Αφηρημένη

Ιστορικό:Υπάρχει σπανιότητα τεχνικών απεικόνισης και επεξεργασίας εικόνας για ακριβή διάκριση και ποσοτικό προσδιορισμό της δερματικής εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), κυρίως του κολλαγόνου. Αυτή η μελέτη στόχευε να αναπτύξει και να επιδείξει μια ολιστική προσέγγιση απεικόνισης και επεξεργασίας εικόνας για την απεικόνιση και την ποσοτικοποίηση της αναδιαμόρφωσης του κολλαγόνου σε μακρο-, μικρο- και νανο-κλίμακα χρησιμοποιώντας ιστοχημική απεικόνιση, Συνεστιακή Μικροσκοπία Ανάκλασης (RCM) και Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (AFM) , αντίστοιχα.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και έχει την ικανότητα να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου και να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες, και έχει επίσης μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο How to use Antioxidant Cistanche

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Υλικό και μέθοδοι:Για την απόδειξη της ιδέας, ένα εμπορικό προϊόν αντιγήρανσης που είναι γνωστό ότι επάγει τη νεοσύνθεση και την αναδιοργάνωση του κολλαγόνου δοκιμάστηκε ex vivo σε βιοψίες ανθρώπινου δέρματος από δύο ηλικιωμένες γυναίκες.

Αποτελέσματα:Σε σχέση με το μη επεξεργασμένο δέρμα, οι ίνες κολλαγόνου (RCM) και τα ινίδια (AFM) ήταν μακρύτερες και ευθυγραμμισμένες μετά τη θεραπεία. Η περιεκτικότητα σε κολλαγόνο και ελαστίνη (ιστοχημική απεικόνιση και ELISA) βελτιώθηκε στατιστικά μετά τη θεραπεία.

Συμπέρασμα:Με βάση τα ευρήματά μας, μπορούμε να συμπεράνουμε: (1) Η AFM, η RCM και η ιστοχημική απεικόνιση μπορούν να διακρίνουν με ακρίβεια το κολλαγόνο από άλλα συστατικά ECM στο δέρμα και (2) οι μέθοδοι επεξεργασίας εικόνας μπορούν να επιτρέψουν τον ποσοτικό προσδιορισμό και ως εκ τούτου να καταγράψουν μικρές βελτιώσεις στην αναδιαμόρφωση του κολλαγόνου μετά θεραπεία (εμπορικό καλλυντικό προϊόν με τεχνολογία οργάνωσης κολλαγόνου ως proof-of-concept). Η αναφερόμενη ολιστική προσέγγιση απεικόνισης έχει άμεσες κλινικές συνέπειες για τους επιστήμονες και τους δερματολόγους ώστε να λαμβάνουν γρήγορες, σε πραγματικό χρόνο και ακριβείς αποφάσεις στην έρευνα και τη διάγνωση του δέρματος.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ

αντιγήρανση, μικροσκοπία ατομικής δύναμης, αναδιοργάνωση κολλαγόνου, δερματική αναδιαμόρφωση, εξωκυτταρική μήτρα, συνεστιακή μικροσκοπία ανάκλασης (Vivascope)

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η ελεγχόμενη αναδιαμόρφωση της δερματικής εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη και ομοιόσταση του δέρματος και άλλων οργάνων. Η αναδιαμόρφωση του ECM είναι το χαρακτηριστικό στην παθοφυσιολογία της γήρανσης του δέρματος,1 στην επούλωση τραυμάτων και σε ορισμένες θανατηφόρες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων, ενδεικτικά, των καρκίνων και της ίνωσης.2 Υπάρχουν πολυάριθμες αισθητικές και ιατρικές επιλογές για τη θεραπεία αυτών των παθήσεων του δέρματος, ωστόσο, οι μέθοδοι απεικόνισης είναι σπάνιες για απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο της αναδιαμόρφωσης της ECM, κυρίως του κολλαγόνου που είναι το πιο άφθονο δομικό συστατικό της δερματικής ECM. Αν και υπό ανάπτυξη, μερικές από τις νέες μη επεμβατικές τεχνικές κλινικής απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο για την οπτικοποίηση του κολλαγόνου και της οργάνωσής του είναι η μικροσκοπία πολλαπλών φωτονίων με δεύτερη αρμονική γενιά (MPM-SHG), η ομοεστιακή μικροσκοπία 3 ανάκλασης (RCM), η τομογραφία οπτικής συνοχής (OCT), 5,6 Συνεστιακή Οπτική Τομογραφία Συνοχής Lindfield (LC-OCT) που βασίζεται στον συνδυασμό τρόπων RCM και OCT, 7 μαγνητική τομογραφία (MRI), 8 και υπερηχογράφημα.9 Από αυτές, RCM, MPM και Τα LC-OCT είναι όργανα απεικόνισης δέρματος με πιστοποίηση CE. Ωστόσο, μεταξύ όλων αυτών, η τεχνική RCM (Vivascope® 1500 και 3000 από την Lucid, Inc. USA) είναι η μόνη εγκεκριμένη από τον FDA κλινική δερματολογική διαγνωστική τεχνική (510(k)# K080788), η οποία καλύπτεται επίσης από τις περισσότερες ασφάλειες στην ΗΠΑ για τη διάγνωση δερματικών βλαβών.10 Είναι μια μη επεμβατική και οικονομικά αποδοτική εναλλακτική λύση στις κλασσικές τεχνικές βιοψίας και ιστοπαθολογίας για τη διάγνωση και παρακολούθηση των καρκίνων του δέρματος και τη θεραπεία τους. AFM), 11 ηλεκτρονική μικροσκοπία, 11,12 ιστοχημική απεικόνιση με χρήση μικροσκοπίας φθορισμού, 13 μικροσκοπία πολωμένου φωτός, 14 ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ (CLSM), 15,16 πολυτροπική ομοεστιακή ανάκλαση και μικροσκόπιο φθορισμού, 17 και μικροσκοπία ακτίνων X μικρής-81 πολύ γνωστό.

