Εξωιικό DNA σε παρασκευάσματα ιικού φορέα που σχετίζονται με αδενοειδείς παράγοντες επάγει έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις εξαρτώμενες από το TLR9 σε ανθρώπινα πλασμακυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα

Τα εναιωρήματα φορέων αδενο-συσχετιζόμενου ιού (AAV) που παράγονται είτε σε κύτταρα HEK προερχόμενα από άνθρωπο είτε σε κύτταρα εντόμων Spodoptera frugiperda (Sf9) διαφέρουν ως προς τα υπολειμματικά συστατικά του κυττάρου ξενιστή καθώς και τις ειδικές για το είδος μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που εμφανίζονται στις πρωτεΐνες καψιδίου AAV . Εδώ αναλύσαμε την επίδραση αυτών των διαφορών στις ανοσογονικές ιδιότητες του φορέα. Διεγείραμε ανθρώπινα πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα με διάφορους φορείς AAVCMV-eGFP που παράγονται από κύτταρα HEK και Sf9 κύτταρα που παράγονται από διαφορετικούς κατασκευαστές. Διαπιστώσαμε ότι οι φορείς AAV8-CMV-eGFP καθώς και οι φορείς AAV2-CMV-eGFP προκάλεσαν φλεγμονώδεις αποκρίσεις κυτοκίνης ειδικές για παρτίδα, αλλά όχι συγκεκριμένες για την πλατφόρμα παραγωγής ή για τον κατασκευαστή. Αυτά θα μπορούσαν να μειωθούν ή να καταργηθούν με τον αποκλεισμό της σηματοδότησης του υποδοχέα 9 που μοιάζει με διόδια ή με την ενζυματική μείωση του DNA στις παρτίδες φορέα χρησιμοποιώντας DNase. Η επιτυχής μεταγωγή κυττάρων ΗΕΚ από παρτίδες AAV που υπέστησαν επεξεργασία με DNase και αναλύσεις DNA έδειξαν ότι η DNase δεν επηρέασε την ακεραιότητα του φορέα αλλά αποδόμησε το εξωιικό DNA. Συμπεραίνουμε ότι τόσο τα παρασκευάσματα AAV που προέρχονται από κύτταρα HEK όσο και Sf{21}}μπορούν να περιέχουν ανοσογόνα εξωιικά συστατικά DNA τα οποία μπορούν να πυροδοτήσουν φλεγμονώδεις ανοσοαποκρίσεις ειδικές για παρτίδα. Αυτό υποδηλώνει ότι οι βελτιωμένες στρατηγικές για την απομάκρυνση των εξωιικών ακαθαρσιών του DNA μπορεί να είναι καθοριστικής σημασίας για τη μείωση των ανοσογονικών ιδιοτήτων των παρασκευασμάτων φορέα AAV.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Την τελευταία δεκαετία παρατηρήθηκε τεράστιο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών που βασίζονται στον ανασυνδυασμένο αδενοσυνδεόμενο ιό (AAV) τόσο για βασική έρευνα όσο και για κλινικές εφαρμογές1–3. Ο κύριος λόγος έγκειται στο γεγονός ότι οι φορείς AAV ήταν εξαιρετικά ευέλικτα εργαλεία στον τομέα της γονιδιακής θεραπείας δεδομένης της ικανότητάς τους να παρέχουν αποτελεσματικά και με ασφάλεια θεραπευτικά γονίδια στους ιστούς στόχους4. Ωστόσο, ένας αυξανόμενος αριθμός ερευνητών ανεξαρτήτως αναφέρουν ευρήματα που υποδηλώνουν τοπικές και συστηματικές ανοσολογικές αποκρίσεις μετά τη χορήγηση του AAV σε προκλινικές και κλινικές μελέτες5–8.

