Πώς ο πολυσακχαρίτης Cistanche Deserticola επηρεάζει την απορρόφηση των οστών;

Επικοινωνία: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ο πολυσακχαρίτης Cistanche deserticola εξασθενεί την οστεοκλαστογένεση και την οστική απορρόφηση μέσω της αναστολής της σηματοδότησης RANKL και της παραγωγής αντιδραστικών ειδών οξυγόνου

Dezhi Song et al

Η οστεοπόρωση είναι μια μεταβολική νόσος που χαρακτηρίζεται από οστεοπενία και οστική μικροδομική επιδείνωση. Οι οστεοκλάστες είναι τα κύρια τελεστικά κύτταρα που αποικοδομούν την οστική μήτρα και η ανώμαλη λειτουργία τους οδηγεί στην ανάπτυξη οστεοπόρωσης. Η συσσώρευση αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) κατά τη διάρκεια του κυτταρικού μεταβολισμού προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών, επομένως, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην οστεοπόρωση.Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης(CDP) διαθέτει αντιόγκο,αντιφλεγμονώδηκαι αντιοξειδωτική δράση. Ωστόσο, η επίδραση των οστεοκλαστών CDPon είναι ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν χρώση ανθεκτικής στην τρυγική όξινη φωσφατάση, ανοσοφθορισμός, αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης και ανάλυση westernblot για να αποδειχθεί ότι η CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ανέστειλε την οστεοκλαστογένεση και την απορρόφηση του υδροξυαπατίτη. Επιπλέον, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ανέστειλε επίσης την έκφραση των γονιδίων δεικτών οστεοκλάστη συμπεριλαμβανομένων των Ctsk, Mmp9 και Acp5 και δεν είχε καμία επίδραση στον ενεργοποιητή υποδοχέα της έκφρασης του πυρηνικού παράγοντα κΒ (RANK). Οι μηχανιστικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)αυξάνει την έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων για την εξασθένιση της παραγωγής ROS με τη μεσολάβηση του RANKL στους οστεοκλάστες και αναστέλλει τον πυρηνικό παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων και την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται από μιτογόνο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CDP μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα υποψήφιο φάρμακο για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης που προκαλείται από υπερβολική δραστηριότητα οστεοκλαστών.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑοστική απορρόφηση,Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης, MAPK, οστεοκλάστες, δραστικά είδη οξυγόνου

1|ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η ισορροπία μεταξύ του σχηματισμού οστού, με τη μεσολάβηση των οστεοβλαστών, και της οστικής απορρόφησης, με τη μεσολάβηση των οστεοκλαστών, παίζει ζωτικό ρόλο στη διατήρηση της μεταβολικής ομοιόστασης των οστών (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). Όταν η οστική απορρόφηση υπερβαίνει τον σχηματισμό οστού, εμφανίζεται οστεοπόρωση, η οποία χαρακτηρίζεται από μειωμένη οστική μάζα και οστική μικροδομική βλάβη (Ikeda, 2008). Η οστεοπόρωση είναι μια κοινή ασθένεια σε ηλικιωμένα άτομα και σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες και η παθογένειά της δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως (Cooper & Melton, 1992). Η ανεπάρκεια οιστρογόνων είναι η κύρια αιτία της οστεοπόρωσης (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Επιπλέον, τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μπορούν να προκληθούν από τον ενεργοποιητή υποδοχέα του συνδέτη πυρηνικού παράγοντακΒ (RANKL) και σχετίζονται με το σχηματισμό οστεοκλαστών (Yip et al., 2005) και έτσι μπορεί να συμβάλλουν στην ανάπτυξη οστεοπόρωσης (Manolagas, 2010). Ορισμένες μελέτες έχουν βρει ότι η ανεπάρκεια Nrf2-αντιοξειδωτικών αυξάνει τα επίπεδα ROS και προάγει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών που προκαλείται από το RANKL (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013). Επομένως, η μείωση της παραγωγής ROS κατά τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών θα πρέπει να αξιολογηθεί ως θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης.

