Σχεδιασμός, σύνθεση και αντιμελανογόνες επιδράσεις των παραγώγων (2-υποκατεστημένος φαινυλ-1,3-διθειολάνη-4-υλ) μεθανόλης

Επικοινωνία: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultan Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1

Αφηρημένη:Οι συγγραφείς σχεδίασαν και συνέθεσαν 17 παράγωγα (2-υποκατεστημένο φαινυλ-1,3-διθειολάνη-4-υλ) μεθανόλης (PDTM) για να βρουν ένα νέο χημικό ικρίωμα, το οποίο δείχνει εξαιρετικόανασταλτικό της τυροσινάσηςδραστηριότητα. Οι ανασταλτικές δραστηριότητές τους στην τυροσινάση αξιολογήθηκαν έναντι της τυροσινάσης μανιταριού στα 50 μΜ και πέντε από τα παράγωγα PDTM (PDTM3, PDTM7–PDTM9 και PDTM13) βρέθηκαν να αναστέλλουν το μανιτάριτυροσινάσηπερισσότερο από το kojic acid ή την arbutin, τους θετικούς μάρτυρες. Από δεκαεπτά PDTM, το PDTM3 (μισή-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση 13,94±1,76 μM), με τμήμα 2,4-διυδροξυφαινυλίου, παρουσίασε τα μεγαλύτερα ανασταλτικά αποτελέσματα (ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση κοτζικού οξέος 18. ±{10}} 2,14 μΜ). Είναι ενδιαφέρον ότι οι ενώσεις PDTM χωρίς ομάδα υδροξυλίου, PDTM7–PDTM9, είχαν επίσης ισχυρότερες ανασταλτικές δραστηριότητες από το κοτζικό οξύ. Σε μελέτες πυριτίου για τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ της τυροσινάσης και των πέντε PDTM έδειξαν ότι οι συγγένειες δέσμευσής τους σχετίζονταν στενά με τις ανασταλτικές τους δραστηριότητες της τυροσινάσης. Πειράματα με βάση τα κύτταρα που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα μελανώματος δέρματος ποντικού B16F10 έδειξαν ότι το PDTM3 ανέστειλε αποτελεσματικάμελανογένεσηκαι κυψελοειδέςτυροσινάσηδραστηριότητα. Μια μελέτη βιωσιμότητας κυττάρων που διεξήχθη χρησιμοποιώντας κύτταρα B16F10 έδειξε ότι η αντιμελανογόνος δράση του PDTM3 δεν αποδόθηκε στην κυτταροτοξικότητά του. Οι κινητικές μελέτες έδειξαν ότι το PDTM3 ανέστειλε ανταγωνιστικά την τυροσινάση, υποδεικνύοντας τη δέσμευση στη δραστική θέση της τυροσινάσης. Βρήκαμε ότι το PDTM3 με ένα νέο χημικό ικρίωμα θα μπορούσε να είναι ένας πολλά υποσχόμενος υποψήφιος για παράγοντες λεύκανσης του δέρματος και ότι ο δακτύλιος 1,3-διθειολάνης θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως χημικό ικρίωμα για την ισχυρή αναστολή της τυροσινάσης.Λέξεις-κλειδιά:αναστολέας τυροσινάσης, μελανογένεση, 1,3-διθειολάνη, PDTM

Το Cistanche είναι ένας αναστολέας της τυροσινάσης.

Εισαγωγή

Τις τελευταίες δεκαετίες,αναστολείς τυροσινάσηςπαρουσίασαν σημαντικό ενδιαφέρον, λόγω του βασικού ρόλου που διαδραματίζει η τυροσινάση σεμελανογένεση. Η μελανίνη παράγεται χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό ενζυματικά καταλυόμενων και χημικών αντιδράσεων. Η βιοσυνθετική οδός που είναι υπεύθυνη για την παραγωγή μελανίνης αποσαφηνίστηκε αρχικά από τους Raper1 και Mason2 και τροποποιήθηκε πρόσφατα από τους Cooksey et al3 και Schallreuter et al.4 Η μελανογένεση ξεκινά από το ένζυμο τυροσινάση, το οποίο καταλύει τα δύο πρώτα οξειδωτικά στάδια στη βιοσυνθετική οδό της οξείδωσης της μελανίνης: από l-τυροσίνη σε l-dopa ακολουθούμενη από l-dopa σε l-dopaquinone (Εικόνα 1). Αυτά τα δύο στάδια είναι επίσης τα στάδια που καθορίζουν το ρυθμό στη βιοσύνθεση μελανίνης, επειδή το φυσιολογικό pH μπορεί να συνεχίσει αυθόρμητα τα επόμενα βήματα.5 Η ντοπακινόνη που παράγεται στο δεύτερο στάδιο μετατρέπεται σε κυστεϊνυλντόπα από τη γλουταθειόνη ή την κυστεΐνη και τέλος σε φαιομελανίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για το κίτρινο έως κόκκινα χρώματα του δέρματος των θηλαστικών, ή να ντοπαχρωματιστεί με αυτο-οξείδωση και τέλος η ευμελανίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για τα καφέ/μαύρα χρώματα του δέρματος των θηλαστικών (Εικόνα 1). Η μελανίνη προστατεύει το ανθρώπινο δέρμα από την επιβλαβή υπεριώδη ακτινοβολία και επίσης καθορίζει τη φαινοτυπική εμφάνιση. Από την άλλη πλευρά, η υπερβολική συσσώρευση μελανίνης στο δέρμα μπορεί να προκαλέσει ασθένειες που σχετίζονται με την υπερμελάγχρωση και καλλυντικά προβλήματα, όπως πανάδες, μέλασμα και γεροντικές φακίδες.

