Η γλυκόζη ασκεί αντιμελανογόνο δράση με έμμεση αδρανοποίηση της τυροσινάσης στα μελανοκύτταρα και σε ένα ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος

Αφηρημένη:

Τα σάκχαρα είναι πανταχού παρόντα στους οργανισμούς και είναι γνωστά καλλυντικά συστατικά για την ενυδάτωση του δέρματος με ελάχιστες παρενέργειες. Η γλυκόζη, ένα απλό σάκχαρο που χρησιμοποιείται ως πηγή ενέργειας από τα ζωντανά κύτταρα, χρησιμοποιείται συχνά σε προϊόντα περιποίησης δέρματος. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι η ζάχαρη και οι ενώσεις που σχετίζονται με τη ζάχαρη έχουν αντι-μελανογόνες επιδράσεις στα μελανοκύτταρα. Ωστόσο, ο υποκείμενος μοριακός μηχανισμός με τον οποίο η γλυκόζη αναστέλλει τη σύνθεση μελανίνης είναι άγνωστος, παρόλο που η γλυκόζη χρησιμοποιείται ως λευκαντικό καθώς και ως ενυδατικό συστατικό στα καλλυντικά. Εδώ, βρήκαμε ότι η γλυκόζη μείωσε σημαντικά την περιεκτικότητα σε μελανίνη των διεγερμένων από τη μελανοκυττάρων ορμόνης (MSH) Β16 κυττάρων και των φυσιολογικών ανθρώπινων μελανοκυττάρων με σκούρα χρώση χωρίς σημάδια κυτταροτοξικότητας.

Επιπλέον, η τοπική θεραπεία της γλυκόζης έδειξε τη λευκαντική της αποτελεσματικότητα μέσω φωτογραφίας, χρώσης Fontana-Masson (F&M) και μικροσκοπίας πολλαπλών φωτονίων σε ένα χρωματισμένο τρισδιάστατο μοντέλο ανθρώπινου δέρματος, το MelanoDerm. Ωστόσο, η γλυκόζη δεν άλλαξε τη γονιδιακή έκφραση ή τα επίπεδα πρωτεΐνης των κύριων μελανογόνων πρωτεϊνών στα μελανοκύτταρα. Ενώ η γλυκόζη μείωσε δυναμικά την ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης στα μελανοκύτταρα, δεν μείωσε τη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών σε ένα πειραματικό σύστημα χωρίς κύτταρα. Ωστόσο, η γλυκόζη μεταβολίστηκε σε γαλακτικό οξύ, το οποίο μπορεί να καταστείλει δυναμικά τη δραστηριότητα της τυροσινάσης. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η γλυκόζη αναστέλλει έμμεσα τη δραστηριότητα της τυροσινάσης μέσω της μετατροπής σε γαλακτικό οξύ, εξηγώντας τις αντι-μελανογόνες επιδράσεις της στα μελανοκύτταρα.

Η λευκαντική τυροσινάση είναι ένα βασικό ένζυμο στη σύνθεση της μελανίνης. Οι συνολικές γλυκοσίδες του Cistanche deserticola—μια ένωση που απομονώνεται από το φυσικό κινέζικο φυτικό φάρμακο Το Cistanche deserticola μπορεί να μειώσει σημαντικά τη δραστηριότητα της τυροσινάσης. Το αποτέλεσμα είναι μια ανταγωνιστική αναστρέψιμη αναστολή, η οποία μπορεί να αναστείλει αποτελεσματικά τη χρώση του δέρματος, ένα υπέροχο αποτέλεσμα λεύκανσης ομορφιάς. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι: όταν η συγκέντρωση των συνολικών γλυκοσιδών του Cistanche deserticola ήταν στο εύρος των 0.5-3.0 mg·mL-1, είχε ανασταλτικό χαρακτήρα. επίδραση στη δραστηριότητα της τυροσινάσης και μια καλή σχέση δόσης-επίδρασης βρέθηκε στην περιοχή των 0.5-2.0 mg·mL-1.

Κάντε κλικ για να μάθετε τι είναι το cistanche

Λέξεις-κλειδιά:

μελανογένεση; ζάχαρη; γλυκόζη; τυροσινάση; ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος

1. Εισαγωγή

Η μελανογένεση είναι η διαδικασία παραγωγής μελανίνης και είναι απαραίτητη για την προστασία του δέρματος. Η μελανίνη απορροφά το υπεριώδες φως (UV) και προστατεύει το δέρμα από τις βλαβερές επιδράσεις της υπεριώδους ακτινοβολίας και των ελεύθερων ριζών [1]. Ωστόσο, επειδή η υπερβολική παραγωγή μελανίνης προκαλεί υπερμελάγχρωση, όπως φακίδες και φακίδες, οι οποίες μπορεί να θεωρηθούν μη αισθητικές, πολλές έρευνες έχουν αφιερωθεί στην εύρεση αποτελεσματικών αποχρωματιστικών συστατικών για καλλυντικά ή φάρμακα [2-4].

Η ζάχαρη είναι ένα ισχυρό υγραντικό για την ενυδάτωση του δέρματος και χρησιμοποιείται ως καλλυντικό συστατικό για την ενυδάτωση του δέρματος με ελάχιστες παρενέργειες. Επιπλέον, τα σάκχαρα και οι παράγοντες που σχετίζονται με τη ζάχαρη επηρεάζουν τη μελανογένεση [5,6]. Η γλυκοζυλίωση της τυροσινάσης, ενός βασικού ενζύμου που εμπλέκεται στη σύνθεση της μελανίνης, μπορεί να αλλοιωθεί, αναστέλλοντας την καταλυτική της δραστηριότητα και επιταχύνοντας την αποδόμησή της [7]. Ο ρόλος των σακχάρων στη μελανογένεση έχει τονιστεί από μελέτες που διερευνούν την επίδραση της γλυκοζυλίωσης στον φαινότυπο μελάγχρωσης των μελανοκυττάρων και τους ρόλους των υπολειμμάτων σακχάρου στην καταλυτική δραστηριότητα της τυροσινάσης [5-7]. Ορισμένες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα παράγωγα ζάχαρης μπορούν να αναστείλουν την ωρίμανση της τυροσινάσης, επηρεάζοντας τη γλυκοζυλίωση της. Για παράδειγμα, η Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (NAG), μια αμινοεξόζη που παράγεται φυσιολογικά με την προσθήκη μιας αμινομάδας στη γλυκόζη, διαταράσσει τη γλυκοζυλίωση της τυροσινάσης, με αποτέλεσμα αποχρωματιστικές επιδράσεις στο δέρμα του ινδικού χοιριδίου και στο ανθρώπινο δέρμα [8].

Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενώσεις που σχετίζονται με το σάκχαρο αναστέλλουν την έκφραση ή την ενεργοποίηση της τυροσινάσης καθώς και μεταβάλλουν τη γλυκοζυλίωση της. Για παράδειγμα, αξιολογήσαμε τη λευκαντική αποτελεσματικότητα του γαλακτουρονικού οξέος (GA), ενός οξέος σακχάρου που είναι μια οξειδωμένη μορφή γαλακτόζης και το κύριο συστατικό της πηκτίνης. Το γαλακτουρονικό οξύ ασκεί λευκαντική δράση μέσω της ρύθμισης της δραστηριότητας και της έκφρασης της τυροσινάσης σε κύτταρα μελανώματος ποντικού Β16 και σε ένα ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος [9]. Σε μια άλλη αναφορά, ένας νέος τύπος κυκλικού ολιγοσακχαρίτη, γνωστός ως κυκλική νιτροζυλ νιγερόζη (CNN), έδειξε μια ασθενή αλλά σημαντική άμεση ανασταλτική επίδραση στην ενζυματική δραστηριότητα της τυροσινάσης, υποδηλώνοντας έναν πιθανό μηχανισμό υπομελάγχρωσης [10]. Παρόμοια με την ωρίμανση της τυροσινάσης με σωστή γλυκοζυλίωση, η έκφραση ή η δραστηριότητα του CNN θα μπορούσε να είναι στόχος αντι-μελανογόνων παραγόντων [11]. Ωστόσο, πολλοί αντι-μελανογόνοι παράγοντες έχουν σοβαρές παρενέργειες, όπως η λεύκη [12,13]. Υπάρχει λοιπόν μεγάλο ενδιαφέρον για ασφαλέστερες αποχρωστικές ενώσεις.

Εδώ, διερευνήσαμε τις αντι-μελανογόνες επιδράσεις της γλυκόζης σε κύτταρα μελανώματος ποντικού Β16 και φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα. Επιπλέον, εξετάσαμε το χρώμα των ιστών και την κατάσταση της επιδερμίδας χρησιμοποιώντας χρώση τομής ιστού ενός ισοδύναμου ανθρώπινου δέρματος. Με βάση τα ευρήματά μας, προτείνουμε ότι η λευκαντική δράση της γλυκόζης εξαρτάται από την παραγωγή γαλακτικού οξέος, με αποτέλεσμα την αδρανοποίηση της τυροσινάσης.

2. Αποτελέσματα

2.1. Αντιμελανογονική αποτελεσματικότητα της γλυκόζης σε B16 και NHMs

Για να διερευνήσουμε την αντιμελανογόνο δράση της γλυκόζης, χρησιμοποιήσαμε δύο τύπους μελανοκυττάρων, τα κύτταρα μελανώματος Β16 (μια σειρά κυττάρων μελανώματος ποντικού) και τα φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα (NHMs). Αρχικά, προσδιορίσαμε εάν η γλυκόζη ήταν τοξική για τα κύτταρα Β16. Η γλυκόζη δεν έδειξε καμία κυτταροτοξικότητα σε συγκεντρώσεις έως 100 mM σε κύτταρα Β16, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Με βάση τα δεδομένα κυτταροτοξικότητας, τα κύτταρα Β16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις γλυκόζης για 72 ώρες παρουσία της ορμόνης διέγερσης μελανοκυττάρων (MSH), ενός επαγωγέα της μελανογένεσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, η γλυκόζη μείωσε σαφώς και σημαντικά την περιεκτικότητα σε ενδοκυτταρική μελανίνη με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το Kojic acid (KA) χρησιμοποιήθηκε ως ένωση αναφοράς για την αντιμελανογένεση, επειδή χρησιμοποιείται συχνά ως καλλυντικό συστατικό για τη λεύκανση του δέρματος [1,3,4]. Το χρώμα των προϊόντων λύσης σε κύτταρα που υπέστησαν επεξεργασία με γλυκόζη ήταν πιο ανοιχτό από το χρώμα των κυττάρων ελέγχου (Εικόνα 1C).

Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι η ποσότητα της μελανίνης που εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας μειώθηκε και το χρώμα του μέσου έγινε φωτεινό (Εικόνα 1D). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την αντι-μελανογόνο δράση της γλυκόζης σε σκούρα χρωματισμένα NHMs. Η γλυκόζη σε συγκεντρώσεις έως και 100 mM δεν ήταν κυτταροτοξική για έως και τέσσερις 4 ημέρες (Εικόνα 1Ε). Όταν προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα σε μελανίνη μετά από αγωγή με γλυκόζη των NHMs για 4 ημέρες, διαπιστώσαμε ότι η περιεκτικότητα σε μελανίνη μειώθηκε με τρόπο δοσοεξαρτώμενο (Εικόνα 1ΣΤ). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η γλυκόζη καταστέλλει τη σύνθεση μελανίνης στα μελανοκύτταρα.

