Επιδράσεις λεύκανσης του δέρματος και κατά των ρυτίδων βιοδραστικών ενώσεων που απομονώνονται από το κέλυφος φιστικιών με χρήση εξαγωγής με τη βοήθεια υπερήχων

Επικοινωνία:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 και Jin Woo Kim 1,2,3,*

Αφηρημένη:Η μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης με τη βοήθεια υπερήχων (ΗΑΕ) για ταυτόχρονη βελτιστοποίηση εξαρτώμενων μεταβλητών, συμπεριλαμβανομένων της δραστηριότητας δέσμευσης ριζών DPPH (RSA), της αναστολής δραστηριότητας τυροσινάσης (TAI) και της αναστολής της δραστηριότητας κολλαγενάσης (CAI) εκχυλισμάτων κελύφους φυστικιού. Τα αποτελέσματα των κύριων μεταβλητών συμπεριλαμβανομένου του χρόνου εξαγωγής (5.0~55.0 min, X1), της θερμοκρασίας εξαγωγής (26.0~94.0 ◦C). , Χ2) και η συγκέντρωση αιθανόλης (0.0 τοις εκατό ~99,5 τοις εκατό, Χ3) βελτιστοποιήθηκαν. Με βάση πειραματικές τιμές από κάθε συνθήκη, προέκυψαν μοντέλα τετραγωνικής παλινδρόμησης για την πρόβλεψη των βέλτιστων συνθηκών. Ο συντελεστής προσδιορισμού (R2) της ανεξάρτητης μεταβλητής ήταν στο εύρος των 0.89~0.96, γεγονός που δείχνει ότι το μοντέλο παλινδρόμησης είναι κατάλληλο για την πρόβλεψη. Κατά την πρόβλεψη των βέλτιστων συνθηκών των ΗΑΕ με βάση τη μέθοδο υπέρθεσης, εντοπίστηκε χρόνος εκχύλισης 31,2 λεπτών, θερμοκρασία εκχύλισης 36,6 ◦C και συγκέντρωση αιθανόλης 93,2 τοις εκατό. Υπό αυτές τις συνθήκες, προβλέφθηκαν RSA 74,9 τοις εκατό , TAI 50,6 τοις εκατό και CAI 86,8 τοις εκατό, που δείχνουν καλή συμφωνία με τις πειραματικές τιμές. Μια αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης έδειξε ότι το εκχύλισμα κελύφους φυστικιού μείωσε τα επίπεδα mRNA τουτυροσινάση-σχετικά γονίδια πρωτεΐνης-1 και μεταλλοπρωτεϊνάσης θεμέλιας ουσίας-3 σε Β16-F0 κύτταρα. Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε τολεύκανση δέρματοςκαι αντιρυτιδικά αποτελέσματα των εκχυλισμάτων κελύφους φυστικιού σε πρωτεΐνες καθώς και σε επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, και τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το κέλυφος φυστικιού είναι ένα αποτελεσματικό καλλυντικό υλικό γιαλεύκανση δέρματοςαντιρυτιδικά αποτελέσματα. Με βάση αυτή τη μελέτη, το κέλυφος του φιστικιού, το οποίο θεωρήθηκε υποπροϊόν, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη υγιεινών τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών.

Λέξεις-κλειδιά:κέλυφος φυστικιού? βελτιστοποίηση;λεύκανση δέρματος; αντιρυτιδικό; αντιοξειδωτικό;τυροσινάση; κολλαγενάση; πρωτεΐνη που σχετίζεται με ανθρώπινη τυροσινάση-1 (TRP-1); μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας (MMP)

Κάντε κλικ στο οργανικόπροϊόντα περιποίησης της επιδερμίδας που λεύκουν το cistanche.

1. Εισαγωγή

Η μελανίνη είναι μια πολυμερής χρωστική ουσία καφέ ή μαύρου χρώματος που συντίθεται από θεμελιανοσώματα μελανοκυττάρων στην επιδερμίδα. Η κύρια λειτουργία του είναι να εμποδίζει τις υπεριώδεις ακτίνες (UV) για να προστατεύει το δέρμα. Εναλλακτικά, η υπερβολική παραγωγή του μπορεί να προκαλέσει σκουρόχρωμα, όπως μέλασμα, κρεατοελιές και κηλίδες ηλικίας [1-3]. Η τυροσινάση είναι ένα κύριο ένζυμο που καταλύει τις αντιδράσεις αυτοοξείδωσης και πολυμερισμού, μέσω των οποίων η τυροσίνη μετατρέπεται σε ντοπακινόνη μέσω της διυδροξυφαινυλαλανίνης και παράγει μελανίνη μέσω της ντοπαχρωματοποίησης της βιοσύνθεσης μελανίνης [4]. Έτσι, χρησιμοποιείται ευρέως για τη μείωση ή την εξασθένιση της παραγωγής μελανίνης μέσω της αναστολής τουτυροσινάσηδραστηριότητα προκειμένου να ενισχυθεί η λευκαντική επίδραση των καλλυντικών [5]. Η ταχεία εκβιομηχάνιση και η αυξημένη χρήση χλωροφθορανθράκων κατέστρεψαν σοβαρά το προστατευτικό στρώμα του όζοντος της γης, με αποτέλεσμα μεγαλύτερη ποσότητα UV να φτάσει στο έδαφος και να εκθέσει το δέρμα. Αυτή η αύξηση της υπεριώδους ακτινοβολίας επάγει κατά συνέπεια την ενεργό παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) στο ανθρώπινο σώμα, όπως ανιόντα υπεροξειδίου, υπεροξείδια υδρογόνου και ρίζες υδροξυλίου. Τέτοια είδη έχουν προωθήσει τη συνεχή οξείδωση της τυροσίνης, με αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή μελανίνης. Από την άποψη αυτή, διεξάγονται ενεργά μελέτες για την αναστολή τουτυροσινάσηδραστηριότητα καθώς και την αφαίρεση ROS προκειμένου να αναπτυχθούνλεύκανση δέρματοςπαράγοντες [6]. Το κολλαγόνο είναι μια κύρια εξωκυτταρική μήτρα που περιλαμβάνει το 90 τοις εκατό του χόριου. Το κολλαγόνο προστατεύει και δίνει ελαστικότητα στο δέρμα και εμπλέκεται στη μηχανική ακαμψία του δέρματος, στην αντίσταση, στη σύνδεση των συνδετικών ιστών και στον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων [7]. Οι πρωτεΐνες που αποτελούν την εξωκυτταρική μήτρα, όπως το κολλαγόνο, αποσυντίθενται από την κολλαγενάση, όπως η μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας (MMP), προκαλώντας ρυτίδες, μείωση της ελαστικότητας και χαλάρωση του δέρματος [8]. Διάφοροι τύποι MMPs που εκφράζονται με ROS υδρολύουν την αλυσίδα κολλαγόνου, τον συνδετικό ιστό του δέρματος και δημιουργούν την ανώμαλη σταυροσύνδεσή του για να αυξήσουν την αποσύνθεση του κολλαγόνου και να επιταχύνουν το σχηματισμό ρυτίδων [9]. Για το λόγο αυτό, η αναστολή της παραγωγής μελανίνης και της αποσύνθεσης κολλαγόνου μέσω της μείωσης της παραγωγής ROS έχει αποτελέσει το κύριο επίκεντρο για τη λεύκανση του δέρματος και την πρόληψη των ρυτίδων [10]. Αρβουτίνη, κοτζικό οξύ και λινολενικό οξύ, ως καλλυντικά λεύκανσης και ρετινόλη, γαλάτη, ανδαδενοσίνη, ως αντι -τα καλλυντικά για τις ρυτίδες, χρησιμοποιούνται ευρέως τα τελευταία χρόνια. Ωστόσο, η χρήση αυτών των υλικών είναι περιορισμένη, δεδομένης της αστάθειάς τους παρουσία φωτός και θερμότητας καθώς και σε ανεπιθύμητες ενέργειες, συμπεριλαμβανομένου του ερεθισμού του δέρματος και της δερματίτιδας εξ επαφής [11]. Με αυξανόμενο ενδιαφέρον για φυσικά αντιοξειδωτικά για την αντιμετώπιση των ελλείψεων των συμβατικών συστατικών λεύκανσης και κατά των ρυτίδων, εκχυλίσματα φυτικής προέλευσης έχουν χρησιμοποιηθεί ενεργά για την ανάπτυξη βιοδραστικών ενώσεων για φιλικό και ασφαλές δέρμαλεύκανσηκαι αντιρυτιδικά καλλυντικά [12,13].

Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι εκχύλισης που χρησιμοποιούνται σήμερα για την εξαγωγή βιοδραστικών ενώσεων από φυτά. Ωστόσο, η εξαγωγή βιοδραστικών ενώσεων από φυσικές πηγές, ιδιαίτερα φυτά, έχει διεξαχθεί κυρίως μέσω μεθόδων εκχύλισης διαλύτη, ζεστού νερού και Soxhlet, οι οποίες έχουν παρουσιάσει διάφορα μειονεκτήματα, όπως χαμηλή απόδοση εκχύλισης, αποσύνθεση συστατικών, χαμηλή σταθερότητα και υψηλό κόστος λειτουργίας. [14]. Έτσι, έχουν δοκιμαστεί πρόσφατα μέθοδοι εκχύλισης, συμπεριλαμβανομένης της υποβοηθούμενης με υπερήχους, της υποβοηθούμενης από μικροκύματα και της υπερκρίσιμης εξαγωγής [15]. Συγκεκριμένα, ο υπέρηχος είναι ένα ηχητικό κύμα με συχνότητα περίπου 20 kHz ή περισσότερο, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα συμπίεση, σπηλαίωση και σπανιότητα του υγρού, μεγιστοποιώντας έτσι τη μοριακή κίνηση σε σύντομο χρονικό διάστημα για την επίτευξη υψηλής απόδοσης εξαγωγής [16]. Επιπλέον, ο υπέρηχος είναι πλεονεκτικός, καθώς ο χρόνος σύντομης εκχύλισής του ελαχιστοποιεί την αποσύνθεση βιοδραστικών ενώσεων και αξιολογείται ως αποτελεσματική μέθοδος για την εξαγωγή φυσικών συστατικών με αντιοξειδωτικό,λεύκανση, και αντιρυτιδικές ιδιότητες από πολλά φυτά και βότανα [17]. Η βελτιστοποίηση συνθηκών εξαγωγής είναι απαραίτητη για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της εξαγωγής με τη βοήθεια υπερήχων (ΗΑΕ), και η διαδικασία βελτιστοποίησης μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε με πειραματικές είτε με στατιστικές μεθόδους. Η παραδοσιακή μέθοδος ενός παράγοντα κάθε φορά, με όλες τις μεταβλητές να παραμένουν σταθερές και να αλλάζουν μόνο ένας παράγοντας κάθε φορά, έχει περιορισμούς στον προσδιορισμό των διαδραστικών επιδράσεων εάν είναι ένα πείραμα πολλαπλών μεταβλητών. Από την άλλη πλευρά, το RSM παρέχει στατιστικές πληροφορίες σχετικά με τη συσχέτιση μεταξύ μεταβλητών σε πειράματα πολλαπλών μεταβλητών, μαζί με αποτελεσματικά πειράματα που χρησιμοποιούν ελάχιστο αριθμό δειγμάτων, καθώς και σημαντικές μαθηματικές και στατιστικές τεχνικές για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας και της καταλληλότητας του μοντέλου παλινδρόμησης. Διάφορα σχέδια RSM, όπως πλήρης παραγοντικός σχεδιασμός, σχεδιασμός Box-Behnken και κεντρικός σύνθετος σχεδιασμός (CCD), έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως. Μεταξύ αυτών, το CCD είναι πολύ αποτελεσματικό και επομένως παρέχει πολλές πληροφορίες για τα αποτελέσματα μεταβλητής πειράματος και το συνολικό πειραματικό σφάλμα, με ελάχιστο αριθμό απαιτούμενων εκτελέσεων [18]. Ως εκ τούτου, σε πολλές υπάρχουσες μελέτες, το CCD έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ανάπτυξη, βελτίωση και βελτιστοποίηση της διαδικασίας συνθήκες για την εξαγωγή διαφόρων αντιοξειδωτικών και άλλων μεταβολιτών από φυσικά προϊόντα.

Το φυστίκι (Arachis hypogaea) είναι ετήσιο φυτό που ανήκει στην οικογένεια των ψυχανθών. Καλλιεργείται σε περισσότερες από 50 χώρες σε όλο τον κόσμο, συμπεριλαμβανομένης της Νότιας Κορέας, της Ινδίας, της Κίνας και των Ηνωμένων Πολιτειών [19]. Τα φιστίκια είναι πλούσιες πηγές πρωτεϊνών (25 τοις εκατό), λιπιδίων (47 τοις εκατό) και υδατανθράκων (16 τοις εκατό), καθώς και μέταλλα, βιταμίνες, νιασίνη, ακόρεστα λιπαρά οξέα, ανδρολεϊκά οξέα [20]. Καταναλώνονται είτε ως μη επεξεργασμένα είτε ως επεξεργασμένα προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων των ξηρών καρπών, του βουτύρου και του μαγειρικού λαδιού. Υπολογίζεται ότι η παγκόσμια ετήσια παραγωγή φιστικιών ανέρχεται σε 4,1 εκατομμύρια τόνους συνολικά και ότι το κέλυφος του φιστικιού αντιπροσωπεύει το 35 τοις εκατό ~ 40 τοις εκατό του συνολικού βάρους του φιστικιού [21]. Υπολογίζεται ότι περισσότεροι από 1,5 εκατομμύρια τόνοι φιστικιών απορρίπτονται ετησίως ως υποπροϊόντα. Ωστόσο, δεδομένου ότι μόνο ένα μέρος των φιστικιών χρησιμοποιείται ως ζωοτροφή και ότι τα περισσότερα από αυτά αποτεφρώνονται ή υγειονομούνται σε χώρους υγειονομικής ταφής, προκαλώντας κόστος διάθεσης και περιβαλλοντικά προβλήματα, είναι απαραίτητο να παραχθούν υλικά υψηλής προστιθέμενης αξίας με χρήση κελύφους φυστικιών για να ξεπεραστεί το πρόβλημα των υποπροϊόντων [22 ]. Προηγούμενες μελέτες για τα αντιοξειδωτικά έχουν δείξει ότι έχουν αναφερθεί αντιφλεγμονώδεις και αντι-παχυσαρκικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων από δέρμα φυστικιών [23,24]. Ωστόσο, μέχρι στιγμής, δεν υπάρχει έρευνα για την παραγωγή λειτουργικών καλλυντικών υλικών για βελτίωσηλεύκανσηκαι αντιρυτιδικά αποτελέσματα χρησιμοποιώντας βιοδραστικές ενώσεις από το κέλυφος των φιστικιών. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη εξήγαγε βιοδραστικές ενώσεις από ένα κέλυφος φιστικιού χρησιμοποιώντας την υποβοηθούμενη με υπερήχους εκχύλιση (ΗΑΕ) για να επιβεβαιώσει τα αντιοξειδωτικά, λευκαντικά και αντιρυτιδικά τους αποτελέσματα και παρουσίασε περαιτέρω μια βέλτιστη κατάσταση ΗΑΕ χρησιμοποιώντας τη μέθοδο επιφάνειας απόκρισης (RSM) και αύξησε τη λειτουργικότητα των εκχυλισμάτων προκειμένου να επιβεβαιωθεί η δυνατότητα χρήσης του ως τρόφιμα, καλλυντικά και ιατρικά συστατικά.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

