Η εναπόθεση αμυλοειδούς P στον ορό είναι ένα ευαίσθητο και ειδικό χαρακτηριστικό της μεμβρανικής σπειραματοπάθειας με καλυμμένες εναποθέσεις IgG Kappa

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 και John M. Arthur2

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:σπειραματονεφρίτιδα; καλυμμένες καταθέσεις? φασματομετρία μάζας; μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια. υποεπιθηλιακές εναποθέσεις

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει τη λειτουργία των νεφρών

Η μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG (MGMID) είναι ένα πρόσφατα περιγραφόμενο μοτίβο σπειραματονεφρίτιδας με μοναδική ιστοπαθολογία. Το μοτίβο χαρακτηρίζεται από υποεπιθηλιακό και/ή μεσαγγειακόαπρόσβλητοςεναποθέσεις που «καλύπτονται», σε χρώση ανοσοσφαιρίνης με συνήθη ανοσοφθορισμό, αλλά έντονα χρωματίζονται για ελαφρά αλυσίδα IgG και κάπα μετά την πέψη με πρωτεάση. Οι ασθενείς με αυτό το πρότυπο σπειραματονεφρίτιδας είναι συνήθως νεαρές γυναίκες που παρουσιάζουν πρωτεϊνουρία και ασαφές ιστορικό αυτοάνοσης νόσου όπως χαμηλού τίτλου αντιπυρηνικά αντισώματα. Εδώ συγκρίναμε το προφίλ φασματομετρίας μάζας των μικροτεμαχισμένων σπειραμάτων σύλληψης με λέιζερ από εννέα βιοψίες νεφρού MGMID με οκτώ βιοψίες που δείχνουν άλλα μοτίβα μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας. Η πρωτεΐνη που αυξήθηκε πιο σημαντικά στο MGMID ήταν το αμυλοειδές P ορού. Η ανοσοχρώση έδειξε το αμυλοειδές P ορού εντοπισμένο με IgG στα σπειράματα του MGMID αλλά όχι με τη μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια που σχετίζεται με το PLA2R. Το αμυλοειδές Ρ του ορού ήταν θετικό στα σπειράματα και των 32 βιοψιών MGMID αλλά αρνητικό σε βιοψίες άλλων τύπων μεμβρανωδών σπειραματοπαθειών όπως αυτές που σχετίζονται με το PLA2R και το THSD7A. Υπήρχαν τέσσερις βιοψίες με χρώση σπειραματικού ορού αμυλοειδούς P μεταξύ των 173 βιοψιών που δεν πληρούσαν τα κριτήρια για MGMID ή αμυλοείδωση. Και οι τέσσερις από αυτές τις βιοψίες με θετική χρώση αμυλοειδούς P ορού είχαν ένα μεμβρανώδες μοτίβο σπειραματοπάθειας με εναποθέσεις κάππα IgG που διέφεραν από το MGMID μόνο λόγω της έλλειψης "κάλυψης". Έτσι, η θετική χρώση εντός των σπειραματικών αποθέσεων για αμυλοειδές ορού Προσδιορίζει μια μοναδική μορφή σπειραματονεφρίτιδας που πιθανόν να έχει κοινό παθοφυσιολογικό μηχανισμό νόσου.

Η μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις IgG κάππα (MGMID) είναι ένα ιστοπαθολογικό μοτίβο σπειραματονεφρίτιδας που περιγράφηκε το 2014, το οποίο ήταν η πρώτη περιγραφή αυτού που ονομάστηκε καλυμμένες σπειραματικές εναποθέσεις.1 Η χαρακτηριστική ιστοπαθολογία αυτής της νόσου περιλαμβάνει την παρουσία μεσαγγειακού και υποεπιθηλίου καταθέσεις με περιορισμό IgG κάπα. Περιέργως, αν και η χρώση του συστατικού 3 (C3) του συμπληρώματος είναι συχνά εμφανής με τον συνήθη ανοσοφθορισμό σε κατεψυγμένο ιστό, η χρώση Ig συχνά καλύπτει, που σημαίνει ότι δείχνει ψευδώς αρνητική χρώση με συνήθη ανοσοφθορισμό αλλά θετική χρώση όταν επαναλαμβάνεται σε ιστό ενσωματωμένο σε παραφίνη μετά από πέψη πρωτεάσης. Έτσι, εκτός εάν ο παθολόγος διατηρεί υψηλό δείκτη υποψίας για αυτή την οντότητα, θα μπορούσε να διαγνωστεί λανθασμένα ως σπειραματοπάθεια C3. Άλλες οντότητες που έχουν περιγραφεί ότι δείχνουν αυτό το φαινόμενο κάλυψης σε σπειραματονεφρίτιδα περιλαμβάνουν μεμβρανοπολλαπλασιαστική σπειραματονεφρίτιδα με καλυμμένες μονοτυπικές εναποθέσεις Ig και κρυοσφαιριναιμική σπειραματονεφρίτιδα.2,3

Οι ασθενείς που διαπιστώθηκε ότι έχουν MGMID στη βιοψία είναι συνήθως νεαρές γυναίκες<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 τοις εκατό) ήταν αρνητικά για μονοκλωνικά Igs με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού και δεν έχουν παρατηρηθεί περιπτώσεις που να συσχετίζονται με υποκείμενη αιματολογική κακοήθεια.4

Υποτέθηκε ότι τα κοινά κλινικοπαθολογικά ευρήματα μεταξύ των ασθενών με MGMID μπορεί να είναι ενδεικτικά ενός κοινού μοριακού παθοφυσιολογικού μηχανισμού που οδηγεί τη νόσο τους. Η πρόθεσή μας στην πρώτη αναφορά αυτής της οντότητας ήταν να ορίσουμε μια κοόρτη για περαιτέρω ανάλυση.1 Περιγράφουμε εδώ την παρουσία του συστατικού p αμυλοειδούς ορού πρωτεΐνης (SAP) που βρίσκεται μοναδικά στις εναποθέσεις των σπειραμάτων MGMID. Η ανοσοχρώση για SAP σε σπειραματικές εναποθέσεις είναι μια ευαίσθητη και ειδική τεχνική για τη διάγνωση του MGMID που παρέχει επίσης παθογόνο εικόνα.

