Sigma Chemical Company (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Οι σκόνες του ZDW (αριθμός παρτίδας 051941) και τα συστατικά του (Cornus officinalis Siebold & Zucc, αρ. παρτίδας C810Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένη, παρτίδα αρ. C730N; Dioscorea oppositifolia L., αρ. παρτίδας C624N; Phellodendron amurense Rupr., φλοιός, αρ. παρτίδας C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα, αρ. παρτίδας C805N; Paeonia, Andreosk, roottic αρ. παρτίδας C813Y, Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα, αρ. παρτίδας C819N, Poria cocos (Schw.) Wolf, αρ. παρτίδας C827N) αγοράστηκαν από την SunTen Pharmaceutical Co. (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, 29 g 8-μείγματος βοτάνων (4 g Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 g Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο, 4 g Dioscorea oppositifolia L., 2 g Phellodendron amurense Rupr., φλοιός, 2 g Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα, 3 g Paeonia suffruticose Andrews, φλοιός ρίζας, 3 g Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα και 3 g Poria cocos (Schw.) ml σε 290 ml Wolf) ήταν αποσταγμένου νερού για 4 ώρες στους 100 1C, διηθήθηκε, λυοφιλίστηκε για να δώσει 7,5 g ξηρά εκχυλίσματα και στη συνέχεια αναμίχθηκε με 2,2 g αμύλου αραβοσίτου και 5,3 g κονιοποιημένης κυτταρίνης για να παραχθούν 15 g ZDW. Όλα τα βότανα επαληθεύτηκαν από έναν καθηγητή βοτανολογίας από το Brion Research Institute of Taiwan, ROC. Τα δείγματα κουπονιών κατατέθηκαν στο Herbarium of National Research Institute of Chinese Medicine, Taiwan, ROC (αριθμοί κουπονιού: Cornus officinalis Siebold & Zucc - NHP{{32} }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. - NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., φλοιός - NHP-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα - NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, φλοιός ρίζας- NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα - NHP-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf - NHP -00309). Τα φυτικά φάρμακα (0,1 g) χωνεύτηκαν με 1 ml τεχνητού εντερικού υγρού (1 τοις εκατό παγκρεατίνη, 50 mM διόξινο φωσφορικό κάλιο, pH 7,5) στους 37 1C για 2 ώρες, διηθήθηκαν στο 0.{58}} μ m φίλτρα και στη συνέχεια εφαρμόζονται σε πειράματα κυττάρων. Επιπλέον, μόνο τεχνητό εντερικό υγρό επωάστηκε επίσης στους 37 1C για 2 ώρες, διηθήθηκε μέσω φίλτρων 0.{22- μm και στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε ομάδες ελέγχου.

2.2. Ανάλυση δακτυλικών αποτυπωμάτων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC)

Η ποιότητα του ZDW μετρήθηκε με HPLC. Εν συντομία, {{0}}.1 g σκόνης ZDW διαλύθηκε σε δαιμονικό νερό σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, διηθήθηκε μέσω φίλτρων {{{0}}.22- μ m φίλτρων. , και στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε ανάλυση HPLC. Εκατό μ l του διαλύματος εφαρμόστηκαν σε στήλη 250 4,6 mm C18- (Grace. Columbia, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Waters HPLC εξοπλισμένο με 60{{18 }} ελεγκτής και έναν ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδου 996 (Waters, St. Massachusetts, ΗΠΑ). Το δείγμα στη συνέχεια εκλούστηκε με 0-95 τοις εκατό γραμμική βαθμίδα μεθανόλης σε δαιμονικό νερό, pH 7,0, για 60 λεπτά με ρυθμό ροής 0,8 ml/min. Τα διαλύματα έκλουσης ανιχνεύθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν στα 254 nm από 0 λεπτά έως 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε 10 φορές και τα αποτελέσματα είναι συνεπή.