Τυροσινάσηείναι ευρέως κατανεμημένο σε βακτήρια, μύκητες, έντομα, φυτά και ζώα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, και είναι υπεύθυνη για τα χρώματα του ανθρώπινου δέρματος και των μαλλιών και το ανεπιθύμητο μαύρισμα φρούτων και λαχανικών. έχουν ενθαρρύνει τους επιστήμονες να αναζητήσουν νέους ισχυρούς αναστολείς τυροσινάσης για χρήση ως παράγοντες λεύκανσης του δέρματος και κατά του καφέ. Πολλάαναστολείς τυροσινάσηςέχουν ανακαλυφθεί μέχρι σήμερα,7–9, αλλά σχετικά λίγα έχουν εγκριθεί ως υλικά λεύκανσης του δέρματος, λόγω ανησυχιών για την ασφάλεια ή αδύναμων επιδράσεων λεύκανσης.

Σε προηγούμενες μελέτες μας, με βάση τις δομές της l-τυροσίνης και της l-dopa, φυσικών υποστρωμάτων τυροσινάσης, σχεδιάσαμε δύο πιθανούς αναστολείς τυροσινάσης με δακτύλιο θειαζολιδίνης (MHY384 και MHY794· Εικόνα 1) και τους συνθέσαμε με συμπύκνωση ενός κατάλληλου βενζαλδεΰδη και l-κυστεΐνη ή υδροχλωρική κυστεαμίνη. Αυτές οι δύο ενώσεις αναγνωρίστηκαν ότι είναι ισχυρά ανταγωνιστικέςαναστολείς τυροσινάσηςκαι για την αποτελεσματική μείωση της μελανογένεσης σε άτριχα ποντίκια HRM2.10,11 Εκτός από την άμεση αναστολή της δραστηριότητας τυροσινάσης, το MHY384 ανέστειλε την έκφραση της τυροσινάσης καταστέλλοντας την κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη-PKA10 και κυκλική γουανοσίνη που προκαλείται από ΝΟ, επίσης, κυκλική γουανοσίνη 3H194, επίσηςτυροσινάσηέκφραση που προκαλείται από τη μεσολάβηση ΝΟμελανογένεσησηματοδότηση.11 Αυτά τα θετικά αποτελέσματα και το γεγονός ότι το δισθενές –S– είναι ένα κλασικό ισόστερο του δισθενούς –NH– μας ενθάρρυναν να συνθέσουμε παράγωγα με έναν δακτύλιο διθειολάνης ως υποκατάστατο του δακτυλίου θειαζολιδίνης που υπάρχει συνήθως στα MHY384 και MHY794, προκειμένου να βρούμε νέα αναστολείς τυροσινάσης.

Στην παρούσα μελέτη, ως μέρος των συνεχιζόμενων προσπαθειών μας για την εύρεση ενός νέου και ισχυρού χημικού ικριώματος για την αναστολή της τυροσινάσης και την ανάπτυξη νέωναναστολείς τυροσινάσης, συνθέσαμε μια κατηγορία δομικά καινοτόμων παραγώγων (2-υποκατεστημένο φαινυλ-1,3-διθειολάνη-4-υλ)μεθανόλη (PDTM) (Εικόνα 1) και διερευνήσαμε τις αντιμελανογόνες επιδράσεις τους χρησιμοποιώντας δοκιμές τυροσινάσης μανιταριών και με βάση τα κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, το kojic acid και η arbutin χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για την ανασταλτική δραστηριότητα της τυροσινάσης, επειδή το kojic acid είναι ένας από τους πιο συχνά χρησιμοποιούμενους θετικούς μάρτυρες για την αξιολόγηση της αναστολής της τυροσινάσης και η arbutin χρησιμοποιείται κλινικά ως λευκαντικός παράγοντας.