Εικόνα 1|Το αμυλοειδές P-συστατικό ορού (SAP) είναι σημαντικά εμπλουτισμένο σε μικροτεμαχισμένα σπειράματα από ασθενείς με μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG. Για στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν κανονικοποιημένες απόλυτες τιμές ποσοτικοποίησης με βάση την ένταση από τη MaxQuant (Ινστιτούτο Βιοχημείας Max Planck, Planegg, Γερμανία). Οι διακεκομμένες γραμμές απεικονίζουν ευρετικές αποκοπές για αλλαγή πτυχής και τιμή P. (α) Μια γραφική παράσταση ηφαιστείου που συγκρίνει 3 μεμβρανώδεις περιπτώσεις θετικού για υποδοχέα φωσφολιπάσης Α2 (PLA2R) με άλλες προσδιορίζει 2 πρωτεΐνες που είναι σαφείς ακραίες θέσεις στο επάνω δεξιό τεταρτημόριο. (β) Ηφαιστειακή γραφική παράσταση που συγκρίνει 2 θετικές μεμβρανώδεις περιπτώσεις 7A (THSD7A) που περιέχουν θρομβοσπονδίνη τύπου 1 με άλλες προσδιορίζει 2 πρωτεΐνες που είναι σαφείς ακραίες τιμές με την THSD7A να δείχνει τη μεγαλύτερη αλλαγή πτυχής. (γ) Μια γραφική παράσταση ηφαιστείου που συγκρίνει δείγματα μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG με όλους τους άλλους τύπους μεμβρανωδών περιπτώσεων προσδιορίζει 6 πρωτεΐνες που είναι σαφείς ακραίες τιμές στο επάνω δεξιό τεταρτημόριο. C6, συστατικό συμπλήρωμα 6; C7, συστατικό συμπλήρωμα 7; CFHR1, πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με τον παράγοντα Η συμπλήρωμα; HP1BP3, πρωτεΐνη 1 που δεσμεύει την ετεροχρωματίνη 3; HPRT1, υποξανθινο φωσφοριβοσυλτρανσφεράση 1; IGHG3, Ig βαρύ σταθερό γάμμα 3.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Φασματομετρία μάζας μικροτεμαχισμένων σπειραμάτων σύλληψης με λέιζερ

Ανάλυση φασματομετρίας μάζας μικροτεμαχισμένων σπειραμάτων σύλληψης με λέιζερ από 9 περιπτώσεις MGMID συγκρίθηκε με 8 περιπτώσεις μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας (MG) συμπεριλαμβανομένων 3 περιπτώσεων θετικού MG υποδοχέα φωσφολιπάσης (PLA2R), 2 περιπτώσεων θρομβοσπονδίνης τύπου 17-Α THSD7A) – θετικό MG και 3 περιπτώσεις MG λύκου. Συνολικά 1695 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε αυτή την ανάλυση. Διεξήχθη μια ανάλυση απόδειξης της αρχής προκειμένου να ελεγχθεί εάν οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην παθογένεση της νόσου του MG θα μπορούσαν να ανιχνευθούν με φασματομετρία μάζας. Για κάθε γνωστό μεμβρανώδη τύπο, η διαφορική αφθονία πρωτεΐνης συγκρίθηκε με τις υπόλοιπες ομάδες χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες τιμές απόλυτης ποσοτικοποίησης με βάση την ένταση (iBAQ). Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το τεστ Welch's t και τα αποτελέσματα εμφανίστηκαν σε ένα οικόπεδο ηφαιστείου. Το PLA2R ήταν σημαντικά πιο άφθονο σε περιπτώσεις MG που σχετίζεται με PLA2R και έδειξε την ισχυρότερη αλλαγή πτυχής (Εικόνα 1α). Το THSD7A εμφάνισε τις ισχυρότερες αναδιπλούμενες αλλαγές στο MG που σχετίζεται με το THSD7A, αν και με μεγαλύτερη τιμή P λόγω του μικρού μεγέθους δείγματος σε αυτήν την ομάδα (n ¼ 2, Εικόνα 1β). Συνολικά, αυτή η ανάλυση απόδειξης της αρχής έδειξε ότι η φασματομετρία μάζας μικροτεμαχισμένων σπειραμάτων σύλληψης με λέιζερ μπορεί να αναγνωρίσει πρωτεΐνες σημαντικές για την παθογένεση της νόσου στη μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια.

Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να εντοπίσουμε πρωτεΐνες που πιθανώς εμπλέκονται στην παθογένεση του MGMID χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση. Συνολικά 6 πρωτεΐνες ήταν σημαντικά πιο άφθονες στα δείγματα MGMID σε σχέση με τις άλλες ομάδες (Πίνακας 1). Η πρωτεΐνη με την υψηλότερη αλλαγή πτυχής ήταν η SAP (Εικόνα 1γ). Οι υπόλοιπες πρωτεΐνες αποτελούνταν από IgG Kappa, 3 πρωτεΐνες συμπληρώματος και την πρωτεΐνη 1 που δεσμεύει την ετεροχρωματίνη 3 (HP1BP3). Το SAP θεωρήθηκε ο κορυφαίος υποψήφιος καθώς ανιχνεύτηκε σε όλα τα δείγματα MGMID και έδειξε τη μεγαλύτερη διαφορά σε αφθονία σε σχέση με τα δείγματα που δεν ήταν MGMID. Όλα τα Ig που ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας σε μικροτεμαχισμένα σπειράματα σύλληψης με λέιζερ από περιπτώσεις μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας με εναποθέσεις κάππα IgG φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Οι φασματικές μετρήσεις με δειγματοληψία όλων των πρωτεϊνών που έδειξαν $1 log2 αυξημένη αφθονία σε δείγματα MGMID και τιμή P #0.1 φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2.

