Γενετική της οστεοποντίνης σε ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο: Η γερμανική μελέτη για τη χρόνια νεφρική νόσο

Περίληψη

Βιολογικά βότανα για την υγεία των νεφρών

Εισαγωγή

Η οστεοποντίνη (OPN) που κωδικοποιείται από το γονίδιο SPP1 περιγράφηκε για πρώτη φορά ως γλυκοπρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια SIBLING (Small Integrin-Binding LIgand N-linked Glycoprotein) το 1985 [1]. Το OPN εκφράζεται σε πολλούς ιστούς όπως οστεοβλάστες, οστεοκύτταρα, οδοντοβλάστες (που παίζουν ρόλο στην ανοργανοποίηση και την απορρόφηση των οστών [2,3]), μακροφάγα, λεία μυϊκά κύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά μπορεί επίσης να βρεθεί στο εσωτερικό αυτί, το κεντρικό νευρικό σύστημα και τον πλακούντα [1,2]. Αν και το OPN μπορεί να ανιχνευθεί σε πολλούς τύπους κυττάρων, συντίθεται κυρίως και εκφράζεται στον νεφρικό ιστό. Η παραγωγή OPN διεγείρεται από πολλούς παράγοντες, όπως η παραθυρεοειδική ορμόνη, η καλσιτριόλη, το ασβέστιο, το φωσφορικό άλας και οι κυτοκίνες. Η πρωτεΐνη μπορεί να δεσμεύσει ιντεγκρίνες μέσω μιας συγκεκριμένης πεπτιδικής αλληλουχίας, του μοτίβου αργινίνης-γλυκίνης-ασπαρτικού οξέος (RGD), καθιστώντας δυνατή την αλληλεπίδραση με διάφορους τύπους κυττάρων (μέσω της οδού πυρηνικού παράγοντα κάπα Β, [4,5]). Στο νεφρό, οι ιντεγκρίνες μπορούν να βρεθούν στην κάψουλα Bowman, στο σπειραματικό επιθήλιο και στο αγγειακό επιθήλιο [6,7]. Το OPN συντίθεται στο παχύ ανιόν άκρο του βρόχου του Henle και στο άπω σωληνάριο [1,8].

Σε μια ανασκόπηση του Kaleta (2019), έχουν συζητηθεί γνωστοί (παθο)φυσιολογικοί ρόλοι του OPN [1]. Με βάση αυτή την ανασκόπηση, ο φυσιολογικός ρόλος του OPN στο νεφρό δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός, αλλά έχει προταθεί ως απαραίτητος για τη σωληνογένεση [1]. Η έκφραση του mRNA του SPP1 καθώς και της πρωτεΐνης OPN ήταν αυξημένη σε μοντέλα νεφρικών παθήσεων κυρίως σε αρουραίους και η υψηλή έκφραση OPN συσχετίστηκε με πρωτεϊνουρία, μειωμένη νεφρική λειτουργία και ίνωση [1]. Μια μελέτη εντόπισε διάφορους πολυμορφισμούς στην περιοχή του προαγωγέα SPP1 που επηρεάζουν τη μεταγραφική του δραστηριότητα [9]. Στο παρελθόν, πολλές συγκεκριμένες παραλλαγές γονιδίου SPP1 έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση και την εξέλιξη διαφορετικών νεφρικών παθήσεων. Άλλες μελέτες περιπτώσεων ελέγχου ανέφεραν ότι συγκεκριμένες παραλλαγές του γονιδίου SPP1 σχετίζονται με διαφορετικούς ασθενείς με νεφρική νόσο σε σύγκριση με μια (υγιή) ομάδα ελέγχου: Για παράδειγμα, το rs1126616 αναφέρθηκε επανειλημμένα ως δείκτης για νεφρίτιδα λύκου και νεφροπάθεια ανοσοσφαιρίνης Α [10- 14]. Σε σχέση με τη διαβητική νεφροπάθεια, έχουν αναφερθεί τα δύο SNP στο SPP1, rs11730582 και rs17524488 [15,16]. Ως εκ τούτου, σκεφτήκαμε ότι η παρουσία μειωμένης νεφρικής λειτουργίας μπορεί να αποτελεί ένα καλό πλαίσιο μελέτης για να εδραιωθεί περαιτέρω η κατανόησή μας για τα γενετικά υπόβαθρα των επιπέδων OPN στη νεφρική νόσο, καθώς ορισμένοι βιολογικοί μηχανισμοί ενδέχεται να ρυθμίζονται προς τα πάνω και επομένως να είναι ευκολότερος να ανιχνευθούν. εμφανίστηκε πριν από το [17-19]. Στο Jing et al. [19], για παράδειγμα, το μέγεθος των επιπτώσεων για γνωστούς τόπους που εντοπίστηκαν σε ένα GWAS ουρικού ορού σε ασθενείς με ΧΝΝ ήταν παρόμοιου ή υψηλότερου μεγέθους από εκείνες που αναφέρθηκαν από μελέτες με βάση τον πληθυσμό. Η γερμανική μελέτη για τη χρόνια νεφρική νόσο (GCKD) περιλαμβάνει μια μεγάλη ομάδα ασθενών με ΧΝΝ [20]. Εκτός από τα δημογραφικά και κλινικά δεδομένα, είναι διαθέσιμα γενετικά δεδομένα καθώς και μετρήσεις βασικής γραμμής του OPN ορού, παρέχοντας ένα ιδανικό περιβάλλον για τη διερεύνηση της γενετικής του OPN. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε GWAS των επιπέδων OPN ορού στη μελέτη GCKD