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, όλα τα αντιδραστήρια που διατίθενται στο εμπόριο - l-τυροσίνη (κωδικός T3754), l-dopa (κωδικός PHR1271), κοτζικό οξύ (κωδικός K3125), MTT (3-(4,5-διμεθυλ{{ 8}}θειαζολυλ)-2,5-διφαινυλ-2βρωμιούχο Η-τετραζόλιο) (κωδικός M2128), PMSF (φαινυλμεθυλσουλφονυλφθορίδιο) (κωδικός P7626), Triton X-100 ( 4-(1,1,3,3-τετραμεθυλβουτυλ)φαινυλπολυαιθυλενογλυκόλη) (κωδικός T8787), όξινο φωσφορικό κάλιο (κωδικός P9666), διόξινο φωσφορικό κάλιο (κωδικός PHR1330), 2,{2} διμερκαπτο-1-προπανόλη (κωδικός 64046), 1,4-διοξάνη (κωδικός 296309), θειικό οξύ (κωδικός 339741) και βενζαλδεΰδες - αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St Louis, MO, ΗΠΑ). Εμβρυϊκός βόειος ορός, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS), πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και θρυψίνη αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific (Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Μανιτάριτυροσινάση(κωδικός Τ3824) και η ορμόνη διέγερσης μελανοκυττάρων (-MSH· κωδικός Μ4135) αγοράστηκαν επίσης από τη Sigma-Aldrich. Τα φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) 1Η και 13C καταγράφηκαν σε όργανα Varian Unity Inova 400 και Varian Unity AS 500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Τα δεδομένα φασματομετρίας μάζας χαμηλής ανάλυσης (MS) και υψηλής ανάλυσης MS λήφθηκαν σε ένα Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA) και ένα φασματόμετρο μάζας υγρής χρωματογραφίας υγρού χρόνου πτήσης 6530 Accurate Mass, αντίστοιχα . Η σύνθεση του PDTM1–PDTM17 πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας.

εκχύλισμα κιστάνι

Γενική διαδικασία για τη σύνθεση του PDTM1–PDTM17

Σε ένα αναδευόμενο διάλυμα 2,3-διμερκαπτο-1-προπανόλης (100 mg, 0,80 mmol) σε 1,4-διοξάνη (1 mL) προστέθηκε ένα διάλυμα θειικού οξέος (0,1 ισοδυναμία) σε 1,4-διοξάνιο (1 mL) και μια κατάλληλη βενζαλδεΰδη (1,1 ισοδυναμία) στη συνέχεια. Αφού αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε στους 70 βαθμούς για 40 λεπτά έως 1 ώρα. Το μίγμα στη συνέχεια κατανεμήθηκε μεταξύ οξικού αιθυλεστέρα και νερού και η οργανική στιβάδα ξηράνθηκε υπεράνω ανύδρου MgS04, διηθήθηκε και εξατμίστηκε. Το υπόλειμμα που λήφθηκε καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία στήλης πυριτικής πηκτής για να δώσει καθαρά προϊόντα PDTM: PDTM1–PDTM17.14 Δομικός χαρακτηρισμός (1Η και 13C NMR και δεδομένα μάζας όλων των PDTM και 1-D και 2-D NMR φάσματα ορισμένων PDTMs) των συντιθέμενων ενώσεων παρέχονται σε Συμπληρωματικά υλικά.

Αναστολή του μανιταριούτυροσινάσηαπό PDTM1–PDTM17

Οι ανασταλτικές επιδράσεις των αναλόγων PDTM στην τυροσινάση μανιταριού διερευνήθηκαν με μικρές τροποποιήσεις, όπως περιγράφηκε προηγουμένως στην εργασία μας.15 Κάθε ένωση (10 μL, τελική συγκέντρωση 50 μΜ) αναμίχθηκε με διάλυμα υποστρώματος (170 μL), που παρασκευάστηκε από 14,7 mM φωσφορικό κάλιο ρυθμιστικό (ρΗ 6,5) και 293 μΜ διάλυμα 1-τυροσίνης (1:1, ν/ν), σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας φρεατίου 96-. Σε κάθε φρεάτιο, διάλυμα τυροσινάσης μανιταριού (20 μL, 1,000 U/mL) προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Τα περιεχόμενα ντοπαχρώματος που σχηματίζεται σε φρεάτια προσδιορίστηκαν με μέτρηση οπτικών πυκνοτήτων στα 475 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν το Kojic acid και η arbutin. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα ποσοστά αναστολής τωντυροσινάσηυπολογίστηκαν ως εξής:

Αναστολή ( ποσοστό )=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)

όπου το Α δηλώνει την οπτική πυκνότητα της υπό δοκιμή ένωσης και το Β αντιπροσωπεύει την οπτική πυκνότητα του μάρτυρα.