2.1. Τοποθέτηση των μοντέλων RSM

Σε αυτήν την εργασία, η θερμοκρασία εκχύλισης, ο χρόνος εκχύλισης και η συγκέντρωση αιθανόλης επιλέχθηκαν ως οι κύριες μεταβλητές του CCD χρησιμοποιώντας το προκαταρκτικό πείραμα ενός παράγοντα κάθε φορά για τον προσδιορισμό των σημαντικών μεταβλητών που επηρεάζουν τα ΗΑΕ (Πίνακας 1).

Στη συνέχεια, κατασκευάστηκαν 17 πειραματικές εκτελέσεις, συμπεριλαμβανομένων 3 επαναλήψεων στο κεντρικό σημείο χρησιμοποιώντας 3-μεταβλητές και 5 επίπεδα CCD. Τα πειραματικά σφάλματα ελαχιστοποιήθηκαν με τυχαιοποίηση της πειραματικής σειράς προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί ο αντίκτυπος της ανεξήγητης μεταβλητότητας. Τα πειραματικά και τα προβλεπόμενα αποτελέσματα για τη δραστηριότητα καθαρισμού ριζών DPPH (RSA),τυροσινάσηη αναστολή δραστηριότητας (TAI) και η αναστολή της δραστηριότητας της κολλαγενάσης (CAI) παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Για να προσδιοριστεί η συσχέτιση μεταξύ των 17 πειραματικών σειρών των πειραματικών συνθηκών CCD και των πειραματικών αποτελεσμάτων, προτάθηκαν μοντέλα πολλαπλής παλινδρόμησης για την πρόβλεψη των βέλτιστων επιπέδων αυτών των 3 μεταβλητών. Εφαρμόζοντας ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης στα πειραματικά δεδομένα, οι εξαρτημένες μεταβλητές (Y) και οι δοκιμασμένες μεταβλητές συσχετίστηκαν με τις ακόλουθες εξισώσεις τετραγωνικής παλινδρόμησης (Πίνακας 3).

Η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) είναι μια στατιστική δοκιμή για την ανάλυση πειραματικών δεδομένων. Υποδιαιρεί τη συνολική διακύμανση ενός συνόλου δεδομένων σε συστατικά μέρη που σχετίζονται με συγκεκριμένες πηγές διακύμανσης προκειμένου να ελεγχθεί μια υπόθεση στις μεταβλητές του μοντελιστή για την εκτίμηση των συνιστωσών διακύμανσης [25]. Η ανάλυση επιφάνειας απόκρισης και η ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συντελεστών, την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των όρων του μοντέλου και την προσαρμογή των μαθηματικών μοντέλων των πειραματικών δεδομένων που στόχευαν στη βελτιστοποίηση της συνολικής περιοχής για τις μεταβλητές απόκρισης [26]. Όπως καθορίζεται από το μοντέλο, οι συντελεστές συσχέτισης (R2) που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της σχέσης μεταξύ των πειραματικών και των προβλεπόμενων αποκρίσεων από μοντέλα παλινδρόμησης ήταν στην περιοχή 0.8862~0.9622. Αυτό υποδηλώνει ότι οι μεταβλητές διεργασίας που αναλύθηκαν εξηγούν περισσότερο από το 88,6 τοις εκατό των ανεξάρτητων μεταβλητών. Το λογισμικό Design-Expert χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των συντελεστών των εξισώσεων τετραγωνικής παλινδρόμησης και η καταλληλότητα του μοντέλου δοκιμάστηκε με ANOVA. Σύμφωνα με τη μονωνυμική τιμή του συντελεστή των εξισώσεων τετραγωνικής παλινδρόμησης παρατίθενται στον Πίνακα 4 και η σειρά προτεραιότητας μεταξύ των βασικών επιδράσεων των ανεξάρτητων μεταβλητών είναι συγκέντρωση αιθανόλης (X3) > θερμοκρασία εκχύλισης (X2) > χρόνος εκχύλισης (X1).

2.2. Επίδραση των Συνθηκών Εκχύλισης στο RSA

Ο Πίνακας 2 δείχνει τα πειραματικά δεδομένα του RSA σύμφωνα με διαφορετικές συνθήκες των ΗΑΕ. Το RSA εκχυλίσματος κελύφους φυστικιού προσδιορίστηκε στην περιοχή από 7,6 τοις εκατό ~ 89,9 τοις εκατό. Το υψηλότερο RSA προσδιορίστηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες εκχύλισης: χρόνος εκχύλισης 55.0 min, θερμοκρασία εκχύλισης 60.{{10}} ◦C και συγκέντρωση αιθανόλης 5. 0.0 τοις εκατό (Εκτέλεση #10). Το χαμηλότερο RSA 7,6 τοις εκατό , σε χρόνο εκχύλισης 30 λεπτών, θερμοκρασία εκχύλισης 60,0 ◦C και συγκέντρωση αιθανόλης 0,0 τοις εκατό, προσδιορίστηκε ως η πειραματική τιμή (Εκτέλεση #13) . Εφαρμόζοντας ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης, τα πειραματικά δεδομένα και οι απαντήσεις συσχετίστηκαν με εξισώσεις τετραγωνικής παλινδρόμησης (Πίνακας 3). Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε ότι το R2 του μοντέλου παλινδρόμησης ήταν 0,9308 (p=0,0027), γεγονός που δείχνει ότι αυτή η εξίσωση μπορούσε να εξηγήσει το 93,0 τοις εκατό των αποτελεσμάτων των πειραματικών συνθηκών, υπονοώντας ότι το μοντέλο ήταν πολύ σημαντικό και μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ακριβή πρόβλεψη η συνάρτηση απόκρισης.