Εικόνα 1. Επίδραση της γλυκόζης σε κύτταρα Β16 και φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα (NHMs). (Α) Επίδραση της γλυκόζης στη βιωσιμότητα των κυττάρων Β16. (Β) Περιεχόμενα ενδοκυτταρικής μελανίνης σε κύτταρα Β16 που διεγείρονται από -MSH. Τα περιεχόμενα ενδοκυτταρικής μελανίνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης κυττάρων, όπως περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων. (Γ) Το χρώμα του κυτταρολύματος. (D) Τα περιεχόμενα εξωκυτταρικής μελανίνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα μέσα που περιέχουν εκκρινόμενη μελανίνη μετά από συν-αγωγή με γλυκόζη και -MSH για 72 ώρες. Το KA υποδεικνύει κοτζικό οξύ (100 μg/mL), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως ένωση αναφοράς. Η φωτογραφία δείχνει τα χρώματα των πολιτιστικών μέσων. (Ε) Επίδραση της γλυκόζης στη βιωσιμότητα των NHMs. (ΣΤ) Επιδράσεις της γλυκόζης στη σύνθεση μελανίνης σε NHMs. Τα NHM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης για 4 ημέρες, πλύθηκαν και λύθηκαν με NaOH για να προσδιοριστούν τα περιεχόμενα ενδοκυτταρικής μελανίνης. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη υπολογίστηκε με απορρόφηση στα 405 nm και κανονικοποιήθηκε από τη συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SD τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.2. Λευκαντική επίδραση της γλυκόζης σε ένα 3D ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος

Για να προσδιορίσουμε περαιτέρω την αντιμελανογονική ικανότητα της γλυκόζης, χρησιμοποιήσαμε ένα τρισδιάστατο μοντέλο ανθρώπινου δέρματος, το MelanoDerm. Όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι, η γλυκόζη εφαρμόστηκε τοπικά στο MelanoDerm για 18 ημέρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση CCK-8. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, δεν παρατηρήθηκε κυτταροτοξικότητα ιστού μετά από θεραπεία με γλυκόζη για 18 ημέρες. Οι αλλαγές χρώματος του ιστού αξιολογήθηκαν με φωτογραφία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, ο επεξεργασμένος με γλυκόζη ιστός ήταν πιο ανοιχτόχρωμος από τον ιστό που είχε υποστεί αγωγή με φυσιολογικό ορό με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS). Επιπλέον, η χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E) αποκάλυψε ότι η γλυκόζη δεν προκάλεσε κατάρρευση ιστού, ενώ η χρώση fontana-masson (F&M) έδειξε ότι η γλυκόζη μείωσε τον αριθμό των υπερχρωματισμένων μελανοκυττάρων (όπως υποδεικνύεται από τα βέλη) στη βασική στιβάδα (Εικόνα 2C) .

Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τις αλλαγές στην περιεκτικότητα σε μελανίνη, συγκρίναμε τα σήματα αυτοφθορισμού της μελανίνης στα στρώματα μελανοκυττάρων των ιστών που έχουν υποστεί επεξεργασία με PBS και γλυκόζη χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού διέγερσης δύο φωτονίων (TPEF), όπως φαίνεται στο Σχήμα 2D. Μια ανάλυση αυτών των εικόνων έδειξε ότι ο όγκος μελανίνης μειώθηκε κατά περίπου 36 τοις εκατό και η ένταση του σήματος TPEF για τη μελανίνη στην πλούσια σε μελανοκύτταρα περιοχή μειώθηκε κατά περίπου 38 τοις εκατό στους ιστούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με γλυκόζη σε σύγκριση με τους ιστούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS.

Εικόνα 2. Επίδραση της γλυκόζης στο ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος, MelanoDerm. (Α) Βιωσιμότητα ισοδύναμων ανθρώπινου δέρματος που έχουν υποστεί επεξεργασία με γλυκόζη. (Β) Τα ισοδύναμα του ανθρώπινου δέρματος (MelanoDerm; n=3) υποβλήθηκαν σε τοπική αγωγή με γλυκόζη για 18 ημέρες και στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν. Η τιμή ΔL υποδεικνύει τον βαθμό ελαφρότητας σε σύγκριση με τον ιστό που έχει υποστεί αγωγή με PBS. (Γ) Χρώση H&E και F&M τμημάτων ιστού. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στερεώθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης και ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης για χρώση (ράβδος κλίμακας, 5{{10}} μm). Τα μαύρα βέλη δείχνουν χρωματισμένα μελανοκύτταρα. (Δ) Απεικόνιση μελανίνης (200 × 200 × 60 μm3) ισοδύναμων ανθρώπινου δέρματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο TPEF. Τα ψευδόχρωμα (κόκκινα) σήματα υποδεικνύουν μελανίνη (γραμμή κλίμακας, 50 μm). Τα γραφήματα υποδεικνύουν την ποσοτικοποίηση του όγκου μελανίνης και των σημάτων TPEF. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση τιμή ± SD τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. Επίδραση της γλυκόζης στην έκφραση των μελανογόνων πρωτεϊνών σε μελανοκύτταρα

Στη συνέχεια, για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός αποχρωματισμού της γλυκόζης στα μελανοκύτταρα, αξιολογήσαμε την επίδρασή της στην έκφραση μελανογόνων ενζύμων όπως η τυροσινάση και το Tyrp-1 σε κύτταρα Β16 και NHM. Τα κύτταρα Β16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γλυκόζη για τους υποδεικνυόμενους χρόνους παρουσία -MSH. Στη συνέχεια, τα επίπεδα πρωτεΐνης τυροσινάσης και Tyrp-1 προσδιορίστηκαν με δοκιμασία στυπώματος Western (Εικόνα 3Α). Τα επίπεδα έκφρασης της τυροσινάσης και του Tyrp-1 δεν μειώθηκαν από τη γλυκόζη σε κανένα χρονικό σημείο. Επιπλέον, τα επίπεδα μεταγραφής της τυροσινάσης δεν επηρεάστηκαν από τη γλυκόζη σε κύτταρα Β16 που διεγείρονται από -MSH (Εικόνα 3Β). Παρόμοια με τα κύτταρα Β16, τα επίπεδα πρωτεΐνης τυροσινάσης, Tyrp-1 και MITF δεν ανεστάλησαν από τη γλυκόζη (Εικόνα 3C) σε κύτταρα NHM που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γλυκόζη, και τα επίπεδα mRNA της τυροσινάσης και του Tyrp{14}} δεν ήταν επίσης μειώθηκε, αλλά μάλλον αυξήθηκε ελαφρά από τη γλυκόζη (Εικόνα 3D).