Η μισή-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) είναι η συγκέντρωση μιας ένωσης που αναστέλλει μια τυπική απόκριση 50 τοις εκατό. Το IC50 προέρχεται από τον άξονα x σε μια καμπύλη συγκέντρωσης αναστολέα έναντι σχηματισμού προϊόντος και προσδιορίζεται από την ευθυγράμμιση της καμπύλης δόσης-απόκρισης στον εξαρτώμενο άξονα γ. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκαν δοσοεξαρτώμενα πειράματα αναστολής εις τριπλούν για τον προσδιορισμό της IC50 των ενώσεων. Σύμφωνα με το ποσοστό αναστολής πέντε δόσεων (τελική συγκέντρωση 10, 20, 30, 40 και 50 μΜ) σε κάθε πείραμα, προσδιορίστηκαν οι λογαριθμικές γραμμικές καμπύλες και οι εξισώσεις τους. Στη συνέχεια υπολογίστηκαν μεμονωμένες τιμές IC50 ως η συγκέντρωση όταν ο άξονας γ ισοδυναμούσε με 50 τοις εκατό αναστολή. Τα αποτελέσματα από τα τρία πειράματα παρουσιάζονται.

Ανάλυση της φύσης της αναστολής της τυροσινάσης μανιταριών

Για να αποσαφηνιστεί η φύση της ανασταλτικής επίδρασης του PDTM3 στην τυροσινάση μανιταριών, πραγματοποιήθηκαν κινητικές μελέτες. PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 ή 25 μΜ τελική συγκέντρωση]) προστέθηκε σε 170 μL διαλύματος l-τυροσίνης (0,5, 1, 2 ή 4 mM τελική συγκέντρωση) και στη συνέχεια ανακατεύουμε με μανιτάριατυροσινάσηδιάλυμα (20 μL, 1,000 U/mL) σε κάθε φρεάτιο μιας 96-πλάκας φρεατίου. Μετά την επώαση του μίγματος για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς, τα περιεχόμενα της ντόπαχρωμης που παρήχθη σε φρεάτια προσδιορίστηκαν με μέτρηση των οπτικών πυκνοτήτων στα 475 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Για τον προσδιορισμό της φύσης της αναστολής, χρησιμοποιήθηκε ένα διάγραμμα Lineweaver-Burk.

εκχύλισμα κιστάνι όφελος

Προσομοίωση σύνδεσης PDTM3 ή κοτζικού οξέος με τυροσινάση

Η προσομοίωση in silico docking του συνδέτη πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με το AutoDock Vina χρησιμοποιώντας μια τεχνική συστηματικής αναζήτησης και τη δομή 3-D του Agaricus bisporusτυροσινάση(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 Στην κρυσταλλική δομή της τυροσινάσης, η θέση δέσμευσης της l-τυροσίνης χρησιμοποιήθηκε ως θύλακας σύνδεσης. Τα αποτελέσματα της προσομοίωσης ελήφθησαν από τη σύνδεση μεταξύ τυροσινάσης και συνθετικών ενώσεων (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 και PDTM13) ή κοτζικού οξέος. Πριν από την εκτέλεση προσομοίωσης σύνδεσης με τις ενώσεις, 2-Οι δομές D των ενώσεων μετασχηματίστηκαν σε δομές 3-D, προσδιορίστηκαν τα φορτία των ενώσεων και εισήχθησαν άτομα υδρογόνου χρησιμοποιώντας το ChemOffice. Το LigandScout 3.1.2 χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη πιθανών αλληλεπιδράσεων μεταξύ συνδετών και τυροσινάσης και την ταυτοποίηση φαρμακοφόρων. Εικόνες προσομοίωσης σύνδεσης 17 PDTM παρέχονται σε Συμπληρωματικό υλικό.

