Η Διαδοχική Φασματομετρία Μάζας Υψηλής Ανάλυσης Προσδιορίζει ένα Ιδιαίτερο Μοτίβο Γαγγλιοσίδης στην Πρώιμη Διαβητική Νεφρική Νόσο σε ασθενείς με Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 Ⅱ

2.2. Λεπτομερής δομική ανάλυση πολυσιαλυλιωμένων ειδών που σχετίζονται με μακρολευκωματινουρία από HCD MS/MS

Ο έλεγχος HR-MS έδειξε ότι η γαγγλιοσίδη των μακρολευκωματουρικών ασθενών χαρακτηρίζεται από αυξημένη συνολική περιεκτικότητα σε σιαλικό οξύ. Τουλάχιστον τέσσερις πεντασιαλογαγγλιοτετραόσες κατηγορίας GQ1 ταυτοποιήθηκαν στο δείγμα Α3 με μεγάλη ακρίβεια μάζας. Το ιόν σε m/z 812,7{{10}}68, που ανιχνεύθηκε μόνο στο φάσμα μάζας διαλογής του Α3, εκχωρήθηκε, σύμφωνα με τον υπολογισμό μάζας, στο τριπλά αποπρωτονιωμένο και άλας GQ1 (d18:1/18 :0). Προκειμένου να χαρακτηριστεί δομικά αυτό το είδος που σχετίζεται με τη μακρολευκωματουρία λεπτομερώς, απομονώσαμε το ιόν σε m/z 812.7068 και το υποβάλαμε σε HCD MS/MS σε HR σε κατάσταση αρνητικού ιόντος. Οι στόχοι αυτού του πειράματος διαδοχικής MS ήταν: (i) η διερεύνηση της δομής της αλυσίδας ολιγοσακχαρίτη. (ii) την επιβεβαίωση της σύνθεσης κεραμιδίου, η οποία υποτέθηκε λαμβάνοντας υπόψη τη μάζα ολόκληρων των μορίων GQ1. (iii) συλλογή συγκεκριμένων δεδομένων σχετικά με τον εντοπισμό των μονοσακχαριτών Neu5Ac κατά μήκος της ραχοκοκαλιάς του ολιγοσακχαρίτη, που οδηγεί σε διάκριση ισομερών από τις πέντε πιο κοινές δομές GQ1(d18:1/18:0) (Εικόνα 3) που μπορεί να υπάρχουν στα ούρα του ασθενείς με μακρολευκωματουρία.

Απεικονίζεται το φάσμα κατακερματισμού του πρόδρομου ιόντος [M-4H+Na]3− που ανιχνεύθηκε σε m/z 812.7068, που δημιουργήθηκε με το συνδυασμό του TIC που αποκτήθηκε για δύο λεπτά υπό μεταβλητή ενέργεια σύγκρουσης εντός εύρους 30–80 eV. στο Σχήμα 4.

Εικόνα 3. Τα πέντε πιο κοινά ισομερή του GQ1(d18:1/18:0): (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) ισομερές; (Β) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) ισομερές. (C) GQ1c(d18:1/18:0)ισομερές; (D) GQ1d(d18:1/18:0) ισομερές; (Ε) GQ1e(d18:1/18:0) ισομερές.

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΝΑ ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 25% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 9% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ ΓΙΑ ΛΟΙΜΩΞΗ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

Τα δεδομένα MS/MS επικυρώνουν τη (d18:1/18:0) σύνθεση του κεραμιδίου από το Y0 στα m/z 564,8704 και το Y1 στο m/z 726,5845 που αντιστοιχεί στην αλληλουχία Glc-Cer, καθώς και στο ιόν εσωτερικής διάσπασης, S, σε m/z 325,1828 που αντιστοιχεί στο C18:0 λιπαρό οξύ (Εικόνα 5). Παρομοίως, τεκμηριώνεται επίσης η συνολική κατάσταση σιαλυλίωσης του μορίου. Ως εκ τούτου, από το ιόν Β1 που ανιχνεύθηκε σε m/z 290,0868 και το ανθρακικό αντίστοιχό του σε m/z 312,0686 που αντιστοιχεί στην αποκόλληση ενός υπολείμματος Neu5Ac από το γονικό ιόν, μαζί με το απομακρυσμένο στοιχείο που ανιχνεύθηκε σε m/z 581,1807 και m/z 581,1807 και m/z , επιβεβαιώστε την εμφάνιση της σύνδεσης Neu5Ac-Neu5Ac.

Σχήμα 5. Σχήμα κατακερματισμού από HCD MS/MS που παρουσιάζεται από τον πρόδρομο [M-4H++Na+ ] 3− στο m/z 812.7068 και τα ιόντα αλληλουχίας διαγνωστικά για το δομικό ισομερές GQ1d.