2.3. Κυτταρικής καλλιέργειας

Αγοράσαμε εγγύς σωληναριακά νεφρικά κύτταρα αρουραίου (NRK-52E) από το Κέντρο συλλογής και έρευνας Bioresource (Hsinchu, Ταϊβάν). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με αντιβιοτικό/αντιμυκητιακό διάλυμα και 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό. Αναπτύχθηκαν έως ότου η μονοστιβάδα έγινε συρρέουσα. Τα καλλιεργημένα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν στο μέσο χωρίς ορό όλη τη νύχτα πριν από το πείραμα. Εκχυλίσματα ZDW από τεχνητό εντερικό υγρό προστέθηκαν σε λιμοκτονικά κύτταρα σε ενδεικνυόμενη συγκέντρωση και επωάστηκε τεχνητό εντερικό υγρό ως θεραπεία ελέγχου. Μετά από επώαση 24 ωρών, συλλέχθηκαν δείγματα κυττάρων και εφαρμόστηκαναπόπτωσηανάλυση και ανάλυση Western blotting.

2.4. Παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Για την παρακολούθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα "xCELLigence" της Roche Applied Sciences (Ιντιανάπολη, ΙΝ, ΗΠΑ). Τα κύτταρα NRK-52Ε σπάρθηκαν εις διπλούν σε πλάκες Ε σε πυκνότητα 10000 κυττάρων/φρεάτιο. Έπειτα, οι πλάκες E μεταφέρθηκαν στο όργανο xCELLi-glance RTCA DP για αυτοματοποιημένη παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO 2 στους 37 1C. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στις πλάκες Ε παρέμειναν από την πείνα όλη τη νύχτα. Για τον προσδιορισμό πολλαπλασιασμού, εκχυλίσματα ZDW προστέθηκαν στα κύτταρα για 30 λεπτά και στη συνέχεια 3 mmol/lγενταμυκίνηπροστέθηκε στα κύτταρα. Ο δείκτης κυψέλης, μια αυθαίρετη μονάδα που αντανακλά την αντίσταση κυψέλης-αισθητήρα, μετρούνταν κάθε 15 λεπτά. Ο υπολογισμός της κλίσης πραγματοποιήθηκε με την έκδοση λογισμικού RTCA 1.2 (Roche Applied Sciences). Πραγματοποιήθηκαν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

2.5. Ανίχνευση απόπτωσης

Η διπλή χρώση ισοθειοκυανικής φλουορεσκεΐνης (FITC)-αννεξίνης V/ιωδιούχου προπιδίου (PI) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευσηαπόπτωσηπροκαλούμενο απόγενταμυκίνηθεραπευτική αγωγή. Τα επεξεργασμένα κύτταρα NRK-52Ε συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Η ειδική δέσμευση της FITC-αννεξίνης V και η χρώση με ΡΙ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένααπόπτωσηκιτ ανίχνευσης (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

2.6. Ανάλυση Western blot

Είκοσι μικρογραμμάρια λύματος πρωτεΐνης NRK-52Ε εφαρμόστηκαν σε κάθε λωρίδα της ταινίας στύπωσης και αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Αντισώματα για Bcl-2 και κασπάση-3 αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ΗΠΑ) και αραιώθηκαν 1:1000 για την ανάλυση. Η γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα σχετικά επίπεδα των ζωνών πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Quantiscan (Biosoft, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο).

2.7. Ζώα και θεραπείες

Αρσενικά ποντίκια BALB/c ηλικίας 8 εβδομάδων και βάρους 20–25 g ελήφθησαν από την BioLasco Taiwan (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Πειραματικών Ζώων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Ταϊπέι. Τα ζώα στεγάστηκαν σε μια κεντρική εγκατάσταση, υποβλήθηκαν σε κύκλο φωτός-σκότους 12-ωρών και εφοδιάστηκαν με κανονική τροφή για αρουραίους και νερό βρύσης. Η πειραματική ομάδα ποντικών (n¼6) γιαγενταμυκίνηθεραπεία υποβλήθηκαν σε ενδοπεριτοναϊκή (IP) ένεση μεγενταμυκίνη(20 mg/kg/ημέρα) για 10 ημέρες. Η σκόνη ZDW (1 ή 2 g/kg) διαλύθηκε σε φυσιολογικό ορό και χορηγήθηκε από το στόμα πρινγενταμυκίνηένεση κάθε φορά. Τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου (n¼6) έλαβαν ορό από το στόμα και ενδοπεριτοναϊκά. Όλα τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πεντοβαρβιτάλη 30-50 mg/kg σωματικού βάρους ενδοπεριτοναϊκά (Sigma, St. Louis, MO) 1 ημέρα μετά την τελευταία τους ένεση. Στη συνέχεια, τα ζώα θυσιάστηκαν ενώ ήταν ακόμη υπό την επίδραση της αναισθησίας και συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από την καρδιά για τη μέτρηση της κρεατινίνης ορού και του αζώτου της ουρίας του αίματος. ονεφράσυλλέχθηκαν με λαπαροτομία και ο ιστός του νεφρικού φλοιού καταψύχθηκε γρήγορα σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκε στο-80C.