Προσδιορισμός του επιπέδου μελανογένεσης σε κύτταρα B16F10

Αναλύσεις περιεκτικότητας σε μελανίνη με μικρές τροποποιήσεις χρησιμοποιήθηκαν σε κύτταρα B16F10 για τις ανασταλτικές επιδράσεις του PDTM3 σεμελανογένεση.19 Κύτταρα που σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5×104 κύτταρα/φρεάτιο σε μια πλάκα 24-πηγαδιού αφέθηκαν να προσκολληθούν στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 5 τοις εκατό CO2 όλη τη νύχτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε -MSH (1 μΜ) και PDTM3 (0, 5, 10 ή 25 μΜ) ή κοτζικό οξύ (25 μΜ) και το τρυβλίο επωάστηκε για 24 ώρες υπό τις ίδιες συνθήκες. Αφού πλύθηκαν δύο φορές με PBS, τα κύτταρα αποσπάστηκαν με επώαση στους 60 βαθμούς σε 200 μL NaOH 1 Ν για 1 ώρα. Τα προϊόντα λύσης μετακινήθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και οι οπτικές πυκνότητες μετρήθηκαν στα 405 nm με έναν αναγνώστη ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας συνδεδεμένο με ένζυμο για τον υπολογισμό του μέσου ποσοστού αναστολών του kojic acid και του PDTM3. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Δοκιμασία δραστηριότητας τυροσινάσης σε κύτταρα B16F10

Με την εκτίμηση του ρυθμού οξείδωσης της l-dopa,τυροσινάσηοι δραστηριότητες αξιολογήθηκαν με μικρές τροποποιήσεις, όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη εργασία.20 Τα κύτταρα που σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5×104 κύτταρα/πηγάδι σε μια πλάκα 24-πηγαδιού αφέθηκαν να κολλήστε στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε -MSH (1 μΜ) και PDTM3 (0, 5, 10 ή 25 μΜ) ή κοτζικό οξύ (25 μΜ) και η πλάκα επωάστηκε υπό τις ίδιες συνθήκες για 24 ώρες. Αφού ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS, τα κύτταρα λύθηκαν με 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης που περιείχε 0,1 mM PMSF (5 μL), 50 mM PBS (90 μL, pH 6,8) και 1 τοις εκατό Triton X-100 (5 μL) και παγώθηκε στους -80 βαθμούς για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης αποψύχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στους 12,000 g για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς και τα υπερκείμενα (80 μL) συνδυάστηκαν με 10 mM l-dopa (20 μL) σε μια πλάκα 96-πηγαδιού, η οποία στη συνέχεια επωάζεται για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς. Οι οπτικές πυκνότητες υπολογίστηκαν στα 500 nm και οι ανασταλτικές δραστηριότητες της τυροσινάσης προσδιορίστηκαν ως εξής:

Αναστολή ( ποσοστό )=× 100 ([Α−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)

όπου Β και Α είναι οι οπτικές πυκνότητες του τυφλού πριν και μετά την επώαση, αντίστοιχα, και D και C είναι οι οπτικές πυκνότητες της δοκιμαστικής ένωσης πριν και μετά την επώαση, αντίστοιχα.

Στατιστική ανάλυση

Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Dunnett χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν οι μέσοι όροι της ομάδας διέφεραν σημαντικά από εκείνους των μαρτύρων. Το μη ζευγαρωμένο t-test Welch χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν τα αποτελέσματα του PDTM3 και του kojic acid ήταν σημαντικά διαφορετικά. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Όλα τα αποτελέσματα υποδεικνύονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι αμφίπλευρες τιμές P του 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα και συζήτηση

Η παρασκευή του PDTM1–PDTM17PDTM1–PDTM17 συντέθηκε όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. Θέρμανση 2,3-διμερκαπτο-1-προπανόλη και πολυάριθμες κατάλληλα υποκατεστημένες βενζαλδεΰδες (1–17) σε 1,4-διοξάνη σε Η παρουσία θειικού οξέος έδωσε τα επιθυμητά προϊόντα PDTM ως στερεά ή κολλώδες λάδι. Οι δομές των τελικών προϊόντων επιβεβαιώθηκαν με 1Η και 13C NMR, φασματοσκοπία συσχέτισης, ετεροπυρηνική μονοκβαντική φασματοσκοπία συσχέτισης, ετεροπυρηνική φασματοσκοπία συσχέτισης πολλαπλών δεσμών και MS χαμηλής και υψηλής ανάλυσης. Η παρουσία του απλού που αντιστοιχεί στο πρωτόνιο –SCH(Ph)S– στα δ=6,09–5,56 ppm σε φάσματα 1H NMR επιβεβαίωσε τον σχηματισμό ενός δακτυλίου διθειολανίου μεταξύ βενζαλδεΰδων και 2,3-μερκαπτο -1-προπανόλη. Στα φασματοσκοπικά δεδομένα 1H NMR των PDTMs, η κορυφή 2-H εμφανίστηκε πιο κάτω από τις κορυφές των πρωτονίων που συνδέονται με άτομα άνθρακα sp3 και οι κορυφές 4-H εξωμεθυλενίου και 5-H2 παρατηρήθηκαν περισσότερο επάνω πεδίο με ονομαστική σειρά. Σε φασματοσκοπικά δεδομένα 13C NMR, εκτός από τις κορυφές από τον δακτύλιο φαινυλίου, η κορυφή άνθρακα του εξωμεθυλενίου (~64 ppm) ήταν πιο κάτω, ακολουθούμενη από 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) και 5-C (~41 ppm). Τέσσερα προϊόντα - PDTM6, PDTM12, PDTM13 και PDTM15 - ελήφθησαν το καθένα ως ένα μόνο ρακεμικό, ενώ τα άλλα λήφθηκαν ως μείγμα δύο ρακεμικών ([2R,4R]/[2S,4S] και [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1,5), οι αναλογίες των οποίων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπικά δεδομένα 1H NMR. Το φαινόμενο στον σχηματισμό του προϊόντος δεν μπορούσε να εξηγηθεί απλώς με στερεοχημικά, ηλεκτρονικά ή/και στερεοηλεκτρονικά εφέ. οαναστολή τυροσινάσηςη ανάλυση πραγματοποιήθηκε χωρίς διαχωρισμό των ρακεμικών.

