Αντιμελανογόνες και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες του αιθανολικού εκχυλίσματος της Kummerowia Striata: Η Kummerowia Striata ρυθμίζει την αντιμελανογόνο δράση μέσω της μείωσης της ρύθμισης του TRP-1, του TRP-2 και της έκφρασης MITF

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Η Kummerowia striata (K. striata) χρησιμοποιείται ως παραδοσιακό φάρμακο για θεραπεία που σχετίζεται με φλεγμονές. Για να προσδιορίσουμε εάν έχει ευεργετικές αντιμελανογόνες και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες, διερευνήσαμε τις βιολογικές δραστηριότητες του αιθανολικού εκχυλίσματος Kummerowia striata (EKS) χρησιμοποιώντας μια ποικιλία συστημάτων μοντέλων in vitro και κυτταροκαλλιέργειας. Η αντι-μελανογόνος δράση αξιολογήθηκε σε κύτταρα μελανώματος B16F10 όσον αφορά τη σύνθεση μελανίνης και την in vitro ανασταλτική δράση της τυροσινάσης. Οι αντιοξειδωτικές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας άλας διαμμωνίου 2,2-διφαινυλ-1-πικρυλυδραζυλίου (DPPH) και 2,2ʹ-κασινο-δις (3-αιθυλοβενζοθειαζολίνης-6-σουλφονικού οξέος (ABTS). Το EKS έδειξε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση σε προσδιορισμούς DPPH και ABTS. Τα επίπεδα μεταγραφής του mRNA και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης της τυροσινάσης, της πρωτεΐνης 1 που σχετίζεται με τυροσινάση, της πρωτεΐνης 2 που σχετίζεται με την τυροσινάση και του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία μειώθηκαν με δοσοεξαρτώμενο τρόπο με τη θεραπεία με EKS.

Επιπλέον, το EKS δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, υποδεικνύοντας ότι ο μηχανισμός δράσης της αναστολής της σύνθεσης μελανίνης με τη μεσολάβηση EKS δεν περιλαμβάνει κυτταροτοξικότητα. Επίσης, επιβεβαιώσαμε ότι το π-κουμαρικό οξύ και η κερκετίνη είναι σημαντικές ενώσεις για τις αντι-μελανογένεση και τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες του EKS. Συλλογικά, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι το EKS διαθέτει αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες. Περαιτέρω αξιολόγηση και ανάπτυξη του EKS ως λειτουργικού συμπληρώματος ή καλλυντικού μπορεί να είναι χρήσιμη για τη λεύκανση του δέρματος και τη μείωση των ρυτίδων.

Για τη λεύκανση, διαπιστώσαμε ότι το Cistanche έχει λευκαντικό αποτέλεσμα και το Cistanche είναι πλούσιο σε βιταμίνη C, η οποία θεωρείται πολύ αποτελεσματικός λευκαντικός παράγοντας. Η βιταμίνη C μπορεί να αναστείλει τη σύνθεση της μελανίνης, ενός τύπου μελανίνης που μπορεί να κάνει το δέρμα των ανθρώπων θαμπό. Ταυτόχρονα, η βιταμίνη C μπορεί επίσης να προωθήσει την παραγωγή κολλαγόνου, το οποίο είναι μια ουσία που κάνει το δέρμα πιο σφριγηλό και πιο ελαστικό.

Εκτός από τα παραπάνω συστατικά, το Cistanche περιέχει επίσης μια ποικιλία αμινοξέων και ιχνοστοιχείων, τα οποία είναι επίσης πολύ ευεργετικά για την υγεία του δέρματος. Για παράδειγμα, ο ψευδάργυρος που περιέχεται στο Cistanche μπορεί να βοηθήσει στη θεραπεία της ακμής και των ηλιακών εγκαυμάτων, ενώ παράλληλα αποτρέπει τη γήρανση του δέρματος. Επιπλέον, το Cistanche έχει επίσης καλή προστατευτική δράση στο συκώτι και στο ανοσοποιητικό σύστημα.

Κάντε κλικ στο προϊόν συμπληρώματος cistanche deserticola

1. Εισαγωγή

Μελέτες για την εξωτερική γήρανση έχουν αναφέρει ότι το δέρμα παίζει σημαντικό ρόλο στον εντοπισμό της γήρανσης του ανθρώπου [1,2]. Η γήρανση του δέρματος μπορεί να χωριστεί σε δύο τύπους: τη χρονολογική γήρανση, η οποία συνοδεύεται από την προοδευτική επιδείνωση της δομής και της λειτουργίας του δέρματος με την πάροδο του χρόνου και ο άλλος είναι η εξωγενής γήρανση (φωτογήρανση) όπου η υφή του δέρματος αλλάζει λόγω μακράς διάρκεια έκθεσης στο ηλιακό φως [3,4]. Οι ελεύθερες ρίζες και τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου είναι τα πιο σημαντικά συστατικά που τροφοδοτούν τη γήρανση του δέρματος. Προκαλούν οξειδωτικό στρες στα κύτταρα του δέρματος και οι ουσίες που παράγονται κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας προκαλούν αυξημένη παραγωγή μελανίνης και ρυτίδες.