Μία από τις σημαντικότερες προειδοποιήσεις που περιορίζουν τη χρήση των προαναφερθεισών τεχνικών κλινικής απεικόνισης είναι ότι απαιτεί κουραστική χειροκίνητη αξιολόγηση, επειδή η εξειδίκευση και η εμπειρία στο θέμα για την ακριβή ανάλυση ασπρόμαυρων εικόνων των δομών του δέρματος είναι απαραίτητη.19,20 Ως εκ τούτου, απαιτούνται περισσότερες προσπάθειες απαιτείται στον τομέα της επεξεργασίας εικόνας για την ανάπτυξη και την επικύρωση αλγορίθμων και λογισμικού για την αυτοματοποίηση της ανάλυσης,5 την παραγωγή εικόνων με ψηφιακή χρωματισμό εύκολα στην ερμηνεία,16,17 και την εξαγωγή ποσοτικών πληροφοριών για την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και τη θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της οργάνωσης κολλαγόνου στο πλαίσιο της έρευνα.3,6,12–14 Θα επιτρέψει σε μη δερματολόγους και δερματολόγους να λαμβάνουν αποφάσεις πιο γρήγορα και με μεγαλύτερη σιγουριά, καθώς οι αποφάσεις θα λαμβάνονται από ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος των τυχαιοποιημένων εικόνων. Κάποιες θεμελιώδεις μελέτες έχουν γίνει για να δείξουν τη χρήση του RCM και του MPM για την κατανόηση των αλλαγών του δέρματος που σχετίζονται με την ηλικία (συμπεριλαμβανομένης της οργάνωσης του κολλαγόνου) σε νεαρά σε σχέση με ηλικιωμένα άτομα ή άτομα με φωτογήρανση.21,22 Ωστόσο, υπάρχει περιορισμένη προσπάθεια για την επέκταση της ισχύος από αυτές τις τεχνικές απεικόνισης για την καταγραφή βελτίωσης στη θεραπεία, η οποία απαιτεί εξελιγμένη επεξεργασία εικόνας για τη λήψη ποσοτικών πληροφοριών.3,13,16

Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να αναπτύξει και να επιδείξει μια ολιστική προσέγγιση απεικόνισης και επεξεργασίας εικόνας για την απεικόνιση και την ποσοτικοποίηση των βελτιώσεων στη δερματική αναδόμηση (κυρίως κολλαγόνο). Για την απόδειξη της ιδέας, ένα κλινικά αποδεδειγμένο εμπορικό καλλυντικό αντιγήρανσης με τεχνολογία οργάνωσης κολλαγόνου χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της σκοπιμότητας χρήσης επεξεργασίας εικόνας για τον ποσοτικό προσδιορισμό μικρών αλλαγών στο κολλαγόνο πριν και μετά τη θεραπεία.

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1 Βιοψίες δέρματος και αντιμετώπισή τους

Οι βιοψίες δέρματος που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν την έρευνα ήταν το υπολειπόμενο υλικό από την πλαστική χειρουργική της κοιλιάς που ελήφθη από δύο δότες μετά από συγκατάθεσή τους (η συγκατάθεση διατηρήθηκε από τις κλινικές). Η δότρια #1 (62 ετών) και η δότρια #2 (52 ετών) ήταν και οι δύο γυναίκες και τύπος δέρματος Fitzpatrick II. Οι βιοψίες διατηρήθηκαν υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας και υποβλήθηκαν σε καθημερινή αγωγή με δοκιμαστικό προϊόν ή έλεγχο (χωρίς θεραπεία ή εικονικό φάρμακο) για 6 ημέρες και συλλέχθηκαν την ημέρα 7 για απεικόνιση και ELISA. Βιοψίες από δότη #1 χρησιμοποιήθηκαν για ELISA, RCM και AFM, ενώ βιοψίες από δότη #2 χρησιμοποιήθηκαν για ιστοχημική απεικόνιση.

2.2 Απεικόνιση RCM και AFM

Οι βιοψίες δέρματος από τον δότη #1 συλλέχθηκαν την Ημέρα 7 και απεικονίστηκαν απευθείας χωρίς καμία τομή και χρώση. Το AFM (Bruker, Multimode 8 AFM) και το RCM (Vivascope® 1500) χρησιμοποιήθηκαν για τη λήψη εικόνων υψηλής ανάλυσης νανο-και μικροκλίμακας κολλαγόνου σε δέρμα που έχει υποστεί επεξεργασία με το προϊόν δοκιμής και χωρίς επεξεργασία ως έλεγχος. Για όλα τα πειράματα, το AFM ήταν εξοπλισμένο με ένα μικρό πρόβολο (PPP-FMR- 20, Νανοαισθητήρες): σταθερά ελατηρίου, k=0.5–9,5 N/m, συχνότητα συντονισμού, f {{13} }–115 kHz στον αέρα και λειτούργησε σε λειτουργία πατήματος σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα δέρματος τοποθετήθηκαν πλευρικά σε μαγνητικό δίσκο (1 mm × 1 mm) και τοποθετήθηκαν στη σκηνή. Οι εικόνες AFM αποκτήθηκαν μέσω μιας πλάγιας/πλάγιας όψης των βιοψιών δέρματος για να αποφευχθεί η τομή. Για την απεικόνιση RCM, λήφθηκαν επτά τυχαίες εικόνες από βιοψίες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και χωρίς θεραπεία από την κορυφή (πλευρά της κεράτινης στιβάδας) και κάτω (πλευρά του δέρματος) για τη λήψη εικόνων υψηλής ποιότητας κολλαγόνου. Οι εικόνες RCM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ConfoScan® για υφή κολλαγόνου για να αναφέρουν τον μέσο δείκτη κατακερματισμού. Ο δείκτης κατακερματισμού ορίζεται από την περιοχή των αντικειμένων διαιρούμενη με τον αριθμό των αντικειμένων που λαμβάνονται μετά την επεξεργασία των ακατέργαστων εικόνων για υφή κολλαγόνου. Το Σχήμα S1 δείχνει την επεξεργασία εικόνας χρησιμοποιώντας το ConfoScan® για τη λήψη ποσοτικών τιμών στον δείκτη κατακερματισμού κολλαγόνου (CFI).