Οι οστεοκλάστες προέρχονται από τη γραμμή των μονοκυττάρων ή των μακροφαγοαιματοποιητικών κυττάρων και είναι τα μόνα πολυπύρηνα κύτταρα που εκτελούν οστική απορρόφηση (Teitelbaum, 2000). Ως εκ τούτου, η έρευνα που αφορά το σχηματισμό οστεοκλαστών έχει μεγάλη σημασία για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών για ασθένειες του μεταβολισμού των οστών (Lorenzo, 2017). Ο παράγοντας διέγερσης αποικιών μακροφάγων (M‐CSF) και ο RANKL, που παράγονται από οστεοβλάστες και ενεργοποιημένα Τ κύτταρα, είναι σημαντικές κυτοκίνες που ρυθμίζουν την οστεοκλαστογένεση (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). Το RANKL επάγει την έκφραση του πυρηνικού παράγοντα των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων (NFATc1), ο οποίος είναι ένας κρίσιμος μεταγραφικός παράγοντας ενεργός κατά τον σχηματισμό οστεοκλαστών (Ishidaet al., 2002). Το ενεργοποιημένο NFATc1 προάγει την έκφραση γονιδίων δεικτών οστεοκλαστών, όπως η ανθεκτική στην τρυγική όξινη φωσφατάση (TRAcP) και η καθεψίνη K (CTSK) που ρυθμίζουν την οστεοκλαστογένεση και τη λειτουργία των οστεοκλαστών (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης(CDP) απομονώνεται από τα σαρκώδη στελέχη τουCistancheκαι διαθέτει ανοσορύθμιση, αντικαρκινική, αντιγηραντική και άλλα φαρμακολογικά αποτελέσματα (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)είχε ανασταλτική επίδραση στην επαγόμενη από λιποπολυσακχαρίδια παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου (NO) σε κύτταρα ποντικού (κύτταρα BV-2, Nan et al., 2013). Επιπλέον, εκχύλισμα πλούσιο σε αφενυλαιθανοειδή (ECD) απόCistancheενίσχυσε την ικανότητα κολύμβησης των ποντικών μειώνοντας τη μυϊκή βλάβη, καθυστερώντας τη συσσώρευση γαλακτικού οξέος και βελτιώνοντας την αποθήκευση ενέργειας (Cai et al., 2010). Ωστόσο, οι επιδράσεις της CDP στη λειτουργία και τη δραστηριότητα των οστεοκλαστών παραμένουν άγνωστες.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)αναστέλλει τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών που προκαλείται από το RANKL και την οστική απορρόφηση. Ο υποκείμενος μηχανισμός ήταν αυτό το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ενισχύει την έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων για να εξασθενίσει την παραγωγή ROS και στη συνέχεια καταστέλλει τους καταρράκτες σηματοδότησης του ενεργοποιημένου NFAT RANKL και της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεΐνης κινάσης (MAPK). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της οστεοπόρωσης που προκαλείται από την υπερβολική οστεοκλαστική οστική απορρόφηση.

2|ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1|Υλικά

CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)(καθαρότητα > 98 τοις εκατό) αγοράστηκε από τη Solarbio (Πεκίνο, Κίνα) και παρασκευάστηκε σε συγκέντρωση αποθέματος 1 mM σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Τα αντισώματα είναι ειδικά για τα c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, φωσφορυλιωμένα (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK και ‐ακτίνη ελήφθησαν από τον Santa Cruz Biotechnology (Σαν Χοσέ, Καλιφόρνια). Τα αντισώματα κατά της V-ATPase d2 παρήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (H. Feng et al., 2009). Το σύστημα ανάλυσης 3‐(4,5‐διμεθυλοθειαζολ‐2‐υλο)‐5‐(3‐καρβοξυμεθοξυφαινυλο)‐2‐(4‐σουλφοφαινυλο)‐2Η‐τετραζόλιο (MTS) και λουσιφεράσης ελήφθη από την Promega (Σίδνεϊ, Αυστραλία). Το ανασυνδυασμένο M‐CSF αγοράστηκε από την R&D Systems (Minneapolis, MN). Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη GST-rRANKL εκφράστηκε και καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Xu et al., 2000).