Η μελανίνη συντίθεται με την οξείδωση της τυροσινάσης ή της L-3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνης (L-DOPA) μέσω της δραστηριότητας της τυροσινάσης και της πρωτεΐνης 1 που σχετίζεται με την τυροσινάση (TRP-1). Τα μελανοκύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην προστασία του δέρματος από βλάβες από την ακτινοβολία [5,6]. Η βιοσύνθεση της μελανίνης στα μελανοκύτταρα διαμεσολαβείται από το ένζυμο τυροσινάση που ρυθμίζει τον σχηματισμό της L-DOPA μέσω της υδρόλυσης της τυροσίνης και το σχηματισμό της DOPA κινόνης μέσω οξείδωσης της DOPA [7,8]. Επιπλέον, ο μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF) είναι ένας βασικός μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει τη μεταγραφή των μελανογόνων ενζύμων (δηλ. τυροσινάση, TRP-1 και TRP-2) [9,10]. Η τυροσινάση και η TRP-1 ρυθμίζονται μεταγραφικά από το MITF, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στην οδό σύνθεσης μελανίνης [11,12].

Kummerowia striata (Thunb. ex Murray) Το Schindl (K. striata) είναι ένα ετήσιο φυτό ιθαγενές στην ανατολική Ασία, συμπεριλαμβανομένης της Κορέας, της Κίνας και της Ιαπωνίας. Το φυτό έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό ως παραδοσιακό φαρμακευτικό βότανο στην αντιφλεγμονώδη θεραπεία. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να αναλύσει τις πιθανές αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δράσεις ενός αιθανολικού εκχυλίσματος K. striata (EKS) και των δύο ενώσεων του. Οι αντιοξειδωτικές δραστικότητες αξιολογήθηκαν ως προς τις δραστηριότητές τους δέσμευσης ελεύθερων ριζών με χρήση άλατος διαμμωνίου 2,2ʹ-καζινο-δις (3-αιθυλβενζοθειαζολίνης-6-σουλφονικού οξέος) (ABTS) και 2,{{11 Δοκιμασίες }}διφαινυλ-1-πικρυλυδραζυλίου (DPPH). Οι δραστικότητες κατά της τυροσινάσης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία αναστολής τυροσινάσης. Βρήκαμε ότι το EKS και οι ενώσεις του είναι πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι για χρήση σε καλλυντικά προϊόντα για τη λεύκανση του δέρματος και τη μείωση των ρυτίδων.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας

Κυτταρικές σειρές μελανώματος ποντικού B16F10 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, San Jose, CA, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (Gibco, ΗΠΑ) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO2 στον αέρα στους 37 βαθμούς.

2.2. Αντιδραστήρια

Τα ακόλουθα αντισώματα αγοράστηκαν από εμπορικές πηγές: αντι-τυροσινάση, αντι-TRP-1, αντι-TRP-2 και αντι-MITF (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, ΗΠΑ). αντισώματα αντι- -ακτίνης και συζυγή IgG-υπεροξειδάσης χρένου ποντικού και κουνελιού (Cell Signaling, Beverly, MA, ΗΠΑ).

2.3. Παρασκευή εκχυλίσματος Kummerowia striata

Τα εναέρια μέρη του K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler συλλέχθηκαν στο Gimpo, Gyeonggi, Νότια Κορέα τον Σεπτέμβριο του 2013 και αναγνωρίστηκαν από τον καθηγητή Joa Sub Oh, College of Pharmacy, Πανεπιστήμιο Dankook, Cheonan, Νότια Κορέα. Ένα δείγμα κουπονιού (G63) έχει κατατεθεί στο Bio-center, Gyeonggido Business & Science Accelerator, Suwon, Νότια Κορέα. Τα εναέρια μέρη του K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler (1,8 kg) εκχυλίστηκαν με 70 τοις εκατό EtOH (3 χ 18 L) σε θερμοκρασία δωματίου. Τα συνδυασμένα εκχυλίσματα EtOH στη συνέχεια συμπυκνώθηκαν υπό κενό στους 40 βαθμούς για να δώσουν 180 g υπολείμματος. Το εκχύλισμα EtOH εναιωρήθηκε σε απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια κατανεμήθηκε διαδοχικά με διχλωρομεθάνιο (CH2Cl2), οξικό αιθυλεστέρα (EtOAc) και βουτανόλη (n-BuOH). Το κλάσμα MC (7,52 g) διαχωρίστηκε με υγρή χρωματογραφία στήλης [γυάλινη στήλη (7,5 × 40 cm) γεμάτη με σιλικαζέλ (70-230 mesh)] χρησιμοποιώντας μίγματα βαθμίδωσης ως διαλύτες έκλουσης (CH2Cl2 → MeOH).

Τα κλάσματα εκλούσεως F001–F006 ελήφθησαν από αυτόν τον αρχικό υγρό χρωματογραφικό διαχωρισμό. Το κλάσμα F003 καθαρίστηκε με χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιώντας γυάλινη στήλη (5,0 χ 40 cm) γεμάτη με πήκτωμα ODS-C18. Η στήλη στη συνέχεια εκλούστηκε με H2O → MeOH με αποτέλεσμα επτά υποκλάσματα (F007-F013). Το π-κουμαρικό οξύ (15,2 mg) απομονώθηκε από το F007 με υγρή χρωματογραφία στήλης [γυάλινη στήλη (3,0 χ 40 cm) γεμάτη με ODS-C18] χρησιμοποιώντας βαθμιδωτή έκλουση (Η2Ο → MeOH). Η κερκετίνη (13,5 mg) απομονώθηκε από το F004 με υγρή χρωματογραφία στήλης [γυάλινη στήλη (3,0 × 40 cm) γεμάτη με ODS-C18] χρησιμοποιώντας έκλουση βαθμίδωσης (Η2Ο → MeOH). Οι δομές τους διευκρινίστηκαν με έναν συνδυασμό 1D και 2D πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και φασματομετρίας μάζας, καθώς και με σύγκριση με την αναφερόμενη βιβλιογραφία [13,14].