2.8. In situ τελικός προσδιορισμός βιοτινυλιωμένου UTP nick end labeling (TUNEL) με τη μεσολάβηση της δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης

Κατεψυγμένα τμήματα ιστού (4 μ m) τουνεφρόυποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη φλουορεσκεΐνη ApopTag in situαπόπτωσηκιτ ανίχνευσης (CHEMICON International, Inc., CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν ολίγοις,νεφρόΤα πλακίδια ιστού υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ και Η₂O₂και επωάστηκε με το μίγμα αντίδρασης που περιέχει τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράση (TdT) και συζευγμένο με διγοξιγενίνη dUTP για 1 ώρα στους 37 1C, τοποθετήθηκε με ένα διάλυμα στερέωσης που περιέχει PI και τελικά παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού.

2.9. Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι7 τυπικές αποκλίσεις (SD). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση δοκιμών Student t-test, όπου το P 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό.

3. Αποτελέσματα

3.1. Επίδραση του ZDW στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Για τον ποιοτικό έλεγχο του ZDW, χρησιμοποιήσαμε HPLC για να δημιουργήσουμε το χρωματογράφημα δακτυλικών αποτυπωμάτων όπως φαίνεται στην Εικ. 1. Αρχικά ερευνήσαμε την επίδραση των εκχυλισμάτων ZDW στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NRK-52Ε. Για να μιμηθεί το γαστρεντερικό περιβάλλον, το ZDW χωνεύτηκε και εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας τεχνητό εντερικό υγρό και στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε πειράματα κυττάρων.

Στην παρακολούθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε πραγματικό χρόνο, τόσο οι καμπύλες πολλαπλασιασμού όσο και οι κλίσεις έδειξαν ότι τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 μg/ml ZDW είχαν υψηλότερους ρυθμούς πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με τεχνητό εντερικό υγρό (Εικ. 2Α και Β). Αντίθετα, 300 μg/ml ZDW μείωσαν σημαντικά τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού. Η δόση των 30 μ g/ml ZDW περιέχει 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., φλοιός, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, φλοιός ρίζας, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα και 4 μ g/ml Poria cocos (Schw.) Λύκος. Ωστόσο, αυτές οι δόσεις των συστατικών μείωσαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NRK{15}}αντ' αυτού (Εικ. 2C).Γενταμυκίνηανέστειλε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη και ακόμη και μείωσε τον δείκτη αριθμού κυττάρων, ο οποίος επανήλθε εν μέρει με την επεξεργασία κατά 3 ή 30 μg/ml ZDW όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α. Υψηλές δόσεις ZDW (300 μg/ml) αύξησαν περαιτέρω την ανασταλτική δράση τουγενταμυκίνηστην πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η χαμηλή δόση ZDW (3–30 g/ml) προάγει τον πολλαπλασιασμό των NRK-52Ε κυττάρων, ακόμη και παρουσίαγενταμυκίνηθεραπευτική αγωγή.

3.2. Επίδραση του ZDW στην απόπτωση

Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την επίδραση των εκχυλισμάτων ZDW στογενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσησε κύτταρα NRK{0}}Ε με χρώση αννεξίνης V/PI και κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, τα εκχυλίσματα ZDW από 0,3 έως 300 μg/ml δεν προκάλεσαν σημαντικήαπόπτωσησε κελιά NRK-52Ε. Έκθεση σε 3 mmol/l τουγενταμυκίνηαξιοσημείωτα αυξημένα αποπτωτικά κύτταρα. Η προεπεξεργασία των κυττάρων με ZDW μειώθηκε σημαντικάγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσημε δοσοεξαρτώμενο τρόπο και το ανασταλτικό αποτέλεσμα κορυφώθηκε στα 30 μg/ml και μειώθηκε στα 300 μg/ml ZDW (Εικ. 3).