Η επίδραση μιας μεμονωμένης μεταβλητής των ΗΑΕ σε σταθερά επίπεδα άλλων μεταβλητών στο RSA προβλέπεται και φαίνεται στο Σχήμα 1α. Το RSA τείνει να αυξάνεται και μετά να μειώνεται καθώς αυξάνονται όλα τα UAEvariables. Η συγκέντρωση αιθανόλης είχε τη μεγαλύτερη επίδραση στο RSA μεταξύ των τριών μεταβλητών των ΗΑΕ, ενώ ο χρόνος εκχύλισης και η θερμοκρασία εκχύλισης είχαν τη μικρότερη επίδραση στο RSA. Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με τα αποτελέσματα ANOVA στα οποία οι συγκεντρώσεις αιθανόλης παρουσίασαν πιο σημαντική επίδραση (p=0.0002) στο RSA όπως φαίνεται στον Πίνακα 4. Το αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης μεταξύ ανεξάρτητων μεταβλητών στο RSA οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 3D επιφανειακές καμπύλες απόκρισης. Η θερμοκρασία εκχύλισης και ο χρόνος εκχύλισης άλλαξαν ταυτόχρονα στο σταθερό επίπεδο συγκέντρωσης αιθανόλης (Εικόνα 2Α). Καθώς αυξάνονταν οι δύο μεταβλητές (θερμοκρασία εξαγωγής και χρόνος), το RSA αυξήθηκε στο μέγιστο επίπεδο και στη συνέχεια μειώθηκε ξανά. Το υψηλότερο RSA λήφθηκε σε θερμοκρασία εκχύλισης 56,1 ◦C, που επομένως υποδηλώνει ότι η εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων με αντιοξειδωτικές δυνατότητες, όπως οι πολυφαινόλες, αυξάνεται με την καταστροφή συστατικών του φυτικού τοιχώματος, όπως η λιγνίνη, σε θερμοκρασίες έως 56,1 ◦C. Ωστόσο, σε υψηλότερες θερμοκρασίες, το RSA μειώθηκε λόγω της αποσύνθεσης ή του πολυμερισμού των αντιοξειδωτικών συστατικών. Το Σχήμα 2Β, Γ δείχνει ότι το RSA δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τον χρόνο ή τη θερμοκρασία εκχύλισης, ενώ το RSA επηρεάστηκε σημαντικά από τη συγκέντρωση αιθανόλης, η οποία ήταν η υψηλότερη στη συγκέντρωση αιθανόλης 61,0 τοις εκατό και η οποία επίσης μειώθηκε ξανά. Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με αυτό του πειράματος εκχύλισης με ζεστό νερό της Lespedeza cuneata από τους Kim et al. στο οποίο το RSA επηρεάστηκε περισσότερο από τη συγκέντρωση αιθανόλης παρά από τη θερμοκρασία εκχύλισης και το RSA ήταν το μέγιστο στο εύρος συγκέντρωσης αιθανόλης από 60 τοις εκατό ~ 70 τοις εκατό [27]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αποτελεσματικότητα εκχύλισης του δυαδικού διαλύτη (νερό και αιθανόλη) είναι πιο αποτελεσματική για την εκχύλιση με έναν μόνο διαλύτη στα ΗΑΕ από κελύφη φιστικιών.

2.3. Επίδραση των Συνθηκών Εκχύλισης στο TAI

Τυροσινάσηείναι ένα ένζυμο που προάγει την παραγωγή μελανίνης με την οξείδωση της τυροσίνης στο βασικό στρώμα της επιδερμίδας και η αναστολή αυτού του ενζύμου είναι απαραίτητη για την ενίσχυση τηςλεύκανση δέρματος [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >θερμοκρασία εκχύλισης (p < {0}},0598) > χρόνος εκχύλισης (p < 0,4329), που επιβεβαίωσε ότι η επίδραση της συγκέντρωσης αιθανόλης ήταν η πιο σημαντική στο TAI.

Για να συγκριθεί η επίδραση των συνθηκών των ΗΑΕ στο TAI, χρησιμοποιήθηκε η γραφική παράσταση διαταραχής για την αξιολόγηση της επίδρασης μεμονωμένων μεταβλητών στο TAI με τον καθορισμό δύο μεταβλητών στο κεντρικό σημείο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1β, το TAI έδειξε διαφορετικό μοτίβο σε σύγκριση με το προηγούμενο πείραμα RSA. αυξήθηκε καθώς αυξανόταν η συγκέντρωση αιθανόλης, ενώ ο χρόνος εκχύλισης δεν επηρέασε σημαντικά το TAI. Η σημαντική αναλογική αύξηση του TAI με τη συγκέντρωση αιθανόλης μπορεί να εξηγηθεί από τα αποτελέσματα ANOVA. Το TAI επηρεάστηκε σημαντικά από τον κύριο όρο συγκέντρωσης αιθανόλης (X3) και (p < 0.05)="" ο="" τετραγωνικός="" όρος="" δεν="" είναι="" στατιστικά="" σημαντικός,="" δείχνοντας="" έτσι="" μια="" ισχυρή="" αναλογική="" σχέση="" μεταξύ="" της="" συγκέντρωσης="" tai="" και="" αιθανόλης.="" η="" καμπύλη="" επιφάνειας="" απόκρισης="" 3d="" είναι="" η="" γραφική="" αναπαράσταση="" της="" εξίσωσης="" τετραγωνικής="" παλινδρόμησης="" και="" των="" αποτελεσμάτων="" του="" tai,="" όπως="" επηρεάζεται="" από="" τη="" θερμοκρασία="" εκχύλισης="" (x1),="" τον="" χρόνο="" εκχύλισης="" (x2)="" και="" τη="" συγκέντρωση="" αιθανόλης="" (x3).="" το="" σχήμα="" 3α="" απεικονίζει="" το="" αποτέλεσμα="" αλληλεπίδρασης="" του="" χρόνου="" εκχύλισης="" και="" της="" συγκέντρωσης="" αιθανόλης="" στο="" tai.="" το="" αποτέλεσμα="" επιβεβαίωσε="" ότι="" ο="" χρόνος="" εκχύλισης="" δεν="" έδειξε="" σημαντική="" επίδραση="" στο="" tai,="" ενώ="" η="" συγκέντρωση="" της="" αιθανόλης="" είχε="" ισχυρή="" αναλογική="" σχέση="" με="" το="" tai.="" ομοίως,="" όπως="" φαίνεται="" στο="" σχήμα="" 3β,="" το="" tai="" εξαρτιόταν="" περισσότερο="" από="" τη="" συγκέντρωση="" αιθανόλης="" παρά="" από="" τη="" θερμοκρασία="" εκχύλισης="" και="" το="" υψηλότερο="" tai="" επιτεύχθηκε="" καθώς="" η="" συγκέντρωση="" αιθανόλης="" αυξήθηκε="" στο="" 99,5="" τοις="" εκατό.="" κατά="" την="" εξερεύνηση="" των="" συνθηκών="" των="" ηαε="" για="" το="" μέγιστο="" tai,="" οι="" μέγιστες="" τιμές="" συνθηκών="" tai="" προβλέφθηκαν="" να="" είναι="" 3{{2{0}},0="" λεπτά,="" 26,3="" ◦c="" και="" 99,5="" τοις="" εκατό="" .="" αυτό="" το="" αποτέλεσμα="" είναι="" παρόμοιο="" με="" αυτό="" που="" αναφέρουν="" οι="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" σε="" μια="" μελέτη="" για="" τη="" βιολογική="" δραστηριότητα="" των="" φύλλων="" κιτρώνας,="" όταν="" 20,0="" τοις="" εκατό="" ~="" 80,0="" τοις="" εκατό="" αιθανόλης="" χρησιμοποιήθηκε="" ως="" διαλύτης="" εκχύλισης,="" το="" tai="" αυξήθηκε="" αναλογικά="" ως="" απόκριση="" στην="" αύξηση="" της="" συγκέντρωσης="" της="" αιθανόλης="" και="" έδειξε="" μέγιστη="" αξία="" στην="" εκχύλιση="" με="" χρήση="" 80="" τοις="" εκατό="" αιθανόλης.="" αυτό="" υποδηλώνει="" ότι="" η="" χρήση="" υψηλότερης="" συγκέντρωσης="" αιθανόλης="" είναι="" πλεονεκτική="" στην="" εκχύλιση="" βιοδραστικών="" ενώσεων="">λεύκανση δέρματοςαποτέλεσμα από κελύφη φιστικιών ή άλλα φυτά.