2.4. Γενικές διαδικασίες

1D και 2D [1H-1Φασματοσκοπία συσχέτισης H (COSY), ετεροπυρηνική απλή κβαντική συνοχή (HSQC) και ετεροπυρηνική συσχέτιση πολλαπλών δεσμών (HMBC)] Τα φάσματα NMR μετρήθηκαν σε Bruker Ascend III 7{{19} {25}} Φασματόμετρο NMR MHz (Rheinstetten, Γερμανία) με τετραμεθυλσιλάνιο ως εσωτερικό πρότυπο. Οι χημικές μετατοπίσεις εκφράστηκαν ως δ τιμές. Τα φάσματα μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) ελήφθησαν σε φασματόμετρο μάζας LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία ανοικτής στήλης με χρήση πήγματος πυριτίας (Kiesel gel 60, 70-230 mesh, και 230-400 mesh, Merck) και πήγματος ODS-C18 ODS-A (12 nm S7 μm, YMC GEL, Ιαπωνία). Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας προεπικαλυμμένη γέλη πυριτίου 60 F254 (0,25 mm, Merck) και προεπικαλυμμένη γέλη πυριτίου 60 RP-18 F-254S (0,25 mm, Merck), αντίστοιχα. Όλα τα χημικά και οι διαλύτες ήταν αναλυτικής ποιότητας και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό.

2.5. Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Πραγματοποιήθηκε δοκιμασία 3-(4,5-Διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-διφαινυλ-τετραζολίου βρωμιούχου (MTT) για να προσδιοριστεί η επίδραση του EKS στα κύτταρα βιωσιμότητα. Κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96- φρεατίων (1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) και υποβλήθηκαν σε αγωγή με EKS για 24 ώρες. Συνολικά, προστέθηκαν 100 μL μέσου χωρίς ορό που περιείχε 10 τοις εκατό διάλυμα ΜΤΤ (5 mg/ml) και επωάστηκε για 3 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και πλύθηκε δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Στη συνέχεια, 100 μL διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και διαλύθηκαν σε αναδευτήρα. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA (Molecular Device, USA).

2.6. Περιεκτικότητα κυτταρικής μελανίνης

Κύτταρα B16F10 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6-πηγαδιών σε πυκνότητα 1 × 105 κύτταρα ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες. Η μελανογένεση προκλήθηκε με 100 ηΜ -μελανοκυττάρου-διεγερτική ορμόνη (-MSH). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αρβουτίνη (θετικός έλεγχος) και EKS σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. Μετά από πλύση με PBS δύο φορές, προστέθηκε ρυθμιστικό λύσης [100 mM φωσφορικό νάτριο (pH 6,8) και 0,1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), 1 τοις εκατό Triton X-100] και διαλύθηκε στους -80 βαθμούς για 30 λεπτά. Μετά τη συλλογή των κυττάρων, 1 Ν NaOH που περιέχει 10 τοις εκατό DMSO αντέδρασε στους 65 βαθμούς για 1 ώρα για να διαλυθεί το ίζημα και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm.

2.7. Δοκιμασία αναστολής τυροσινάσης

Η ανασταλτική δράση της τυροσινάσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Yagi et al. [15]. Η αντίδραση διεξήχθη σε 0.1 Μ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού καλίου (ρΗ 6,5) που περιέχει 1,5 mM L-τυροσίνη και 1250 μονάδες/ml τυροσινάση μανιταριού. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 βαθμούς για 20 λεπτά. Τα δείγματα δοκιμής προσδιορίστηκαν για αναστολή τυροσινάσης με μέτρηση της επίδρασής της στη δραστηριότητα τυροσινάσης χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA στα 490 nm. Η αρμπουτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας.

2.8. Δοκιμασία δραστικότητας καθαρισμού ριζών DPPH

Η δραστηριότητα σάρωσης ριζών DPPH μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Blois [16] και Ozgen et al. [17]. Εν συντομία, 100 μL διαλύματος DPPH διαλυμένου σε μεθανόλη προστέθηκαν σε 100 μL EKS, το οποίο αραιώθηκε στην απαιτούμενη συγκέντρωση και η αντίδραση διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 517 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA (Molecular Device, USA). Η αντιοξειδωτική βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη (ΒΗΑ) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και προσδιορίστηκε η τιμή IC50 του EKS.

2.9. Δραστηριότητα καθαρισμού ριζών ABTS

Η δραστηριότητα καθαρισμού ριζών ABTS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [18,19]. Το ABTS plus σχηματίστηκε με ανάμιξη 7 mM διαλύματος ABTS και 2,45 mM διαλύματος υπερθειικού καλίου (K2S2O8) με ABTS: K2S2O8 (αναλογία 2: 1) για 12–16 ώρες για να σχηματιστεί ένα κατιόν (ABTS συν ). Η τιμή απορρόφησης στα 734 nm ήταν 1,35 ± 0,05. Συνολικά, 100 μL του αραιωμένου διαλύματος και 100 μL EKS αραιωμένου στις απαιτούμενες συγκεντρώσεις αντέδρασαν σε θερμοκρασία δωματίου για 6 λεπτά και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 734 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA. Το BHA, ένα αντιοξειδωτικό, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας και προσδιορίστηκε η τιμή IC50 του EKS.