Το ZDW εξάγει προστατευμένα κύτταρα NRK-52Ε απόγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωση. Για να επιβεβαιώσουμε αυτό το αποτέλεσμα, παρακολουθήσαμε επίσης την επίδραση του ZDW στην αποπτωτική οδό σηματοδότησης που προκαλείται απόγενταμυκίνη. Σε φυσιολογικά κύτταρα NRK{{0}}Ε, οι συγκεντρώσεις ZDW από 0,3 έως 300 μg/ml δεν επηρέασαν σημαντικά την έκφραση του Bcl-2 και τη διάσπαση της κασπάσης-3 (Εικ. . 4).ΓενταμυκίνηΗ θεραπεία μείωσε σημαντικά την έκφραση του Bcl-2 και προκάλεσε διάσπαση της κασπάσης-3 στα κύτταρα NRK-52Ε. Η προεπεξεργασία των κυττάρων με ZDW βελτίωσε την έκφραση του Bcl-2 στογενταμυκίνη-επεξεργασμένα κύτταρα και μειωμένα σημαντικάγενταμυκίνη-επαγόμενη διάσπαση κασπάσης-3 (Εικ. 4).

3.3. Επίδραση των συστατικών του ZDW στην απόπτωση

Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η πιο αποτελεσματική συγκέντρωση του ZDW ήταν κοντά στα 30 μg/ml. Θεωρητικά, 30 μ g/ml ZDW περιέχει 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., φλοιός, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, φλοιός ρίζας, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα και 3 μ g/ml κόκος Poria. Ωστόσο, τα εκχυλίσματα αυτών των συστατικών στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις δεν επηρέασαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NRK-52Ε όπως αποκαλύπτεται από την παρακολούθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε πραγματικό χρόνο (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Παρακολουθήσαμε περαιτέρω τα συστατικά του ZDW ξεχωριστά για τις επιδράσεις τους στην έκφραση του Bcl-2 και στη διάσπαση της κασπάσης-3γενταμυκίνη-επεξεργασμένα κύτταρα NRK-52Ε. Το Σχ. 5 δείχνει ότι το Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., ρίζα, ψημένο, Dioscorea απέναντι, Paeonia suffruticose Andrews, φλοιός ρίζας, Alisma Plantago-Aquatica L., ρίζωμα και Poria cocos δεν επηρέασαν την έκφραση του Bcl{{4} και κασπάση-3 διάσπαση σεγενταμυκίνη-επεξεργασμένα κύτταρα. Μόνο 0.2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., bark and Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα στα 4 και 60 μ g/ml ανέστειλαν και τα δύογενταμυκίνη-επαγόμενη μείωση του Bcl-2 και αύξηση της διάσπασης της κασπάσης-3 ταυτόχρονα (Εικ. 5).

Παρόμοια με τα αποτελέσματα Western blotting, η χρώση με αννεξίνη V/PI αποκάλυψε ότι το Phellodendron amurense Rupr., ο φλοιός σε 0,2 μg/ml και το Anemarrhena asphodeloides Bunge, το ρίζωμα στα 4 και 60 μg/ml ανέστειλαν σημαντικάγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωση(Εικ. 6). Τα άλλα φυτικά συστατικά δεν είχαν αντιαποπτωτική δράσηγενταμυκίνη-επεξεργασμένα NRK-52Ε κύτταρα όπως αποκαλύπτεται από την κυτταρομετρία ροής (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Το ZDW περιέχει 6,9 τοις εκατό Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα. Η δόση των 60 μg/ml του Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma ήταν πολύ μεγαλύτερη από την ποσότητα που περιείχε τα 300 μg/ml ZDW, η οποία ήταν η υψηλότερη δόση που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Η δόση φλοιού Phellodendron amurense Rupr. 0,2 μg/ml ήταν παρόμοια με την ποσότητα του φλοιού Phellodendron amurense Rupr. που περιέχεται σε 3 μg/ml ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, δοσολογία ριζώματος 4 μg/ml ήταν κοντά στην ποσότητα του Anemarrhena asphodeloides Bunge, ρίζωμα που περιέχεται σε 30 μg/ml ZDW. Οι συγκεντρώσεις ZDW τόσο των 3 όσο και των 30 μg/ml είχαν σημαντικές αντι-αποπτωτικές επιδράσεις (Εικ. 2), οι οποίες μπορεί να προκύψουν εν μέρει από το Phellodendron amurense Rupr., τον φλοιό και το Anemarrhena asphodeloides Bunge, το ρίζωμα.