Αποτελέσματα Περιγραφή του συνόλου ανάλυσης GCKD

Ο Πίνακας 1 παρέχει μια επισκόπηση των βασικών χαρακτηριστικών ενός επιλεγμένου αριθμού μεταβλητών για την πλήρη κοόρτη μελέτης GCKD και το σύνολο ανάλυσης GWAS στο οποίο οι συμμετέχοντες με πλήρη δεδομένα για τη γενετική, τις μετρήσεις OPN καθώς και τον εκτιμώμενο ρυθμό σπειραματικής διήθησης (eGFR) και την λευκωματίνη ούρων Περιλαμβάνεται η αναλογία -προς-κρεατινίνη (UACR) (Σχήμα S1). Δεν υπήρχαν σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ της πλήρους κοόρτης και του συνόλου ανάλυσης. Συνολικά, το σύνολο ανάλυσης GWAS χαρακτηρίστηκε από ένα ποσοστό 60% ανδρών με μέση ηλικία 6{{1{0}},2 ετών (SD: 12.0) , με διάμεσες τιμές 46,0 mL/min/1,73m2 (ρ25: 37,0· ρ75: 57,0) για το eGFR και 50,2 mg/g (ρ25: 9,4· ρ75: 382,8) για το UACR (Πίνακας 1). Μεταξύ των συμμετεχόντων που συμπεριλήφθηκαν, το 35% είχε διαδεδομένο σακχαρώδη διαβήτη, το 16% ήταν καπνιστές και το 30% ανέφεραν ιστορικό καρδιαγγειακής νόσου (CVD). Τα διάμεση επίπεδα OPN στην πλήρη κοόρτη ήταν 29,2 ng/mL (ρ25: 20,7· ρ75: 41,9· Πίνακας 1). Τα επίπεδα OPN αυξήθηκαν κατά μέσο όρο στις κατηγορίες eGFR και στις κατηγορίες UACR από διάμεσο 25,4 ng/mL για το στάδιο G1/2 ΧΝΝ σε 38,5 ng/mL για το στάδιο ΧΝΝ G4/5, καθώς και από τις μέσες τιμές OPN 25,6 ng/mL για το στάδιο UACR A1 να σημαίνει τιμές OPN 34,2 ng/mL για το στάδιο UACR A3 (Σχήμα S2).

Μελέτη συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα και λεπτή χαρτογράφηση