2.10. Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Κύτταρα μελανώματος B16F10 σπάρθηκαν σε τρυβλία 6-πηγαδιών σε πυκνότητα 1 × 106 κύτταρα/φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EKS (100-400 ug/mL) για 72 ώρες. Για την εξαγωγή ολικού RNA, αντιδραστήριο Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για λύση των κυττάρων και προστέθηκαν 200 μL χλωροφορμίου. Στη συνέχεια, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 13,000 rpm για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς και το υπερκείμενο αναμίχθηκε με ισοπροπανόλη για 30 λεπτά στους -70 βαθμούς. Μετά από φυγοκέντρηση στις 13, 000 rpm για 20 λεπτά στους 4 βαθμούς, το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και 70 τοις εκατό EtOH-διαιθυλοπυροανθρακικό νερό προστέθηκε σε κάθε σωλήνα. Μετά από φυγοκέντρηση στους 13,000 rpm για 5 λεπτά στους 4 βαθμούς, το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και ξηράνθηκε σε θερμοκρασία δωματίου.

Στη συνέχεια, 1 ug εκχυλισθέντος ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε μονόκλωνο cDNA με ολίγο dT χρησιμοποιώντας Taq DNA πολυμεράση και SuperScript®III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Το cDNA ενισχύθηκε στο MyGene™ Series Peltier Thermal Cycler Model MG96 G (LongGene Scientific Instruments, Hangzhou, Κίνα) χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές και AccuPower® Pfu PCR premix (Bioneer Corporation, Daejeon, Δημοκρατία της Κορέας). Οι συνθήκες κύκλου PCR ήταν 5 λεπτά στους 95 μοίρες ακολουθούμενοι από 30 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 βαθμούς, 30 δευτερολέπτων στους 60 βαθμούς, 1 λεπτό στους 72 βαθμούς και μια τελική επέκταση για 10 λεπτά στους 72 βαθμούς. Μετά την ενίσχυση, τα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 τοις εκατό που περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο και αναλύθηκαν με τη χρήση ενός διαφωτιστή UV.

2.11. Ανάλυση Western blot

Κύτταρα μελανώματος B16F10 καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS σε πυκνότητα 1 × 106 κύτταρα σε τρυβλία 6- φρεατίων στους 37 βαθμούς και 5 τοις εκατό CO2 για 24 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του μέσου καλλιέργειας, το EKS (100–400 ug/ml) αραιωμένο στο μέσο υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 72 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Sigma Aldrich) και φυγοκεντρήθηκαν στις 15,000 rpm για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς. Οι συνολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από τα κύτταρα και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου 8 τοις εκατό-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Whatman, Dassel, Γερμανία). Η μεμβράνη αποκλείστηκε με 5 τοις εκατό BSA για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκε όλη τη νύχτα με πρωτογενές αντίσωμα στους 4 βαθμούς. Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε και επωάστηκε με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η μεμβράνη πλύθηκε και ανιχνεύθηκε με SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, USA).

2.12. Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Student's t-test με Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, ΗΠΑ). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση, και p< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference. 

Εικ. 1. Επιδράσεις του αιθανολικού εκχυλίσματος Kummerowia striata στην αναστολή της τυροσινάσης, τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τη σύνθεση μελανίνης (Α) Η ανασταλτική δραστηριότητα τυροσινάσης του αιθανολικού εκχυλίσματος Kummerowia striata (EKS) αναλύθηκε μετρώντας την ποσότητα ντοπαχρώματος που παρήχθη στην αντίδραση. Η αρμπουτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. (Β) Περιεκτικότητα σε μελανίνη σε κύτταρα B16F10 διεγερμένα με 100 nM MSH. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη υπολογίστηκε ως ποσοστό της περιεκτικότητας στον έλεγχο. (Γ) Τα κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 υποβλήθηκαν σε αγωγή με EKS (25-400 ug/ml) και αρβουτίνη (400 ug/ml). Η κυτταροτοξικότητα του EKS και της αρβουτίνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ΜΤΤ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων αντιγράφων. Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται ως *P <0,05, **P <0,01, σε σύγκριση με δείγματα που δεν έχουν υποστεί αγωγή ή κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με -MSH.

\

Εικ. 2. Αντιοξειδωτική δράση του αιθανολικού εκχυλίσματος Kummerowia striata (Α και Β) Η δράση δέσμευσης ελεύθερων ριζών προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται. Η αντιοξειδωτική δράση μετρήθηκε με τη χρήση δοκιμασίας δραστικότητας σάρωσης ριζών DPPH και δοκιμής κατιόντων ABTS συν ρίζας. Ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων αντιγράφων. Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται ως *P < 0.05, **P <0,01, σε σύγκριση με τα δείγματα που δεν έχουν υποστεί επεξεργασία.