2.4. Επίδραση των συνθηκών εξόρυξης στο CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >συγκέντρωση αιθανόλης (ρ=0.0240) > χρόνος εκχύλισης (ρ=0.8505), υποδεικνύοντας έτσι ότι η επίδραση της θερμοκρασίας εκχύλισης και της συγκέντρωσης αιθανόλης ήταν σημαντικές στο CAI.

Το Σχήμα 1γ δείχνει ένα διάγραμμα διαταραχών στο οποίο είναι σταθερές δύο μεταβλητές και απεικονίζει την επίδραση μιας μεμονωμένης μεταβλητής στο CAI. Οι επιδράσεις και των τριών μεταβλητών στο CAI αποδείχθηκαν παρόμοιες και οι τρεις μεταβλητές έδειξαν σημαντικές επιδράσεις και αυξήθηκαν και στη συνέχεια μειώθηκαν το CAI καθώς κάθε ανεξάρτητη μεταβλητή αυξανόταν. Στη μελέτη μας, αναπτύχθηκαν τρισδιάστατες καμπύλες επιφανειακής απόκρισης για να απεικονίσουν την αλληλεπίδραση δύο ανεξάρτητων μεταβλητών στο CAI χρησιμοποιώντας εξισώσεις τετραγωνικής παλινδρόμησης (Εικόνα 4). Όταν η συγκέντρωση αιθανόλης σταθεροποιήθηκε στο κεντρικό σημείο, η επίδραση του χρόνου εκχύλισης και της θερμοκρασίας στο CAI εκτιμήθηκε στο Σχήμα 4Α. Καθώς οι δύο μεταβλητές άλλαξαν ταυτόχρονα, το CAI αυξήθηκε στα 33,4 λεπτά και στους 76,8 ◦C και μειώθηκε ξανά μετά από ένα μέγιστο CAI 92,8 τοις εκατό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β, Γ, το CAI είχε την υψηλότερη τιμή στη συγκέντρωση αιθανόλης 64,3 τοις εκατό, δείχνοντας σταδιακή φθίνουσα τάση στη συνέχεια, γεγονός που υποδηλώνει ότι ένας δυαδικός διαλύτης που αποτελείται από 64,3 τοις εκατό αιθανόλη είναι πιο κατάλληλος ως διαλύτης εκχύλισης. Αυτό το αποτέλεσμα είναι συνεπές με προηγούμενες έρευνες που ανέφεραν ότι ένας δυαδικός διαλύτης νερού και αιθανόλης έδειξε υψηλότερο CAI από το νερό στην εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από Orostachys japonica, κάτι που υποδηλώνει ότι η αιθανόλη 50% θα ήταν πιο πλεονεκτικό στην εκχύλισηλεύκανση δέρματοςσυστατικά [34]. Το μέγιστο CAI του εκχυλίσματος κελύφους φυστικιού που προβλέφθηκε από το μοντέλο τετραγωνικής παλινδρόμησης ήταν 94,5 τοις εκατό, το οποίο ελήφθη υπό συνθήκες χρόνου εκχύλισης 45,1 λεπτών, θερμοκρασίας εκχύλισης 93,6 ◦C και συγκέντρωσης αιθανόλης 42,3 τοις εκατό. Το CAI που ελήφθη στη μελέτη μας ήταν 94,5 τοις εκατό, το οποίο είναι υπερδιπλάσιο από τα αποτελέσματα του 39,4 τοις εκατό και 40,3 τοις εκατό των τιμών CAI των εκχυλισμάτων πράσινου τσαγιού που αναφέρθηκαν από τους Oh et al. [35].

2.5. Βέλτιστες Συνθήκες Εκχύλισης

Αντιοξειδωτικό,λεύκανση δέρματοςκαι τα αντιρυτιδικά αποτελέσματα είναι όλες σημαντικές λειτουργίες για τα καλλυντικά και είναι απαραίτητο να προκύψουν συνθήκες που μπορούν να μεγιστοποιήσουν αυτές τις τρεις λειτουργίες ταυτόχρονα στη βελτιστοποίηση των συνθηκών των ΗΑΕ. Το σχήμα 5 δείχνει μια διαδικασία βελτιστοποίησης που μπορεί ταυτόχρονα να μεγιστοποιήσει τα RSA (Y1), TAI (Y2) και CAI (Y3) επικαλύπτοντας κάθε βέλτιστη συνθήκη ενός γραφήματος περιγράμματος που προκύπτει μέσω μιας εξίσωσης τετραγωνικής παλινδρόμησης. Τα εύρη ανεξάρτητων μεταβλητών για τη βελτιστοποίηση τριών μεταβλητών περιορίστηκαν στο χρόνο εξαγωγής 5.0~55.0 min, θερμοκρασία εξαγωγής 26.{{10}}~94. .0 ◦C και συγκέντρωση αιθανόλης 0,0 τοις εκατό ~ 99,5 τοις εκατό (Πίνακας 5). Σύμφωνα με μεμονωμένες βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης, οι βέλτιστες συνθήκες των ΗΑΕ ήταν 31,2 λεπτά χρόνου εκχύλισης, 36,6 ◦C θερμοκρασία εκχύλισης, 93,2 τοις εκατό συγκέντρωση αιθανόλης και, υπό τις παραπάνω συνθήκες, RSA 74,9 τοις εκατό, TAI 50,6 τοις εκατό και CAI 86.8 τοις εκατό είχε προβλεφθεί. Όταν οι προβλεπόμενες τιμές RSA, TAI και CAI συγκρίθηκαν με αυτές που ελήφθησαν από το πείραμα για επικύρωση, οι τιμές από τη δοκιμή επικύρωσης ήταν παρόμοιες με εκείνες των προβλεπόμενων τιμών, όπου οι τιμές ήταν 78,2 τοις εκατό , 52,3 τοις εκατό και 87,7 τοις εκατό, αντίστοιχα.