2.3 Ιστοχημική απεικόνιση

Για να ελεγχθεί η επίδραση του αντιγηραντικού προϊόντος στη θεραπεία της φωτογηρασμένης επιδερμίδας (ανάκτηση κολλαγόνου και ελαστίνης που έχει υποστεί φωτοφθορές), οι βιοψίες από τον δότη #2 εκτέθηκαν σε προσομοιωμένη δόση UV (6 J/cm2 με 96 τοις εκατό UVA ). Τα δείγματα και οι συνθήκες που δοκιμάστηκαν στα πειράματα ήταν: (Α) αρνητικός μάρτυρας (χωρίς επεξεργασία, χωρίς υπεριώδη ακτινοβολία και χωρίς προϊόν δοκιμής), (Β) θετικός έλεγχος (δέρμα εκτεθειμένο σε υπεριώδη ακτινοβολία, αλλά χωρίς προϊόν δοκιμής) και (Γ) υποβλήθηκε σε αγωγή ( δέρμα που εκτίθεται στην υπεριώδη ακτινοβολία, ακολουθούμενη από καθημερινή θεραπεία με προϊόν δοκιμής). Οι βιοψίες δέρματος συλλέχθηκαν την Ημέρα 7, τεμαχίστηκαν, χρωματίστηκαν για κολλαγόνο (χρώση Picosirius) και ελαστίνη (ανοσοχρώση) και απεικονίστηκαν. Οι εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αποκλειστικό αλγόριθμο ανάλυσης εικόνας για τη λήψη ποσοτικών πληροφοριών σχετικά με την περιεκτικότητα σε κολλαγόνο και ελαστίνη στο θηλώδες χόριο. Εν συντομία, η αναλυτική διαδικασία για τη λήψη ποσοτικών πληροφοριών σχετικά με το περιεχόμενο κολλαγόνου και ελαστίνης περιλαμβάνει τη μετατροπή εικόνων RGB σε χρωματικό χώρο LAB, φιλτράρισμα του φόντου για τη λήψη καθαρών εικόνων κολλαγόνου και ελαστίνης και στη συνέχεια ομαλοποίηση της περιεκτικότητας σε κολλαγόνο και ελαστίνη στο θηλώδες χόριο σε την ίδια περιοχή ή πολλά pixel. Υπήρχαν έξι βιοψίες ή δείγματα δέρματος για κάθε πάθηση και δύο τομές ή εικόνες από κάθε δείγμα, με αποτέλεσμα N=12 εικόνες και σημεία δεδομένων για στατιστική δοκιμή. Το σχήμα S2 δείχνει το σχηματικό της προσέγγισης επεξεργασίας εικόνας για τη λήψη ποσοτικών τιμών στην περιεκτικότητα σε κολλαγόνο.

2.4 ELISA

Μετά τη συλλογή ιστού την ημέρα 7, χρησιμοποιήθηκε μια διάτρηση διαμέτρου 4 mm για τη λήψη μικρότερων βιοψιών και επιλέχθηκαν δύο βιοψίες με ~25 mg/βιοψία. Οι διάτρητες βιοψίες (50 mg συνολικού βάρους) αναμίχθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιείχε 0,1 τοις εκατό Triton και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, ακολουθούμενη από ομογενοποίηση του ιστού χρησιμοποιώντας έναν αυτοματοποιημένο ομογενοποιητή διπλής επεξεργασίας με μηχανικά και υπερηχητικά χαρακτηριστικά για την πλήρη λύση του ιστός. Ο λυμένος ιστός φυγοκεντρήθηκε, το υπερκείμενο συλλέχθηκε, χωρίστηκε σε δύο τμήματα και αποθηκεύτηκε στους -80◦C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Εκτός από την κανονικοποίηση όσον αφορά το βάρος (50 mg), τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν επίσης ως προς τη συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης στο υπερκείμενο. Το υπερκείμενο αναλύθηκε για Pro-Collagen 1, Elastin, Alpha-Smooth Muscle Actin (A-SMA), Tenascin-X και Υαλουρονικό οξύ χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ELISA. Οι στατιστικές πραγματοποιήθηκαν σε N=6 σημεία δεδομένων (3 βιοψίες × 2 δείγματα).

3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η ιστοχημική απεικόνιση (Εικόνα 1) παρείχε μακροσκοπικές πληροφορίες σχετικά με την κατανομή και την ποσότητα του κολλαγόνου και της ελαστίνης. Παρατηρήθηκε σαφής μείωση στο κόκκινο χρώμα των δεσμίδων ινών κολλαγόνου και ελαστίνης μετά την επεξεργασία των βιοψιών δέρματος με υπεριώδη ακτινοβολία.