3. Αποτελέσματα

3.1. Αντιμελανογενετικές επιδράσεις του EKS

Για τον προσδιορισμό των αντι-μελανογόνων δράσεων του EKS, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία τυροσινάσης μανιταριού χρησιμοποιώντας L-τυροσίνη ως υπόστρωμα και τυροσινάση μανιταριού ως πηγή ενζύμου. Δεδομένου ότι η τυροσινάση είναι ένα βασικό ένζυμο που καταλύει το στάδιο περιορισμού του ρυθμού στη βιοσύνθεση μελανίνης, μετρήσαμε πρώτα την ανασταλτική ικανότητα της τυροσινάσης του EKS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, το EKS άσκησε σημαντική ανασταλτική επίδραση στη δραστηριότητα τυροσινάσης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το EKS εμφάνισε ανασταλτικές επιδράσεις στη δραστηριότητα της τυροσινάσης μανιταριού και το ανασταλτικό αποτέλεσμα του EKS ήταν παρόμοιο με αυτό της αρβουτίνης που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Στη συνέχεια, για να προσδιοριστεί η επίδραση του EKS στη σύνθεση μελανίνης, προσδιορίστηκε ποσοτικά η περιεκτικότητα σε μελανίνη των κυττάρων μελανώματος B16F10 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με EKS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, η θεραπεία με EKS μείωσε την περιεκτικότητα σε μελανίνη στα κύτταρα μελανώματος με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι η μείωση της κυτταρικής μελανίνης μπορεί να οφείλεται στην αναστολή των δραστηριοτήτων τυροσινάσης. Επιπλέον, η διερεύνηση της επίδρασης του EKS στη βιωσιμότητα των κυττάρων μελανώματος B16F10 έδειξε ότι το EKS δεν είχε σημαντική κυτταροτοξική επίδραση στα κύτταρα B16F10 στη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε (Εικ. 1C). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ξεκάθαρα ότι το EKS ασκεί αντι-μελανογόνες επιδράσεις μέσω της αναστολής της δραστηριότητας της τυροσινάσης και της σύνθεσης μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος B16F10 χωρίς να προκαλεί κυτταροτοξικότητα.

3.2. Αντιοξειδωτική δράση του EKS

Η δραστικότητα σάρωσης του EKS προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ελεύθερες ρίζες DPPH (Εικ. 2Α). Το EKS εμφάνισε υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση (δραστηριότητα καθαρισμού=50.22 τοις εκατό, IC50=98.71 ug/ml). Η ικανότητα σάρωσης του EKS αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας κατιόν ρίζας ABTS (Εικ. 2Β). Η ικανότητα σάρωσης ριζών ABTS του EKS ήταν παρόμοια με εκείνη του θετικού μάρτυρα BHA (ικανότητα σάρωσης=99.53 τοις εκατό, IC50=24.64 ug/ml). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το EKS έχει υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση.

3.3. Επίδραση του EKS στην έκφραση των γονιδίων σύνθεσης μελανίνης

Για να διερευνήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους το EKS ρυθμίζει περαιτέρω τη μελανογένεση, εξετάσαμε τις αλλαγές στην έκφραση μελανογόνων γονιδίων και πρωτεϊνών, όπως η τυροσινάση, η TRP-1, η TRP-2 και η MITF, που παίζουν καθοριστικό ρόλο στη μελανογένεση [20]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η έκφραση mRNA της τυροσινάσης, TRP-1, TRP-2 και MITF πυροδοτήθηκε από -MSH. Ωστόσο, η θεραπεία με EKS μείωσε σημαντικά την έκφραση του mRNA (100–400 ug/ml). Επιπλέον, το EKS έδειξε ισχυρή ανασταλτική δράση παρόμοια με αυτή του θετικού μάρτυρα αρβουτίνης. Στη συνέχεια, η επίδραση του EKS στην έκφραση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη μελανογένεση αξιολογήθηκε με ανάλυση western blot. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η θεραπεία με EKS ανέστειλε σημαντικά τα επαγόμενα από -MSH επίπεδα έκφρασης τυροσινάσης, TRP{-1, TRP-2 και MITF σε κύτταρα B16F10. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι οι ανασταλτικές επιδράσεις του EKS στη μελανογένεση στα κύτταρα B16F10 μπορεί να προκαλούνται μέσω της μείωσης της ρύθμισης των μελανογόνων γονιδίων και πρωτεϊνών, όπως η τυροσινάση, το TRP1, το TRP-2 και το MITF.

Εικ. 3. Επιδράσεις του αιθανολικού εκχυλίσματος Kummerowia striata στη διαδικασία βιοσύνθεσης μελανίνης (Α) Η έκφραση της τυροσινάσης, TRP1, TRP2 και MITF σε επίπεδο mRNA προσδιορίστηκε με χρήση RT-PCR. Η αρμπουτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Τα mRNA της τυροσινάσης, TRP1, TRP2 και MITF αναλύθηκαν με πρωτόκολλο πυκνομετρίας. Η αρμπουτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. (Β) Η έκφραση της τυροσινάσης, TRP1, TRP2 και MITF σε επίπεδο πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με στύπωμα western. Η αρμπουτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Η τυροσινάση, το TRP1, το TRP2 και το MITF αναλύθηκαν με πρωτόκολλο πυκνομετρίας. Η αρμπουτίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων αντιγράφων. Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται ως *P < {{10}}.05, **P <0.01, σε σύγκριση με κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με -MSH.

Εικ. 4. Αναλύθηκε η δραστηριότητα αναστολής της τυροσινάσης και η αντιοξειδωτική δράση των δραστικών ενώσεων του αιθανολικού εκχυλίσματος Kummerowia striata (Α) Η ανασταλτική δραστηριότητα της τυροσινάσης του p-κουμαρικού οξέος και της κερκετίνης (12,5–50 μΜ). (Β) Η αντι-μελανογόνος δράση του κουμαρικού οξέος και της κερκετίνης (100–400 μΜ) αναλύθηκε σε κύτταρα B16F10. (Γ) Η αντιοξειδωτική δράση του π-κουμαρικού οξέος και της κερκετίνης (6,25-100 μΜ) μετρήθηκε με τη χρήση ABTS συν δοκιμή κατιόντων ριζών. Η αρβουτίνη και το BHA χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων αντιγράφων. Η στατιστική σημασία υποδεικνύεται ως *P < 0,05, **P < 0,01, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα δείγματα.