2.6. Σύγκριση ΝΑ και ΗΑΕ

Για να επιβεβαιώσουμε την αποτελεσματικότητα εκχύλισης των ΗΑΕ, συγκρίνουμε το εκχύλισμα RSA, TAI και CAI από κέλυφος φιστικιού που παράγεται χρησιμοποιώντας τεχνικές εκχύλισης ΗΑΕ και Soxhlet (SE). Όταν η SE διεξήχθη υπό γενικές συνθήκες SE χρησιμοποιώντας 99,5 τοις εκατό αιθανόλη στους 70 ◦C για 4 ώρες χρόνου εκχύλισης, τα RSA, TAI και CAI βρέθηκαν να είναι 75,5 τοις εκατό , 60,2 τοις εκατό και 74,4 τοις εκατό, τα οποία δεν ήταν πολύ διαφορετικό από τα αποτελέσματα που λαμβάνονται υπό τις βέλτιστες συνθήκες των ΗΑΕ. Ωστόσο, όταν οι συνθήκες SE ορίστηκαν ίσες με τις βέλτιστες συνθήκες των ΗΑΕ των 31,2 min και 93,2 τοις εκατό αιθανόλης, οι RSA, TAI και CAI μειώθηκαν κατά 62,0, 28,3 και 45,6 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα ΗΑΕ υπό βέλτιστες συνθήκες. Το πλεονέκτημα του υπερήχου στην παραγωγή χρήσιμων υλικών από κελύφη φυστικιών αξιολογήθηκε ως μια διαδικασία κατάλληλη για υψηλή παραγωγικότητα και εκβιομηχάνιση λόγω της χαμηλής κατανάλωσης διαλυτών και του μικρού χρόνου εκχύλισης.

2.7. Έκφραση mRNA του MMP-3 και του TRP-1

Στα μελανοκύτταρα θηλαστικών, η μελανογένεση και η υδρόλυση του κολλαγόνου ελέγχονται από τα γονίδια TRP και MMP, αντίστοιχα, και τα TRP{{0}} και MMP-3 είναι γνωστά ως τα κύρια γονίδια για τη ρύθμιση της μελανογένεσης και της υδρόλυσης κολλαγόνου. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκε ανάλυση RT-PCR σε προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων κυττάρων Β16-F0 και η επίδραση του εκχυλίσματος φιστικιού που παρήχθη από τα ΗΑΕ υπό βέλτιστες συνθήκες (31,2 λεπτά, 36,6 μοίρες, 93,2 τοις εκατό) σχετικά με την έκφραση mRNA των MMP-3 και TRP-1 μελετήθηκε. Όπως δείχνει το σχήμα 6, το εκχύλισμα κελύφους φυστικιού μείωσε σημαντικά την έκφραση του MMP{-3 και του TRP-1 σε κύτταρα B16-F0 όταν τα πειράματα γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκαν με ένα φιστίκι Εύρος συγκέντρωσης εκχυλίσματος κελύφους 0~1 mg/mL. Το εκχύλισμα από κέλυφος φυστικιού μείωσε σημαντικά την έκφραση MMP{-3 και TRP-1 κατά 6.1-φορές και 8.7-φορές, αντίστοιχα, σε 1.0 mg, αντίστοιχα, σε 1.0 mg. /mL. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το εκχύλισμα από κέλυφος φυστικιού αναστέλλει την αποικοδόμηση κολλαγόνου στα κύτταρα B16F0 με την απενεργοποίηση του MMP 3 έως την απενεργοποίηση του MMP-1 και παρεμποδίζει τη συνεργασία του MMP-9 [36]. Υπάρχουσες μελέτες έχουν δείξει ότι η θεραπεία με φυτικά εκχυλίσματα ανέστειλε την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF) φωσφορυλιώνοντας την εξωκυτταρική κινάση πρωτεΐνης που ρυθμίζεται από το σήμα (ERK). Έτσι, η ανασταλτική επίδραση της παραγωγής μελανίνης από το εκχύλισμα κελύφους φυστικιού αποδίδεται στην αναστολή τηςτυροσινάσηδραστηριότητα μέσω της αναστολής έκφρασης των ERK και MITF [37]. Έτσι, τα εκχυλίσματα κελύφους φυστικιού μείωσαν τα επίπεδα έκφρασης mRNA του TRP-1 και του MMP-3, γεγονός που υποδηλώνει ότι το εκχύλισμα κελύφους φυστικιού έχει ισχυρές ανασταλτικές δραστηριότητες στην κολλαγονόλυση και τη μελανογένεση, καθιστώντας το ένα εξαιρετικό καλλυντικό υλικό μελεύκανση δέρματοςκαι αντιρυτιδικά αποτελέσματα.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Υλικά και Αντιδραστήρια

Τα κελύφη φυστικιών αγοράστηκαν από το Nonghyup mart (Gochang, Jeonbuk, Κορέα) στις 2 Μαρτίου 190 και τα κελύφη ξηράνθηκαν στους 60 ◦C χρησιμοποιώντας ξηρό φούρνο (FC 49, Lab House, Σεούλ, Κορέα) για 24 ώρες μέχρι το ξηρό βάρος παρέμεινε σταθερό. Τα αποξηραμένα κελύφη φυστικιών κονιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν επεξεργαστή τροφίμων (Hanil HMF-3800, Σεούλ, Κορέα) και στη συνέχεια πέρασαν από κόσκινο 600 μm. Η αιθανόλη αγοράστηκε από τη χημική ουσία Samchun (95,0 τοις εκατό v/v, Σεούλ, Κορέα). Το αντιδραστήριο Folin–Ciocalteu, το γαλλικό οξύ (97 τοις εκατό) και η κερσετίνη αγοράστηκαν από τη Merck (Kenilworth, NJ, ΗΠΑ). 2,2-Διφαινυλ-1-πικρυλυδραζυλ (DPPH), ασκορβικό οξύ και 3,4-διυδροξυ-L-φαινυλαλανίνη (L-DOPA) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Όλες οι άλλες χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα ήταν αναλυτικής ποιότητας και αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich. Όλα τα αποθεματικά διαλύματα παρασκευάστηκαν με καθαρισμένο απιονισμένο νερό χρησιμοποιώντας σύστημα καθαρισμού aMilli-Q (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Υπερηχογραφική Εξαγωγή και Εξαγωγή Soxhlet