Οι φορείς AAV έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν έμφυτους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων ανοσοποιητικού όπως ο υποδοχέας τύπου toll (TLR)2 και TLR9 με αποτέλεσμα την απελευθέρωση φλεγμονωδών κυτοκινών και ιντερφερονών τύπου Ι (IFN) 9,10. Ανοσογόνα συστατικά του AAV που μπορεί να διεγείρουν αυτές τις αποκρίσεις περιλαμβάνουν πρωτεΐνες καψιδίου και γονιδίωμα φορέα9,10. Ανοσοποιητικές αποκρίσεις μετά την εφαρμογή AAV μπορεί επίσης να πυροδοτηθούν από ακαθαρσίες στο εναιώρημα φορέα5,11. Αυτές οι ακαθαρσίες έχουν οριστεί ως οποιοδήποτε συστατικό που υπάρχει στο καθαρισμένο εναιώρημα φορέα AAV εκτός από το επιθυμητό προϊόν12 και προκύπτουν από τη διαδικασία παραγωγής του φορέα. Δύο από τις κύριες μεθόδους παραγωγής κλινικών ανασυνδυασμένων φορέων AAV περιλαμβάνουν τη διαμόλυνση πλασμιδικού DNA σε κύτταρα ΗΕΚ και τη μόλυνση κυττάρων εντόμου Spodoptera frugiperda (Sf9) με βακολοϊό13. Συνεπώς, δυνητικά ανοσογόνες ακαθαρσίες που περιέχονται σε εναιωρήματα φορέα ΑΑν θα μπορούσαν να περιλαμβάνουν ενδοτοξίνες, συστατικά μέσου κυτταροκαλλιέργειας, αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για καθαρισμό ΑΑν, πρωτεΐνες και DNA που προέρχονται από κύτταρα ξενιστές και υπολειμματικό DNA βακουλοϊού ή πλασμίδιο DNA5. Πρόσθετοι παράγοντες που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανοσογονικότητα των εναιωρημάτων φορέων AAV είναι οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTMs) που αποτυπώνονται στο καψίδιο από τις διαφορετικές πλατφόρμες παραγωγής φορέων5. Είναι σημαντικό ότι οι φορείς AAV που προέρχονται από κύτταρα HEK και οι φορείς AAV που προέρχονται από κύτταρα Sf9 διαφέρουν πολύ ως προς τα PTMs τους, τις υπολειμματικές ακαθαρσίες πρωτεΐνης του κυττάρου ξενιστή11 και ενδεχομένως επίσης ως προς τις ακαθαρσίες DNA τους (ΗΕΚ κυτταρικού DNA έναντι DNA κυττάρων Sf9 καθώς και υπολειπόμενου πλασμιδικού DNA έναντι βακουλοϊικού DNA)14. Τα πλασμακυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα (pCDs) είναι ένας εξειδικευμένος έμφυτος κυτταρικός τύπος που εκκρίνει μεγάλες ποσότητες IFN τύπου Ι και προφλεγμονώδεις κυτοκίνες σε ιογενείς λοιμώξεις9,15 και παίζουν σημαντικό ρόλο στην αίσθηση των φορέων AAV9. Συνεπώς, για να αναλύσουμε εάν οι διαφορές μεταξύ των φορέων AAV που παράγονται από κύτταρα HEK και των φορέων AAV που παράγονται από κύτταρα Sf{26}} οδηγούν σε διαφορές στις ανοσογονικές τους ιδιότητες, διεγείραμε ανθρώπινα pDC με διαφορετικές παρτίδες του ίδιου φορέα AAV που ελήφθη από τα δύο συστήματα παραγωγής και διαφορετικών κατασκευαστών. Βρήκαμε ότι οι μισές παρτίδες φορέων που εξετάστηκαν προκάλεσαν προφλεγμονώδεις ανοσοαποκρίσεις ειδικές για παρτίδα που δεν σχετίζονταν ούτε με το σύστημα παραγωγής φορέα ούτε με τον κατασκευαστή. Αυτές οι αποκρίσεις διαμεσολαβήθηκαν από τη σηματοδότηση TLR9 και ήταν ευαίσθητες στην επεξεργασία των παρτίδων φορέων με DNase. Η επιτυχής μεταγωγή κυττάρων ΗΕΚ τόσο από παρτίδες φορέων AAV χωρίς επεξεργασία όσο και με αγωγή με DNase και αναλύσεις DNA των παρασκευασμάτων AAV υποδηλώνουν ότι η DNase δεν επηρέασε την ακεραιότητα των σωματιδίων AAV αλλά μάλλον στόχευε το μη ενθυλακωμένο εξω-ιικό DNA. Συλλογικά, αυτό υποδηλώνει ότι τα παρασκευάσματα φορέα AAV μπορεί να περιέχουν μη-ενθυλακωμένο εξω-ιικό DNA που μπορεί να επηρεάσει τις ανοσογονικές ιδιότητες των παρασκευασμάτων φορέα AAV σε ανθρώπινα pDC.