3.4. Το π-κουμαρικό οξύ και η κερκετίνη από το EKS εμφάνισαν ισχυρές αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δράσεις

Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να αναγνωρίσουμε και να καθαρίσουμε τις λειτουργικές ενώσεις που υπάρχουν στο EKS που παρουσιάζουν ισχυρές αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Οι διάφορες ενώσεις ταυτοποιήθηκαν ως λουτεολίνη, π-κουμαρικό οξύ, ροσμαρινικό οξύ, κερκετίνη, γενιστεΐνη και (συν)-κατεχίνη. Μεταξύ αυτών, το π-κουμαρικό οξύ και η κερκετίνη ανέστειλαν την τυροσινάση και τη σύνθεση της μελανίνης και επέδειξαν ικανότητα σάρωσης παρόμοια με την αρμπουτίνη, έναν πολύ γνωστό παράγοντα αποχρωματισμού, με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το π-κουμαρικό οξύ και η κερκετίνη είναι σημαντικές ενώσεις για τις αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές ιδιότητες του EKS.

4. Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να αναλύσουμε το αντι-μελανογόνο και αντιοξειδωτικό δυναμικό του EKS και των δύο ενώσεων του p-κουμαρικού οξέος και της κερκετίνης και βρήκαμε ότι το EKS διαθέτει ισχυρές αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δράσεις.

Η μελάγχρωση του δέρματος προκαλείται κυρίως από μελανοκύτταρα στη βασική στιβάδα του δέρματος, μετά από διέγερση από την υπεριώδη ακτινοβολία. Τα διεγερμένα κερατινοκύτταρα εκκρίνουν -MSH (μια μικρή πεπτιδική ορμόνη) [21]. Έτσι, η έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία προκαλεί παραγωγή μελανίνης με αποτέλεσμα την υπερμελάγχρωση [22]. Πρόσφατα, πολλοί ερευνητές έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών λευκαντικών ενώσεων, επειδή τα καλλυντικά με λευκαντικά αποτελέσματα αποτελούν μεγάλο μέρος της αγοράς καλλυντικών. Μελέτες σχετικά με την αναστολή της βιοσύνθεσης μελανίνης αποκάλυψαν ότι η αρβουτίνη, το κοτζικό οξύ και πολλά άλλα φυσικά προϊόντα αναστέλλουν τη μελανογένεση και την υπερμελάγχρωση. Ωστόσο, οι παρενέργειες της αρβουτίνης [23] και του κοτζικού οξέος [24] έχουν πρόσφατα αναφερθεί και η χρήση αυτών των ουσιών μπορεί να περιοριστεί. Επομένως, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθούν ασφαλή υλικά λεύκανσης του δέρματος χωρίς παρενέργειες. Πρόσφατη έρευνα έχει επικεντρωθεί στην ανάπτυξη καλλυντικών λεύκανσης δέρματος από φυσικά υλικά.

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει τις διάφορες βιολογικές δραστηριότητες των εκχυλισμάτων K. striata. Συγκεκριμένα, το K. striata είναι φαρμακευτικά αποτελεσματικό για τη φλεγμονή και την οξείδωση [25,26]. Ωστόσο, οι επιδράσεις και οι μοριακοί μηχανισμοί του K. striata στη μελανογένεση δεν έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα. Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά ότι το EKS διαθέτει αντιμελανογόνες και αντιοξειδωτικές δράσεις.

Η τυροσινάση, η TRP-1 και η TRP-2 παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιοσύνθεση μελανίνης [27]. Έτσι, ο μηχανισμός που διέπει την επίδραση των παραγόντων λεύκανσης του δέρματος περιλαμβάνει την αναστολή της παραγωγής μελανίνης με τη μείωση της δραστηριότητας της τυροσινάσης [28]. Η έκφραση των γονιδίων τυροσινάσης, TRP-1 και TRP-2 είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται από το MITF [29]. Στην παρούσα μελέτη, οι αντι-μελανογονικές δραστηριότητες του EKS βρέθηκαν να διαμεσολαβούνται από την αναστολή της δραστηριότητας της τυροσινάσης και της επαγόμενης από -MSH σύνθεσης μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος B16F10, χωρίς την επαγωγή κυτταροτοξικότητας (Εικ. 1). Αυτές οι αντι-μελανογονικές δραστηριότητες του EKS βρέθηκε ότι μεσολαβούνται από την καθοδική ρύθμιση του mRNA που προκαλείται από -MSH και της πρωτεϊνικής έκφρασης της τυροσινάσης, TRP-1, TRP-2 και MITF (Εικ. 3). Οι αντιοξειδωτικές δράσεις μετρήθηκαν με προσδιορισμούς DPPH και ABTS. Το EKS έδειξε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση παρόμοια με το BHA, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (Εικ. 2). Οι δραστικές ενώσεις που υπάρχουν στο EKS απομονώθηκαν και επιβεβαιώθηκαν ως π-κουμαρικό οξύ και κερκετίνη. Παρόλο που έχουν αναφερθεί διάφορες βιολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων καρδιοπροστατευτικών [30], αντιφλεγμονωδών [31,32], αντι-μεταλλαξιογόνων [33] αντιοξειδωτικών [34,35] και αντι-μελανογόνων [36] δράσεων για το p-κουμαρικό οξύ και κερσετίνη από διάφορα φυτά, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αναφέρει ότι το π-κουμαρικό οξύ και η κερσετίνη από το EKS έχουν αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δράσεις.

Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήθηκαν οι αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δράσεις του EKS. Το EKS άσκησε αντι-μελανογόνες και αντιοξειδωτικές δραστηριότητες μέσω της ρύθμισης της δραστηριότητας της τυροσινάσης και της επαγόμενης από -MSH σύνθεσης μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος B16F10, χωρίς να προκαλεί κυτταροτοξικότητα. Οι κύριες δραστικές ενώσεις ήταν το π-κουμαρικό οξύ και η κερσετίνη. Έτσι, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι το EKS μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πιθανός αποχρωματιστικός και αντιοξειδωτικός παράγοντας.