Λαμβάνοντας υπόψη την πιο κοινή θέση σύνδεσης των υπολειμμάτων Neu5Ac είτε στο εσωτερικό είτε στο εξωτερικό Gal, υπάρχουν πέντε πιθανοί δομικοί υποψήφιοι για το GQ1(d18:1/18:0), όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Ωστόσο, το ιόν στο m/z 1032,3662 που σχηματίζεται από διπλό δεσμό και εσωτερικές εγκάρσιες διασπάσεις δακτυλίου και εκχωρείται στο Z4 /Y{0/ 2,4A2 , μαζί με το ιόν που ανιχνεύεται στο m/z 936,7894 ως Y2 / 3,5A1, υποστηρίζει την προσκόλληση και των τεσσάρων υπολειμμάτων Neu5Ac στο εσωτερικό Gal. Αν και η συχνότητα εμφάνισης άλλων δομικών ισομερών δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς, αυτά τα δύο ιόντα θραυσμάτων αποδεικνύουν ότι το δομικό μοτίβο είναι σύμφωνο με το υποψήφιο (D), το οποίο αντιστοιχεί στο d ισομερές του GQ1(d18:1/18:0) , υπάρχει σίγουρα στο δείγμα Α3. Το σχήμα στο Σχήμα 5 απεικονίζει την οδό κατακερματισμού που βιώνεται από το πρόδρομο ιόν που αντιστοιχεί στο GQ1d(d18:1/18:0).

Ο επόμενος υποψήφιος πολυσιαλικός σχετιζόμενος με τη μακρολευκωματινουρία για λεπτομερή δομική ανάλυση είναι το ιόν [M-3H+ ] 3− που ανιχνεύεται αποκλειστικά στο φάσμα μάζας διαλογής του δείγματος Α3 σε m/z 708,3379 και έχει εκχωρηθεί, με βάση τον ακριβή υπολογισμό της μάζας, σε GT1(d18:1/18:0). Αυτό το ιόν απομονώθηκε και υποβλήθηκε στην ανάλυση θρυμματισμού με διαδοχική MS χρησιμοποιώντας HCD. Το φάσμα ιόντων προϊόντος που δημιουργείται από τη σύνοψη σαρώσεων που αποκτήθηκαν για 2 λεπτά σε μεταβλητές ενέργειες σύγκρουσης μεταξύ 30 και 80 eV παρουσιάζεται στο Σχήμα 6, μαζί με τη χημική δομή αυτού του είδους και την αντιστοίχιση των κύριων σημάτων. Ο μηχανισμός κατακερματισμού υπό τις χρησιμοποιούμενες συνθήκες MS/MS, μαζί με τα διαγνωστικά ιόντα θραυσμάτων, απεικονίζεται στο Σχήμα 7. Για να βελτιωθεί η ορατότητα όλων των εκχωρημένων ιόντων προϊόντων, ο Πίνακας 3 συμπληρώνει τη λίστα των αναγνωρισμένων σημάτων στο φάσμα που παρουσιάζεται στο Σχήμα 6.

Σχήμα 6. Δομική ανάλυση με (−) nanoESI HR HCD MS/MS του προδρόμου ιόντος [M-3H+] 3− που ανιχνεύθηκε στο δείγμα Α3 σε m/z 708,3379, το οποίο, σύμφωνα στον υπολογισμό μάζας, αντιστοιχεί στο GT1(d18:1/18:0). Χρόνος απόκτησης: 2 λεπτά; μεταβλητές ενέργειες σύγκρουσης εντός 30–80 eV. Ένθετο: η δομή του ισομερούς GT1b(d18:1/18:0) που προκύπτει από τα δεδομένα MS/MS.

Ο κατακερματισμός του HCD οδήγησε σε πολλά ιόντα αλληλουχίας, τα οποία προέκυψαν ως αποτέλεσμα γλυκοσιδικών δεσμών και διασπάσεων σταυρωτού δακτυλίου. Αυτά τα ιόντα είναι πολύ χρήσιμα για την αντιστοίχιση ολόκληρης της αλληλουχίας υδατανθράκων, με την ταυτοποίηση των ισομερών θέσης GT1 και για την επιβεβαίωση της σύνθεσης κεραμιδικής αγλυκόνης.

Ο τύπος κεραμιδίου d18:1/18:0 αποκαλύπτεται από το ιόν Υ0 στο m/z 564,5353 και υποστηρίζεται από την αλληλουχία Glc-Cer που προσδιορίζεται μέσω του Υ1 στο m/z 726,5879. Επιπλέον, η εκχώρηση ιόντων αποδεικνύει την παρουσία ισομορφής GT1. Το ιόν στο m/z 493.1669, με σύνθεση NeuAc–GalNAc, μπορεί να προέρχεται αποκλειστικά από το GT1, το οποίο χαρακτηρίζεται από τη σιαλυλίωση του υπολείμματος GalNAc. Τα υπόλοιπα ιόντα θραυσμάτων υποδηλώνουν την ύπαρξη του δομικού ισομερούς GT1b στο δείγμα Α3. Η δομή του GT1b υποστηρίζεται από όλα τα ιόντα που προκύπτουν από το μη αναγωγικό άκρο του μορίου, που τεκμηριώνεται από τη σειρά τύπου Υ, συνοδευόμενα από δύο ιόντα Ζ, από τα οποία το ένα εμφανίζεται σε μικρότερη αφθονία (Εικόνα 6). Ωστόσο, το Y2/B2 που ανιχνεύθηκε ως ιόν αρκετής αφθονίας στο m/z 888.6405 δίνει στοιχεία για την αλληλουχία Gal–Glc–Cer, που πιθανώς προέρχεται από ισομερές GT1a ή GT1b μετά την αντίστοιχη αποσιαλυλίωση είτε από Neu5Ac είτε από Neu5Ac-Neu5Ac το εσωτερικό Gal ή από ένα ισομερές που περιέχει ένα μη υποκατεστημένο εσωτερικό Gal, όπως το GT1d.