Οφέλη από το σωληνίσκο cistanche- ενίσχυση του ανοσοποιητικού συστήματος

Αποτελέσματα

Το AAV προκαλεί έμφυτες ανοσοαποκρίσεις ειδικές για παρτίδα σε ανθρώπινα pDC.

Μελέτες έχουν δείξει ότι οι φορείς AAV που προέρχονται από κύτταρα HEK και προερχόμενοι από κύτταρα Sf9 διαφέρουν ως προς τα PTM και τις ακαθαρσίες που περιέχονται στα ιικά εναιωρήματα11. Υποθέσαμε ότι αυτοί οι παράγοντες θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε διαφορές στις ανοσογονικές ιδιότητες μεταξύ των παρτίδων φορέων που προέρχονται από κύτταρα HEK και Sf9. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, αναλύσαμε συνολικά οκτώ παρτίδες φορέων ορότυπου 8 (AAV8) AAV που περιέχουν την πανομοιότυπη αλληλουχία DNA του προαγωγέα κυτταρομεγαλοϊού (CMV) και το ίδιο διαγονίδιο για την ενισχυμένη πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού (eGFP) (AAV{{9} CMV-eGFP· πέντε παρτίδες HEK- και τρεις Sf9 προερχόμενες από κύτταρα) και τέσσερις παρτίδες AAV2-CMV-eGFP (δύο παρτίδες προερχόμενες από κύτταρα HEK- και δύο Sf9) από τρεις διαφορετικούς κατασκευαστές [κατασκευαστής A; Viral Vector Core Facility of University of Iowa (Iowa, USA), κατασκευαστής B; Virovek (CA, ΗΠΑ) και κατασκευαστής C; Vigene Biosciences (MD, ΗΠΑ)]. Για να μεγιστοποιηθούν οι ομοιότητες μεταξύ των παρτίδων, οι επτά παρτίδες AAV8 από τον κατασκευαστή Α και τον κατασκευαστή Β (Πίνακας 1) παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το ίδιο αρχικό πλασμίδιο. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε καταχώρηση σταγονιδίων ψηφιακής PCR (ddPCR) των γονιδιωμάτων φορέα (vg) των παρτίδων φορέων AAV σε μέτρηση δίπλα-δίπλα χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικούς στόχους: έναν εντός της αλληλουχίας CMV και τον άλλο εντός της αλληλουχίας eGFP του οι φορείς. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τον ποσοτικό προσδιορισμό του στόχου CMV χρησιμοποιήθηκαν για την τιτλοδότηση των παρτίδων φορέα AAV στα ακόλουθα πειράματα (Πίνακας 1). Τα pDC είναι εξειδικευμένοι ιικοί αισθητήρες που παράγουν μαζικά IFN τύπου Ι μετά από ιογενή μόλυνση15, συμπεριλαμβανομένων των φορέων AAV9. Για να διερευνήσουμε εάν οι φορείς AAV που παράγονται από κύτταρα HEK και οι φορείς AAV που παράγονται από Sf9- διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να προκαλούν εγγενείς ανοσολογικές αποκρίσεις σε ανοσοεπαρκή κύτταρα, διεγείραμε τα ανθρώπινα pDC με τις παρτίδες φορέων AAV που αναφέρονται παραπάνω. Για το σκοπό αυτό, τα pDC καθαρίστηκαν από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) μεμονωμένων υγιών ανθρώπινων δοτών με αρνητική επιλογή χρησιμοποιώντας μαγνητική ενεργοποιημένη ταξινόμηση κυττάρων (MACS). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής επιβεβαίωσε την καθαρότητα των απομονωθέντων pDC πάνω από 90% (Εικ. S1). Δέκα, pDC ενός μεμονωμένου δότη σπάρθηκαν και διεγέρθηκαν με παρτίδες φορέων AAV8 και AAV2 σε ΜΟΙ 1:1 × 106 vg/κύτταρο για 18 ώρες. Το MOI 1:106 vg/κύτταρο που εφαρμόζεται σε ένα σύνολο 12.500 κυττάρων σε 50 ul/κυψελίδα μεταφράζεται σε τίτλο 2,5×1011 vg/ml. Χρησιμοποιήσαμε αυτόν τον τίτλο επειδή είναι εντός του εύρους αυτού που εφαρμόζεται σε μελέτες γονιδιακής θεραπείας αμφιβληστροειδούς σε ανθρώπους (π.χ. 1× 1012 vg/ml16 ή 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) και πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου (π.χ. 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6). Η διέγερση με το όχημα χρησίμευε ως έλεγχος. Η επώαση με παρτίδες φορέων AAV8 και AAV2 δεν οδήγησε σε οποιαδήποτε ανιχνεύσιμη διαγονιδιακή έκφραση σε pDC. Ωστόσο, τέσσερις από τις οκτώ παρτίδες AAV8 (παρτίδες A-HEK{-1, A-HEK{-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) και δύο από τις τέσσερις παρτίδες AAV2 (παρτίδες B-Sf9-1, B-Sf9-2) προκάλεσαν πολλαπλασιασμό αντιδραστικών κυττάρων στα διεγερμένα pDC (Εικ. 1α). Αυτό συνοδεύτηκε από απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών (IP-10, MIP{-1 και TNF- ) και IFN τύπου Ι (IFN- ). Αντίθετα, ούτε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός ούτε η απελευθέρωση κυτοκίνης προκλήθηκαν από το υπόλοιπο AAV8 (παρτίδες A-Sf{9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) και παρτίδες AAV2 (παρτίδες C-HEK-1, C-HEK-2). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε τρία έως τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα το καθένα που εκτελέστηκε με τα κύτταρα ενός μεμονωμένου δότη (Εικ. 1a-c και Πίνακας S1). Οι ειδικές για παρτίδες διαφορές στις συγκεντρώσεις κυτοκίνης σε αυτά τα ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό μοντέλο μικτών επιδράσεων και τη δοκιμή post hoc Dunnett (Q=2.6) συγκρίνοντας τους μέσους όρους ελάχιστου τετραγώνου των διαφορετικών παρτίδων φορέων AAV με το χειριστήριο του οχήματος (πίνακες S2 και S3). Αυτό έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές στις αποκρίσεις κυτοκίνης μεταξύ παρτίδων "ανοσογόνου" φορέα AAV (Παρτίδες AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}}, ή παρτίδες AAV2 B-Sf9-1, B-Sf{9-2 αντίστοιχα) και έλεγχος, αλλά όχι σημαντικές διαφορές μεταξύ των παρτίδων "μη ανοσογονικών" φορέων AAV (Παρτίδες AAV8 A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 ή AAV2 παρτίδες C-HEK-1, C-HEK-2 αντίστοιχα) και ελέγχου (Πίνακας S3). Οι συγκεντρώσεις των υπόλοιπων μετρούμενων κυτοκινών που περιλαμβάνονται στην πολυπλεξία είτε ήταν κάτω από το εύρος της ανάλυσης (δηλ. , IL{-6, IL{-10, IL{-12, IL{-13, IL{-17, GM-CSF, IFN- ) ή