Το κέλυφος φυστικιού σε σκόνη (1 g) τοποθετήθηκε σε ένα δοχείο εκχύλισης, το καθένα με 10 mL διαλύτη και αναμίχθηκε χρησιμοποιώντας αναμικτήρα vortex (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Κορέα) για 1 λεπτό. Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με κυκλοφορία νερού στον εξαγωγέα υπερήχων (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Κορέα) χρησιμοποιώντας έναν εξωτερικό κυκλοφορητή λουτρού ψυγείου (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea ) με ψηφιακό χρονοδιακόπτη και ελεγκτή θερμοκρασίας. Η εξαγωγή πραγματοποιήθηκε με τη συσκευή υπερήχων εξοπλισμένη με ψηφιακό χρονόμετρο και ελεγκτή θερμοκρασίας. Το δείγμα υποβλήθηκε σε υπερήχους για διάφορες πειραματικές διάρκειες και θερμοκρασίες σε συχνότητα λειτουργίας 40 kHz. Στη συνέχεια, το εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε στις 10,000 rpm για 10 λεπτά (236R, Labogene, Σεούλ, Κορέα). Μετά τη φυγοκέντρηση, οι όγκοι του δείγματος έγιναν στα 5 mL και διηθήθηκαν μέσω φίλτρου μεμβράνης 0,2 μm πριν από την ανάλυση. Για την εκχύλιση Soxhlet, το κονιοποιημένο κέλυφος φυστικιού (5 g) εκχυλίστηκε συνεχώς με 100 mL χρησιμοποιώντας 99,5 τοις εκατό αιθανόλη για 4 ώρες (8 κύκλους) σε μέγιστη θερμοκρασία 70 ◦C σε μια συσκευή Soxhlet. Η τεχνική εκχύλισης με τη βοήθεια υπερήχων αποδείχθηκε ότι είναι πολύ αποτελεσματική στην εξαγωγή ελαίου από σπόρους σταφυλιού, το πλεονέκτημα του υπερήχου, σε σύγκριση με τις συμβατικές μεθόδους εκχύλισης τόσο για λάδι όσο και για πολυφαινόλες, ήταν παρόμοιο, καθώς η απόδοση λαδιού/πολυφαινολών αποκτήθηκε με χαμηλότερη κατανάλωση διαλύτη και μικρότερη χρόνος εξαγωγής.

3.3. Πειραματικό σχέδιο

Ο πειραματικός σχεδιασμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας CCD, έναν τύπο RSM για την ελαχιστοποίηση του αριθμού των πειραματικών εκτελέσεων και τη μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταξύ των παραγόντων. Το λογισμικό TheDesign-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό πειραμάτων, την ανάλυση δεδομένων και τη βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης για τη μεγιστοποίηση της εκχύλισης βιοδραστικών ενώσεων που έχουν αντιοξειδωτικά,λεύκανση δέρματος, και αντιρυτιδικά αποτελέσματα από το κέλυφος των φιστικιών. Τα πειράματα σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις τιμές CCD, το εύρος και το κεντρικό σημείο των τριών ανεξάρτητων μεταβλητών που παρουσιάστηκαν βασίστηκαν στα αποτελέσματα προκαταρκτικών πειραμάτων (Πίνακας 1). Το CCD εφαρμόστηκε για να προβλέψει τις βέλτιστες συνθήκες των ΗΑΕ για τη μεγιστοποίηση των αποκρίσεων συμπεριλαμβανομένων των RSA, TAI και CAI από κελύφη φυστικιών. Ως ανεξάρτητες μεταβλητές, οι τρεις μεταβλητές που επιλέχθηκαν ήταν ο χρόνος εκχύλισης (Χ1), η θερμοκρασία εκχύλισης (Χ2) και η συγκέντρωση αιθανόλης (Χ3). Συνολικά δημιουργήθηκαν 17 πειραματικές εκτελέσεις με τρεις επαναλήψεις στα κεντρικά σημεία για την εκτίμηση της αναπαραγωγιμότητας. Το μοντέλο τετραγωνικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για την προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων και εφαρμόστηκε για την πρόβλεψη των μεταβλητών απόκρισης, όπως φαίνεται στην Εξίσωση (1):

Y= 0 συν 1Χ1 συν 2Χ2 συν 3Χ3 συν 11Χ12 συν 22Χ22 συν 33Χ32 συν 12Χ1Χ2 συν 13Χ1Χ3 συν 23Χ2Χ3 (1)

όπου Y είναι η προβλεπόμενη απόκριση. Το 0 είναι η σταθερά (τομή). 1, 2 και 3 είναι οι συντελεστές παλινδρόμησης για τους όρους γραμμικής επίδρασης. 11, 22 και 33 είναι οι όροι τετραγωνικού αποτελέσματος. και 12, 13 και 23 είναι οι όροι του εφέ αλληλεπίδρασης, αντίστοιχα. Μια ανάλυση επιφάνειας απόκρισης και η ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συντελεστών παλινδρόμησης και της στατιστικής σημασίας των όρων του μοντέλου και για την προσαρμογή των μαθηματικών μοντέλων του πειραματικού [38].

3.4. DPPH Radical Scavenging Activity (RSA)

Το RSA του εκχυλίσματος κελύφους φυστικιού ήταν όπως περιγράφεται από τους Pereira-Caro et al. [39]. Διάλυμα 0.01 mM DPPH σε μεθανόλη (95 τοις εκατό) παρασκευάστηκε και 1,25 mL προστέθηκε σε 0,25 mLof αραιωμένο εκχύλισμα. Η RSA προσδιορίστηκε για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 517 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-Visspectrophotometer (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan) μετά από 20 λεπτά επώασης. Το τυφλό παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας απεσταγμένο νερό και το RSA υπολογίστηκε σύμφωνα με τα παρακάτω. (Εξίσωση (2)):

RSA ( ποσοστό )={1 −Abs (δείγμα) /Abs (έλεγχος) }× 100 (2)

3.5. Αναστολή δραστηριότητας τυροσινάσης (TAI)

Το TAI πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την τροποποιημένη μέθοδο χρησιμοποιώντας L-DOPA ως υπόστρωμα από τους Jo et al. [40]. Τα δείγματα αναμίχθηκαν με 200 μL L-DOPA και 200 ​​μL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού καλίου (ρΗ 6,8) και 200 ​​μLτυροσινάση(125 U/mL) προστέθηκε στον δοκιμαστικό σωλήνα και επωάστηκε στους 37 ◦C για 20 λεπτά. Η απορρόφηση του δείγματος μετρήθηκε στα 475 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-Vis και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τον έλεγχο. Για κάθε συγκέντρωση, η ενζυμική δραστηριότητα υπολογίστηκε ως ποσοστό σε σύγκριση με εκείνη της δοκιμασίας χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς κανένα αναστολέα, και το TAI υπολογίστηκε με βάση τον ακόλουθο τύπο. (Εξίσωση (3)):

TAI ( ποσοστό )={1 −Abs (έλεγχος) − Abs (δείγμα) /Abs (έλεγχος)}× 100 (3)

όπου Abs (μάρτυρας) είναι η απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος συν κολλαγενάση. Abs (δείγμα) είναι η απορρόφηση ρυθμιστικού διαλύματος συν κολλαγενάση συν δείγμα/πρότυπο.

3.6. Αναστολή δραστηριότητας κολλαγενάσης (CAI)

Η μέτρηση του CAI των εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε με τροποποίηση των μεθόδων των Wünsch και Heindrich [41]. Το υπόστρωμα, 4-phenylazobezyloxylcarbonyl-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), διαλύθηκε σε 10 mL ρυθμιστικού διαλύματος σε 1,2 mg/mL και στη συνέχεια προστέθηκαν 125 μL διαλύματος και επωάστηκαν για 60 λεπτά στους 37 ◦C. Η κολλαγενάση διαλύθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα σε 0,4 mg/mL και 75 μL διαλύματος ενζύμου προστέθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα. Το μίγμα ενζύμου-υποστρώματος επωάστηκε σε λουτρό νερού στους 37°C για 30 λεπτά και η αντίδραση σταμάτησε με προσθήκη 75 μL κιτρικού οξέος 20 τοις εκατό (β/ο). Μετά την προσθήκη 1,5 mL οξικού αιθυλεστέρα, η στιβάδα του οξικού αιθυλεστέρα διαχωρίστηκε και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 320 nm. Το ποσοστό της αναστολής υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο.