3.4. Προστατευτική δράση του ZDW στα νεφρά

Η προστατευτική επίδραση του ZDW σεγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσηαποδείχθηκε περαιτέρω σε μοντέλο ζώου ποντικού. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία μεγενταμυκίνη(20 mg/kg/ημέρα) ή φυσιολογικό ορό ως μάρτυρες. Οι πειραματικές ομάδες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZDW (1 ή 2 g/kg/ημέρα) επιπλέον. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας (9 ημέρες), ηνεφράσυλλέχθηκαν με λαπαροτομία και τεμαχίστηκαν για in situ προσδιορισμούς TUNEL. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7, οι πυρήνες στονεφρόοι τομές αποκαλύφθηκαν ως φωτεινές κηλίδες βαμμένες με PI. Οι διάσπαρτοι και φωτεινοί πυρήνες που χρωματίστηκαν από το TUNEL μπορούσαν να ανιχνευθούν σε ολόκληρο τον νεφρικό φλοιό σεγενταμυκίνη-ζώα που έλαβαν θεραπεία, ωστόσο σπάνια ανιχνεύθηκαν στα δείγματα ελέγχου. Η θεραπεία ZDW μειώθηκεγενταμυκίνη-επαγόμενοι αποπτωτικοί πυρήνες με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Οι περισσότεροι από τους σημασμένους με TUNEL πυρήνες φάνηκαν στο εγγύς επιθήλιο του σωληναρίου. Το ZDW ανέστειλε την in vivoγενταμυκίνη-επαγόμενο κύτταροαπόπτωσησε αρουραίονεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Η νεφρική λειτουργία των πειραματικών ποντικών παρακολουθήθηκε επίσης με μέτρηση της συγκέντρωσης αζώτου ουρίας αίματος και κρεατινίνης ορού.

Το σχήμα 8 δείχνει ότι οι συγκεντρώσεις αζώτου ουρίας αίματος και κρεατινίνης ορού ήταν αυξημένες στογενταμυκίνη-Ομάδες που έλαβαν θεραπεία και η θεραπεία ZDW τις ανέστειλε σημαντικάγενταμυκίνη-προκαλούμενες αυξήσεις. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το ZDW εκφράζει νεφρική προστατευτική δράση in vivo.

4. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρωθήκαμε στην επίδραση του ZDW σεγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσησε αρουραίους εγγύςνεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Τα κύρια ευρήματα έδειξαν ότι το ZDW (3 και 30 μg/ml) μειώθηκεγενταμυκίνη-επαγόμενη αποπτωτική βλάβη σε κύτταρα NRK-52Ε (Εικ. 3). Η προεπεξεργασία του ZDW επίσης ανέστειλεγενταμυκίνη-επαγόμενα αποπτωτικά σήματα, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης του Bcl-2 και της αύξησης της διάσπασης της κασπάσης-3 (Εικ. 4). Σε ένα μοντέλο ποντικιού τουγενταμυκίνητοξικότητας, η θεραπεία ZDW μείωσε σημαντικά τα αποπτωτικά κύτταρα στον νεφρικό φλοιό και βελτίωσε τη νεφρική λειτουργία (Εικ. 7 και 8). Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το ZDW προστατεύεινεφρικά σωληναριακά κύτταρααπόγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωση. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι 30 μg/ml ZDW προώθησαν τον πολλαπλασιασμό των NRK- 52Ε κυττάρων (Εικ. 2), που θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάκτηση των νεφρικών σωληναρίων απόοξύςνεφρόνόσος. Ωστόσο, η υψηλή δόση ZDW (300 μg/ml) μείωσε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και η αντιαποπτωτική του δράση επίσης μειώθηκε (Εικ. 2 και 3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ZDW σε υψηλές δόσεις είναι κυτταροτοξικό γιανεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Επομένως, προτείνουμε η χορήγηση ZDW σε επαρκείς δόσεις θα ήταν ευεργετική για ασθενείς μεγενταμυκίνη-προκλήθηκενεφρόβλάβη.