2.2|Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα RAW264.7 (κύτταρα μακροφάγων ποντικού) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο ελάχιστο απαραίτητο μέσο (Thermo FisherScientific, Scoresby, Αυστραλία) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό ορό βοοειδών, 2 mM L-γλουταμίνη , 100 U/ml πενικιλίνης και 100 ug/ml στρεπτομυκίνης (πλήρες μέσο). Μονοκύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών (BMMs) απομονώθηκαν από ποντίκια C57BL/6J ηλικίας 6 εβδομάδων, τα οποία υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με διαδικασίες που εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Πανεπιστημίου της Δυτικής Αυστραλίας (RA/3/100/1244). Τα μακριά οστά αφαιρέθηκε από μαλακούς ιστούς και ο μυελός των οστών ξεπλύθηκε από το μηριαίο οστό και την κνήμη, το οποίο στη συνέχεια καλλιεργήθηκε σε πλήρες μέσο παρουσία M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Δοκιμασία οστεοκλαστογένεσης

Τα BMM επιστρώθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων με πυκνότητα 6 × 103 κύτταρα ανά φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλήρες μέσο που περιείχε M‐CSF (50 ng/ml) και GST‐rRANKL (100 ng/ml), παρουσία ή απουσία ποικίλες συγκεντρώσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>τρεις πυρήνες) ταυτοποιήθηκαν ως οστεοκλάστες.

2.4|Δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Τα BMM σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 6 × 103 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν όλη τη νύχτα για να προσκολληθούν. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα επωάστηκαν με ποικίλες συγκεντρώσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης). Μετά από άλλες 48 ώρες, το διάλυμα MTS (20 μΐ/φρεάτιο) προστέθηκε και επωάστηκε με κύτταρα για 2 ώρες. Η απορρόφηση στα 490 nm προσδιορίστηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Ανοσοφθορισμού χρώση

Τα BMM σπάρθηκαν σε πυκνότητα 6 × 103 κύτταρα ανά φρεάτιο παρουσία M-CSF (50 ng/ml) όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με M-CSFand GST-rRANKL (100 ng/ml) μέχρι να σχηματιστούν ώριμοι οστεοκλάστες. Οι θεοστεοκλάστες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ποικίλες συγκεντρώσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)για 48 ώρες πριν σταθεροποιηθεί με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη, διαπερατότητα με 0.1 τοις εκατό Triton X-100–PBS και αποκλεισμός με 3 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών σε PBS. Τα παρασκευασμένα κύτταρα επωάστηκαν με συζευγμένη με ροδαμίνη φαλλοϊδίνη για 45 λεπτά στο σκουρόχρωμο για την F-ακτίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, πυρήνες αντιχρωματίστηκαν με 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) και τοποθετήθηκαν με καλυπτρίδες για ομοεστιακή μικροσκοπία.

2.6|Δοκιμασία απορρόφησης υδροξυαπατίτη

Για τη μέτρηση της δραστηριότητας των οστεοκλαστών, τα BMM (1 × 105 κύτταρα ανά φρεάτιο) που καλλιεργήθηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με κολλαγόνο έξι φρεατίων (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) διεγέρθηκαν με GST-rRANKL (100 ng/ml) και M-CSF (50 ng/ml). ) μέχρι να δημιουργηθούν ώριμοι οστεοκλάστες (Zhou et al., 2016). Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποσπάστηκαν απαλά από το διάλυμα διάσπασης των κυττάρων σε πλάκες (Sigma-Aldrich) και ίσος αριθμός ώριμων οστεοκλαστών σπάρθηκαν σε μεμονωμένα φρεάτια επικαλυμμένα με υδροξυαπατίτη πλάκες 96 φρεατίων (Corning Osteoassay, Corning, NY). Οι ώριμοι οστεοκλάστες επωάστηκαν σε ένα μέσο που περιείχε GST-rRANKL και M-CSF με ή χωρίς CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)στις αναφερόμενες συγκεντρώσεις. Μετά από 48 ώρες, τα μισά από τα φρεάτια χρωματίστηκαν ανοσοϊστοχημικά για δραστικότητα TRAcP, όπως περιγράφηκε παραπάνω, για τον υπολογισμό του αριθμού πολυπύρηνων κυττάρων ανά φρεάτιο. Τα υπόλοιπα φρεάτια λευκάνθηκαν για 10 λεπτά για να αφαιρεθούν τα κύτταρα και να επιτραπεί η μέτρηση των περιοχών που απορροφήθηκαν. Οι απορροφημένες περιοχές φωτογραφήθηκαν υπό τυπική μικροσκοπία φωτός και το λογισμικό Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιηθεί η εκατοστιαία περιοχή της επιφάνειας υδροξυαπατίτη που απορροφήθηκε από τους οστεοκλάστες.