Από την άλλη πλευρά, το Υ2 που ανιχνεύθηκε στο m/z 734.5701 τεκμηριώνει τον εντοπισμό του στοιχείου disialo Neu5AcNeu5Ac στο εσωτερικό Gal, μια διαμόρφωση που συνάδει με το ισομερές GT1b. Η παρουσία της απομακρυσμένης ομάδας αποδεικνύεται επίσης από το ιόν Β2 στο m/z 581.1828.

Στο HCD MS/MS, πολλά σήματα σχετίζονται με τη μερική αποσιαλυλίωση του μορίου, όπως τα ιόντα Υ4 και/ή Υ3 που αντιστοιχούν στην αποσιαλυλιωμένη αλληλουχία Gg4Cer. Ωστόσο, αυτά τα ιόντα δεν μπορούν να υποδείξουν τις θέσεις προσκόλλησης του Neu5Ac στον ουδέτερο πυρήνα γλυκάνης Gg4. Επιπλέον, το σήμα στο m/z 364,1243 που αντιστοιχεί στην αλληλουχία Gal–GalNAc που έχει εκχωρηθεί στο ιόν εσωτερικής διάσπασης GT1b B3/B1 μπορεί να αποδοθεί στο ισομερές GT1c επειδή αυτή η γλυκομορφή περιέχει έναν μη υποκατεστημένο τερματικό δισακχαρίτη Gal–GalNAc. Ως εκ τούτου, εκτός από το Y2, το οποίο σχετίζεται με το GT1b, όλα τα ιόντα θα μπορούσαν να προκύψουν από άλλα ισομερή θέσης Neu5Ac, όπως τα GT1a, GT1, GT1c ή ακόμα και το σπάνια αναφερόμενο GT1d. Από την άλλη πλευρά, το ίδιο το Y2 θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα ενός γεγονότος χαμηλής πιθανότητας, το οποίο εξάλειψε επίσης το Neu5Ac από το στοιχείο δοκιμών που συνδέεται με το εσωτερικό Gal.

Δεδομένου ότι, εκτός από την αποκάλυψη του GT1, τα δεδομένα MS/MS που σχετίζονται με τις διασπάσεις του γλυκοσιδικού δεσμού δεν μπόρεσαν να αποδώσουν με σαφήνεια άλλα ισομερή GT1 στο μείγμα Α3, αναλύσαμε πιο προσεκτικά τα ιόντα διάσπασης δακτυλίου για να ανακαλύψουμε πιθανή εσωτερική θραυσματοποίηση που υποστηρίζει το GT1b. Παρατηρήσαμε το χαμηλής έντασης τριπλά φορτισμένο ιόν στο m/z 634,6067, το οποίο είναι σύμφωνο με το 0,2 τύπο διάσπασης σταυρωτού δακτυλίου σε ένα από τα τερματικά υπολείμματα σιαλικού οξέος, το οποίο, σε η περίπτωση του είδους GT1b, μπορεί να εμφανιστεί είτε από 0,2X4 ή 0,2X3 ή και τα δύο. Επειδή το ισομερές GT1b είναι γενικά πιο κοινό από το GT1, τα Σχήματα 6 και 7 παρουσιάζουν την αντιστοίχιση ιόντων και το σχήμα κατακερματισμού ειδικά για το GT1b.

Λόγω της συμμετρίας της αλυσίδας Gal-GalNAc-Gal, δεν υπάρχει πιθανότητα να αποκλειστούν εντελώς άλλα δομικά ισομερή. Παρόλο που τα δεδομένα HCD MS/MS καταδεικνύουν την ύπαρξη των GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) και GT1b(d18:1/18: 0) στο δείγμα A3, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανή εμφάνιση άλλων ισομερών GQ1 και GT1. Ωστόσο, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι τρία ισομερή-GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) και GT1 (d18:1 /18:0) υπάρχουν σίγουρα στο δείγμα Α3 και μπορούν να μελετηθούν περαιτέρω ως μοριακοί δείκτες μακρολευκωματινουρίας.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Κριτήρια Εγγραφής Θεμάτων