Τα φυτικά φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα κυττάρων αφομοιώθηκαν και εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας τεχνητό εντερικό υγρό που περιέχει παγκρεατίνη. Η παγκρεατίνη αποτελείται από αμυλάση, λιπάση και πρωτεάση. Κατ' αρχήν, τα βιοπροσβάσιμα μόρια στα φυτικά φάρμακα μπορούν να ληφθούν χρησιμοποιώντας μια εργαστηριακή εκχύλιση που μιμείται το γαστρεντερικό περιβάλλον σε λεπτομέρειες όπως υπάρχουν χημικά και ένζυμα, θερμοκρασία, χρόνοι έκθεσης και pH. Στο σύστημά μας,νεφρικά σωληναριακά κύτταραείχαν την ευκαιρία να αλληλεπιδράσουν με τα βιοπροσβάσιμα μόρια στα φυτικά φάρμακα, αλλά όχι με τις πρώτες ύλες. Τα αποτελεσματικά βιοπροσβάσιμα μόρια του ZDW στο σύστημά μας είναι ακόμα άγνωστα. Ανίχνευση απορρόφησης ZDW σενεφρικά σωληναριακά κύτταραείναι δύσκολο μέχρι στιγμής γιατί δεν υπάρχει κατάλληλος στόχος για παρακολούθηση. Ωστόσο, τα εκχυλίσματα τεχνητού εντέρου του ZDW άσκησαν μια δοσοεξαρτώμενη επίδραση σε κυτταρικά πειράματα. Αυτά τα πειράματα υποδηλώνουν ότι τα εκχυλίσματα τεχνητού εντέρου του ZDW περιέχουν αποτελεσματικά βιοπροσβάσιμα μόρια που δρουν στα νεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, το ZDW από το στόμα εξέφρασε επίσης δοσοεξαρτώμενη νεφρική προστατευτική δράση σεγενταμυκίνη-ποντίκια που έλαβαν θεραπεία (Εικ. 7 και 8). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα αποτελεσματικά μόρια των εκχυλισμάτων τεχνητού εντέρου του ZDW μπορεί επίσης να υπάρχουν στονεφράποντικών που έλαβαν θεραπεία με ZDW. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν φαρμακολογική συνέπεια μεταξύ των κυτταρικών μελετών με εκχυλίσματα τεχνητού εντέρου φυτικών φαρμάκων και των μελετών σε ζώα με από του στόματος φυτικά φάρμακα. Η εφαρμογή τεχνητών εντερικών υγρών σε κυτταρικές μελέτες είναι διαθέσιμη πρόσφατα. Στα κύτταρα Caco-2 χρησιμοποιήθηκαν τεχνητά εντερικά υγρά για τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών κυτταρικής πρόσληψης του L-valyl-ara-C (Cheon et al., 2006). Η από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα των ρύπων του εδάφους μετρήθηκε in vitro χρησιμοποιώντας τεχνητά εντερικά υγρά (Ellickson et al., 2001). Η βιοπροσβασιμότητα του αρσενικού σε διάφορους τύπους ρυζιού μελετήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα in vitro σύστημα γαστρεντερικού υγρού (He et al., 2012). Η τεχνητή γαστρεντερική εκχύλιση έδωσε αποτελέσματα σε λογική συμφωνία με τις κλινικές μετρήσεις της βιοδιαθεσιμότητας αρσενικού που μετρήθηκαν με ανάλυση ούρων σε ενήλικες ανθρώπους μετά την κατάποση παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής που περιέχει αρσενικό (Koch et al., 2007). Επιπλέον, η παγκρεατίνη στο τεχνητό εντερικό υγρό θα αφομοιωθεί και θα χάσει την ενζυματική της δραστηριότητα κατά τη διάρκεια της επώασης 37 1C. Η συγκέντρωση της παγκρεατίνης σε πειράματα κυττάρων ήταν επίσης πολύ χαμηλή (0.3 30 ppm). Η επίδραση της παγκρεατίνης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό καιαπόπτωσηείναι πολύ περιορισμένη. Προτείνουμε ότι η εξαγωγή τεχνητού εντερικού υγρού είναι μια από τις ιδανικές μεθόδους εκχύλισης για παραδοσιακά φυτικά φάρμακα σε πειράματα κυτταροκαλλιέργειας.