Ανασταλτικές επιδράσεις του PDTM1–PDTM17 στην τυροσινάση μανιταριού

Οι δυνατότητες των 17 συντιθέμενων προϊόντων, PDTM1–PDTM17, να αναστέλλουν τη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το kojic acid22 και την arbutin23 ως θετικούς μάρτυρες. Οι αναστολές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας 293 μΜ Ι-τυροσίνη ως υπόστρωμα και συνθετικές ενώσεις σε συγκέντρωση 50 μΜ.ΤυροσινάσηΟι αναστολές από το kojic acid και την arbutin προσδιορίστηκαν στα 50 και 500 μΜ, αντίστοιχα.

Τρεις ενώσεις – PDTM11 (3,4,5-τριμεθοξυφαινυλ), PDTM15 (4-υδροξυ-3-μεθυλφαινυλ) και PDTM17 (3,5-δι-τ-βουτυλ{{ 12}}υδροξυμεθυλ) – ανέστειλε την τυροσινάση στον ίδιο βαθμό με το κοτζικό οξύ και την ανέστειλε περισσότερο από την αρμπουτίνη (Πίνακας 1). Πέντε παράγωγα PDTM – PDTM3 (2,4-διυδροξυφαινυλ), PDTM7 (4-μεθοξυφαινυλ), PDTM8 (3,{4-διμεθοξυφαινυλ), PDTM9 (2,4-διμεθοξυφαινυλ), και PDTM13 (3-βρωμο{-4-υδροξυφαινυλ) - ανέστειλαν την τυροσινάση πιο ισχυρά από το κοτζικό οξύ. Οι τιμές IC50 αυτών των ενώσεων εξετάστηκαν: 13,94±1,76 μΜ (PDTM3), 16,47±2,36 μΜ (PDTM7), 16,97±2,99 μΜ (PDTM8), 27,85±1,47 μΜ (PDTM9) και 15,57 μM (PDTM9) και 15,57±2,36 μΜ (PDTM7). Οι χαμηλές τιμές IC50 των PDTM3, PDTM7, PDTM8 και PDTM13 έδειξαν ότι η ισχύς ήταν ισχυρότερη από εκείνη του κοτζικού οξέος (18.86±2.14 μΜ) και της αρβουτίνης (381.26±3.22 μΜ), τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι . Είναι ενδιαφέρον ότι αυτό το αποτέλεσμα συμφωνεί με το προηγούμενο εύρημα μας ότι πολλά ανάλογα με ένα τμήμα 2,4-διυδροξυφαινυλίου έχουν υψηλότερηανασταλτικό της τυροσινάσηςδραστηριότητα από το kojic acid.10,13,24–32