Ο Πίνακας 1 δείχνει τις ποσοτικές τιμές περιεκτικότητας σε κολλαγόνο και ελαστίνη σε τρεις συνθήκες θεραπείας. Αυτές οι τιμές μας επέτρεψαν να μετρήσουμε βελτιώσεις στην περιεκτικότητα σε κολλαγόνο και ελαστίνη και να κάνουμε στατιστικές συγκρίσεις. Η μείωση της περιεκτικότητας σε κολλαγόνο (−23 τοις εκατό έναντι μη επεξεργασμένης) και ελαστίνης (−30 τοις εκατό έναντι μη επεξεργασμένης) μετά την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία ήταν σημαντική (Εικόνα 2). Μετά από θεραπεία με το προϊόν δοκιμής για 6 ημέρες, οι βιοψίες δέρματος που εκτέθηκαν σε υπεριώδη ακτινοβολία μπόρεσαν να ανακτήσουν κολλαγόνο (συν 18 τοις εκατό έναντι θεραπείας με υπεριώδη ακτινοβολία) και ελαστίνη (συν 46 τοις εκατό έναντι θεραπείας με υπεριώδη ακτινοβολία). Αν και η οργάνωση του κολλαγόνου δεν είναι ξεκάθαρη στις ιστοχημικές εικόνες (επειδή το κολλαγόνο είναι πιο άφθονο και πυκνά συσσωρευμένο στο δέρμα), η χαρακτηριστική κάθετη ευθυγράμμιση των ινών ελαστίνης που τρέχουν προς την επιδερμίδα παρατηρείται σε φυσικό (Εικόνα 1Α) και δέρμα που έχει υποστεί βλάβη από την υπεριώδη ακτινοβολία μετά από επεξεργασία με προϊόν δοκιμής (Εικόνα 1Γ).

Η ELISA (Εικόνα 3) συγκρίνει τα επίπεδα των βιοδεικτών που εκφράζονται από βιοψίες δέρματος που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το προϊόν δοκιμής ή εικονικό φάρμακο (που δεν περιέχει ένα κοκτέιλ ενεργών συστατικών που είναι γνωστά για δερματική αναδόμηση). Σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο, υπήρξε 2-3 φορές αύξηση των επιπέδων ελαστίνης και κολλαγόνου, ιδιαίτερα του προκολλαγόνου τύπου 1 (προϊόν δοκιμής έναντι εικονικού φαρμάκου). Αν και δεν είναι σημαντική, παρατηρήθηκε επίσης αξιοσημείωτη αύξηση (P < 0.1) στο υαλουρονικό οξύ και στην τενασκίνη-Χ.

Το RCM μπόρεσε να αποκαλύψει με επιτυχία την οργάνωση των ινών κολλαγόνου (δέσμη ινιδίων κολλαγόνου) στο δέρμα (Εικόνα 4). Λόγω των ομοεστιακών και οπτικών χαρακτηριστικών της πλάκας τετάρτου κύματος, η τεχνική ήταν σε θέση να διακρίνει με επιτυχία το κολλαγόνο (ισχυρό ενδογενές σκιαγραφικό παράγοντα με διπλή διάθλαση) από άλλες μήτρες χωρίς να τεμαχίζει και να λερώνει το δέρμα. Το βραχύ κατακερματισμένο κολλαγόνο και η συσσωρευμένη διάταξη του (χαρακτηριστικό του κατεστραμμένου και κακώς οργανωμένου κολλαγόνου σε γερασμένο/φωτογερασμένο δέρμα) παρατηρούνται σε βιοψία δέρματος που δεν έχει υποβληθεί σε θεραπεία. Μετά από θεραπεία με το προϊόν δοκιμής για 6 ημέρες, η διάταξη των ινών κολλαγόνου σε αυτήν τη βιοψία δέρματος 62-του γυναικείου έτους (δότης #1) φαίνεται σχετικά πιο οργανωμένη από τις μη επεξεργασμένες ίνες κολλαγόνου με μήκη άνω των 100 μm. παράλληλα μεταξύ τους. Αν και κακή αντίθεση, μπορούμε να παρατηρήσουμε το σχήμα και το μέγεθος των ινοβλαστών (που επισημαίνονται με βέλη στο Σχήμα 4), των μεγάλων και απλωμένων ινοβλαστών με κανονικά σχήματα στο θεραπευμένο δέρμα έναντι του μη επεξεργασμένου δέρματος. Τα φωτεινά στρογγυλά κελιά στο Σχήμα 4C παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Θα μπορούσαν να είναι ιστιοκύτταρα ή φλεγμονώδη κύτταρα. Δεν είναι σαφές εάν αυτά τα φλεγμονώδη κύτταρα αντιπροσωπεύουν φυσιολογικές παθήσεις της υγείας του δέρματος ή αν εκφράστηκαν ως απόκριση σε σημαντική δύναμη που ασκήθηκε στην κεφαλή λέιζερ για να επιτευχθεί καλύτερη επαφή μεταξύ της κεφαλής λέιζερ και του δέρματος για εικόνες υψηλής ποιότητας του κολλαγόνου ίνες.

Ο Πίνακας 2 δείχνει τον μέσο δείκτη κατακερματισμού που προσδιορίστηκε με ανάλυση ConfoScan® επτά τυχαίων εικόνων θεραπευμένου έναντι μη επεξεργασμένου δέρματος. Ο δείκτης κατακερματισμού μέσου όρου κολλαγόνου της ομάδας που υποβλήθηκε σε αγωγή έναντι της ομάδας που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία ήταν 0.032 και 0,064, αντίστοιχα. Η μείωση του δείκτη κατακερματισμού υποδηλώνει βελτίωση στην οργάνωση του κολλαγόνου.