Πραγματοποιήσαμε ένα GWAS για τα επίπεδα OPN ορού (log{{0}}}μετασχηματισμένα) χρησιμοποιώντας ~7,7 εκατομμύρια υψηλής ποιότητας αυτοσωμικές διαλληλικές παραλλαγές της μελέτης GCKD με ελάσσονα συχνότητα αλληλόμορφων (MAF) £0,01 (S1 Τραπέζι). Η γραφική παράσταση εκατομμυρίων-ποσοστιαίου που συγκρίνει τις παρατηρούμενες και τις αναμενόμενες τιμές p από το OPN GWAS δεν έδειξε πληθωρισμό (συντελεστής πληθωρισμού λ=1.01), σύμφωνα με την απουσία συστηματικών σφαλμάτων (Σχήμα S3). Συνολικά, η γραφική παράσταση του Μανχάταν αποκάλυψε τρεις σημαντικές περιοχές σε όλο το γονιδίωμα που σχετίζονται με επίπεδα OPN (p-value<5.0E-08; S4 Fig). Besides the three identified regions, the conditional analysis did not reveal additional independent signals (S5 Fig). The respective association results for the three index SNPs (= SNP with the lowest p-value in the respective region) are presented in Table 2. For all three SNPs, the coded allele was present frequently (allele frequency range 0.5– 0.75). The respective coded allele in our cohort decreased OPN levels on average (S6 Fig) with effect estimates per copy of the coded allele ranging from -0.10 to -0.18 (SE: 0.01–0.02; Table 2). One of the index SNPs on chromosome 4 (rs10011284, 4:88833389) is located upstream of SPP1, which encodes the protein OPN itself (Fig 1A). The other index SNP on chromosome 4 (rs4253311, 4:187174683) maps into the KLKB1 gene (intronic variant), encoding the protein prekallikrein (PK) that is converted to kallikrein (KAL); a protease implicated in the surface-dependent activation of coagulation, bradykinin (BK) release, and potentially the renin-angiotensin-aldosterone system (Fig 2A). The index SNP on chromosome 5 (rs2731673, 5:176839898) maps closest to the F12 gene, which encodes coagulation factor XII, a serine protease that cleaves KLKB1-encoded PK to KAL, among other functions and is also related to blood coagulation, fibrinolysis, and the generation of BK (S7 Fig). A summary of annotations combined from different publicly accessible databases and related to all three SNPs is provided in S2 Table. We next tested whether these three index SNPs were associated with serum OPN levels in the Young Finns Study (YFS) cohort, a population-based study with a mean age of 38 years (SD: 5.0) and a mean eGFR of 92.6 mL/min/1.73m2 (SD: 20.7; S1 Methods). Both SNPs on chromosome 4, rs10011284 and rs4253311, were significantly associated with OPN levels showing also direction consistency (Table 2 and Figs 1B and 2B). In contrast, rs2731673 closest to the F12 gene did not replicate in the YFS cohort (S7 Fig). The two replicated SNPs on chromosome 4 explained 1% of OPN levels each within the GCKD study and did not show a non-additive effect on OPN levels (S8 Fig). Moreover, statistical fine-mapping was performed for the two replicated loci to resolve associated loci into potentially causal variants by constructing credible sets that collectively accounted for a 99% posterior probability of containing the variant or variants that cause the association signal (PPA; Material and methods, [21]). However, fine-mapping results are inconclusive as both constructed sets are large, and single variants included only exhibit low PPA estimates (S3 Table)

Αναλύσεις εντοπισμού

Για να μάθουμε περισσότερα σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς και τους σχετικούς φαινοτύπους που κρύβονται πίσω από τα αναγνωρισμένα σήματα συσχέτισης για το OPN, συγκρίναμε μοτίβα των αποτελεσμάτων OPN GWAS σε προκαθορισμένες περιοχές με αντίστοιχες συνοπτικές στατιστικές GWAS από τρεις άλλες πηγές που χρησιμοποιούν ανθρώπινα δεδομένα (δείτε Υλικό και μεθόδους για λεπτομέρειες). Συγκρίσιμα μοτίβα μπορεί να υποδηλώνουν μια κοινή βιολογική βάση.

Γονιδιακή έκφραση. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις εντοπισμού των συνοπτικών στατιστικών OPN GWAS που σχετίζονται με τους δύο αναδιπλασιασμένους τόπους με τις αντίστοιχες συνοπτικές στατιστικές GWAS της γονιδιακής έκφρασης σε cis χρησιμοποιώντας δεδομένα από το έργο GTEx και τη μελέτη NEPTUNE

(Material and methods). Colocalization (posterior probability of H4 [p12] >0.8) of the OPN association signals were detected with the expression of MEPE in the lung (Fig 3A) and of SPP1 in the pancreas (Fig 3B and S4 Table). Furthermore, colocalization was found between the OPN association signal and expression of F11 in six other tissues (in descending order of H4): tibial artery (Fig 3C), brain cortex, terminal ileum part of the small intestine, muscular of the esophagus, transverse colon, and aortic artery (S4 Table). Except for the colocalization of the OPN signal with an expression of MEPE in the lung, the effect direction of both traits (OPN and gene expression) was concordant (alpha12>0; Πίνακας S4). Πρωτεόμιο πλάσματος. Επιπλέον, διεξήχθησαν αναλύσεις εντοπισμού χρησιμοποιώντας συνοπτικές στατιστικές GWAS των συσχετισμών SNP σε cis και in trans με επίπεδα ~3,{3}} διαφορετικών πρωτεϊνών πλάσματος (pGWAS) που αναφέρθηκαν από τους Sun et al. (Υλικό και μέθοδοι, [22]). Ενώ δεν υπήρχε εντοπισμός για τις συνοπτικές στατιστικές του GWAS του OPN και των πρωτεϊνών σε cis, τα αποτελέσματα του pGWAS για 87 πρωτεΐνες από διάφορες κατηγορίες πρωτεϊνών βρέθηκε ότι μετατοπίζονται με αποτελέσματα OPN GWAS για το rs4253311 στο KLKB1 (Πίνακας S5). Για την πλειοψηφία των αποτελεσμάτων συνεντοπισμού