Cistancheμπορεί να βελτιωθείνεφρόλειτουργία

Χρώση SAP σε περιπτώσεις μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας

Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά της πρωτεΐνης SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) έδειξε ισχυρή θετική χρώση κατά μήκος των σπειραματικών βασικών μεμβρανών των περιπτώσεων με MGMID που εντοπίστηκε με IgG με συνεστιακή ανάλυση. Το SAP δεν έδειξε εντοπισμό με IgG στα σπειράματα από MG που σχετίζεται με PLA2R (Εικόνα 2). Ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά του HP1BP3 δοκιμάστηκε σε 4 βιοψίες με MGMID και έδειξε αρνητική χρώση στις σπειραματικές εναποθέσεις και των 4 περιπτώσεων.

Πραγματοποιήθηκε χρώση SAP σε συνολικά 211νεφρόβιοψίεςμε σπειραματονεφρίτιδα (Πίνακας 2). Συνολικά 36 περιπτώσεις με εναποθέσεις ανοσοποιητικού τύπου βάφτηκαν θετικά για SAP. Όλες οι περιπτώσεις που βάφτηκαν θετικά είχαν κοινά ορισμένα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της παρουσίας μεσαγγειακών και υποεπιθηλιακών εναποθέσεων με περιορισμό IgG κάππα και χωρίς ενδοτριχοειδείς ή μεμβρανοπολλαπλασιαστικές αλλαγές με μικροσκοπία φωτός. Το SAP ήταν αρνητικό σε όλες τις περιπτώσεις, με καλυμμένες εναποθέσεις που δεν ήταν MGMID, συμπεριλαμβανομένων 3 περιπτώσεων κρυοσφαιριναιμικής σπειραματονεφρίτιδας και 3 περιπτώσεων καλυμμένης μεμβρανοπολλαπλασιαστικής σπειραματονεφρίτιδας. Ήταν επίσης αρνητικό και στις 19 περιπτώσεις πολλαπλασιαστικής σπειραματονεφρίτιδας με μονοκλωνικές εναποθέσεις Ig (PGNMID), συμπεριλαμβανομένων περιπτώσεων με IgG1 κάπα (4 περιπτώσεις), IgG2 λάμδα (1 περίπτωση), IgG 3 κάπα (8 περιπτώσεις) και IgG3 λάμδα (6 περιπτώσεις). ). Και οι 30 περιπτώσεις πολυκλωνικής μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας (PLA2R, THSD7A, λύκος και τμηματική) ήταν αρνητικές για SAP. Επιπρόσθετες μορφές σπειραματονεφρίτιδας μελετήθηκαν επίσης και ήταν αρνητικές. Μεταξύ των σχετιζόμενων με τη μόλυνση σπειραματονεφρίτιδας, υπήρξαν 7 θετικές για χρώση IgG και 6 που είχαν ενδείξεις υποεπιθηλιακών εναποθέσεων εξογκώματος. Όπως ήταν αναμενόμενο, και οι 6 περιπτώσεις αμυλοείδωσης έδειξαν θετική χρώση στις εναποθέσεις αμυλοειδούς. Ωστόσο, το μουτζουρωμένο σχέδιο εναπόθεσης ήταν σε πλήρη αντίθεση με την κοκκώδη χρώση που υπήρχε σε περιπτώσεις MGMID. Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες σπειραμάτων σε χρώση SAP από μια ποικιλία διαφορετικών νεφρικών παθήσεων φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1.

Και οι 32 περιπτώσεις που είχαν προηγουμένως αναγνωριστεί ως MGMID ήταν θετικές για SAP. Επιπρόσθετα, υπήρξε θετική χρώση για SAP στα σπειράματα από 4 από τις 25 περιπτώσεις μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας με μονοτυπική εναπόθεση IgG που δεν συγκαλύφθηκε κατά ρουτίνα

ανοσοφθορισμού, συμπεριλαμβανομένων 4 από τις 13 περιπτώσεις με IgG1 κάπα, 0 από 2 περιπτώσεις με IgG1 λάμδα, 0 από 5 περιπτώσεις με IgG2 κάππα, 0 από 4 περιπτώσεις με IgG3 κάππα και {{ 12}} από 1 περίπτωση με IgG4 κάπα. Συνολικά, 32 από τις 36 (89 τοις εκατό) των θετικών σε SAP σπειραματοπάθειες καλύφθηκαν και εντάχθηκαν στην κατηγορία MGMID, ενώ οι άλλες 4 από τις 36 (11 τοις εκατό ) αποκαλύφθηκαν και διαγνώστηκαν ως MG με εναποθέσεις κάππα IgG1. Οι ασθενείς με μονοτυπική μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια που δεν κάλυπταν αλλά ήταν θετικοί για SAP είχαν μέση ηλικία 33 ετών, με αναλογία γυναικών προς άνδρες 4:0. Οι περιπτώσεις με μονοτυπική μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια που δεν κάλυπταν αλλά ήταν αρνητικές για SAP είχαν μέση ηλικία 59,3 έτη με αναλογία γυναικών προς άνδρες 15:4.

Πίνακας 1|Οι πρωτεΐνες αυξήθηκαν σημαντικά στα σπειράματα ασθενών μεμεμβρανώδη σπειραματοπάθειαμε καλυμμένες εναποθέσεις κάπα IgG, όπως φαίνεται από τη φασματομετρία μάζας

Αντιδραστικότητα ορού στο SAP

Οροί από 22 ασθενείς με MGMID, 12 με θετική στο PLA2R μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια και 6 φυσιολογικούς ελέγχους δοκιμάστηκαν για αντιδραστικότητα IgG στο SAP με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA). Αν και υπήρχε κάποια μεταβλητότητα μεταξύ των ασθενών σε κάθε ομάδα, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην αντιδραστικότητα IgG προς το SAP μεταξύ των ομάδων (Συμπληρωματικό Σχήμα S2).