Εικόνα 3. Επίδραση της γλυκόζης στην έκφραση μελανογόνων πρωτεϊνών σε κύτταρα Β16 και NHMs. (Α, Β) Κύτταρα Β16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με -MSH για τον υποδεικνυόμενο χρόνο παρουσία ή απουσία 20 mM γλυκόζης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες στυπώματος Western (Α) και qRT-PCR (Β). (Γ) Τα NHM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης για 48 ώρες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία στυπώματος Western. (Δ) Τα NHM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον υποδεικνυόμενο χρόνο παρουσία 50 mM γλυκόζης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές qRT-PCR. Τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση τιμή ± SD τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων.

2.4. Επίδραση της γλυκόζης στη δραστηριότητα της τυροσινάσης

Για να ορίσουμε περαιτέρω τον μηχανισμό δράσης της γλυκόζης, εξετάσαμε εάν είχε ανασταλτική επίδραση στη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, βρήκαμε ότι η γλυκόζη δεν είχε ανασταλτική επίδραση στη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών, υποδεικνύοντας ότι η γλυκόζη δεν επηρεάζει άμεσα τη δραστηριότητα της τυροσινάσης. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε έναν προσδιορισμό ολικής ενδοκυτταρικής δραστηριότητας τυροσινάσης χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης κυττάρων που είχαν υποστεί επεξεργασία με γλυκόζη τόσο από κύτταρα Β16 όσο και από NHM. Είναι ενδιαφέρον ότι η ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης αναστέλλεται με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα Β16 που έχουν υποστεί αγωγή με γλυκόζη παρουσία -MSH (Εικόνα 4Β). Στα NHMs, η γλυκόζη ανέστειλε επίσης την ενδοκυτταρική δραστηριότητα τυροσινάσης (Εικόνα 4C). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την πιθανότητα η γλυκόζη να απενεργοποιεί έμμεσα την τυροσινάση στα μελανοκύτταρα.

Σχήμα 4. Επίδραση της γλυκόζης στη δραστηριότητα της τυροσινάσης. (Α) Επίδραση της γλυκόζης στη δραστηριότητα της τυροσινάσης μανιταριού σε ένα σύστημα χωρίς κύτταρα. (Β, Γ) Δοκιμασία κυτταρικής δραστηριότητας τυροσινάσης. (Β) Τα κύτταρα Β16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης για 24 ώρες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία κυτταρικής δραστηριότητας τυροσινάσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων. (Γ) Τα NHM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 mM γλυκόζης για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία κυτταρικής δραστηριότητας τυροσινάσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων. Η δραστηριότητα της κυτταρικής τυροσινάσης κανονικοποιήθηκε από το συνολικό περιεχόμενο πρωτεΐνης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SD τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων (*p < 0.05, **p <0,01, ***p < 0,001).

2.5. Απενεργοποίηση τυροσινάσης από την παραγωγή γαλακτικού οξέος σε μελανοκύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με γλυκόζη

Η γλυκόζη μετατρέπεται στον κυτταρικό μεταβολίτη γαλακτικό, ο οποίος είναι το γαλακτικό οξύ στο διάλυμα και ο οποίος έχει αναφερθεί ότι είναι αποτελεσματικός στη θεραπεία χρωστικών βλαβών [14,15]. Επομένως, υποθέσαμε ότι η γλυκόζη μετατρέπεται σε γαλακτικό οξύ στα μελανοκύτταρα και ότι τα αυξημένα επίπεδα γαλακτικού οξέος αναστέλλουν τη μελανογένεση μέσω της αδρανοποίησης της τυροσινάσης. Για να αξιολογήσουμε αυτήν την υπόθεση, πρώτα αξιολογήσαμε την παραγωγή γαλακτικού οξέος σε μέσα από μελανοκύτταρα που έχουν υποστεί επεξεργασία με γλυκόζη. Όπως αναμενόταν, η γλυκόζη ρύθμισε σημαντικά προς τα πάνω την περιεκτικότητα σε γαλακτικό οξύ στα καλλιεργούμενα μέσα με κύτταρα Β16 (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, επειδή το γαλακτικό οξύ είναι γνωστό ότι αναστέλλει άμεσα τη δραστηριότητα της τυροσινάσης [15], αξιολογήσαμε εάν το γαλακτικό οξύ κατέστειλε τη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, το γαλακτικό οξύ ανέστειλε δραματικά τη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών, σε αντίθεση με τη γλυκόζη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μετατροπή της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ έχει αντι-μελανογόνο δράση μέσω της απενεργοποίησης της τυροσινάσης από το γαλακτικό οξύ.

Σχήμα 5. Παραγωγή γαλακτικού από γλυκόζη και επίδραση γαλακτικού οξέος στη δραστηριότητα τυροσινάσης. (Α) Παραγωγή γαλακτικού στα επεξεργασμένα με γλυκόζη κύτταρα Β16. (Α) Τα κύτταρα Β16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης για 3 ημέρες. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία γαλακτικού με χρήση των καλλιεργημένων μέσων, όπως περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων. (Β) Επίδραση του γαλακτικού οξέος στη δραστηριότητα της τυροσινάσης μανιταριού σε ένα σύστημα χωρίς κύτταρα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SD τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων μετρήσεων (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001) .