Προκειμένου να αναπτυχθεί και να επικυρωθεί η μέθοδος, μια κοόρτη προσυμπτωματικού ελέγχου ασθενών με ΣΔ Τύπου 2 και υγιών ατόμων ελέγχου αξιολογήθηκε σε μια πιλοτική μελέτη εγκάρσιας τομής. Συνολικά 30 ασθενείς με ΣΔ τύπου 2 που παρακολουθούσαν το Νεφρολογικό Τμήμα Εξωτερικών Ιατρείων και το Τμήμα Εξωτερικών Ιατρείων Διαβήτη και Μεταβολικών Νόσων χωρίστηκαν σε 3 ομάδες σύμφωνα μεαλβουμίνη ούρων/αναλογία κρεατινίνης(UACR) ως εξής: 10 ασθενείς με φυσιολογική αλβουμινουρία (A1, που ορίζεται ως UACR < 30 mg/g), 10 με μικρολευκωματινουρία (A2, UACR 30–300 mg/g) και 10 με μακρολευκωματινουρία (A3, UACR > 300 mg/ σολ). Δέκα υγιείς μάρτυρες (C) που ταιριάζουν με την ηλικία και το φύλο που παρακολουθούσαν ένα γραφείο γενικού ιατρού για εξετάσεις ρουτίνας χωρίς γνωστό ιστορικό νεφρικών παθήσεων και χωρίς ΣΔ (εξαιρείται με τιμή HbA1c μικρότερη ή ίση με 5,6%) εγγράφηκαν επίσης σε αυτό μελέτη

Όλοι οι ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη είχαν ελάχιστη 5-ετή διάρκεια ΣΔ, σταθερή νεφρική λειτουργία για τουλάχιστον 2 χρόνια, καλό έλεγχο της αρτηριακής πίεσης (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for βιοψία νεφρού(έλλειψη αιματουρίας και άλλων αιτιών πρωτεϊνουρίας, χωρίς ταχεία μείωση του GFR).

3.2. Δήλωση Δεοντολογίας

Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας στην Έρευνα του Ιδρύματος (Board of Human Studies-"Victor Babes" University of Medicine and Pharmacy Timisoara, Nr. 15/12.09.2016 ; Επαρχιακό Νοσοκομείο Επειγόντων Περιστατικών, Αρ. 100/23.11.2016). Όλοι οι ασθενείς και οι μάρτυρες συμφώνησαν να συμμετάσχουν στη μελέτη υπογράφοντας μια ενημερωμένη φόρμα συγκατάθεσης.

3.3. Εργαστηριακές Εκτιμήσεις

Ο γαγγλιοσίδης των ούρων 30 ασθενών με ΣΔ Τύπου 2 διερευνήθηκε σε μια πιλοτική μελέτη εγκάρσιας τομής με μια συγκριτική ανάλυση με 10 υγιείς μάρτυρες. Οι βιοχημικές παράμετροι αναφέρονται σε ουρία και κρεατινίνη ορού, πρωτεϊνουρία 24 ωρών, UACR, ίζημα ούρων και καλλιέργεια ούρων. Όλοι οι ασθενείς ήταν αρνητικοί για ουρολοιμώξεις. Η σύνθεση των φυσικών μιγμάτων γαγγλιοσιδίων ανιχνεύθηκε από δείγματα ούρων που συλλέχθηκαν 24 ώρες. Τα δείγματα ούρων των ασθενών και των μαρτύρων αποθηκεύτηκαν βραχυπρόθεσμα στους -20 ◦C και αποψύχθηκαν πριν από τον προσδιορισμό.ΧΝΝορίστηκε σύμφωνα με την οδηγία KDIGO για την αξιολόγηση καιδιαχείριση της χρόνιας νεφρικής νόσου. Ο eGFR υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τοχρόνια νεφρική νόσοςτύπος εξίσωσης συνεργασίας επιδημιολογίας (εξίσωση κρεατινίνης CKD-EPI 2009) [16].

3.4. Εκχύλιση και καθαρισμός γαγγλιοσίδης

Η εκχύλιση γαγγλιοσίδης ακολούθησε τη μέθοδο που αναπτύχθηκε από τους Svennerholm και Fredman [17] και τροποποιήθηκε από τους Vukeli´c et al. [18]. Προηγουμένως προσαρμόσαμε αυτό το πρωτόκολλο για την εκχύλιση και τον καθαρισμό γαγγλιοσιδών από σωματικά υγρά και το εφαρμόσαμε σε γαγγλιοσίδες εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ). Η μέθοδος περιγράφεται λεπτομερώς στην προηγούμενη μελέτη μας σχετικά με την ανάλυση προφίλ και τον κατακερματισμό των γαγγλιοσιδών του ΕΝΥ με φασματομετρία μάζας [19]. Εν συντομία, τα λιπίδια εκχυλίστηκαν δύο φορές χρησιμοποιώντας μίγμα χλωροφορμίου (C)/μεθανόλης (Μ)/νερού (W) σε συνολική αναλογία όγκου 1:2:0.75 C/M/W, με το "W" να αντιστοιχεί στα ούρα? Επομένως, το μείγμα περιείχε 4 mL C, 8 mL M και 3 mL δείγματος ούρων. Το χλωροφόρμιο και η μεθανόλη αναλυτικής ποιότητας αγοράστηκαν από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία) και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό. Μετά τον πλήρη διαχωρισμό των φάσεων, ακολουθώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται στο [19], συλλέχθηκε η ανώτερη φάση που περιείχε πολικά γλυκοσφιγγολιπίδια.