Για να ρίξουμε μια βαθύτερη ματιά στη διάταξη του κολλαγόνου, αποκτήθηκαν εικόνες AFM για να απεικονίσουν τη διάταξη του κολλαγόνου σε νανοκλίμακα (Εικόνα 5). Μπορούμε να δούμε μεμονωμένα ινίδια κολλαγόνου (που δεσμεύονται για να σχηματίσουν μια ίνα κολλαγόνου) πάχους νανομέτρων. Περαιτέρω, μπορούμε επίσης να δούμε το χαρακτηριστικό μοτίβο εγκάρσιας ζώνης των ινιδίων κολλαγόνου (D ~ 68 nm), το οποίο είναι σε ευθυγράμμιση με τη βιβλιογραφία,11 και επικυρώνει ότι το AFM ήταν σε θέση να διακρίνει το κολλαγόνο από άλλες ίνες ECM. Σε συναίνεση με το RCM, μια σχετικά παράλληλη οργάνωση των ινιδίων κολλαγόνου παρατηρήθηκε επίσης υπό το AFM για το θεραπευμένο έναντι του μη επεξεργασμένου δέρματος.

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Σε αυτήν την έρευνα, διερευνήσαμε τη δυνατότητα χρήσης τριών τεχνικών απεικόνισης για την απεικόνιση αλλαγών στο κολλαγόνο σε βιοψίες ανθρώπινου δέρματος που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα εμπορικό προϊόν αντιγήρανσης που περιέχει ορισμένα συνθετικά πεπτίδια αναφοράς που είναι γνωστό ότι προκαλούν αναδιαμόρφωση κολλαγόνου. Οι τεχνικές ιστοχημικής απεικόνισης και απεικόνισης RCM συνδυάστηκαν με επεξεργασία εικόνας για τη λήψη ημιποσοτικών πληροφοριών σχετικά με την περιεκτικότητα σε κολλαγόνο και τον κατακερματισμό ως δείκτη για τη βελτίωση του κολλαγόνου μετά από θεραπεία με το προϊόν αντιγήρανσης.

Είναι ενδιαφέρον ότι η μελέτη μας έδειξε μια πολύ ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της ιστοχημικής απεικόνισης και της ELISA για την αναφορά σημαντικής αύξησης στα επίπεδα κολλαγόνου και ελαστίνης μετά τη θεραπεία με το προϊόν δοκιμής. Το προ-κολλαγόνο τύπου 1 είναι ο δείκτης του νεοσυντιθέμενου κολλαγόνου και η υπερέκφρασή του από ινοβλάστες σε απόκριση στο Matrixyl® (Sederma/Croda) είναι ένας καλά χαρακτηρισμένος μηχανισμός για την αντιγηραντική δράση.23,24 Υπήρξε επίσης σημαντική αύξηση στην έκφραση του A-SMA, ενός δείκτη μοναδικό στους μυοϊνοβλάστες, οι οποίοι είναι ειδικά διαφοροποιημένα κύτταρα ινοβλαστών. Ο ρόλος του A-SMA στη συστολή και αναδιαμόρφωση του ECM που προκαλείται από ινοβλάστες είναι καλά κατανοητός,25 και αναφέρεται μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του A-SMA και της δραστηριότητας συστολής των ινοβλαστών.26 Μια αύξηση στο υαλουρονικό οξύ, αν και μη σημαντική, θα μπορούσε να είναι κατά κύριο λόγο αποδίδεται στην παρουσία του υαλουρονικού οξέος ως ενυδατικού συστατικού στο αντιγηραντικό προϊόν. Η TNSX είναι μια νέα πρωτεΐνη ECM που εντοπίζεται μεταξύ ή στην επιφάνεια των ινιδίων κολλαγόνου στο δέρμα27 και η TNSX αναφέρεται ότι προκαλεί δοσοεξαρτώμενη ινιδίτιδα κολλαγόνου,28,29 αν και υπάρχει αμφισβήτηση εάν το TNSX συνδέεται ειδικά με τον τύπο προ-κολλαγόνου 1 ή άλλα βιομόρια κολλαγόνου και ECM επίσης.28,29 Αναφέρεται δοσοεξαρτώμενη αύξηση του TNSX ως απόκριση στο SKINectura™ (Lucas Meyer Cosmetics), ένα δραστικό συστατικό στο προϊόν δοκιμής αντιγήρανσης (Διεθνής αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας # PCT /IB2017/056370). Ως εκ τούτου, μπορεί να υποτεθεί ότι το Matrixyl® (Sederma/Croda) και το SKINectura™ (Lucas Meyer Cosmetics) στο προϊόν δοκιμής συνεργάζονται για να διευκολύνουν τη σύνθεση και την ευθυγράμμιση του πρόσφατα συντεθέντος κολλαγόνου, προκολλαγόνου τύπου 1. Σημαντική μείωση του κολλαγόνου και της ελαστίνης μετά από θεραπεία με υπεριώδη ακτινοβολία (μοντέλο δέρματος που έχει υποστεί φθορά), ακολουθούμενη από την επισκευή τους μετά από θεραπεία με ένα αντιγηραντικό προϊόν (επίπεδα πίσω στο φυσικό δέρμα που δεν εκτίθεται στην υπεριώδη ακτινοβολία) υποδεικνύει την ικανότητα της ιστοχημικής απεικόνισης (πολωμένη μικροσκοπία) και της τεχνικής επεξεργασίας εικόνας να μετρήστε μικρές αλλαγές στο περιεχόμενο των στοιχείων ECM (Εικόνες 1 και 2). Έγιναν επιμελείς προσπάθειες για την προσπάθεια απεικόνισης της οργάνωσης κολλαγόνου και ελαστίνης (μετά την επισήμανση ανοσοφθορισμού) χρησιμοποιώντας το πρόσφατα αγορασμένο σύστημα απεικόνισης φθορισμού Thunder Leica. Ωστόσο, το ψήφισμα δεν ήταν αρκετά υψηλό, και ως εκ τούτου τίποτα δεν μπορούσε να εξαχθεί αξιόπιστα σχετικά με τον οργανισμό. Η απεικόνιση CLSM που βασίζεται σε φθορισμό προσφέρει υψηλότερη ανάλυση από τη συμβατική απεικόνιση φθορισμού ευρέος πεδίου για να επιτρέπει σαφή απεικόνιση της οργάνωσης του κολλαγόνου και της ελαστίνης. Η συμβατική απεικόνιση φθορισμού ευρέος πεδίου περιορίζεται από την κυριαρχία του δευτερεύοντος φθορισμού και το πάχος των δειγμάτων, τα οποία δεν αποτελούν ανησυχία για το CLSM.