Συγκρούσεις συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Χρηματοδότηση

Το έργο αυτό υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα Τεχνολογικής Ανάπτυξης (S2393982) που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο ΜΜΕ και νεοφυών επιχειρήσεων (MSS, Κορέα).

Έγγραφο διαφάνειας

Το έγγραφο Διαφάνεια που σχετίζεται με αυτό το άρθρο βρίσκεται στην ηλεκτρονική έκδοση.

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] P. Limtrakul, S. Yodkeeree, P. Thippraphan, W. Punfa, J. Srisomboon, Anti-aging and tyrosinase inhibition effect of Cassia fistula flower βουτανολικό εκχύλισμα, συμπλήρωμα BMC. Εναλλακτική. Med. 16 (2016) 497.

[2] A. Gragnani, S. Cornick, V. Chominski, S. Ribeiro de Noronha, S. Alves Corrêa de Noronha, L. Ferreira, Review of major theories of skin aging, Adv. Aging Res. 3 (2014) 265–284.

[3] TD Pedrosa, AO Barros, JR Nogueira, AC Fruet, IC Rodrigues, DQ Calcagno, MA Smith, TP de Souza, SB Barros, MC de Vasconcellos, et al., Αντιρυτιδική και αντιλευκαντική δράση του jucá ( Libidibia ferrea Mart.) εκχυλίσματα, Αρχ. Dermatol. Res. 308 (2016) 643–654.

[4] N. Delalle-Lozica, Τοπική θεραπεία ως βασική πρόληψη αντιγήρανσης, Acta Clin. Κροάτης. 49 (2010) 529–536.

[5] N. Maddodi, A. Jayanthy, V. Setaluri, Shining light on skin pigmentation: the darker and the bright side of effect of UV radiation, Photochem. Photobiol. 88 (2012) 1075–1082.

[6] Χ. Δεσινιώτη, Α. Τζ. Στρατηγός, Δ. Ρηγόπουλος, Α.Δ. Κατσαμπάς, Ανασκόπηση γενετικών διαταραχών υπομελάγχρωσης: διδάγματα από τη βιολογία των μελανοκυττάρων, Έκφρ. Dermatol. 18 (2009) 741–749.

[7] A. Nishina, A. Miura, M. Goto, K. Terakado, D. Sato, H. Kimura, Y. Hirai, H. Sato, N. Phay, Mansonone E από Mansonia gages ανέστειλαν τη μελανογένεση που προκαλείται από -MSH σε κύτταρα Β16 με αναστολή της έκφρασης CREB και της φωσφορυλίωσης στην οδό PI3K/Akt, Biol. Pharm. Ταύρος. 41 (2018) 770–776.

[8] VJ Hearing, TM Ekel, Mammalian tyrosinase. Σύγκριση υδροξυλίωσης τυροσίνης και σχηματισμού μελανίνης, Biochem. J. 57 (1976) 549-557.

[9] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Plants and natural products for the treatment of skin hyperpigmentation – a review, Planta Med. (2018), https://doi.org/10.1055/a0583-0410 [Epub πριν από την εκτύπωση].

[10] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Θεραπεία υπερμελάγχρωσης δέρματος με χρήση βοτάνων: ανασκόπηση κλινικών στοιχείων, J. Cosmet. Laser Ther. 20 (2018) 123–131.

[11] JJ Hsiao, DE Fisher, The roles of microphthalmia-associated transcription factor and pigmentation in melanoma, Arch. Biochem. Biophys. 563 (2014) 28–34.

[12] LA Garraway, HR Widlund, MA Rubin, G. Getz, AJ Berger, S. Ramaswamy, R. Beroukhim, DA Milner, SR Granter, J. Du, C. Lee, et al., Integrative genomic analys ταυτοποιούν το MITF ως ογκογονίδιο επιβίωσης γενεαλογίας που ενισχύεται σε κακοήθη μελάνωμα, Nature 436 (2005) 117-122.

[13] X. Zhang, P. Guo, G. Sun, S. Chen, M. Yang, N. Fu, H. Wu, X. Xu, Φαινολικές ενώσεις και φλαβονοειδή από τους καρπούς του Pandanus tectorius Soland, J. Med . Plants Res. 6 (2012) 2622–2626.

[14] H. Li, Q. Ma, Y. Liu, J. Qian, J. Zhou, Y. Zhou, Chemical συστατικά από Polygonum perfoliatum, Chin. J. Appl. Περιβάλλω. Biol. 15 (2009) 615–620.

[15] A. Yagi, T. Kanbara, N. Morinobu, Inhibition of mushroom-tyrosinase by aloe extract, Planta Med. 56 (1987) 515-517.

[16] MS Blois, Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature 181 (1958) 1199–1200.

[17] U. Ozgen, A. Mavi, Z. Terzi, A. Yιldιrιm, M. Coşkun, PJ Houghton, Antioxidant properties of some medicinal Lamiaceae species, Pharm. Biol. 44 (2006) 107–112.

[18] NJ Miller, C. Rice-Evans, MJ Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Μια νέα μέθοδος για τη μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας και η εφαρμογή της στην παρακολούθηση της αντιοξειδωτικής κατάστασης σε πρόωρα νεογνά, Clin. Sci. 84 (1993) 407-412.