Ο καθαρισμός των συλλεχθέντων ακατέργαστων γαγγλιοσιδίων επιτεύχθηκε σε διάφορα στάδια [19]: η απομάκρυνση των κατακρημνισμένων συμπλοκών πρωτεΐνης-άλατος, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση, διήθηση γέλης σε στήλη Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, ΗΠΑ ) για την απομάκρυνση μολυσματικών ουσιών χαμηλού μοριακού βάρους και τέλος, ολονύκτια αιμοκάθαρση στους 4 ◦C έναντι του νερού. Οι γαγγλιοσίδες εκχυλίστηκαν υπό ίδιες συνθήκες από όλα τα δείγματα ούρων, δίδοντας τα μίγματα Α1 (νορμολευκωματινουρία), Α2 (μικρολευκωματινουρία), Α3 (μακρολευκωματινουρία) και C (μάρτυρας).

3.5. Προετοιμασία δείγματος για Φασματομετρία Μάζας

Τα καθαρισμένα εκχυλίσματα γαγγλιοσίδης Α1, Α2, Α3 και C εξατμίστηκαν έως πλήρης ξηρότητα σε σύστημα SpeedVac Concentrator SPD 111 V (Savant, Düsseldorf, Γερμανία) συνδεδεμένο με αντλία κενού. Για τη διαλογή MS, κάθε ξηρό εκχύλισμα διαλύθηκε σε καθαρή μεθανόλη για να δημιουργηθεί το αποθεματικό διάλυμα και αποθηκεύτηκε στους -20 ◦C. Πριν από την ανάλυση MS, τα μητρικά διαλύματα φυγοκεντρήθηκαν σε φυγόκεντρο μοντέλου Sigma 2–16 (Sartorius AG, Göttingen, Γερμανία). Για την έγχυση Orbitrap MS, λήφθηκαν δείγματα εργασίας με συγκέντρωση 5 pmol·μL-1 σε καθαρή μεθανόλη με αραίωση κλασμάτων από το μητρικό διάλυμα. Η συγκέντρωση γαγγλιοσίδης στο εγχυόμενο διάλυμα υπολογίστηκε για μέσο μοριακό βάρος 2000 g mol−1.

3.6. Φασματομετρία μάζας Orbitrap με nanoESI

Τα πειράματα MS πραγματοποιήθηκαν σε φασματόμετρο μάζας LTQ Orbitrap Velos Pro™ (Thermo Fisher Scientific, Βρέμη, Γερμανία) εξοπλισμένο με πηγή nanoES εκτός σύνδεσης ES 259 ​​(Thermo Fisher, Βρέμη, Γερμανία).

Το όργανο είναι ένα υβριδικό φασματόμετρο μάζας που συνδυάζει δύο διαφορετικούς τύπους αναλυτών μάζας και παρέχει πληθώρα πλεονεκτημάτων: υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια, καλή ποιότητα δεδομένων και ταχύτητα ανάλυσης, δυνατότητα ανίχνευσης δευτερευόντων συστατικών σε πολύπλοκα μείγματα, χαμηλή κατανάλωση δείγματος, και αποφυγή διασταυρούμενης εξέτασης και μεταφοράς από δείγμα σε δείγμα.

Ο πρώτος αναλυτής είναι μια γραμμική τετραπολική παγίδα ιόντων διπλής πίεσης ικανή να απομονώσει ένα ιόν με συγκεκριμένη αναλογία μάζας προς φορτίο (m/z) και να το ενεργοποιήσει βάζοντας κινητική ενέργεια στο ιόν με τη συγκεκριμένη σειρά m/z να προκαλέσει διάσταση που προκαλείται από σύγκρουση. Ο δεύτερος αναλυτής είναι το Orbitrap, το οποίο αποτελείται από ένα κυλινδρικό εξωτερικό ηλεκτρόδιο και ένα εσωτερικό ηλεκτρόδιο της κάννης, που παγιδεύει τα ιόντα σε κυκλικές τροχιές γύρω από το εσωτερικό ηλεκτρόδιο. Έχει εξαιρετική ικανότητα ανάλυσης και προσφέρει τη δυνατότητα προσδιορισμού της αλληλουχίας πολύπλοκων ιοντικών ειδών σε πειράματα πολλαπλών σταδίων MS (MSn ) με αποτελεσματικές τεχνικές κατακερματισμού.