2.7|Αναλύσεις αναφοράς Luciferase

Για τη διερεύνηση της μεταγραφικής ενεργοποίησης του NFATc1, τα κύτταρα RAW264.7 διαμολύνθηκαν σταθερά με ένα κατασκεύασμα αναφοράς λουσιφεράσης που ανταποκρίνεται στο NFATc1 (Cheng et al., 2018· van der Kraan et al., 2013). Τα μεταμολυνθέντα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 48 φρεατίων χωρίς φρεάτια. 0,5 × 105 κύτταρα ανά φρεάτιο και προεπεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)για 1 ώρα. Μετά την προεπεξεργασία, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με GST-rRANKL (100 ng/ml) για 24 ώρες και η δραστηριότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανάλυσης αναφοράς λουσιφεράσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega).

2,8|Ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR).

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Trizol σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Thermo Fisher Scientific). Το συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ανάστροφη μεταγραφάση του ιού λευχαιμίας ποντικών Moloney με 1 ug εκμαγείου RNA και εκκινητές ολιγο-dT. Η ενίσχυση της αντίδρασης της αλυσίδας πολυμεράσης συγκεκριμένων αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρόγραμμα: 94 μοίρες για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 30 κύκλους 94 μοιρών για 40 δευτερόλεπτα, 60 μοιρών για 40 δευτερόλεπτα και 72 μοίρες για 40 δευτερόλεπτα και ένα τελικό βήμα επέκτασης 5 λεπτών στο 72 μοίρες. Οι λεπτομερείς πληροφορίες των ειδικών εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα σχετικά επίπεδα αγγελιαφόρου RNA υπολογίστηκαν με κανονικοποίηση στην έκφραση του γονιδίου οικιακής φροντίδας Hmbs.

2,9|Ανάλυση Western blot

Τα BMM καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο με M-CSF σε πλάκες έξι φρεατίων και διεγέρθηκαν με GST-rRANKL (100 ng/ml) για τους αναφερόμενους χρόνους. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης ραδιοανοσοκαθίζησης και οι πρωτεΐνες διαλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυ(βινυλιδενοφθοριδίου) (GE Healthcare, Silverwater, Αυστραλία). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με διάφορα ειδικά πρωτογενή αντισώματα με απαλή ανακίνηση κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου. Η αντιδραστικότητα αντισωμάτων στη συνέχεια ανιχνεύθηκε με αντιδραστήριο ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) και οπτικοποιήθηκε με Image-quant LAS 400.

2.10|Ενδοκυτταρική ανίχνευση ROS

Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού κυτταρικής ανίχνευσης ROS διοξεικής διχλωροφλουορεσκεΐνης 2',7' (Abcam, Μελβούρνη, Αυστραλία). Τα BMM (5 × 103 κύτταρα ανά φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RANKL (100 ng/ml), M‐CSF (50 ng/ml) και CDP για 72 ώρες. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας διοξεική διχλωροφλουορεσκεΐνη 2',7', η οποία οξειδώνεται σε φθορίζον DCF παρουσία ROS. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Hank και επωάστηκαν στο σκοτάδι για 30 λεπτά με 10 μΜ DCFH-DA. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία.