3. Συζήτηση

Τα σάκχαρα ή τα υλικά που προέρχονται από τη ζάχαρη χρησιμοποιούνται συχνά ως καλλυντικά συστατικά για την προστασία του δέρματος και τον φυσιολογικό έλεγχο. Για παράδειγμα, η ραφινόζη αυξάνει την ανεξάρτητη από mTOR αυτοφαγία και μειώνει τον κυτταρικό θάνατο σε κερατινοκύτταρα που ακτινοβολούνται με UVB, υποδεικνύοντας ότι ο φυσικός παράγοντας ραφινόζη έχει πιθανή αξία στον περιορισμό της φωτοφθοράς [16]. Η τρεαλόζη και η σακχαρόζη είναι νέοι ενεργοποιητές της αυτοφαγίας στα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα μέσω μιας ανεξάρτητης από το mTOR μονοπατιού [17]. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέα εικόνα για τη ρύθμιση της αυτοφαγίας στα κερατινοκύτταρα με τη μεσολάβηση του σακχάρου. Στην περίπτωση της γλυκόζης, η τοπική γλυκόζη αποδείχθηκε ότι επάγει την έκφραση κλαουδίνης-1 και φιλαγκρίνης σε μοντέλο ποντικού ατοπικής δερματίτιδας και καλλιέργειας κερατινοκυττάρων, υποδεικνύοντας ότι έχει αντιφλεγμονώδη δράση επιδιορθώνοντας τη λειτουργία του δερματικού φραγμού [18]. Επιπλέον, η γλυκόζη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και ενισχύει τη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων του δέρματος [19]. Ως εκ τούτου, η γλυκόζη ρυθμίζει διάφορες πτυχές της επιδερμιδικής φυσιολογίας, όπως οι λειτουργίες φραγμού του δέρματος και τα επίπεδα ενυδάτωσης των κερατινοκυττάρων.

Τα σάκχαρα μπορούν να δράσουν ως αποχρωματιστικοί παράγοντες μέσω αρκετών διαφορετικών μηχανισμών που περιλαμβάνουν τυροσινάση. Για παράδειγμα, ορισμένοι παράγοντες αναστέλλουν την ωρίμανση της τυροσινάσης, ενώ άλλοι παράγοντες επάγουν την αναστολή της έκφρασης ή της δραστηριότητας του γονιδίου της τυροσινάσης [5,8-10]. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τους μηχανισμούς που κρύβονται πίσω από τις επιδράσεις αποχρωματισμού της γλυκόζης.

Για να προσδιορίσουμε την επίδραση της γλυκόζης στη μελανογένεση, εστιάσαμε προηγουμένως στους υποδοχείς X του ήπατος (LXRs), οι οποίοι είναι πυρηνικοί υποδοχείς ενεργοποιημένοι από συνδέτη που παίζουν καθοριστικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων και την ομοιόσταση της χοληστερόλης [20]. Βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του υποδοχέα Χ του ήπατος αναστέλλει τη μελανογένεση μέσω της επιτάχυνσης της αποικοδόμησης του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF) που προκαλείται από εξωκυτταρικό σήμα κινάσης (ERK) [21].

Επιπλέον, η γλυκόζη είναι ένας ενδογενής συνδέτης LXR [22]. Έτσι, υποθέσαμε ότι η γλυκόζη έχει αντι-μελανογόνα αποτελέσματα λόγω της ενεργοποίησης μιας οδού που εξαρτάται από το LXR. Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Γ, η γλυκόζη δεν άλλαξε τα επίπεδα έκφρασης της τυροσινάσης ή του MITF, αν και η ενεργοποίηση του LXR μείωσε τα επίπεδα έκφρασης αυτών των πρωτεϊνών στα μελανοκύτταρα. Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η γλυκόζη είχε αποχρωματιστικά αποτελέσματα στα μελανοκύτταρα ανεξάρτητα από την ενεργοποίηση του LXR.

Η γλυκόζη είναι το κύριο υπόστρωμα για την παραγωγή ενέργειας και υδρολύεται μέσω σειριακών αντιδράσεων πολλών ενζύμων, γνωστών ως γλυκόλυση. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η γλυκόλυση έχει μόνο ένα τελικό προϊόν, το γαλακτικό οξύ, είτε υπό αερόβιες είτε σε αναερόβιες συνθήκες. Υπό αερόβιες συνθήκες (O2), το γαλακτικό χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα της μιτοχονδριακής γαλακτικής αφυδρογονάσης (MLD). Τα LDH το μετατρέπουν σε πυροσταφυλικό που εισέρχεται στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA). Υπό αναερόβιες συνθήκες (N2), το γαλακτικό συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Επομένως, η οδός γλυκόλυσης ξεκινά με τη γλυκόζη ως υπόστρωμά της και τελειώνει με την παραγωγή γαλακτικού ως κύριο τελικό προϊόν [23]. Επιπλέον, ο David et al. μέτρησε το κλάσμα γλυκόζης που μετατράπηκε σε γαλακτικό οξύ ή πυροσταφυλικό στο φυσιολογικό ανθρώπινο μελανοκύτταρο [24]. Οι περισσότεροι από τους μεταβολίτες της γλυκόζης ήταν γαλακτικό οξύ και όχι πυροσταφυλικό.

Το γαλακτικό οξύ είναι ένα άλφα υδροξυ οξύ (AHA). Αυτά τα οξέα χρησιμοποιούνται εκτενώς σε καλλυντικά σκευάσματα ως επιφανειακοί παράγοντες απολέπισης [25]. Επιπλέον, το γαλακτικό οξύ καταστέλλει τον σχηματισμό μελανίνης αναστέλλοντας άμεσα τη δραστηριότητα της τυροσινάσης, μια επίδραση ανεξάρτητη από την όξινη φύση της, πράγμα που σημαίνει ότι οι επιδράσεις του γαλακτικού οξέος στις μελαγχρωματικές βλάβες οφείλονται όχι μόνο στην επιτάχυνση του κύκλου εργασιών των επιδερμικών κυττάρων αλλά και στην άμεση αναστολή του σχηματισμού μελανίνης στο μελανοκύτταρα [15]. Έτσι, σκεφτήκαμε ότι η γλυκόζη μπορεί να ασκήσει την αντιμελανογόνο δράση της μέσω της παραγωγής γαλακτικού οξέος επειδή η γλυκόζη μπορεί να μετατραπεί σε γαλακτικό οξύ.