Εικόνα 2|Εντοπισμός του IgG και του αμυλοειδούς P-συστατικού ορού (SAP). (α–γ) Πειράματα ανοσοφθορισμού που πραγματοποιήθηκαν σε δείγμα νεφρικής βιοψίας από ασθενή που διαγνώστηκε με μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG δείχνουν κοκκώδη σπειραματική βασική μεμβράνη για (α) SAP και (β) IgG. (γ) Υπάρχει ισχυρός εντοπισμός του SAP και του IgG στις εναποθέσεις της σπειραματικής βασικής μεμβράνης. (δ-στ) Πειράματα ανοσοφθορισμού που πραγματοποιήθηκαν σε δείγμα νεφρικής βιοψίας από ασθενή με μεμβρανώδη σπειραματοπάθειες θετικού για υποδοχέα 3 φωσφολιπασών Α2 δείχνουν (δ) αρνητική χρώση σπειραματικής βασικής μεμβράνης για SAP και (ε) θετική κοκκώδη σπειραματική βασική μεμβράνη χρώση G για I. (στ) Υπάρχει έλλειψη εντοπισμού σε αυτόν τον ασθενή με μεμβρανώδεις σπειραματοπάθειες που σχετίζονται με 3 φωσφολιπάσες Α2 υποδοχέα. Για να βελτιστοποιήσετε την προβολή αυτής της εικόνας, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου στον Πίνακα 2|Αποτελέσματα χρώσης του συστατικού p αμυλοειδούς ορού (SAP) σε βιοψίες νεφρών

ΑΑ, αμυλοειδές Α; AL, ελαφριά αλυσίδα αμυλοειδούς. C3, συστατικό συμπλήρωμα 3; GBM, σπειραματική βασική μεμβράνη. MG, μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια; MGMID, μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG. MPGN, μεμβρανοπολλαπλασιαστικό; σπειραματονεφρίτιδα; PGMNID, πολλαπλασιαστική σπειραματονεφρίτιδα με μονοκλωνικές εναποθέσεις κάππα IgG. PLA2R, υποδοχέας φωσφολιπάσης Α2; THSD7A, θρομβοσπονδίνη τύπου 1 που περιέχει 7Α.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Το MGMID είναι ένα πρόσφατα περιγραφόμενο και μοναδικό μοτίβο σπειραματοπάθειας που χαρακτηρίζεται από υποεπιθηλιακές και μεσαγγειακές εναποθέσεις που χρωματίζουν για IgG κάπα με παραφίνη IF (Εικόνα 3). Οι ασθενείς με αυτό το πρότυπο σπειραματοπάθειας τείνουν να είναι νεαρές γυναίκες (ηλικία<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

Το SAP είναι μια 25-kDa πενταμερής πρωτεΐνη εντός της οικογένειας των πεντραξινών που κωδικοποιείται από το γονίδιο APCS και είναι άφθονο στον ορό και ως συστατικό της σπειραματικής βασικής μεμβράνης.5 Αν και η ακριβής λειτουργία του SAP είναι ασαφής, είναι γνωστή να αλληλεπιδρά στο πλάσμα με μια μεγάλη ποικιλία πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των συστατικών του συμπληρώματος, των απολιποπρωτεϊνών και των ρυθμιστών της πήξης και της πρωτεόλυσης.6 Σχηματίζει σταθερές αλληλεπιδράσεις που εξαρτώνται από το ασβέστιο με τους συνδέτες του, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, των λιποπρωτεϊνών και του DNA, προστατεύοντάς τους από την αποικοδόμηση. Το SAP χρησιμεύει ως διαλυτό μόριο αναγνώρισης προτύπων που εμπλέκεται στην έμφυτη ανοσολογική απόκριση, αναγνωρίζοντας μια ποικιλία μοριακών προτύπων που σχετίζονται με παθογόνο και βλάβη, συμπεριλαμβανομένων μικροβιακών συστατικών και αποπτωτικών κυτταρικών υπολειμμάτων.7 Η αλληλεπίδραση του SAP με μοριακό παθογόνο ή βλάβη Τα μοτίβα προάγουν την εκκαθάριση των αποπτωτικών κυτταρικών υπολειμμάτων με τη μεσολάβηση του συμπληρώματος μέσω άμεσης δέσμευσης στο συστατικό συμπληρώματος 1q (C1q) και ενεργοποίησης της κλασικής οδού συμπληρώματος. Παρά την ενεργοποίηση του συμπληρώματος, το SAP είναι γνωστό ότι προσδίδει ανοσορύθμιση, μειώνοντας τα ουδετερόφιλαφλεγμονήεντός των ιστών μέσω μειωμένης ενδοθηλιακής προσκόλλησης,8 μειωμένης λειτουργίας ελαστάσης,9 και μειωμένης επιστροφής στους ιστούς.10 Το SAP είναι επίσης γνωστό ότι είναι η κύρια πρωτεΐνη δέσμευσης για το DNA και τη χρωματίνη στο πλάσμα.11

Σε ασθένειες, το SAP είναι περισσότερο γνωστό ότι αποτελεί μέρος των εναποθέσεων της αμυλοείδωσης. Αν και λιγότερο καλά μελετημένο, υπάρχουν επίσης στοιχεία ότι θα μπορούσε να παίξει ρόλο σε μοντέλα αυτοάνοσων νοσημάτων σε ανθρώπους και ζώα. Τα αντισώματα SAP έχουν ταυτοποιηθεί σε ασθενείς μεαυτοάνοσοασθένειες, και η μειωμένη έκφραση SAP έχει αποδειχθεί ότι προάγειαυτοανοσίασε μοντέλα ποντικών. Αντισώματα κατά του SAP αναγνωρίζονται στο 44 τοις εκατό των ασθενών με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, με τίτλους αντισωμάτων να συσχετίζονται με τη δραστηριότητα της νόσου.12 Η ανεπάρκεια SAP βρέθηκε να οδηγεί στην ανάπτυξη αυθόρμητης αυτοανοσίας σε επιρρεπή σε αυτοάνοση ποντίκια C57BL/6 και σε μη αυτοάνοσα επιρρεπή ποντίκια 129/Sv όταν διασταυρωθούν με ποντίκια C57BL/ 6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13 αλλά όχι μόνο στο στέλεχος 129/Sv, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να απαιτείται υποκείμενη γενετική ευαισθησία για την ανεπάρκεια SAP για την πρόκληση αυτοανοσίας.14 ποντίκια παρουσιάζουν παραγωγή αντιπυρηνικών αντισωμάτων, αντι-μονόκλωνου DNA, αντισωμάτων δίκλωνου DNA και ρευματοειδών παραγόντων. Αναπτύσσουν πολλαπλασιαστικόαπρόσβλητοςΣπειραματονεφρίτιδα που προκαλείται από σύμπλοκο, πιο συχνά σε γυναίκες.13 Σε ένα μοντέλο νεφρίτιδας ποντικού, όπου η σπειραματονεφρίτιδα προκαλείται με έγχυση ενεργοποιημένου αυτο-DNA στον ορό, η γονιδιακή θεραπεία SAP από έναν πλασμιδιακό φορέα μείωσε την παραγωγή αντισωμάτων αντι-δικλωνικού DNA , εναπόθεση ανοσολογικού συμπλέγματος και νεφρική φλεγμονή και απέτρεψε την εμφάνιση νεφρίτιδας λύκου.15