2.11|Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από δοκιμές Student–Newman–Keulspost hoc χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της σημασίας των διαφορών μεταξύ των αποτελεσμάτων, με το p < 0.05="" να="" θεωρείται="">

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Το CDP αναστέλλει την επαγόμενη από το RANKL την οστεοκλαστογένεση και τη σύντηξη οστεοκλαστών

Για να προσδιορίσετε εάν CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)μπορεί να καταστείλει τον οστεοκλαστικό σχηματισμό που προκαλείται από το RANKL, πρώτα πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία οστεοκλαστογένεσης χρησιμοποιώντας BMM ποντικών (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). Τα BMM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RANKL και M‐CSF για 5 ημέρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις CDP. Το CDP μείωσε τον αριθμό των θετικών σε TRAcP πολυπύρηνων κυττάρων όταν η συγκέντρωση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)έφτασε τα 5 μΜ ή υψηλότερα (Εικόνα 1a,b). Για την αξιολόγηση CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)τοξικότητας και επιβεβαιώσαμε ότι αυτά τα αποτελέσματα δεν αντικατοπτρίζουν τον αριθμό ή τον κυτταρικό θάνατο, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση MTS. Τα BMM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RANKL και M‐CSF για 48 ώρες με ποικίλες δόσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης). Το CDP δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό ΒΜΜ σε συγκέντρωση 15 μΜ λιγότερο (Εικόνα 1γ).

Για τον έλεγχο των επιδράσεων του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)στη σύντηξη οστεοκλαστών, οι οστεοκλάστες προκλήθηκαν με θεραπεία RANKL και M-CSF, με ή χωρίς ποικίλες δόσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης). Οι οστεοκλάστες χρωματίστηκαν με ροδαμίνη-φαλλοειδίνη και DAPI για να εκτιμηθεί ο αριθμός των πυρήνων ανά οστεοκλαστή (Εικόνα 2α). Τόσο ο αριθμός οστεοκλαστών όσο και ο μέσος αριθμός οστεοκλαστών του πυρήνα μειώθηκαν μετά την CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)θεραπεία (5–10 μΜ· Εικόνα 2β, γ). Επομένως, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)είχε ανασταλτικές επιδράσεις στην επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστογένεση και τη σύντηξη οστεοκλαστών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)εξασθενεί τη δραστηριότητα απορρόφησης οστεοκλαστικού υδροξυαπατίτη που προκαλείται από το RANKL

Πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία απορρόφησης υδροξυαπατίτη για την ανίχνευση της επίδρασης του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)σχετικά με τη λειτουργία των οστεοκλαστών (Εικόνα 3α). Μετά από επώαση 24 ωρών, ο αριθμός των οστεοκλαστών ανά φρεάτιο δεν άλλαξε, ενώ η περιοχή απορρόφησης υδροξυαπατίτη μειώθηκε σημαντικά με θεραπεία με 5 και 10 μΜ CDP σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Εικόνα 3β, γ). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)έχει ισχυρές ανασταλτικές επιδράσεις τόσο στον σχηματισμό οστεοκλαστών όσο και στη δραστηριότητα οστεοκλαστρορόφησης χωρίς καμία κυτταροτοξική δράση.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)αναστέλλει τη γονιδιακή έκφραση των δεικτών οστεοκλαστών

Για περαιτέρω διερεύνηση των ανασταλτικών επιδράσεων του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)σχετικά με την οστεοκλαστογένεση και την οστεοκλαστική οστική απορρόφηση, τα BMM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RANKL και M‐CSF για 5 ημέρες με ποικίλες συγκεντρώσεις CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε .RT‐PCR για την ανίχνευση της έκφρασης των γονιδίων δεικτών οστεοκλαστών. Η έκφραση του Nfatc1, ενός κρίσιμου μεταγραφικού παράγοντα κατά τη διάρκεια της οστεοκλαστογένεσης, ανεστάλη από το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 4α). Επιπλέον, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)(5 και 10 μΜ) μειώνουν την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την απορρόφηση των οστών, συμπεριλαμβανομένων των Mmp9, Ctsk και Acp5 (Εικόνα 4b–d).