Μεταξύ των φυτικών συστατικών του ZDW, μόνο το Phellodendron amurense Rupr., ο φλοιός και το Anemarrhena asphodeloides Bunge, το ρίζωμα αναστέλλουνγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσησε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις (Εικ. 5 και 6). Phellodendron amurense Rupr., bark and Anemarrhena asphodeloides Bunge, το ρίζωμα θα πρέπει να παίζει ρόλο στην προστατευτική δράση του ZDW στα NRK-52Ε κύτταρα. Ο φλοιός Phellodendron amurense Rupr., περιέχει μια σειρά από αλκαλοειδή όπως η βερβερίνη, η παλματίνη και η γιατρορρριζίνη. Phellodendron amurense Rupr., ο φλοιός είναι ένας γνωστός αντιφλεγμονώδης παράγοντας (Mori et al., 1995; Uchiyama et al., 1989) και μειώνει το οξειδωτικό στρες στονεφράδιαβητικών αρουραίων (Kim et al., 2008). Το Anemarrhena asphodeloides Bunge χρησιμοποιείται ευρέως στα κινέζικα παραδοσιακά φάρμακα. Τα ριζώματα του Anemarrhena asphodeloides Bunge έχουν αντιδιαβητική, αντιαιμοπεταλιακή συσσώρευση και διουρητική δράση (Takahashi et al., 1985). Οι τιμοσαπωνίνες που απομονώνονται από τα ριζώματα του Anemarrhena asphodeloides Bunge καταστέλλουν τη συσσώρευση αιμοπεταλίων και τη δημιουργία υπεροξειδίου που προκαλείται από ΑΑ σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα (Zhang et al., 1999a, 1999b). Το Anemarrhena asphodeloides Bunge παίζει επίσης έναν κρίσιμο προστατευτικό ρόλο σε εγκεφαλική βλάβη που προκαλείται από ισχαιμία (Oh et al., 2007). Σε αντίθεση με το ZDW, το Phellodendron amurense Rupr., τον φλοιό και το Anemarrhena asphodeloides Bunge, το ρίζωμα εξέφρασε αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα σε περιορισμένο εύρος συγκεντρώσεων (Εικ. 3 και 6). Επιπλέον, 30 μg/ml ZDW προώθησαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αλλά όλα τα συστατικά σε 30 μg/ml ZDW μείωσαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό αντί αυτού (Εικ. 2C). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η δράση προαγωγής του πολλαπλασιασμού του ZDW μπορεί να μην προκύπτει από τα συστατικά του μεμονωμένα. Η προστατευτική δράση του ZDW θα μπορούσε να προκύψει, τουλάχιστον εν μέρει, από συνεργικές επιδράσεις που προκαλούνται από τα συστατικά ή από τη δημιουργία τροποποιημένων μορίων που σχηματίζονται στις διαδικασίες φαρμακευτικής σύνθεσης του ZDW. Παραδοσιακά, πολλοί Κινέζοι ιατροί πιστεύουν ότι μια φόρμουλα με πολυβότανα είναι συνήθως πιο αποτελεσματική από ένα μεμονωμένο φυτικό φάρμακο, κάτι που υποστηρίζεται από τα αποτελέσματά μας.