Τα υπόλοιπα παράγωγα PDTM δεν είχαν (PDTM1 και PDTM2) ή χαμηλή ανασταλτική δράση (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 και PDTM16) σε σύγκριση με το κοζικό οξύ. Σύμφωνα με τα συσσωρευμένα δεδομένα της σχέσης δομής-δραστικότητας, τα ανάλογα με τουλάχιστον μία ομάδα υδροξυλίου ήταν πιο ικανά να αναστέλλουν την τυροσινάση. Κάπως απροσδόκητα, τέσσερα παράγωγα PDTM χωρίς ομάδα υδροξυλίου ανέστειλαν τη δραστηριότητα τυροσινάσης τόσο πολύ ή πιο αποτελεσματικά από το κοζικό οξύ. Αυτά ήταν τα PDTM7 (4-μεθοξυφαινυλ), PDTM8 (3,4-διμεθοξυφαινυλ), PDTM9 (2,4-διμεθοξυφαινυλ) και PDTM11 (3,4,{21}}τριμεθοξυφαινυλ) . Ενώσεις (PDTM1-2, PDTM4-5 και PDTM12) με μόνο μια 4-υδροξυλική ομάδα στον δακτύλιο φαινυλίου ή μια ομάδα αλκοξυ ή υδροξυλίου στη θέση 3 με ένα 4-υδροξυλικό η ομάδα είχε χαμηλή ή καθόλου δραστικότητα, ενώ οι ενώσεις (PDTM13-PDTM17) με μια αλκυλική ή βρωμο ομάδα στη θέση 3 με μια ομάδα 4-υδροξυλίου έδειξαν μέτρια-υψηλή ανασταλτική δράση τυροσινάσης. Αυτά τα αποτελέσματα της σχέσης δομής-δραστηριότητας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι τοανασταλτικό της τυροσινάσηςΗ δραστηριότητα των ενώσεων με μια ομάδα 4-υδροξυλίου επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από τον τύπο του 3-υποκαταστάτη.

κιστανάκιόφελος: αντιγήρανση

Τρόπος αναστολής της τυροσινάσης μανιταριού από το PDTM3

Δεδομένου ότι το PDTM3 ανέστειλε το μανιτάριτυροσινάσηΤα περισσότερα, μια γραφική παράσταση Lineweaver-Burk χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η φύση της ανασταλτικής της επίδρασης. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 2, λήφθηκε ένα διπλό αντίστροφο διάγραμμα και όλες οι γραμμές με διαφορετικές κλίσεις τέμνουν τον άξονα y στο ίδιο σημείο. Επομένως, οι τιμές Km (σταθερά Μιχάλης) αυξήθηκαν σταδιακά με τη συγκέντρωση του PDTM3. Λεπτομερείς τιμές κινητικών παραμέτρων φαίνονται στον Πίνακα 2. Από την άλλη πλευρά, η μέγιστη ταχύτητα αντίδρασης (Vmax) δεν επηρεάστηκε από τη συγκέντρωση PDTM3. Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν την PDTM3 δοσοεξαρτώμενη και ανταγωνιστικά αναστέλλεται τυροσινάση.

In silico docking προσομοιώσεις σύνδεσης της τυροσινάσης με PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 και kojic acid

Το AutoDock Vina χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν τα συντιθέμενα ανάλογα PDTM ανέστειλαν άμεσα την τυροσινάση μέσω της δέσμευσης στην ενεργή της θέση. Κοτζικό οξύ και πέντε ανάλογα PDTM (PDTM3, PDTM7–PDTM9 και PDTM13), τα οποία βρέθηκαν να έχουν ισχυρά μανιτάριαανασταλτικό της τυροσινάσηςδραστηριότητα, χρησιμοποιήθηκαν ως συνδέτες για την προσομοίωση σύνδεσης. Κάθε ένα από αυτά τα ανάλογα PDTM θα μπορούσε να έχει τέσσερα στερεοϊσομερή και οι ενέργειες δέσμευσης των στερεοϊσομερών υποδεικνύονται στο Σχήμα 3Α. Και τα πέντε ανάλογα PDTM βρέθηκαν να έχουν παρόμοια ή υψηλότερη συγγένεια για την ενεργό θέση της τυροσινάσης σε σύγκριση με το κοτζικό οξύ (-5,4 kcal/mol) και το PDTM3 έδειξε τη μεγαλύτερη συγγένεια. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι τα ισχυρά ανασταλτικά αποτελέσματα αυτών των πέντε παραγώγων PDTM αποδίδονταν στη συγγένεια δέσμευσής τους με την τυροσινάση και έδειξε μια στενή σχέση μεταξύ της συγγένειας δέσμευσης, όπως προσδιορίζεται από την προσομοίωση σύνδεσης, και της αναστολής της τυροσινάσης.