3.4|Το CDP καταστέλλει τη δραστηριότητα του NFATc1 και την έκφραση πρωτεΐνης προς τα κάτω

Να εξεταστεί η επίδραση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)σχετικά με τη δραστηριότητα NFATc1 που προκαλείται από RANKL, πραγματοποιήθηκε ανάλυση αναφοράς αλουσιφεράσης. Θεραπεία με CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης), σε συγκεντρώσεις 5 μΜ και υψηλότερες, ανέστειλαν σημαντικά τη δραστηριότητα NFATc1 που προκαλείται από RANKL (Εικόνα 5α). Επιπλέον, η ανάλυση western blot έδειξε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)κατέστειλε σημαντικά την πρωτεϊνική έκφραση των NFATc1 και c-Fos σε BMM που έλαβαν θεραπεία με RANKL και M‐CSF για 3 και 5 ημέρες (Εικόνα 5β). Επιπλέον, η έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη λειτουργία των οστεοκλαστών, όπως η V-ATPase-d2 και η CTSK, μειώθηκε με την παρουσία CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Ωστόσο, το CDP δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση RANK (Εικόνα 5β).

3,5|Το CDP προάγει την έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων για τη δέσμευση της παραγωγής ROS κατά τη διάρκεια της οστεοκλαστογένεσης που προκαλείται από το RANKL

Για να διερευνηθεί ο υποκείμενος μηχανισμός της αναστολής της οστεοκλαστογένεσης που εξαρτάται από CDP, τα BMMs αντιμετωπίστηκαν με RANKL (100 ng/ml) και M‐CSF (50 ng/ml) μαζί με PBS ή CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)για 72 ώρες. Εξετάσαμε την επίδραση του CDP στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS που διεγείρεται από το RANKL. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS αυξήθηκαν με αγωγή με RANKL, η οποία εξασθενήθηκε με CDP (5 και 10 μΜ· Εικόνα 6α). Τόσο ο αριθμός των θετικών σε ROS κυττάρων όσο και η ένταση της χρώσης με ROS μειώθηκαν με τη θεραπεία με CDP με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 6β, γ). Η ανάλυση Western blot έδειξε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)προώθησε την έκφραση θειορεδοξίνης (TRX1) και αναγωγάσης γλουταθειόνης (GSR) ενώ καταστέλλει την έκφραση της επαγώγιμης συνθάσης μονοξειδίου του αζώτου (NOS2) σε BMM που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RANKL και M-CSF για 3 ημέρες (Εικόνα 6δ).

Για περαιτέρω διερεύνηση εάν το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)κατέστειλε τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών μειώνοντας την παραγωγή ROS, στη συνέχεια επεξεργάσαμε τα BMM με υπεροξείδιο (10 μΜ) για να μιμηθούμε την υψηλή κατάσταση ROS στα κύτταρα. Τα BMM προκλήθηκαν από το RANKL και το M-CSF για 3 ημέρες και τα αποτελέσματα της ανάλυσης westernblot και της RT-PCR έδειξαν ότι το υπεροξείδιο προάγει την έκφραση NFATc1 και c-Fos σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5, η έκφραση των NFATc1 και c-Fos κατεστάλη από το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ενώ το υπεροξείδιο διέσωσε την ανασταλτική δράση του CDP (Εικόνα 6e,f). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το CDP κατέστειλε την έκφραση των NFATc1 και c-Fos σαρώνοντας την παραγωγή ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)καταστέλλει τις οδούς MAPK κατά τη διάρκεια της οστεοκλαστογένεσης που προκαλείται από το RANKL

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την επίδραση του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)θεραπεία για την έκφραση TRAF6 με τη μεσολάβηση RANKL και την ενεργοποίηση της οδού MAPK. Μετά από επώαση μέσου χωρίς ορό για 2 ώρες, τα BMMs διεγέρθηκαν με RANKL, χωρίς ή χωρίς CDP, για 60 λεπτά. Η διέγερση με CDP (10 μΜ) δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση TRAF6 και εξασθένησε τη φωσφορυλίωση του JNK2 andERK1/2 στα 10 και 20 λεπτά (Εικόνα 7). Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της ρ38 αναστέλλεται σημαντικά από το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)θεραπεία 60 λεπτών σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (Εικόνα 7). Αυτά τα στοιχεία αποκαλύπτουν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)καταστέλλει τα επαγόμενα από το RANKL μονοπάτια σηματοδότησης MAPK, σύμφωνα με την ανασταλτική επίδρασή του στον σχηματισμό και τη δραστηριότητα των οστεοκλαστών.