[19] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutière, M. Woillez, JM Mérillon, Συγκριτική μελέτη των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων και του συνολικού φαινολικού περιεχομένου 30 φυτικών εκχυλισμάτων βιομηχανικού ενδιαφέροντος χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς DPPH, ABTS, FRAP, SOD και ORAC , J. Agric. Food Chem. 57 (2009) 1768–1774.

[20] M. Otreba, J. Rok, E. Buszman, D. Wrzesniok, Regulation of melanogenesis: the role of cAMP and MITF, Postepy Hig. Med. Dosw. 66 (2012) 33–40.

[21] JS Han, JH Sung, SK Lee, Αντιμελανογένεση δραστικότητα υδρολυμένου εκχυλίσματος ginseng (GINST) μέσω αναστολής της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεΐνης κινάσης JNK σε κύτταρα B16F10, J. Food Sci. 81 (2016) H2085–H2092.

[22] M. Chatatikun, A. Chiabchalard, Ταϊλανδικά φυτά με υψηλά επίπεδα αντιοξειδωτικών, δράση δέσμευσης ελεύθερων ριζών, δράση αντι-τυροσινάσης και αντικολλαγενάσης, συμπλήρωμα BMC. Εναλλακτική. Med. 17 (2017) 487.

[23] C. Couteau, LJ Coiffard, Photostability determination of arbutin, a plant whitening agent, Farmaco 55 (2000) 410–413.

[24] Y. Higashi, Y. Fujii, Προσδιορισμός του kojic acid σε ένα καλλυντικό για λεύκανση δέρματος με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με ανίχνευση υπεριώδους μετά από παραγωγοποίηση πριν από τη στήλη με 4-fluoro-7-nitro{ {6}},1,3-βενζοξαζόλη, J. Cosmet. Sci. 63 (2017) 205–212.

[25] JY Tao, L. Zhao, ZJ Huang, XY Zhang, SL Zhang, QG Zhang, Zhang BH FeiXiao, QL Feng, GH Zheng, Αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα του εκχυλίσματος αιθανόλης από Kummerowia striata (Thunb.) Schindl σε LPS- διεγερμένα κύτταρα RAW264.7, Inflammation 31 (2008) 154–166.

[26] J.-H. Lee, J.-S. Park, Αντιοξειδωτικές δραστηριότητες κλασμάτων που εκχυλίζονται με διαλύτη από Kummerowia striata (Thunb.) Schindl, Indian J. Sci. Τεχνολ. 8 (2015) 28–31.

[27] S. Kippenberger, S. Loitsch, F. Solano, A. Bernd, R. Kaufmann, Quantification of tyrosinase, TRP-1 and Trp-2 transcripts in human melanocytes by reverse transcriptase-competitive multiplex PCR– ρύθμιση από στεροειδείς ορμόνες, J. Invest.Dermatol. 110 (1998) 364–367.

[28] YD Park, SY Kim, YJ Lyou, DY Lee, JM Yang, TXM13 ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος: μια νέα πηγή για την κινητική αναστολής της ανθρώπινης τυροσινάσης και για τον έλεγχο των λευκαντικών παραγόντων, Biochem. Cell ΒίοΙ. 84 (2006) 112–116.

[29] A. Tuerxuntayi, YQ Liu, A. Tulake, M. Kabas, A. Eblimit, HA Aisa, εκχύλισμα Kaliziri ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση τυροσινάσης, TRP{-1, TRP-2 και MITF στο μελάνωμα B16 ποντικού κύτταρα, συμπλήρωμα BMC. Εναλλακτική. Med. 14 (2014) 166.

[30] N. Prasanna, DN Krishnan, M. Rasool, Καρδιοτοξικότητα που προκαλείται από αρσενίτη νατρίου σε αρουραίους: προστατευτικός ρόλος του p-κουμαρικού οξέος, μιας κοινής διατροφικής πολυφαινόλης, Toxicol. Μηχ. Methods 23 (2013) 255–262.

[31] SJ Pragasam, V. Venkatesan, M. Rasool, Ανοσοτροποποιητική και αντιφλεγμονώδης επίδραση του p-κουμαρικού οξέος, μια κοινή διατροφική πολυφαινόλη σε πειραματική φλεγμονή σε αρουραίους, Inflammation 36 (2013) 169–176.

[32] M. Lee, M. Son, E. Ryu, Kim JG Yu SS, BW Kang, GH Sung, H. Cho, H. Kang, Quercetin-induced apoptosis prevents EBV μόλυνση, Oncotarget 6 (2015) 12603–12624 .

[33] LR Ferguson, IF Lim, AE Pearson, J. Ralph, PJ Harris, Bacterial anti mutagenesis by hydroxycinnamic acids from plant cell walls, Mutat. Res. 542 (2003) 49–58.

[34] C. Castelluccio, G. Paganga, N. Melikian, GP Bolwell, J. Pridham, J. Sampson, C. Rice-Evans, Antioxidant potencial of intermediates in phenylpropanoid metabolism in ανώτερα φυτά, FEBS Lett. 368 (1995) 188–192.

[35] IM Erden, A. Kahraman, Η προστατευτική επίδραση της φλαβονόλης κερσετίνης έναντι του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από το υπεριώδες σε αρουραίους, Toxicology 154 (2000) 21-29.

[36] SM An, Koh JS και Boo YC: το π-κουμαρικό οξύ όχι μόνο αναστέλλει τη δραστηριότητα της ανθρώπινης τυροσινάσης in vitro αλλά και τη μελανογένεση σε κύτταρα που εκτίθενται σε UVB, Phytother. Res. 24 (2010) 1175–1180.

For more information:1950477648nn@gmail.com