Εικόνα 3|Ευρήματα νεφρικής βιοψίας σε μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG. Οι μικροφωτογραφίες από τη βιοψία που φαίνεται στο Σχήμα 2 φαίνονται εδώ. (α) Υπάρχουν τμηματικές αιχμές κατά μήκος των σπειραματικών βασικών μεμβρανών, με χρώση αργύρου με μεθεναμίνη Jones (αρχική μεγέθυνση×400). (β) Η ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκαλύπτει υποεπιθηλιακές εναποθέσεις που υπάρχουν κατά μήκος της σπειραματικής βασικής μεμβράνης (αρχική μεγέθυνση×12,000). (γ) Αρνητική χρώση σπειραμάτων για IgG με ανοσοφθορισμό ρουτίνας σε φρέσκο ​​ιστό (άμεσος ανοσοφθορισμός· αρχική μεγέθυνση×400). (δ) Σπειράματα από το ίδιο περιστατικό χρωματίζονται θετικά σε ιστό ενσωματωμένο σε παραφίνη μετά από πέψη με πρωτεάση (άμεσος ανοσοφθορισμός, αρχική μεγέθυνση×400). (ε) Τα σπειράματα παρουσιάζουν χρώση για κάπα και (στ) όχι λάμδα στον ενσωματωμένο σε παραφίνη ιστό που έχει υποστεί πέψη με πρωτεάση (άμεσος ανοσοφθορισμός· αρχική μεγέθυνση×400). Για να βελτιστοποιήσετε την προβολή αυτής της εικόνας, ανατρέξτε στην ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου στη διεύθυνση www.νεφρό-international.org.

Παρά τον περιορισμό της ελαφριάς αλυσίδας που παρατηρείται στη βιοψία, προς το παρόν δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτή η οντότητα σχετίζεται με υποκείμενες λεμφοπολλαπλασιαστικές διαταραχές ή κυκλοφορούν μονοκλωνικά Igs. χρόνος. Ο ρόλος των αυτοαντισωμάτων SAP είναι επίσης αβέβαιος. Σε αντίθεση με άλλες μορφές μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας με πρωτεΐνη που υπάρχει ειδικά στις εναποθέσεις του ανοσοποιητικού, όπως η νόσος που σχετίζεται με PLA2R, το 16 MGMID δεν φαίνεται να οφείλεται σε αυτοαντισώματα που στρέφονται κατά του SAP, καθώς δεν καταφέραμε να ανιχνεύσουμε αντιδραστικότητα αντισωμάτων ορού έναντι του SAP σε ασθενείς με MGMID . Μια εναλλακτική εξήγηση είναι ότι η IgG κάπα είναι παρούσα ως αποτέλεσμα της φυσιολογικής αλληλεπίδρασης μεταξύ αυτών των 2 πρωτεϊνών και όχι μιας αυτοάνοσης αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος, καθώς η αλυσίδα Ig κάπα είναι γνωστό ότι αποτελεί μέρος της φυσιολογικής αλληλεπίδρασης του SAP ορού. αν και χρήσιμο για τη διάγνωση ιστών αυτής της οντότητας, η εξέταση για αντισώματα SAP στον ορό δεν χρησιμεύει ως μη επεμβατική διάγνωση αυτή τη στιγμή και ο υποκείμενος οδηγός αυτής της ασθένειας παραμένει μυστήριο.

Τα κλινικά αποτελέσματα στο MGMID είναι εξαιρετικά ποικίλα, που κυμαίνονται από την αυθόρμητη ύφεση έως την εξέλιξη στο τελικό στάδιονεφρόνόσοςμε υποτροπή στη μεταμόσχευση. Η αναδρομική ανάλυση απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε συσχέτιση μεταξύ της θεραπείας που χρησιμοποιήθηκε και της κλινικής έκβασης.4 Η ανακάλυψη της συμμετοχής του SAP σε αυτή τη νόσο έχει πιθανώς επιπτώσεις στη θεραπεία. Οι θεραπείες που στοχεύουν άμεσα το SAP έχουν δείξει πρώιμη υπόσχεση στη θεραπεία της αμυλοείδωσης.17,18 Επιπλέον, τα αποτελέσματα της φασματομετρίας μάζας δείχνουν ότι οι θεραπείες που στοχεύουν τον καταρράκτη του συμπληρώματος μπορεί να είναι χρήσιμες στη θεραπεία αυτής της μορφής σπειραματονεφρίτιδας, δεδομένου ότι οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες που ήταν αυξημένες στα σπειράματα MGMID σχετίζονται με το συμπλήρωμα. Απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για τον εντοπισμό βιοδεικτών δραστηριότητας για αυτήν την ασθένεια, καθώς και θεραπείες.

Ο λόγος για την κάλυψη των εναποθέσεων του ανοσοποιητικού στις βιοψίες MGMID σε συνήθη ανοσοφθορισμό παραμένει μυστήριο. Η παρουσία του SAP στα κοιτάσματα δημιουργεί νέες πιθανές εξηγήσεις για το φαινόμενο αυτό σε περιπτώσεις MGMID. Για παράδειγμα, οι αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης SAP είναι γνωστό ότι εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από το Ca2þ6 και πολλά από τα μέσα μεταφοράς και τα ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην επεξεργασία του ιστού νεφρικής βιοψίας για ανοσοφθορισμό στερούνται Ca2þ. Αυτή η in vitro απουσία Ca2þ θα μπορούσε να οδηγήσει σε διακοπή των εναποθέσεων του ανοσοποιητικού, έτσι ώστε να μην είναι πλέον διαθέσιμες για ανίχνευση με ανοσοφθορισμό στον παγωμένο ιστό. Οι εναποθέσεις ανοσοσυμπλεγμάτων θα παραμείνουν διαθέσιμες για ανίχνευση στον σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ιστό, ωστόσο, ως αποτέλεσμα των επαγόμενων από φορμαλίνη ομοιοπολικών χημικών δεσμών μεταξύ των πρωτεϊνών στον ιστό.