4|ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Το Cistanche, γνωστό ως «τζίνσενγκ της ερήμου», έχει προσελκύσει πολύ την προσοχή πρόσφατα για την ικανότητά του να ρυθμίζει την ανοσία και να δρα προστατευτικά κατά τη γήρανση και το οξειδωτικό στρες (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Οι υποκατεστημένες με φαινυλοπροπανοειδή γλυκοσίδες, τα κύρια δραστικά συστατικά του Cistanche, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν τη δράση των ΝΟ στα μακροφάγα (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Επιπλέον, αCistancheτο εκχύλισμα μείωσε το οξειδωτικό στρες στο επαναιμιμούμενο μυοκάρδιο μετά από ισχαιμία και έπαιξε σημαντικό ρόλο στην αναστολή των αποπτωτικών οδών που οδηγούν σε καρδιοπροστασία (Yu, Li, & Cao, 2016). Ως σημαντικό συστατικό του Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)έχει μια ποικιλία φαρμακολογικών λειτουργιών. Η τρέχουσα μελέτη μας διαπίστωσε ότι το CDP κατέστειλε τη διαφοροποίηση και την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών που ενεργοποιούνται με RANKL εξασθενώντας την παραγωγή ROS καθώς και την ενεργοποίηση NFAT και MAPK.

Ως όξινη φωσφατάση, η TRAcP υπάρχει σε μια ποικιλία κυττάρων και είναι άφθονη σε οστεοκλάστες και κυψελιδικά μακροφάγα (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). Το TRAcP είναι ένα χαρακτηριστικό ένζυμο των οστεοκλαστών και η έκφρασή του σχετίζεται στενά με τη λειτουργία των οστεοκλαστών, που θεωρείται ως δείκτης της δραστηριότητας των οστεοκλαστών και της οστικής απορρόφησης (Minkin, 1982). Στη μελέτη μας, CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ανέστειλε τον αριθμό των TRAcP-θετικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η επαγόμενη από RANKL οστεοκλαστογένεση μπλοκαρίστηκε από το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης). Η αποικοδόμηση της μήτρας των οστών από τους οστεοκλάστες εξαρτάται από την καθεψίνη K (CTSK) και τα MMPs (Gruber, 2015). Εδώ, το CDP μείωσε σημαντικά την έκφραση των λειτουργικών γονιδίων των οστεοκλαστών όπως τα Mmp9, Ctsk και Acp5.

Η διαφοροποίηση και η λειτουργία των οστεοκλαστών ρυθμίζονται από πολλαπλές οδούς σηματοδότησης (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Μετά τη δέσμευση στο RANK, το RANKL στρατολογεί την πρωτεΐνη προσαρμογής TRAF6 για να ενεργοποιήσει την έκφραση του NFATc1, ο οποίος είναι ένας σημαντικός μεταγραφικός παράγοντας για το σχηματισμό οστεοκλαστών, επηρεάζοντας την ειδική για οστεοκλάστες γονιδιακή έκφραση, συμπεριλαμβανομένων των TRAcP και CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 200). Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση RANK και TRAF6 στους οστεοκλάστες. Ωστόσο, η CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ανέστειλε την επαγόμενη από το RANKL ενεργοποίηση NFATc1 κατά την οστεοκλαστογένεση των BMM. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι τα ROS, που παράγονται από τα μιτοχόνδρια στη διαδικασία παροχής ηλεκτρονίων, προάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και ρυθμίζουν την αποικοδόμηση της οστικής μήτρας (Ha et al., 2004). Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι το RANKL προκάλεσε την πυρηνική εισαγωγή Bach1 και μείωσε την παραγωγή αντιοξειδωτικών ενζύμων με τη μεσολάβηση Nrf2, αυξάνοντας έτσι την ενδοκυτταρική έκφραση και οστεοκλαστογένεση ROS σε ποντίκια (Kanzaki et al., 2017). Επιπλέον, αύξησε την παραγωγή ενδοκυτταρικών ROS από την ομοκυστεΐνη ενίσχυσε το σχηματισμό και τη δραστηριότητα των δοστεοκλαστών (Koh et al., 2006). Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι το CDP μείωσε τη συσσώρευση ROS στους οστεοκλάστες αναστέλλοντας την έκφραση του NOS2 και προάγοντας την έκφραση αντιοξειδωτικών ενζύμων, όπως το TRX1 και η αναγωγάση γλουταθειόνης. Όταν αντιμετωπίσαμε τα BMM με υπεροξείδιο για να ενισχύσουμε την ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS, τα αποτελέσματα ότι η αυξημένη ROS θα μπορούσε να αποκαλύψει ότι η έκφραση του ROS1 ήταν προς τα πάνω NFATc1. Βρήκαμε επίσης ότι το υπεροξείδιο διέσωσε την ανασταλτική επίδραση της έκφρασης CDPon NFATc1. Έτσι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το CDP καταστέλλει τη συσσώρευση ROS για να αναστείλει την έκφραση του NFATc1 και, στη συνέχεια, να καταστείλει τον σχηματισμό και τη λειτουργία των οστεοκλαστών.