Όπως αναμενόταν, διαπιστώσαμε ότι η επεξεργασία με γλυκόζη είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή γαλακτικού οξέος στα μελανοκύτταρα (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι το γαλακτικό οξύ ανέστειλε δυναμικά και άμεσα τη δραστηριότητα της τυροσινάσης (Εικόνα 5Β). Οι Usuki et al. ανακάλυψε επίσης ότι το γαλακτικό οξύ μείωσε τη δραστηριότητα της ενδοκυτταρικής τυροσινάσης σε κύτταρα Β16 και ανθρώπινα κύτταρα HM3KO [15]. Στην αναφορά, τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης της τυροσινάσης και του Tyrp-1 δεν επηρεάστηκαν από το γαλακτικό οξύ. Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η γλυκόζη αυξάνει την παραγωγή γαλακτικού οξέος και ότι αυτό το γαλακτικό οξύ αναστέλλει άμεσα τη δραστηριότητα τυροσινάσης χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, υποδεικνύοντας ότι η γλυκόζη έχει αντιμελανογόνο δράση στα μελανοκύτταρα μέσω έμμεσης απενεργοποίησης τυροσινάσης που εξαρτάται από την παραγωγή γαλακτικού οξέος. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω πειραματισμοί για την επικύρωση του ρόλου του γαλακτικού οξέος και της γλυκόζης στην αποχρωματισμό.

Συλλογικά δεδομένα από αυτή τη μελέτη παρέχουν προκαταρκτικά στοιχεία που υποστηρίζουν τη χρησιμότητα της τοπικής γλυκόζης ως αποτελεσματικής λεύκανσης καθώς και ως ενυδατικού αντιδραστηρίου που μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια σε καλλυντικά και φαρμακευτικά σκευάσματα.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Υλικά

D-γλυκόζη, -MSH, κοτζικό οξύ (ΚΑ), L-τυροσίνη, L-DOPA και γαλακτικό οξύ αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Αντισώματα κατά της τυροσινάσης και της ακτίνης αγοράστηκαν από την Abcam (Cambridge, UK). Το αντίσωμα κατά του Tyrp-1 αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology (CA, ΗΠΑ). Το αντίσωμα κατά του MITF αγοράστηκε από την Proteintech (πόλη, IL, ΗΠΑ).

4.2. Δοκιμασία Κυτταρικής Καλλιέργειας και Βιωσιμότητας

Αγοράσαμε κύτταρα μελανώματος ποντικού Β16, τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα Β16 καλλιεργήθηκαν σε DMEM που περιείχε 4500 mg/L υψηλής γλυκόζης (ATCC 30-2002) όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (ATCC) συμπληρωμένο με 5 τοις εκατό FBS και επωάστηκαν στους 37 ◦C σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 95 τοις εκατό αέρα και 10 τοις εκατό CO2. Πρωτεύοντα NHM με σκούρο χρώμα αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Μέσο 254 (#Μ254500) συμπληρωμένο με Συμπλήρωμα Ανάπτυξης Ανθρώπινου Μελανοκυττάρου (#S0025) και επωάστηκαν στους 37°C υπό ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2. Για πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν πρωτεύοντα NHM μεταξύ των διελεύσεων 4 και 7. Η βιωσιμότητα των καλλιεργημένων κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (DOJINDO, Τόκιο, Ιαπωνία).

4.3. Μέτρηση της περιεκτικότητας σε μελανίνη

Η περιεκτικότητα σε μελανίνη προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται σε προηγούμενες αναφορές [2-4]. Εν συντομία, τα κύτταρα Β16 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης παρουσία -MSH (200 ηΜ) για 72 ώρες. Τα NHM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης για 4 ημέρες. Στη συνέχεια, όλα τα κύτταρα πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και διαλύθηκαν σε 1 Ν NaOH στους 60°C για 1 ώρα. Τα κυτταρολύματα μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν με βάση τις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης σε κάθε φρεάτιο δείγματος.

4.4. Δοκιμασία δραστηριότητας τυροσινάσης μανιταριού

Διερευνήσαμε τις άμεσες επιδράσεις των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων γλυκόζης στη δραστηριότητα της τυροσινάσης των μανιταριών. Εν συντομία, 100 μL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών που περιέχει γλυκόζη αναμίχθηκαν με τυροσινάση μανιταριού (10 μονάδες/φρεάτιο) και συνδυάστηκαν με 50 μL L-τυροσίνης 0,03 τοις εκατό ή L-DOPA σε απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, το μίγμα επωάστηκε μαζί στους 37 ◦C για 10 λεπτά, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm. Ως ένωση αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το Kojic acid (KA), ένας πολύ γνωστός παράγοντας κατά της τυροσινάσης.

4.5. Δοκιμασία Ενδοκυτταρικής Δραστικότητας Τυροσινάσης

Εν συντομία, κύτταρα Β16 ή ΝΗΜ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 50 mM (ρΗ 6,8) που περιείχε 1 τοις εκατό Triton Χ-100 και 0,1 mM φαινυλομεθυλ-σουλφονυλοφθορίδιο. Τα κυτταρολύματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 rpm στους 4 ◦C για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο που περιέχει την κυτταρική τυροσινάση συλλέχθηκε και η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε για κανονικοποίηση. Το κυτταρικό εκχύλισμα επωάστηκε με L-DOPA σε ρυθμιστικό φωσφορικών και ο σχηματισμός ντοπαχρώματος παρακολουθήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 405 nm εντός 30 λεπτών.