Περιγράφουμε εδώ, για πρώτη φορά, τη μοναδική παρουσία του SAP στις σπειραματικές αποθέσεις του MGMID. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η χρώση τουνεφρόβιοψίεςγια το SAP εντοπίζει περιπτώσεις με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα του MGMID, χωρίς κάλυψη, με ανοσοφθορισμό ρουτίνας. Δεδομένων αυτών των αποτελεσμάτων, πιστεύουμε ότι η θετική χρώση εντός των σπειραματικών αποθέσεων για το SAP προσδιορίζει μια μοναδική μορφή σπειραματονεφρίτιδας που μοιράζεται έναν κοινό παθοφυσιολογικό μηχανισμό της νόσου. Μέχρι την πρόσφατη περιγραφή του MGMID, αυτές οι περιπτώσεις διαγνώστηκαν σε πολλές διαφορετικές κατηγορίες που κυμαίνονταν από σπειραματονεφρίτιδα C3 έως σπειραματονεφρίτιδα που σχετίζεται με λοίμωξη έως άτυπη μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια. φασματομετρία για την παροχή παθοφυσιολογικής εικόνας για τη σπειραματονεφρίτιδα που προκαλείται από το ανοσοποιητικό.

ΜΕΘΟΔΟΙ

Τεχνικές επεξεργασίας βιοψίας νεφρού

Χρησιμοποιήθηκαν τυπικές τεχνικές επεξεργασίας νεφρικής βιοψίας, συμπεριλαμβανομένης της μικροσκοπίας φωτός, ανοσοφθορισμού και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας.19,20 Όλα τα δείγματα μικροσκοπίας φωτός χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, άργυρο μεθεναμίνης Jones, τρίχρωμο Masson και αντιδραστήριο περιοδικού οξέος-Schiff. Όλες οι τομές άμεσου ανοσοφθορισμού κόπηκαν στα 4 mm και αντέδρασαν με πολυκλωνικά αντι-ανθρώπινα αντισώματα κουνελιού επισημασμένα με φλουορεσκεΐνη σε IgG, IgA, IgM, C3, C1q, ινωδογόνο και k- και l-ελαφριές αλυσίδες (Dako, Carpenteria, CA) για 1 ώρα, και ξεπλένεται? εφαρμόστηκε μια καλυπτρίδα χρησιμοποιώντας υδατικά μέσα στερέωσης. Επιλεγμένες περιπτώσεις χρωματίστηκαν για πολυκλωνικά αντισώματα ποντικού κατά του ανθρώπου με επισήμανση φλουορεσκεΐνης έναντι των IgG1, IgG2, IgG3 και IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ). Ο ανοσοφθορισμός παραφίνης πραγματοποιήθηκε μετά από πέψη με πρωτεάση όπως περιγράφηκε προηγουμένως.2,3 Επιλέχθηκαν συνολικά 9 βιοψίες MGMID και 8 βιοψίες ελέγχου σύγκρισης με μεμβρανώδη σπειραματοπάθεια άλλων τύπων για ανάλυση φασματομετρίας μάζας. Το πρωτόκολλο μελέτης εγκρίθηκε από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης της Solutions και ήταν σύμφωνο με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι.

Cistanche μπορείτονώνωνεφρό

Φασματομετρία μάζας μικροτεμαχισμένων σπειραμάτων σύλληψης με λέιζερ

Νεφρικός ιστός βιοψίας από ιστό ενσωματωμένο σε παραφίνη σταθεροποιημένο με φορμαλίνη κόπηκε σε πάχος 10 mm σε πλακίδια πλαισίου μεμβράνης Leica PET (Leica, Wetzlar, Γερμανία). Αυτές οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Τα σπειράματα μικροτεμαχίστηκαν σε σωλήνες μικροφυγόκεντρου χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Leica DM60{{20}}0Β. Τα μικροτεμαχισμένα σπειράματα λύθηκαν σε 2 τοις εκατό δωδεκυλοθειικό νάτριο και 0,1 Μ διθειοθρεϊτόλη στους 99 βαθμούς για 1 ώρα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με προετοιμασία δείγματος υποβοηθούμενη από φίλτρο (FASP). , Γκέτινγκεν, Γερμανία). Το δωδεκυλοθειικό νάτριο απομακρύνθηκε με επαναλαμβανόμενες πλύσεις με 8 Μ ουρία σε 0,1 Μ τρις(υδροξυμεθυλ)-αμινομεθάνιο/ΟΙ, ρΗ 8,5. Τα δείγματα στη συνέχεια αλκυλιώθηκαν με 0,05 Μ ιωδοακεταμίδιο. Το ιωδοακεταμίδιο απομακρύνθηκε με 3 πλύσεις με 8 Μ ουρία/0,1 Μ τρις(υδροξυμεθυλ)-αμινομεθάνιο/ΟΙ, ρΗ 8,5, ακολουθούμενα από 3 πλύσεις με 0,05 Μ διττανθρακικό αμμώνιο. Οι πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη με θρυψίνη (βαθμός προσδιορισμού αλληλουχίας, Promega, Madison, WI) σε αναλογία 40:1 β/β στους 37 βαθμούς για 16 ώρες. Τα πεπτίδια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και αφαλατώθηκαν σε μύτες C{36}}Stage (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Τα πεπτίδια που υπέστησαν πέψη αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας NanoLC-διαδοχική χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Τα πεπτίδια φορτώθηκαν σε στήλη παγίδας ανάστροφης φάσης (Integra-frit, New Objective, Woburn, ΜΑ) που περιείχε 2,5 mm φορτισμένη επιφανειακή υβριδική ρητίνη Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) σε σύζευξη με 150 mm X 0.0Αναλυτική στήλη 75 mm που περιέχει την ίδια ρητίνη αντίστροφης φάσης όπως χρησιμοποιείται στην παγίδα. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υπεραπόδοσης nanoAcquity (Waters Corp.) για τη δημιουργία 60-λεπτών διαβάθμισης από 98:2 έως 60:40 ρυθμιστικού διαλύματος αναλογία A:B (ρυθμιστικό διάλυμα A ¼ 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ , 0,5 τοις εκατό ακετονιτρίλιο, ρυθμιστικό διάλυμα Β ¼ 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ, 99,9 τοις εκατό ακετονιτρίλιο).