Τριχοειδή βοριοπυριτικά (μήκους 10 cm) τραβήχτηκαν με εξολκέα μικροσιφώνου Sutter p-97 για να παραχθούν τριχοειδή ηλεκτροψεκασμού με μεγέθη άκρων 10 μm και μήκη κωνικότητας 4 mm. Ένας όγκος 10 µL του διαλύµατος σε συγκέντρωση 5 pmol·µL-1 σε µεθανόλη εισήχθη στο πίσω µέρος του ποµπού και ένα σύρµα πλατίνας 0,25 mm εισήχθη στο διάλυµα. Οι τιμές δυναμικού που εφαρμόστηκαν στο σύρμα πλατίνας και στον κώνο προσαρμόστηκαν μόνιμα για να επιτευχθεί ένας αποτελεσματικός ιονισμός των εξαρτημάτων. Η διαδικασία nanoESI ξεκίνησε με τη ρύθμιση των παραμέτρων του οργάνου ως εξής: τάση nanoESI, 0,80 kV; τάση κώνου, 40–60 V; θερμοκρασία αποδιάλυσης, 80 ◦C; Επίπεδο RF φακού S, 60%. Αυτές οι τιμές των παραμέτρων MS ενίσχυσαν τον ιονισμό και έναν σταθερό ψεκασμό και, ταυτόχρονα, ελαχιστοποίησαν τον κατακερματισμό στην πηγή του ασταθούς υπολείμματος Neu5Ac που συνδέεται στον πυρήνα ολιγοσακχαρίτη του μορίου γαγγλιοσίδης.

Όλα τα φάσματα μάζας (MS και διαδοχικά MS) αποκτήθηκαν σε λειτουργία HR, ανίχνευση τρόπου λειτουργίας αρνητικών ιόντων και εντός του εύρους 200–2000 m/z. Ελήφθησαν σαρώσεις MS με ανάλυση 60.000. Ο χειρισμός και ο έλεγχος του φασματόμετρου μάζας έγινε από το LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Βρέμη, Γερμανία) και η απόκτηση και η επεξεργασία δεδομένων MS επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Βρέμη, Γερμανία).

Πειράματα MS/MS πραγματοποιήθηκαν στο LTQ με CID στην κυψέλη σύγκρουσης χρησιμοποιώντας καθαρότητα ηλίου 5.0 σε πίεση 50 psi ως αέριο σύγκρουσης. Οι σαρώσεις MS/MS αποκτήθηκαν με ανάλυση 20,000. Η επιλογή ιόντων και ο κατακερματισμός πραγματοποιήθηκαν χειροκίνητα. Τα πρόδρομα ιόντα επιλέχθηκαν σε ένα πλάτος απομόνωσης μονάδας 1 m/z και κατακερματίστηκαν με HCD χρησιμοποιώντας ενέργειες μεταβλητής σύγκρουσης εντός του εύρους 30-80 eV για την ενίσχυση της κάλυψης των ιόντων θραυσμάτων.

Τα TIC και τα φάσματα μάζας που προέκυψαν από το συνδυασμό των συσσωρευμένων σαρώσεων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), το οποίο επιτρέπει την εξαγωγή των φασμάτων, καθώς και την εξομάλυνση και αφαίρεση τους.

Πριν από τα πειράματα, η κλίμακα m/z βαθμονομήθηκε εξωτερικά χρησιμοποιώντας την ειδική αναφορά που είναι εμπορικά γνωστή ως Pierce® ESI Negative Ion Solution από την Thermo Scientific (Waltham, MA, ΗΠΑ). Στη λειτουργία αρνητικού ιόντος, αυτό το πρότυπο παρείχε ένα φάσμα με μια δίκαιη ιοντική κάλυψη του εύρους m/z που σαρώθηκε τόσο σε πειράματα MS όσο και σε διπλά πειράματα MS.

Για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών nanoESI MS και MS/MS σε τρόπο λειτουργίας αρνητικών ιόντων, σύγκριση και αξιολόγηση δεδομένων, μετρήθηκαν τα ακόλουθα τυπικά κλάσματα γαγγλιοσίδης, τα οποία είναι διαθέσιμα στο εμπόριο: GM1 (εγκέφαλος βοοειδών). GD1a, GD1b, GT1b και GQ1b (εγκέφαλος χοίρου) και GM3 και GD3 (βόειο γάλα) από την Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, ΗΠΑ), καθώς και ολόκληρο το εκχύλισμα γαγγλιοσίδης από εγκέφαλο βοοειδών, εμπορικά γνωστό ως Cronassial μείγμα, από το Abano Terme (Πάντοβα, Ιταλία).