CAI ( ποσοστό )={1 − [Abs (έλεγχος) − Abs (δείγμα)] /Abs (έλεγχος)}× 100 (4)

όπου Abs (μάρτυρας) είναι η απορρόφηση του ρυθμιστικού διαλύματος συν κολλαγενάση. Το Abs (δείγμα) είναι η απορρόφηση ρυθμιστικού διαλύματος συν κολλαγενάση συν δείγμα/πρότυπο.

3.7. Συντήρηση και Καλλιέργεια Κυτταρικών Σειρών

Κύτταρο μελανώματος Β16-F0 που παράγει μελανίνη ελήφθη από την Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Κορέα) και καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, 10 τοις εκατό, Welgene, Gyeongsan, Κορέα) και αντιβιοτικό διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ). Trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) χρησιμοποιήθηκε για την θρυψίνη των κυττάρων. Όλα τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ποιότητας κυτταροκαλλιέργειας.

3.8. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

Πραγματοποιήθηκε RT-PCR για τη μέτρηση των αλλαγών στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων MMP-3 και TRP-1 που σχετίζονται μελεύκανσηκαι αντιρυτιδικά αποτελέσματα, τα κύτταρα Β16-F0 καλλιεργήθηκαν σε24-πλάκα με φρεάτιο επεξεργασία με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος κελύφους φυστικιού σε DMEM χωρίς ορό και επωάστηκαν για 24 ώρες. Ο μη επεξεργασμένος κυτταρικός έλεγχος διατηρήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες με την ελεγχόμενη ομάδα κατά τη διάρκεια του πειράματος. Η απομόνωση RNA από κύτταρα διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής RNA Universal AccuPrep® (Bioneer, Daejeon, Κορέα). Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας AmfiRiert Platinum cDNA σύνθεσης MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση RT-PCR χρησιμοποιώντας το CFX 96 touch PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) για τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: MMP-3 αίσθηση, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 και αντιπληροφοριακό, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30. και TRP-1 αίσθηση, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 και antisense, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Χρησιμοποιήθηκε ένα κατάλληλο σύνολο εκκινητών που αναφέρθηκαν παραπάνω για την ενίσχυση των αντίστοιχων γονιδίων χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες συνθήκες κύκλου: 94 ◦C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 25 κύκλους στους 95 ◦C για 5 δευτερόλεπτα, 60 ◦C για 30 δευτερόλεπτα (forMMP-3) , και 60 ◦C για 30 s (για TRP-1) και 72 ◦C για 30 s επέκταση. Τα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1 τοις εκατό, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και οπτικοποιήθηκαν με χρήση λογισμικού Gel Doc TM XR plus System and Quantity One 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Μια πρωτεΐνη οικιακής φροντίδας, -ακτίνη, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης με την υπόθεση ότι τα επίπεδα έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών παραμένουν σταθερά.

4. Συμπεράσματα

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκε η συμπληρωματική προσέγγιση για την ανάκτηση και τις χρήσεις βιοδραστικών ουσιών από γεωργικά υποπροϊόντα κελύφους φυστικιών για την ανάπτυξη συστατικών προστιθέμενης αξίας με πολλαπλές χρήσεις. Πρώτα απ 'όλα, προσπαθήσαμε να αυξήσουμε την αποτελεσματικότητα της εξαγωγής βιοδραστικών ενώσεων με αντιοξειδωτικά, λεύκανση του δέρματος και αντιρυτιδικά αποτελέσματα βελτιστοποιώντας τη διαδικασία των ΗΑΕ. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ΗΑΕ για αποτελεσματική παραγωγή βιοδραστικών ενώσεων μελεύκανση δέρματοςκαι αντιρυτιδικά αποτελέσματα από το κέλυφος των φιστικιών και εφαρμόστηκε βελτιστοποίηση βάσει στατιστικής για τη μεγιστοποίηση των RSA, TAI και CAI ταυτόχρονα. Οι συνθήκες των ΗΑΕ βελτιστοποιήθηκαν με χρήση CCD και επιβεβαιώθηκε ότι η επιλογή του διαλύτη και της συγκέντρωσης θα πρέπει να ληφθούν υπόψη κατά την εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από το κέλυφος των φιστικιών. Με την επικάλυψη των επιφανειών απόκρισης, οι καμπύλες τριών εξαρτημένων μεταβλητών, ο χρόνος εκχύλισης 31,2 λεπτών, η θερμοκρασία εκχύλισης 36,6 ◦C και η συγκέντρωση ανιθανόλης 93,2 τοις εκατό προσδιορίστηκαν ως οι βέλτιστες συνθήκες των ΗΑΕ. Έχει επιβεβαιωθεί ότι το RSA των εκχυλισμάτων κελύφους φυστικιού είναι πολύ υψηλό και αναμένεται να αυξηθεί στα TAI και CAI, τα οποία είναι δείκτεςλεύκανση δέρματοςκαι αντιρυτιδικά αποτελέσματα, αντίστοιχα. Η βελτιστοποίηση των συνθηκών των ΗΑΕ επιβεβαίωσε την αύξηση της παραγωγής βιοδραστικών ουσιών στα κελύφη των φιστικιών και τις λευκαντικές και αντιρυτιδικές δραστηριότητες του εκχυλίσματος φιστικιού μέσωτυροσινάσηκαι μείωση της δραστηριότητας της κολλαγενάσης. Με βάση αυτό, η επίδραση των κελύφους φιστικιών στα επίπεδα έκφρασης των MMP και TRP αξιολογήθηκε για να εκτιμηθεί εάν έχουν λευκαντικές και αντιρυτιδικές επιδράσεις σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Τα λευκαντικά και αντιρυτιδικά αποτελέσματα των εκχυλισμάτων κελύφους φυστικιού επιβεβαιώθηκαν μέσω της μείωσης της ρύθμισης του εκφράσεις mRNA καθώς και την αναστολή πρωτεϊνικών εκφράσεων των MMP-3 και TRP-1. Επομένως, το εκχύλισμα από κέλυφος φιστικιού έχει αποδειχθεί αποτελεσματικόλεύκανσηκαι βελτίωση των ρυτίδων στα επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και γονιδίων. Το εκχύλισμα φιστικιού, χρησιμοποιώντας ΗΑΕ, έχει υψηλή αντιοξειδωτική δράση και εξαιρετική δράση λεύκανσης και αντιρυτιδικού δέρματος, δίνοντας στο κέλυφος του φιστικιού μεγάλες δυνατότητες ως φυσικό καλλυντικό και συστατικό διατροφής. Επιπλέον, πιστεύεται ότι η παραγωγή βιοδραστικών ενώσεων με χρήση ΗΑΕ μπορεί να εφαρμοστεί στη διαδικασία εμπορευματοποίησης για την παραγωγή καλλυντικών, τροφίμων και φαρμακευτικών υλικών, δεδομένης της υψηλότερης απόδοσης παραγωγής και του μειωμένου κόστους επεξεργασίας σε σύγκριση με τις συμβατικές διεργασίες.