Τα πεπτίδια εκλούστηκαν από τη στήλη με ένα ενσωματωμένο άκρο ψεκασμού (Picofrit, New Objective) και ιονίστηκαν με ηλεκτροψεκασμό (2.0 kV) και ακολούθησε ανάλυση φασματομετρίας μάζας σε σειρά χρησιμοποιώντας διάσταση επαγόμενης από σύγκρουση υψηλότερης ενέργειας (HCD). Πραγματοποιήθηκαν σαρώσεις έρευνας προδρόμων πεπτιδίων σε ανάλυση 240Κ (στα 400 m/z) με στόχο μέτρησης ιόντων 5×105. Διεξήχθη διαδοχική φασματομετρία μάζας με απομόνωση στο 1,6 Th με τον τετραπόλο, κατακερματισμό HCD με κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης 30 και ανάλυση φασματομετρίας μάζας ταχείας σάρωσης στην παγίδα ιόντων. Τα ληφθέντα δεδομένα φασματομετρίας μάζας σε συνδυασμό αναζητήθηκαν με βάση την πιο πρόσφατη ανθρώπινη βάση δεδομένων Uniprot που περιέχει τόσο τις εγγραφές Swiss Prot όσο και τις καταχωρήσεις TREMBLE χρησιμοποιώντας

MaxQuant (Ινστιτούτο Βιοχημείας Max Planck, Planegg, Γερμανία). Η οπτικοποίηση των δεδομένων έγινε χρησιμοποιώντας Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Το ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης ορίστηκε στο 1 τοις εκατό για τις αντιστοιχίσεις πεπτιδίου προς φάσμα. Για ποσοτικοποίηση χρησιμοποιήθηκαν κανονικοποιημένες τιμές iBAQ από το MaxQuant. Οι κατανομές iBAQ για κάθε δείγμα προσαρμόστηκαν στη μέση τιμή για τον έλεγχο για διαφορές στη φόρτωση. Οι τιμές iBAQ ίσες με μηδέν αφαιρέθηκαν από το σύνολο δεδομένων. Για τη δοκιμή στατιστικών υποθέσεων, πραγματοποιήθηκε ένα 2- δείγμα Welch's t-test για κάθε πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες τιμές iBAQ για τις 2 ομάδες. Εάν μια πρωτεΐνη ανιχνεύτηκε μόνο σε μία ομάδα, πραγματοποιήθηκε 1-τεστ Welch's t-test, χρησιμοποιώντας τη μικρότερη ανιχνευθείσα τιμή iBAQ ως μηδενική υπόθεση.

Χρώση SAP

Τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη σταθεροποιημένες με φορμαλίνη, κομμένες στα 3 mm, αποπαραφινοποιήθηκαν και η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε στους 99 βαθμούς. Οι τομές αντέδρασαν με πολυκλωνικό αντι-SAP πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (1:400· ThermoFisher, Waltham, ΜΑ) και ακολούθησε ένα δευτερεύον αντικουνελιού συζευγμένο με κόκκινο χ της ροδαμίνης κατσίκας που προσροφήθηκε σε στερεά φάση για να εξασφαλιστεί ελάχιστη διασταυρούμενη αντίδραση με τον άνθρωπο IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ). Κάθε περίπτωση εξετάστηκε με θετικούς και αρνητικούς ελέγχους. Η χρώση αξιολογήθηκε με τυπική μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Κρίθηκε θετικό εάν υπήρχε θετική κοκκώδης χρώση τριχοειδούς βρόχου στα σπειράματα και αρνητικό εάν δεν υπήρχε τριχοειδής βρόχος

χρώση στα σπειράματα. Ο εντοπισμός των IgG και SAP στις σπειραματικές βασικές μεμβράνες εξετάστηκε με ομοεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Γερμανία). Για αυτήν την ανάλυση, πολυκλωνικό (συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη) αντι-ανθρώπινη IgG κουνελιού (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) αντέδρασε με τον ιστό που ανακτήθηκε από τη θερμότητα μετά τη χρώση για SAP όπως περιγράφεται παραπάνω. Πραγματοποιήθηκαν αρνητικοί έλεγχοι για να εξασφαλιστεί η εξειδίκευση των αντισωμάτων παραλείποντας τα πρωτογενή αντισώματα. Τέσσερις περιπτώσεις MGMID δοκιμάστηκαν για την παρουσία HP1BP3 (1:100· Thermo Fisher, Waltham, ΜΑ) με χρώση ανοσοϋπεροξειδάσης.

Έλεγχος για αντισώματα ορού στο SAP

Η πρωτεΐνη SAP (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) αραιώθηκε σε 3 ng/ml σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού-διττανθρακικού (pH 9,6) και επικαλύφθηκε σε {{ 6}}πηγαδάκι Immulon H2 (Thermo Scientific) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς . Οι πλάκες πλύθηκαν x3 χρησιμοποιώντας 200 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (1× ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα και 0,05 τοις εκατό tween) και μπλοκαρίστηκαν για 2 ώρες με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (1× ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού, 0,05 τοις εκατό tween, 1 τοις εκατό ζελατίνη ψαριού). Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν χ 3 με 200 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης. Είκοσι μικρολίτρα αραιωμένου ορού (1:100 σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης) προστέθηκαν ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πλάκες πλύθηκαν x 7 με 200 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης και ακολούθησε η προσθήκη του αντισώματος ανίχνευσης, anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Οι πλάκες πλύθηκαν χ 7 με 200 ml ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης. Στη συνέχεια, το υπόστρωμα υπεροξειδάσης 3,3', 5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνης και το υπόστρωμα Sol B υπεροξειδάσης αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:1 και προστέθηκαν 100 ml στην πλάκα. Η αντίδραση διακόπηκε με προσθήκη 100 ml H2SO4 2Μ, που αφέθηκε στον πάγκο για 20 λεπτά πριν από την ανάγνωση στα 450 nm. Για έλεγχο ώστε να διασφαλίσουμε ότι η πρωτεΐνη SAP είναι δεσμευμένη στην πλάκα, χρησιμοποιήσαμε αντι-SAP κουνελιού (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) σε σειριακή αραίωση ακολουθούμενη από IgG-HRP κατά κουνελιού (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Ο έλεγχος έδειξε καλή συσχέτιση μεταξύ της αραίωσης του αντισώματος και της απορρόφησης, με μέση τιμή R-τετράγωνο 0,95.