Τα ERK, JNK και p38 ανήκουν στην οικογένεια MAPK, η οποία εμπλέκεται επίσης στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των οστεοκλαστών (Seger & Krebs, 1995). Το RANKL ενεργοποιεί την οδό MAPK αυξάνοντας τη φωσφορυλίωση των ERK, JNK και p38 (Mizukami et al., 2002). Αποδείξαμε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)κατέστειλε τη φωσφορυλίωση βασικών πρωτεϊνών που προκαλείται από το RANKL στο μονοπάτι MAPK, συμβάλλοντας έτσι στην ανασταλτική επίδραση του CDP στην έκφραση των γονιδίων δεικτών οστεοκλαστών. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει τις ανασταλτικές επιδράσεις του CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)σχετικά με την παραγωγή ROS, το NFAT και την ενεργοποίηση MAPK, που αντιπροσωπεύουν νέους μηχανισμούς δράσης του CDP in vitro.

Συνοπτικά, δείξαμε ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)εξασθενεί την οστεοκλαστογένεση και την απορρόφηση του υδροξυαπατίτη και την έκφραση των γονιδίων δεικτών οστεοκλάστη συμπεριλαμβανομένων των Ctsk, Mmp9 και Acp5. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)ήταν δυνατό να καταστείλει την παραγωγή ROS με τη μεσολάβηση RANKL, καθώς και την ενεργοποίηση NFAT και MAPK (Εικόνα 8). Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα υποψήφιο φάρμακο για τη θεραπεία καταστάσεων που σχετίζονται με οστεοκλάστες που συνοδεύονται από υπερπαραγωγή ROS.

ΣΧΗΜΑ 8 Σχηματικό διάγραμμα CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)λειτουργούν στη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. CDP(Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης)καταστέλλει την παραγωγή ROS που προκαλείται από το RANKL, καθώς και την ενεργοποίηση των NFATc1 και MAPK, αναστέλλοντας έτσι την οστεοκλαστογένεση. CDP,Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτης; MAPK, ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση. NFATc1, πυρηνικός παράγοντας ενεργοποιημένων κυττάρων Τ. RANKL, ενεργοποιητής υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα κBligand; ROS, αντιδραστικά είδη οξυγόνου [Η έγχρωμη εικόνα μπορεί να προβληθεί στο atwileyonlinelibrary.com]

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Nature Science Foundation of China (81572164), το National Key Technology Research and Development Program of China (2017YFC1103300), το Natural ScienceFoundation of Province Guangxi (2016GXNSFAA380295) και το University Science and Technology Research Project of GuangxiProvince (250YBK) ). Υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από το πρόγραμμα GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards, και το Australian Health and Medical Συμβούλιο Έρευνας (NHMRC, Νο. 1107828 και 1027932).

ΣΥΓΚΡΟΥΣΕΙΣ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν συγκρούσεις συμφερόντων

Από: 'Cistanchedeserticolaπολυσακχαρίτηςεξασθενεί την οστεοκλαστογένεση και την οστική απορρόφηση μέσω της αναστολής της σηματοδότησης RANKL και της παραγωγής αντιδραστικών ειδών οξυγόνου από τους Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233:9674–9684