Σχήμα 3. Σύγκριση συνοπτικών στατιστικών από τον εντοπισμό ιστού OPN GWAS και GTEx: (A) MEPE: OPN και ιστός πνεύμονα (H4: p12=0.99), (B) SPP1: OPN και πάγκρεας (H4: p{{ 6}}.85); (C) F11: OPN και κνημιαία αρτηρία (H4: P{10}}.98). Αριστερά: διάγραμμα διασποράς που συγκρίνει τις τιμές p συσχέτισης και από τις δύο πηγές μεταξύ τους (κλίμακα -log10). Επάνω δεξιά: αποτελέσματα OPN GWAS για την περιοχή ενδιαφέροντος. Κάτω δεξιά: Αποτελέσματα GTEx GWAS για την περιοχή ενδιαφέροντος του αντίστοιχου οργάνου. Τα χρώματα αντικατοπτρίζουν τη συσχέτιση LD (r2) χρησιμοποιώντας πληθυσμό 1000 G EUR ως αναφορά.

(60/87, 69%), η κατεύθυνση επίδρασης του OPN και των πρωτεϊνών ήταν σύμφωνη, γεγονός που οφείλεται στο γεγονός ότι το ενεργοποιημένο KKS εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα διεργασιών, όπως φλεγμονή, καρκίνος, καρδιαγγειακές παθήσεις, καθώς και (παθοπάθεια ) φυσιολογικοί ρόλοι στους νεφρούς και στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Για 86 χαρτογραφημένες πρωτεΐνες, διεξήχθη ανάλυση εμπλουτισμού Gene Ontology (GO) για να εκτιμηθεί εάν τα γονίδια που κωδικοποιούν ήταν εμπλουτισμένα με όρους που αντιπροσωπεύουν συγκεκριμένα κυτταρικά συστατικά και μοριακές λειτουργίες (Υλικό και μέθοδοι, Πίνακας S6). Λόγω μιας ιεραρχικής δομής λιστών αναφοράς, οι εμπλεκόμενοι όροι εξαρτώνται εν μέρει ο ένας από τον άλλον που δείχνουν π.χ. επικαλυπτόμενες προς τα πάνω ρυθμιζόμενες μοριακές λειτουργίες καθώς και ρυθμιζόμενες προς τα πάνω ορμόνες και δραστηριότητες υποδοχέων (S9 Σχήμα).

Ασθένειες της UK Biobank (UKB).

To address the interplay between genetic modulation of OPN levels and phenotypes we further conducted a colocalization analysis with binary UKB disease traits that showed a genome-wide significant association in the GeneAtlas resource [23]. Based on marginal association statistics, no positive colocalization was detected between OPN and various disease traits (S7 Table). Still, for four of seven traits with an association signal different from the OPN signal in the region (H3: p1.2>0.8), ανιχνεύθηκε ένα δεύτερο ανεξάρτητο σήμα συσχέτισης για το αντίστοιχο χαρακτηριστικό της νόσου στο UKB. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε πρόσθετες αναλύσεις εντοπισμού με βάση τα ληφθέντα στατιστικά στοιχεία συσχέτισης υπό όρους και εντοπίσαμε έναν θετικό εντοπισμό μεταξύ του σήματος συσχέτισης OPN στο rs4253311 στον τόπο KLKB1 και στο rs1593 για εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση (DVT; H4: p12=0.96; S7 Πίνακας και S10 Σχ.). Στο GeneAtlas GWAS της DVT, το κύριο αλληλόμορφο του rs1593 (A, συχνότητα αλληλόμορφου=0.87) συσχετίστηκε με υψηλότερο κίνδυνο για DVT (OR=1.2, p-value 2,4e{{ 18}}), όπως ήταν το κύριο αλληλόμορφο του rs4253311 (κύριο αλληλόμορφο: G, συχνότητα αλληλόμορφων=0.51, OR=1.13, τιμή p-= 2.6e{{27 }}).