4.6. Απομόνωση RNA και ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR)

Για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση mRNA επιλεγμένων γονιδίων, απομονώθηκε ολικό RNA με TRIzol (Invitrogen, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και 4 μg RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας RT-premix (Bioneer, Seoul, South Κορέα). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ABI 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Τα σετ εκκινητών qRT-PCR για τυροσινάση και Tyrp-1 αγοράστηκαν από την Applied Biosystems και τα κιτ προσδιορισμού γονιδιακής έκφρασης TaqMan (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση. Η έκφραση του γονιδίου στόχου κανονικοποιήθηκε σε εκείνη του γονιδίου housekeeping που κωδικοποιεί την υπομονάδα P0 πλευρικής ριβοσωματικής πρωτεΐνης μίσχου (RPLP0). Η σχετική κβαντοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της συγκριτικής Δ∆Ct σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

4.7. Western Blotting

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια λύθηκαν σε παγωμένο τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Cell Signaling Technology, ΜΑ, USA) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Προσδιορίστηκε η ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης και οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα Bis-Tris βαθμίδωσης 4-12 τοις εκατό (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), που μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Thermo Fisher Scientific). Μετά τη μεταφορά, οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε ένα διάλυμα αποκλεισμού 5 τοις εκατό. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα στους 4 ◦C για 24 ώρες, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιείχε 0.1 τοις εκατό Tween-20 (TBST) και εκτέθηκαν σε δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν τρεις φορές με TBST. Αναπτύχθηκε ένα σήμα χημειοφωταύγειας χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Western blotting ECL (GE Healthcare, Hatfield, UK).

4.8. Τρισδιάστατο (3D) ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος

Χρησιμοποιήσαμε το MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, ΗΠΑ) ως μοντέλο ανθρώπινου ιστού δέρματος. Αυτό το βιώσιμο, ανασυσταμένο, τρισδιάστατο ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος προήλθε από μαύρους δότες και περιέχει φυσιολογικά μελανοκύτταρα και κερατινοκύτταρα. Το MelanoDerm αναπτύχθηκε στη διεπαφή αέρα-υγρού σε μέσο EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, ΗΠΑ). Πριν από την επεξεργασία με γλυκόζη, οι ιστοί πλύθηκαν με 1 mL PBS για να απομακρυνθούν οι υπολειμματικές ενώσεις. Η γλυκόζη διαλύθηκε σε PBS. Η τελική συγκέντρωση γλυκόζης ήταν 2 τοις εκατό. Το δείγμα ελέγχου υποβλήθηκε σε επεξεργασία μόνο με PBS. Εφαρμόστηκε γλυκόζη στο MelanoDerm τις ημέρες 1, 4, 6, 8, 11, 13 και 15. Μετά από 18 ημέρες, οι ιστοί MelanoDerm στερεώθηκαν σε φορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, κόπηκαν σε πάχος 3 μm και υποβλήθηκαν στη χρώση H&E και F&M. Η βιωσιμότητα των δειγμάτων ιστού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (DOJINDO, Τόκιο, Ιαπωνία). Η μελάγχρωση του MelanoDerm αξιολογήθηκε συγκρίνοντας την αλλαγή στην τιμή L*.

4.9. Απεικόνιση φθορισμού διέγερσης δύο φωτονίων (TPEF).

Για να απεικονίσουμε την κατανομή της μελανίνης στο 3D ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος, πραγματοποιήσαμε απεικόνιση TPEF, όπως περιγράφεται στις προηγούμενες αναφορές μας [3,4]. Εν συντομία, κάθε παρασκεύασμα MelanoDerm σταθεροποιήθηκε σε φορμαλίνη 4 τοις εκατό για 24 ώρες στους 4 ◦C και στη συνέχεια πλύθηκε με PBS/0.1 τοις εκατό BSA (αλβουμίνη ορού βοοειδών, Merck, Branchburg, NJ, ΗΠΑ). Οι εικόνες TPEF ελήφθησαν από τη βασική στιβάδα για τη μέτρηση της ενδοκυτταρικής μελανίνης στο στρώμα των μελανοκυττάρων. Οι σχετικές εντάσεις σήματος TPEF για τη μελανίνη στον όγκο μέτρησης ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

4.10. Δοκιμασία L-γαλακτικού

Κύτταρα Β16 σπάρθηκαν σε 1.0 × 105 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 12-πηγαδιού. Μετά από θεραπεία με γλυκόζη για 3 ημέρες, τα εξωκυτταρικά επίπεδα γαλακτικού ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ χρωματομετρικής δοκιμασίας L-γαλακτικού (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

4.11. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SDs (τυπικές αποκλίσεις) και η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με τη δοκιμή t Student. Μια τιμή p < 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Συνεισφορές συγγραφέα:

Conceptualization, H.-JK, JL και CSL; Επιμέλεια δεδομένων, SHL; Investigation, SHL; Methodology, SHL, I.-HB, and E.-SL; Εποπτεία, JL και CSL. Γράψιμο—πρωτότυπο προσχέδιο, SHL και CSL. Γράψιμο — κριτική και επεξεργασία, JL Όλοι οι συγγραφείς έχουν διαβάσει και έχουν συμφωνήσει με τη δημοσιευμένη έκδοση του χειρογράφου.

Χρηματοδότηση:

Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας Επιστημών μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας (NRF) που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας (Αριθμός επιχορήγησης: 2018R1D1A1B07049402).