Καταφέραμε να οπτικοποιήσουμε την οργάνωση του κολλαγόνου χρησιμοποιώντας RCM (Εικόνα 4). Το RCM είναι καλύτερη επιλογή από το CLSM επειδή (1) το RCM δεν χρησιμοποιεί καμία ετικέτα ή χρώση (σε αντίθεση με το fluorescence-CLSM που απαιτεί επισήμανση ανοσοφθορισμού) αφαιρώντας τυχόν πιθανότητες αβεβαιότητας ή μη εξειδίκευσης λόγω ετικετών και (2) Το RCM είναι ευρέως χρησιμοποιήθηκε κλινική τεχνική δερματικής απεικόνισης για το κολλαγόνο. Μια βελτίωση στην υφή των ινών κολλαγόνου, των μακριών και λεπτών ινών μετά από θεραπεία με ένα αντιγηραντικό προϊόν (έναντι των πυκνών και κοντών τεμαχισμένων ινών κολλαγόνου σε μη επεξεργασμένο δέρμα) υποδηλώνει τον τρόπο δράσης του σε δομικό επίπεδο. Η ανάλυση RCM ήταν αρκετά υψηλή για να συλλάβει ακόμη και κύτταρα ινοβλαστών, το εργοστάσιο σύνθεσης κολλαγόνου του δέρματος. Οι ίνες κολλαγόνου που τυλίγονται γύρω από τους ινοβλάστες θα μπορούσαν να είναι οι νεοσυντιθέμενες ίνες κολλαγόνου καθώς είναι πιο λεπτές σε διάμετρο από τις γύρω ίνες κολλαγόνου και τις δέσμες τους (Εικόνα 4). Με βάση την ανάλυση ConfoScan® τυχαιοποιημένων εικόνων RCM, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το μη επεξεργασμένο δέρμα έχει πολύ υψηλότερο δείκτη κατακερματισμένου κολλαγόνου σε σύγκριση με το δέρμα που έχει υποστεί αγωγή. Αν και στις εικόνες RCM μπορούμε να δούμε την παράλληλη ευθυγράμμιση των ινών κολλαγόνου μετά την επεξεργασία με το προϊόν δοκιμής, δεν μπορεί να εξαχθεί συμπέρασμα εκτός εάν υπολογιστεί η αναλογία ισοτροπίας/ανισοτροπίας, η οποία ήταν πέρα ​​από το πεδίο αυτής της έρευνας. Ωστόσο, η εξαιρετικά υψηλή ανάλυση AFM σε επίπεδο νανοκλίμακα αποκαλύπτει στοιχεία ευθυγράμμισης του κολλαγόνου σε επίπεδο μεμονωμένων ινιδίων. Με βάση τη θετική συσχέτιση μεταξύ των εικόνων RCM και AFM σχετικά με την παράλληλη ευθυγράμμιση των ινών κολλαγόνου (χωρίς θεραπεία έναντι αγωγής), υπάρχει μεγάλη πιθανότητα το προϊόν αντιγήρανσης να έχει την ιδιότητα αναδιοργάνωσης του κολλαγόνου. Για μελλοντική έρευνα, η μελέτη θα πρέπει να διεξαχθεί για την παρακολούθηση του ίδιου σημείου (ίνες κολλαγόνου) με την πάροδο του χρόνου (διαμήκης μελέτη) πριν και μετά τη θεραπεία με το προϊόν δοκιμής για να διερευνηθεί εάν πρόκειται για την ευθυγράμμιση του υπάρχοντος κολλαγόνου ή των νεοσυντιθεισών ινών κολλαγόνου που είναι πιο ευθυγραμμισμένο. Ωστόσο, μια τέτοια διαχρονική μελέτη θα απαιτήσει την ενσωμάτωση οργάνων RCM και AFM στην ικανότητα απεικόνισης ζωντανών ιστών και απεικόνιση χρονικής καθυστέρησης για την καταγραφή των αλλαγών σε πραγματικό χρόνο στην αναδιαμόρφωση του κολλαγόνου.