Cistanche για βελτίωσηνεφρόλειτουργία

ΑΠΟΚΑΛΥΨΗ

Όλοι οι συγγραφείς δεν δήλωσαν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟΣ

ΥΛΙΚΟ Συμπληρωματικό αρχείο (PDF)

Εικόνα S1. Αντιπροσωπευτικές εικόνες χρώσης σπειραματικού SAP από μια ποικιλία νεφρικών παθήσεων.

Εικόνα S2. Μελέτες οροαντιδραστικότητας Anti-SAP με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία.

Πίνακας S1. Όλα τα Igs ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας σε μικροτεμαχισμένα σπειράματα σύλληψης με λέιζερ από περιπτώσεις μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας με εναποθέσεις κάππα IgG.

Πίνακας S2. Οι φασματικές μετρήσεις από μια δειγματοληψία όλων των πρωτεϊνών έδειξαν $1 log2 αυξημένη αφθονία σε δείγματα MGMID και τιμή P # 0.1.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et αϊ. Μεμβρανώδης σπειραματοπάθεια με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG.ΝεφρόInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Ανοσοφθορισμός παραφίνης στο εργαστήριο νεφρικής παθολογίας: κάτι περισσότερο από μια τεχνική διάσωσης. Mod Pathol. 2015; 28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, et al. Μεμβρανοπολλαπλασιαστική σπειραματονεφρίτιδα με καλυμμένες μονοτυπικές εναποθέσεις ανοσοσφαιρίνης. Kidney Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN, et al. Κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά μεμβρανώδους σπειραματοπάθειας με καλυμμένες εναποθέσεις κάππα IgG. Kidney Int Rep. 2016; 1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, et al. Δομή του πενταμερούς συστατικού αμυλοειδούς P ανθρώπινου ορού. Φύση. 1994; 367:338-345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. Αλληλεπίδραση του συστατικού αμυλοειδούς P ορού (SAP) σε ανθρώπινο πλάσμα που περιέχει φυσιολογικά επίπεδα ασβεστίου. Βιοχημεία. 2017; 56:896–902.

7. Agrawal Α, Singh PP, Bottazzi Β, et al. Αναγνώριση προτύπων από πεντραξίνες. Adv Exp Med Biol. 2009; 653:98-116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et al. Οι πενταξίνες PTX3 και SAP στην έμφυτη ανοσία, τη ρύθμιση της φλεγμονής και την αναδιαμόρφωση των ιστών. J Hepatol. 2016; 64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Ανθρώπινο συστατικό αμυλοειδούς P: ένας αναστολέας ελαστάσης. Scand J Immunol. 1984; 20:219-226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Αμυλοειδές P ορού: συστημικός ρυθμιστής της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης. J Leukoc Biol. 2014; 96:739-743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Προστατευτικά μόρια—C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP), αμυλοειδές ορού P (SAP), pentraxin3 (PTX3), λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL) και απολιποπρωτεΐνη Α1 (Apo A1), και τα αυτοαντισώματα τους: επιπολασμός και κλινική σημασία στην αυτοάνοση. J Clin Immunol. 2005; 25:582-591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Τα αντισώματα του αμυλοειδούς συστατικού Ρ κατά του ορού σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο συσχετίζονται με τη δραστηριότητα της νόσου. Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1698-1702.

13. Bickerstaff MC, Botto Μ, Hutchinson WL, et al. Το συστατικό P του αμυλοειδούς ορού ελέγχει την αποικοδόμηση της χρωματίνης και αποτρέπει την αντιπυρηνική αυτοανοσία. Nat Med. 1999; 5:694-697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. Αυτοάνοση και σπειραματονεφρίτιδα σε ποντικούς με στοχευμένη διαγραφή του γονιδίου του αμυλοειδούς συστατικού P ορού: ανεπάρκεια SAP ή συνδυασμός στελεχών; Ανοσολογία. 2004; 112:255-264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao Β, et αϊ. Η βελτίωση της νεφρίτιδας του λύκου με γονιδιακή θεραπεία με συστατικό αμυλοειδούς Ρ ορού με διακριτούς μηχανισμούς ποικίλλει από διαφορετικά στάδια της νόσου. PloS One. 2011; 6: e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, et αϊ. Υποδοχέας φωσφολιπάσης Α2 τύπου Μ ως αντιγόνο στόχος στην ιδιοπαθή μεμβρανώδη νεφροπάθεια. N Engl J Med. 2009; 361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, et al. Θεραπευτική κάθαρση του αμυλοειδούς από αντισώματα έναντι του συστατικού P του αμυλοειδούς ορού. N Engl J Med. 2015; 373: 1106-1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, et al. Οι επαναλαμβανόμενες δόσεις αντισώματος στο συστατικό αμυλοειδούς P ορού καθαρίζουν τις εναποθέσεις αμυλοειδούς σε ασθενείς με συστηματική αμυλοείδωση. Sci Transl Med. 2018; 10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Οδηγίες πρακτικής για τη βιοψία νεφρού. Mod Pathol. 2004, 17:1555–1563.

20. Walker Π.Δ. Η νεφρική βιοψία. Arch Pathol Lab Med. 2009; 133:181-188.

21. Wisniewski JR, Zougman Α, Nagaraj Ν, et al. Καθολική μέθοδος παρασκευής δείγματος για ανάλυση πρωτεώματος. Μέθοδοι Nat. 2009; 6: 359–362.