3.7. Συντομογραφία του Γαγγλιοσίδη

Για την εκχώρηση γαγγλιοσιδίων, το σύστημα συντομογραφίας που εισήχθη το 1980 από τον Svenner-holm [20], μαζί με τις συστάσεις από το 1998 της Επιτροπής Βιοχημικής Ονοματολογίας IUPAC-IUB, [21] εφαρμόστηκε ως εξής:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a ή GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV{40}}Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II{3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 ή 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 ή 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. Ερμηνεία δεδομένων MS

Επειδή μέχρι σήμερα δεν είναι διαθέσιμο αποκλειστικό λογισμικό υπολογιστή, βάσεις δεδομένων ή άλλες υπηρεσίες πληροφορικής που να βοηθούν την ερμηνεία της διαλογής γαγγλιοσιδών και των διαδοχικών φασμάτων μάζας, σε αυτή τη μελέτη, τα ανιχνευμένα μοριακά ιόντα αντιστοιχίστηκαν σε είδη γαγγλιοσιδίων με ακριβή υπολογισμό μάζας και με βάση από τις πληροφορίες που είχαμε αποκτήσει προηγουμένως σχετικά με αυτόν τον τύπο γλυκοσφιγγολιπιδίου και τις γνωστές οδούς βιοσύνθεσης. Στην ερμηνεία των δεδομένων MS και MS/MS και των υπολογισμών μάζας, μας βοήθησε ο μεγάλος κατάλογος μοριακών ιόντων γαγγλιοσίδης και θραυσμάτων που έχουμε εντοπίσει και χαρακτηρίσει σε διάφορους ανθρώπινους ιστούς και υγρά μέχρι σήμερα χρησιμοποιώντας προηγμένες προσεγγίσεις MS. Αυτές οι δομές αντιπροσωπεύουν τις αρχικές μας βάσεις δεδομένων, οι οποίες συμπεριλήφθηκαν στις προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες μας [12,19,22-31]. Τα νέα είδη που αναφέρονται σε αυτήν την εργασία ολοκληρώνουν το υπάρχον αρχείο γαγγλιοσιδών μας.

Η αντιστοίχιση των ιόντων ραχοκοκαλιάς ολιγοσακχαριτών που δημιουργήθηκαν εντός του HCD MS/MS ακολούθησε τη γενικά αποδεκτή ονοματολογία [24,25].

4. Συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε μια προσέγγιση βασισμένη σε HR MS και tandem MS για τον προσδιορισμό της γαγγλιοσίδης σε DKD με μια συγκριτική ανάλυση ουρικών εκχυλισμάτων από ασθενείς με νόρμο, μικρο- και μακρολευκωματινουρικούς ασθενείς, καθώς και υγιείς μάρτυρες, που πραγματοποιήθηκε κάτω από το ίδιο διάλυμα και οργανικές συνθήκες. Ο τελικός στόχος της μελέτης μας ήταν να προσδιορίσουμε τις αλλαγές που συμβαίνουν στη σύνθεση και τη δομή των νεφρικών γαγγλιοσιδών που εκφράζονται σε DKD έναντι μαρτύρων και σε διαφορετικά στάδια της νόσου.

Η υψηλή ευαισθησία, αναπαραγωγιμότητα, ανάλυση και ακρίβεια μάζας που παρέχεται από την πλατφόρμα MS που βελτιστοποιήθηκε για αυτόν τον σκοπό μας επέτρεψε να διαπιστώσουμε ότι ο βαθμός σιαλυλίωσης του εκφραζόμενου είδους φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου, αντιπροσωπεύοντας δείκτη DKD , ακόμη και στο στάδιο της φυσιολογικής αλβουμινουρίας ασθενών με ΣΔ τύπου 2. Επιπλέον, οι παρατηρούμενες τροποποιήσεις στη σύνθεση του Cer δείχνουν ότι, δίπλα στη δομή της γλυκάνης, η λιπιδική μονάδα μπορεί επίσης να θεωρηθεί μοριακό δακτυλικό αποτύπωμα για στάδια DKD.

Στην πιο προχωρημένη φάση της έρευνας, το MS/MS by HCD χρησιμοποιήθηκε για τη δομική ανάλυση του είδους με πιθανό ρόλο βιοδείκτη. Στην περίπτωση του δείγματος Α3, τα μοριακά ιόντα, τα οποία, σύμφωνα με τον υπολογισμό της μάζας, βρέθηκαν να αντιστοιχούν σε GQ1(d18:1/18:0) και GT1(d18:1/18:{{1 0}}), αντίστοιχα, απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε κατακερματισμό στο κελί σύγκρουσης του οργάνου. Στόχος αυτών των πειραμάτων ήταν η συλλογή πληροφοριών σχετικά με τη λεπτομερή δομική διαμόρφωση του μορίου. Οι βελτιστοποιημένες συνθήκες αλληλουχίας, ιδιαίτερα το εύρος ενέργειας σύγκρουσης και η πίεση αερίου σύγκρουσης, προκάλεσαν ειδικές διασπάσεις των γλυκοσιδικών δεσμών, οι οποίες οδήγησαν στο σχηματισμό ιόντων θραυσμάτων που ανιχνεύθηκαν ως σχετικά σήματα στα διαδοχικά φάσματα μάζας. Αρκετά ιόντα βρέθηκαν διαγνωστικά για ορισμένα ισομερή που σχετίζονται με τον εντοπισμό των τμημάτων Neu5Ac στην υδατανθρακική αλυσίδα του μορίου γαγγλιοσίδης. Με βάση αυτά τα δομικά πληροφοριακά ιόντα αλληλουχίας, ανακαλύψαμε ότι τα GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) και GT1b(d18:1/18: 0) υπάρχουν ισομερή στο δείγμα Α3 και σχετίζονται με μακρολευκωματινουρία.