5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Με βάση τα ερευνητικά μας ευρήματα από αυτήν τη μελέτη απόδειξης της ιδέας, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι τεχνικές AFM, RCM και ιστοχημικής απεικόνισης είναι ικανές να παρακολουθούν τις αλλαγές στην οργάνωση του κολλαγόνου σε νανο, μικρο και μακρο-κλίμακα, αντίστοιχα. Οι εικόνες AFM και RCM δείχνουν ενδείξεις ευθυγράμμισης κολλαγόνου σε νανο- και μικροκλίμακα μετά την επεξεργασία με το προϊόν δοκιμής. Η ανάλυση τυχαιοποιημένων εικόνων RCM και ιστοχημικών με χρήση ιδιόκτητων προσεγγίσεων επεξεργασίας εικόνας δείχνει περαιτέρω ότι το δέρμα μετά τη θεραπεία με το προϊόν δοκιμής έχει χαμηλότερο κατακερματισμό κολλαγόνου και υψηλότερη πυκνότητα κολλαγόνου σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο. Αν και έχει καταβληθεί κάποια προσπάθεια για την ανάπτυξη και την επικύρωση αλγορίθμων επεξεργασίας εικόνας3,5,6,12–14,16,17 απαιτείται περισσότερη έρευνα προς αυτή την κατεύθυνση για να επιτευχθούν αποφάσεις προκλινικής και κλινικής έρευνας και διαγνωστικής βάσει δεδομένων. Η ολιστική μας προσέγγιση για την εφαρμογή τεχνικών απεικόνισης υψηλής ανάλυσης και υψηλού περιεχομένου σε συνδυασμό με ισχυρούς και ισχυρούς αλγόριθμους και λογισμικό επεξεργασίας εικόνας είναι ένα βήμα προς αυτή την κατεύθυνση.

Αν και το πεδίο αυτής της έρευνας περιορίστηκε στη διερεύνηση της οργάνωσης του κολλαγόνου ως απόκριση σε ένα προϊόν δοκιμής αντιγήρανσης σε ex vivo βιοψία ανθρώπινου δέρματος, αυτές οι τεχνικές απεικόνισης έχουν επιπτώσεις στην παρακολούθηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της αναδιαμόρφωσης της ECM, η οποία είναι το χαρακτηριστικό της φυσιολογικής ανάπτυξης. επούλωση πληγών, καθώς και ένας βασικός δείκτης στην παθοφυσιολογία απειλητικών για τη ζωή καταστάσεων όπως η ίνωση και ο καρκίνος που προκύπτουν από ανεξέλεγκτη αναδιαμόρφωση ECM.2

ΣΥΓΚΡΟΥΣΕΙΣ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι καμία σύγκρουση συμφερόντων δεν θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι βλάπτει την αμεροληψία της έρευνας που αναφέρεται.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Shin JW, Kwon SH, Choi JY, Na JI, Choi HR, Park KC. Μοριακοί μηχανισμοί δερματικής γήρανσης και προσεγγίσεις αντιγήρανσης. Int J Mol Sci. 2019; 20(9):2126.

2. Cox TR, Erler JT. Αναδιαμόρφωση και ομοιόσταση της εξωκυτταρικής μήτρας: Επιπτώσεις για ινωτικές ασθένειες και καρκίνο. Dis Model Mech. 2011; 4 (2): 165–78

3. Pittet JC, Freis O, Vazquez-Duchene MD, Perie G, Pauly G. Αξιολόγηση της περιεκτικότητας σε ελαστίνη/κολλαγόνο στο ανθρώπινο χόριο in-vivo με πολυφωτονική τομογραφία-παραλλαγή με βάθος και συσχέτιση με τη γήρανση. Καλλυντικά. 2014; 1 (3): 211–21

4. Longo C, Casari A, Beretti F, Cesinaro AM, Pellacani G. Skin aging: Μικροσκοπική εκτίμηση επιδερμικών και δερματικών αλλαγών με χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας. J Am Acad Dermatol. 2013; 68(3): e73–82.

5. Yamazaki K, Li E, Miyazawa A, Kobayashi M. Διερεύνηση πολλαπλών οπτικών ιδιοτήτων και μορφολογίας ρυτίδων στις γωνίες των ματιών με τομογραφία οπτικής συνοχής μήτρας Jones πολλαπλής αντίθεσης. Skin Res Technol. 2020;27(3):435–443.

6. Yow AP, Cheng J, Li A, Srivastava R, Liu J, Wong DWK, et al. Αυτοματοποιημένο in vivo 3D σύστημα οπτικής τομογραφίας δέρματος υψηλής ευκρίνειας. Annual Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2016; 2016: 3895–8

7. Ruini C, Schuh S, Sattler E, Welzel J. Line-field ομοεστιακή οπτική τομογραφία συνοχής-πρακτικές εφαρμογές στη δερματολογία και σύγκριση με καθιερωμένες μεθόδους απεικόνισης. Skin Res Technol. 2021; 27:340-52.

8. Tal S, Maresky HS, Bryan T, Ziv E, Klein D, Persitz A, et al.MRI στην ανίχνευση ενέσιμων πληρωτικών καλλυντικών προσώπου. Head Face Med. 2016; 12 (1): 27.

9. Mandava A, Ravuri PR, Konathan R. Υψηλής ανάλυσης υπερηχογραφική απεικόνιση δερματικών βλαβών. Ινδική J Radiol Imaging. 2013; 23 (3): 269–7.

10. Edwards SJ, Mavranesouli I, Osei-Assibey G, Marceniuk G, Wakefield V, Karner C. Vivascope 1500 and 3000 συστήματα ανίχνευσης και παρακολούθησης δερματικών βλαβών: Συστηματική ανασκόπηση και οικονομική αξιολόγηση. Αξιολόγηση Τεχνολογίας Υγείας. 2016; 20 (58): 1–260.

11. Ushiki T. Ίνες κολλαγόνου, δικτυωτές ίνες, ελαστικές ίνες. Μια ολοκληρωμένη κατανόηση από μορφολογική άποψη. Arch Histol Cytol. 2002; 65 (2): 109–26

12. Starborg Τ, Kalson NS., Lu Υ, Mironov Α, Cootes Τ, Holmes D, et αϊ. Χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης και 3view(R) για τον προσδιορισμό του μεγέθους των ινιδίων κολλαγόνου και της τρισδιάστατης οργάνωσης. Nat Protoc. 2013; 8 (7): 1433–48.