Σύγκρουση συμφερόντων:

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Συντομογραφίες

-MSH -μελανοκυτταροδιεγερτική ορμόνη

Πρωτεΐνη σχετιζόμενη με την τυροσινάση Tyrp-1 1

Μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία MITF

NHMs φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα

Φθορισμός διέγερσης TPEF δύο φωτονίων

Υποδοχέας LXR ήπατος Χ

AHAs άλφα υδροξυοξέα

H&E αιματοξυλίνη και ηωσίνη

F&M Fontana-Masson

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Swalwell, Η.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Διερεύνηση του ρόλου της μελανίνης στην παραγωγή κυτταρικών και μιτοχονδριακών ROS που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία/UVA/UVB και το υπεροξείδιο του υδρογόνου και τη βλάβη του μιτοχονδριακού DNA σε κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος. Free Radic. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Park, Μ.; Jung, Κ.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Ένα νέο παράγωγο αδαμαντυλοβενζυλοβενζαμιδίου, AP736, καταστέλλει τη μελανογένεση μέσω της αναστολής του παράγοντα μεταγραφής που σχετίζεται με την cAMP-PKA-CREB-Activated microphthalmia και της έκφρασης της τυροσινάσης. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Ω, SG; et al. Αντιμελανογόνος αποτελεσματικότητα του Melasolv (3,4,5-Τριμεθοξυκινναμιδικός εστέρας θυμόλης) σε μελανοκύτταρα και τρισδιάστατο ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Τα λιπίδια Lee, CS Mannosylerythritol αναστέλλουν τη μελανογένεση μέσω της καταστολής της σηματοδότησης ERK-CREB-MITF-Tyrosinase σε φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα και σε ένα τρισδιάστατο ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, ΒΗ; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Η ανάπτυξη αντιμελανογόνων παραγόντων με βάση τη ζάχαρη. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, Ν.; Gautam, HK Melanogenesis Inhibitors. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. Ando, ​​Η.; Kondoh, Η.; Ichihashi, Μ.; Ακοή, Προσεγγίσεις VJ για τον εντοπισμό αναστολέων της βιοσύνθεσης μελανίνης μέσω του ποιοτικού ελέγχου της τυροσινάσης. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MY; Yoon, TJ Διαταραχή της γλυκοζυλίωσης της τυροσινάσης από τη Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη και τα αποχρωματιστικά της αποτελέσματα σε δέρμα ινδικού χοιριδίου και ανθρώπινο δέρμα. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Αποτελεσματικότητα αποχρωματισμού του γαλακτουρονικού οξέος μέσω της ρύθμισης της τυροσινάσης σε κύτταρα μελανώματος ποντικού Β16 και σε ένα τρισδιάστατο ισοδύναμο ανθρώπινου δέρματος. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; Kunikata, Τ.; Matsumoto, Υ.; Hanaya, Τ.; Harashima, Α.; Nishimoto, Τ.; Ushio, S. Επιδράσεις ενός κυκλικού υδατάνθρακα μη κυκλοδεξτρίνης σε κύτταρα μελανώματος ποντικού: Χαρακτηρισμός ενός νέου τύπου υποχρωματισμένης ζάχαρης. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Νέοι αναστολείς τυροσινάσης από φυσικούς πόρους – Οι υπολογιστικές τους μελέτες. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, Μ.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Μια ενημερωμένη ανασκόπηση για βιολογικές, χημικές και κλινικές πτυχές. Χρώμα. Κύτταρο. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, Μ.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Διαφορετικές επιδράσεις πέντε αποχρωστικών ενώσεων, ροδόδεντρου, κετόνης βατόμουρου, μονοβενζόνης, ρουκινόλης και ΑΡ736 στη μελανογένεση και τη βιωσιμότητα των ανθρώπινων επιδερμικών μελανοκυττάρων. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, π.Χ. Khan, S.; Lange, Α.; Hu, WS Μεταβολισμός γλυκόζης σε κυτταρική καλλιέργεια θηλαστικών: Νέες ιδέες για την προσαρμογή των vintage μονοπατιών. Τάσεις. Biotechnol. 2010, 28, 476-484. [CrossRef]

15. Usuki, Α.; Ohashi, Α.; Sato, Η.; Ochiai, Υ.; Ichihashi, Μ.; Funasaka, Υ. Η ανασταλτική επίδραση του γλυκολικού οξέος και του γαλακτικού οξέος στη σύνθεση μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. Lin, S.; Li, L.; Li, Μ.; Gu, Η.; Chen, X. Raffinose αυξάνει την αυτοφαγία και μειώνει τον κυτταρικό θάνατο σε κερατινοκύτταρα ακτινοβολημένα με UVB. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, Χ.; Li, Μ.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, Μ.; Huang, J.; Chen, Κ.; Οι Gu, Η. Τρεχαλόζη, η σακχαρόζη και η ραφινόζη είναι νέοι ενεργοποιητές της αυτοφαγίας σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα μέσω μιας οδού ανεξάρτητης από mTOR. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, Κ.; Matsushita, Κ.; Wang, J.; Kanekura, T. Η τοπική γλυκόζη επάγει την έκφραση Claudin-1 και Filaggrin σε μοντέλο ποντικού ατοπικής δερματίτιδας και σε καλλιέργεια κερατινοκυττάρων, ασκώντας αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα επιδιορθώνοντας τη λειτουργία του φραγμού του δέρματος. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. Spravchikov, Ν.; Sizyakov, G.; Gartsbein, Μ.; Accili, D.; Tennenbaum, Τ.; Wertheimer, E. Επιδράσεις γλυκόζης στα κερατινοκύτταρα του δέρματος: Επιπτώσεις για τις δερματικές επιπλοκές του διαβήτη. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. Castrillo, Α.; Tontonoz, P. Πυρηνικοί υποδοχείς στη βιολογία των μακροφάγων: Στο σταυροδρόμι του μεταβολισμού των λιπιδίων και της φλεγμονής. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455-480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Park, Μ.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, Η.; Son, ED; Park, YH; Η ενεργοποίηση του υποδοχέα Lim, KM Liver X αναστέλλει τη μελανογένεση μέσω της επιτάχυνσης της υποβάθμισης του MITF με τη μεσολάβηση ERK. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, Ν.; Mak, ΡΑ; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, Ε.; Molteni, V.; Kreusch, Α.; Saez, E. Ο πυρηνικός υποδοχέας LXR είναι ένας αισθητήρας γλυκόζης. Nature 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, Α. Carbohydrate; IntechOpen: Λονδίνο, ΗΒ, 2017. σελ. 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, Α.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Ζ.; Osterman, Α.; Smith, J. Συγκριτικό προφίλ μεταβολικής ροής κυτταρικών γραμμών μελανώματος: Πέρα από το φαινόμενο Warburg. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Dual Effects of Alpha-Hydroxy Acids on the Skin. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com