Σε αυτή τη μελέτη, τογενταμυκίνηΗ συγκέντρωση που εφαρμόστηκε στα πειράματα κυτταροκαλλιέργειας ήταν παρόμοια με προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες (Juan et al., 2007).Γενταμυκίνησυγκεντρώσεις 1-3 mmol/l προκλήθηκαν αποτελεσματικάαπόπτωσησενεφρικά σωληναριακά κύτταρακαι αυτό το εύρος συγκέντρωσης είναι κοντά στο in vivoνεφρόεπίπεδα που βρέθηκαν κατά τη διάρκειαγενταμυκίνηαντιμικροβιακές θεραπείες σε ποντίκια και αρουραίους (El Mouedden et al., 2000a, 2000b· Sandoval and Molitoris, 2004· Servais et al., 2005). Με άλλα λόγια, τογενταμυκίνηΟι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη in vitro ήταν παρόμοιες με τις συγκεντρώσεις που βρέθηκαν σε ποντίκιανεφράin vivo κατά τη διάρκειαγενταμυκίνηθεραπευτική αγωγή. Στο πείραμά μας με το ποντίκι,γενταμυκίνηχορηγήθηκε στα 20 mg/kg ενδοπεριτοναϊκά μία φορά την ημέρα καιγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσηπαρατηρήθηκε στο ποντίκινεφρά(Εικ. 7). Αυτή η δόση προτείνεται ως ίσες δόσεις συντήρησης για έναν ενήλικα ασθενή με εκτιμώμενη κάθαρση κρεατινίνης 90 ml/min (El Mouedden et al., 2000a). Επιπλέον, η προστατευτική δόση του ZDW ήταν 1 έως 2 g/kg/ημέρα σε αυτή τη μελέτη. Ένα ποντίκι είναι 7 έως 8 φορές λιγότερο αποτελεσματικό μεταβολικά από έναν άνθρωπο. Λαμβάνοντας υπόψη τη διαφορά μεταξύ των μεταβολικών ρυθμών ποντικών και ανθρώπων, η δοσολογία ZDW σε μελέτες σε ζώα είναι κοντά στην παραδοσιακή εφαρμογή του ZDW σε ανθρώπους. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν τη βάση για μελλοντικές έρευνες σε ανθρώπους.

Η εξαρτώμενη από κασπάση αποπτωτική σηματοδότηση παίζει βασικό ρόλο σεγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωση. Στη μιτοχονδριακή οδό, η κασπάση-3 είναι μια κασπάση εκτελεστής που μπορεί να διασπαστεί σε ενεργή από την κασπάση-9 που ενεργοποιείται από την προκασπάση-9 από το κυτοσολικό κυτόχρωμα c (Padanilam, 2003; Jiang and Wang , 2004). Η μιτοχονδριακή απελευθέρωση του κυτοχρώματος c ρυθμίζεται από τις πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 που συνδέονται με την εξωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου και εμποδίζουν την εκροή του κυτοχρώματος c (Yang et al., 1997). Στη μελέτη μας,

γενταμυκίνηαύξησε τη διάσπαση της κασπάσης-3 και μείωσε την έκφραση Bcl-2 στα κύτταρα NRK-52Ε. Αυτά τα προκαλούμενα από μιτοχόνδρια αποπτωτικά φαινόμενα αντιστράφηκαν με θεραπεία ZDW. Με βάση τα ευρήματα αυτής της μελέτης, προτείναμε ότι το ZDW προστατεύεινεφρικά σωληναριακά κύτταρααπόγενταμυκίνη-προκαλούμενη αποπτωτική βλάβη μέσω αναστολής της μιτοχονδριακής οδού.

5. Συμπεράσματα

Συνοπτικά, το ZDW σε επαρκείς δόσεις προώθησε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ανέστειλεγενταμυκίνη-προκλήθηκεαπόπτωσησε αρουραίονεφρικά σωληναριακά κύτταρα. Το ZDW μειώνει επίσηςγενταμυκίνη-προκαλούμενη νεφρική τοξικότητα in vivo. Το ZDW θα μπορούσε να έχει θεραπευτικές δυνατότητες για ασθενείς μεγενταμυκίνη-προκλήθηκενεφρόβλάβη.

Ευχαριστίες

Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Bureau of Health Promotion, Department of Health, ROC (DOH98-HP-1106).