13. Wegner KA, Keikhosravi A, Eliceiri AW, Vezina CM. Φθορισμός ερυθρού πικοσίριου πολυπλέκτης με ανοσοϊστοχημεία για την ποσοτική αξιολόγηση του κολλαγόνου σε τομές ιστού. J Histochem Cytochem. 2017; 65 (8): 479–90.

14. Changoor Α, Tran-Khanh Ν, Methot S, Garon Μ, Hurtig ΜΒ, Shive MS, et αϊ. Μια μέθοδος μικροσκοπίας πολωμένου φωτός για ακριβή και αξιόπιστη βαθμολόγηση της οργάνωσης του κολλαγόνου στην επισκευή του χόνδρου. Οστεοαρθρικός Χόνδρος. 2011; 19 (1): 126–35.

15. Bernstein EF, Chen YQ, Kopp JB, Fisher L, Brown DB, Hahn PJ, et αϊ. Η μακροχρόνια έκθεση στον ήλιο μεταβάλλει το κολλαγόνο του θηλώδους χορίου. Σύγκριση προστατευμένου από τον ήλιο και φωτογηρασμένου δέρματος με ανάλυση Northern, ανοσοϊστοχημική χρώση και ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ. J Am Acad Dermatol. 1996; 34 (2 pt 1): 209–18.

16. Schuurmann M, Stecher MM, Paasch U, Simon JC, Grunewald S. Evaluation of digital staining for ex-vivo confocal laser scanning microscopy. JEADV. 2020; 34 (7): 1496–9.

17. Gareau DS. Δυνατότητα ψηφιακής χρώσης πολυτροπικών ομοεστιακών μωσαϊκών για προσομοίωση ιστοπαθολογίας. J Biomed Opt. 2009; 14(3):034050.

18. Zhang Υ, Ingham Β, Cheong S, Ariotti Ν, Tilley RD, Naffa R, et αϊ. Μελέτες σκέδασης ακτίνων Χ μικρής γωνίας Synchrotron σε πραγματικό χρόνο της δομής του κολλαγόνου κατά την επεξεργασία του δέρματος. Ind Eng Chem Res. 2018; 57 (1): 63–9.

19. Από την εικόνα στην πληροφορία: Επεξεργασία εικόνας στη δερματολογία και τη δερματική βιολογία. Στο: Hamblin, M., Avci, P., Gupta, G., συντάκτες. Imaging in dermatology, 1st ed.Academic Press: Amsterdam, Netherland; 2016. Σελ. 519–35.

20. Schneider SL, Kohli I, Hamzavi IH, Council ML, Rossi AM, Ozog DM. Αναδυόμενες τεχνολογίες απεικόνισης στη δερματολογία, μέρος II: Εφαρμογές και περιορισμοί. J Am Acad Dermatol. 2019; 80 (4): 1121–31.

21. Guida S, Pellacani G, Ciardo S, Longo C. Reflectance microscopy imaging of aging skin and skin cancer. Dermatol Prac Concept. 2021; 11 (3): 2021068.

22. Wang H, Shyr T, Fevola MJ, Cula GO, Stamatas GN. Οι σχετιζόμενες με την ηλικία μορφολογικές αλλαγές της δερματικής μήτρας στο ανθρώπινο δέρμα τεκμηριώθηκαν in vivo με πολυφωτονική μικροσκοπία. J Biomed Opt. 2018; 23 (3): 1–4.

23. Jones RR, Castelletto V, Connon CJ, Hamley IW. Το κολλαγόνο διεγερτικό αποτέλεσμα του αμφίφιλου πεπτιδίου C16-KTTKS στους ανθρώπινους ινοβλάστες. ΜοΙ Pharm. 2013; 10(3):1063–9.

24. Gorouhi F, Maibach HI. Ο ρόλος των τοπικών πεπτιδίων στην πρόληψη ή τη θεραπεία του γηρασμένου δέρματος. Int J Cosmet Sci. 2009; 31 (5): 327–45.

25. Shinde AV, Humeres C, Φραγκογιάννης Ν.Γ. Ο ρόλος της ακτίνης α-λείου μυός στη συστολή και την αναδιαμόρφωση της μήτρας που προκαλείται από ινοβλάστες. Biochim Biophys Acta. 2017; 1863 (1): 298–309.

26. Hinz B, Coletta G, Tomasek JJ, Gabbiani G, Chaponnier C. Η έκφραση ακτίνης άλφα λείου μυός ρυθμίζει προς τα πάνω τη συσταλτική δραστηριότητα των ινοβλαστών. ΜοΙ Biol Cell. 2001; 12 (9): 2730-41.

27. Valcourt U, Alcaraz LB, Exposito JY, Lethias C, Bartholin L. Tenascin-X: Beyond the architectural function. Cell Adh Migr. 2015; 9 (1–2): 154– 65.

28. Egging D, van den Berkmortel F, Taylor G, Bristow G, Schalkwijk J. Αλληλεπιδράσεις τομέων ανθρώπινης τενασκίνης-Χ με μόρια εξωκυτταρικής μήτρας δέρματος. Arch Dermatol Res. 2007;298(8):389–96.

29. Minamitani Τ, Ikuta Τ, Saito Υ, Takebe G, Sato Μ, Sawa Η, et αϊ. Τροποποίηση της ινιδολογίας του κολλαγόνου από το κολλαγόνο tenascin-X και τύπου VI. Exp Cell Res. 2004; 298 (1): 305–15

ΒΟΗΘΗΤΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

Μπορείτε να βρείτε πρόσθετες υποστηρικτικές πληροφορίες στην ηλεκτρονική έκδοση του άρθρου στον ιστότοπο του εκδότη.

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】