Τα ληφθέντα αποτελέσματα απαιτούν περαιτέρω επικύρωση ορισμένων υποθέσεων σε διαχρονικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε μεγαλύτερες ομάδες προκειμένου να αποδειχθεί μια σχέση αιτιότητας μεταξύ της πολυπλοκότητας των γαγγλιοσιδών που ανιχνεύονται στα ούραασθενείς DKDκαι η πολύ πρώιμη νεφρική προσβολή στην πορεία του ΣΔ τύπου 2, ακόμη και στο στάδιο της φυσιολογικής λευκωματινουρίας. Ωστόσο, θεωρούμε ότι τα παρόντα ευρήματα ανοίγουν μια ερευνητική κατεύθυνση προς τη διερεύνηση του ρόλου στην εξέλιξη της νόσου που παίζει η σιαλυλίωση, η Ο-ακετυλίωση και η Ο-φουκοζυλίωση των γαγγλιοσιδών, καθώς και οι τροποποιήσεις τους από O-GalNAc και CH3COO-. Μια άλλη ευεργετική πτυχή αυτών των αποτελεσμάτων είναι η πιθανή ανάπτυξη διαδικασιών για πρώιμη διάγνωση DKD με βάση το προφίλ γαγγλιοσιδίων χρησιμοποιώντας προηγμένη φασματομετρία μάζας.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS Ο ρόλος του σακχαρώδους διαβήτη και της υπέρτασης στη χρόνια νεφρική νόσο.J. Ren. Inj. Προηγ.2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed] 

2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, Α.; Israni, AK; Ku, Ε.; Tamura, MK; Li, S. Σύστημα Νεφρικών Δεδομένων ΗΠΑ 2020 Ετήσια Έκθεση Δεδομένων: Επιδημιολογία Νεφρικής Νόσου στις Ηνωμένες Πολιτείες.Είμαι. J. Kidney Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed] 

3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Ενημέρωση παθοφυσιολογίας και διαχείρισης διαβητικής νεφρικής νόσου.J. Med. Αναπλ.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed] 

4. Vallon, V.; Thomson, SC Νεφρική λειτουργία σε μοντέλα διαβητικής νόσου: Το σωληναριακό σύστημα στην παθοφυσιολογία του διαβητικού νεφρού.Annu. Αιδ. Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef] 

5. Milas, Ο.; Gadalean, F.; Vlad, Α.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; et al. Οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες σχετίζονται με βλάβη των ποδοκυττάρων και δυσλειτουργία του εγγύς σωληναριού στο πρώιμο στάδιο της διαβητικής νεφρικής νόσου σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2.J. Diab. Πολύπλοκο.2020, 34, 107479. [CrossRef] 

6. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, Α.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; et al. Τα επίπεδα mRNA που σχετίζονται με τα ποδοκύτταρα των ούρων συσχετίζονται με τη δυσλειτουργία του εγγύς σωληνίσκου στην πρώιμη διαβητική νεφροπάθεια του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2.Diabetol. Metab. Syndr.2017, 9, 31–43. [CrossRef] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Song, JH; Choo, YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Μείωση της γαγγλιοσίδης GM3 σε διαβητικά σπειράματα αρουραίων που προκαλούνται από στρεπτοζωκίνη.Life Sci.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef] 

8. Masson, Ε.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, Ν.; Λαγκάρντ, Μ.; El Bawab, S. a-Series Γαγγλιοσίδες Μεσολαβούν στις Επιδράσεις των Τελικών Προϊόντων Προηγμένης Γλυκίωσης στον Πολλαπλασιασμό των Περικυττάρων και των Μεσαγγειακών Κυττάρων: Ένας κοινός μεσολαβητής για τη μικροαγγειοπάθεια του αμφιβληστροειδούς και του νεφρού;Διαβήτης2005, 54, 220–227. [CrossRef] 

9. Zador, Ζ.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Ένας ρόλος για τη συσσώρευση γλυκοσφιγγολιπιδίων στη νεφρική υπερτροφία του σακχαρώδους διαβήτη που προκαλείται από στρεπτοζοκίνη.J. Clin. Ερευνήστε.1993, 91, 797–803. [CrossRef]

10. Ene, CD; Penescu, Μ.; Anghel, Α.; Neagu, Μ.; Budu, V.; Nicolae, I. Παρακολούθηση Διαβητικής Νεφροπάθειας από Κυκλοφορούντες Γαγγλιοσίδες.J. Immunoass. Immunochem.2016, 37, 68–79. [CrossRef]