Το LigandScout 3.1.2 χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίησητυροσινάσηυπολείμματα αμινοξέων που αλληλεπιδρούν με ανάλογα PDTM. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 3Β και Γ, η 4-ομάδα υδροξυλίου στον δακτύλιο φαινυλίου του PDTM3 αλληλεπιδρά με το His85 της τυροσινάσης μέσω δεσμών υδρογόνου και ο δακτύλιος φαινυλίου αλληλεπιδρά με τα Val283 και Ala286 μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και με το His263 έως π-π αλληλεπίδραση στοίβαξης. Ο δεσμός υδρογόνου μεταξύ της αλκοολικής υδροξυλομάδας και των υπολειμμάτων αμινοξέων της τυροσινάσης ανιχνεύθηκε μόνο για τα PDTM7 και PDTM8. Ωστόσο, η αλκοολική υδροξυλομάδα και των δύο αναλόγων PDTM αλληλεπιδρά με διαφορετικά υπολείμματα αμινοξέων, π.χ., το PDTM7 αλληλεπιδρά με το His244 και το Asn260, ενώ το PDTM8 αλληλεπιδρά με το Gly281. Επιπλέον, το Val283 της τυροσινάσης ενεπλάκη σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και με τα πέντε ανάλογα.

Δοκιμασίες περιεκτικότητας σε μελανίνη

Τα κύτταρα B16F10 χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των αποχρωματιστικών δράσεων των αναλόγων PDTM. Το PDTM3 επιλέχθηκε για τα πειράματα με βάση τα κύτταρα, λόγω του ισχυρού μανιταριού τουανασταλτικό της τυροσινάσηςεπίδραση και την έλλειψη τοξικότητάς του στα κύτταρα B16F10. Το PDTM3 αξιολογήθηκε για την ανασταλτική του δράση έναντι του διεγερμένου από -MSHμελανογένεσησε κύτταρα B16F10 προσδιορίζοντας τα επίπεδα μελανίνης στα κύτταρα. Τα επίπεδα μελανίνης μειώθηκαν σημαντικά μετά την συνεπεξεργασία των κυττάρων με PDTM3 και -MSH σε σύγκριση με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία μόνο με -MSH. Στο εύρος συγκέντρωσης 0-25 μM, το PDTM3 εμφάνισε σημαντική και δοσοεξαρτώμενη αντιμελανογόνο δράση. Επιπλέον, σε συγκέντρωση μόνο 10 μΜ, το PDTM3 έδειξε υψηλότερη ανασταλτική ισχύ από το κοτζικό οξύ στα 25 μΜ, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αντιμελανογόνος δράση του PDTM3 στα κύτταρα B16F10 δεν σχετιζόταν με την κυτταροτοξικότητα.

Δοκιμασία δραστηριότητας τυροσινάσης σε κύτταρα B16F10

Η ανασταλτική επίδραση του PDTM3 στη δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης εξετάστηκε σε κύτταρα B16F10 προδιεγερμένα με -MSH. Το PDTM3 αναστέλλεται ανάλογα με τη δόσητυροσινάσηδραστηριότητα στο εύρος συγκέντρωσης 0–25 μM (Εικόνα 6). Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα ταίριαξαν καλά με τα αποτελέσματα της περιεκτικότητας σε μελανίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αντιμελανογόνος δράση του PDTM3 αποδίδεται στην αναστολή της τυροσινάσης.

συμπέρασμα

Σε αυτή την εργασία, μια ποικιλία αναλόγων PDTM συντέθηκε και αξιολογήθηκε για τις επιδράσεις τους σεμελανογένεσηκαι δραστηριότητα τυροσινάσης σε κύτταρα B16F10. Οκτώ ανάλογα εμφάνισαν την ίδια ή πιο ισχυρή αναστολή έναντι της τυροσινάσης των μανιταριών από το κοτζικό οξύ και το PDTM3 είχε τη μεγαλύτερη ανασταλτική δράση. Στα κύτταρα B16F10, το PDTM3 ανέστειλε σημαντικά τη βιοσύνθεση μελανίνης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο καιτυροσινάσηδραστηριότητα στο εύρος συγκέντρωσης 0–25 μM χωρίς κυτταροτοξική δράση. Σε συγκέντρωση 10 μΜ, το PDTM3 μείωσε τη βιοσύνθεση μελανίνης και τη δραστηριότητα τυροσινάσης σημαντικά περισσότερο από το κοτζικό οξύ στα 25 μΜ. Λαμβάνοντας υπόψη την παρατήρησή μας ότι πολλά ανάλογα PDTM έδειξαν ισχυρές ανασταλτικές δραστηριότητες της τυροσινάσης, προτείνουμε το 1,3-διθειολάνιο να θεωρείται κατάλληλο ικρίωμα γιαανασταλτικό της τυροσινάσηςδραστηριότητα. Τώρα, αναζητούμε συνθήκες διαχωρισμού κάθε μίγματος PDTM δύο ρακεμικών και οι συνθήκες διαχωρισμού και η αντιμελανογόνος δράση κάθε μεμονωμένου ρακεμικού μίγματος θα αναφερθούν σε εύθετο χρόνο.

Αγοράστε συμπληρώματα cistanche