ούτε το "ανοσογόνο" ούτε οι παρτίδες "μη ανοσογόνων" φορέων προκάλεσαν οποιεσδήποτε σημαντικές αυξήσεις στην απελευθέρωσή τους (δηλαδή, IL{-7, IL{-8, G-CSF, MCP-1) (Εικ. S2), υποδηλώνοντας βαθμό εξειδίκευσης στην απόκριση κυτοκίνης που προκαλείται από AAV. Για τη διερεύνηση των αποκρίσεων κυτοκίνης σε προγενέστερο χρονικό σημείο, τα pDC διεγέρθηκαν με τον "ανοσογόνο" φορέα AAV8 παρτίδα A-HEK-1. Παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση στη συγκέντρωση του TNF- στο υπερκείμενο υγρό ήδη στις 2 ώρες μετά τη διέγερση του pDC. Αυτό το μοτίβο απόκρισης θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί σε τρία πειράματα, το καθένα εκτελούμενο με τα κύτταρα ενός μεμονωμένου δότη (Εικ. S3). Για να διερευνήσουμε εάν μια υψηλότερη δόση μιας παρτίδας "μη ανοσογόνου" φορέα AAV8 ήταν σε θέση να προκαλέσει μια ανοσολογική απόκριση, διεγείραμε τα pDC με το τεχνικά μέγιστο εφαρμοστέο MOI (1:4,61× 106 vg). Είναι ενδιαφέρον ότι ούτε ο πολλαπλασιασμός των αντιδραστικών κυττάρων ούτε οι αποκρίσεις κυτοκίνης ανιχνεύθηκαν κατά τη διέγερση με αυτόν τον αυξημένο τίτλο (Εικ. S4). Σε αντίθεση με την υπόθεσή μας, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι οι έμφυτες ανοσοαποκρίσεις στον AAV στα pDC ήταν ειδικές για την παρτίδα και δεν σχετίζονταν με ένα συγκεκριμένο σύστημα παραγωγής ή κατασκευαστή/μέθοδο καθαρισμού.

Πίνακας 1. Διαφορετικές παρτίδες ιικών φορέων AAV8 και AAV2 που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

Σχήμα 1. Επαγωγή ανοσοαποκρίσεων ειδικών για παρτίδα φορέα AAV σε ανθρώπινα pDC. Τα ανθρώπινα pDC διεγέρθηκαν με διαφορετικές παρτίδες AAV8-CMV-eGFP και AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) για 18 ώρες (α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες φωτεινού πεδίου των pDC που διεγέρθηκαν με έλεγχος οχήματος (επάνω εικόνα) ή μια παρτίδα ανοσογόνου φορέα AAV (κάτω εικόνα). Η ράβδος κλίμακας είναι 100 μm. (β) Απελευθέρωση κυτοκίνης IP-10, MIP-1 , TNF- και IFN- 2 από διεγερμένα από AAV8-pDC. (Γ) Απελευθέρωση κυτοκίνης από pDC που διεγείρονται με AAV. Αντιπροσωπευτικά σχέδια ενός από τρία έως τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. Εφόσον στις μετρήσεις IFN- 2 (b,c) και μέτρηση TNF- (γ) ορισμένες τιμές έπεσαν κάτω από το εύρος της ανάλυσης, η σταθερά 1 προστέθηκε σε όλες τις μετρημένες τιμές IFN{- 2 και TNF- για παρουσίαση σε ημιλογαριθμική γραφική παράσταση. Εμφανίζονται οι διάμεσοι και οι διατεταρτημοριακές περιοχές. Στις ετικέτες των μεμονωμένων διανυσματικών παρτίδων οι τρεις κατασκευαστές αντιπροσωπεύονται με τα γράμματα A, B και C. Οι φορείς που προέρχονται από κύτταρα HEK και Sf9-προερχόμενοι από κύτταρα υποδεικνύονται με "HEK και "Sf9" και οι αντίστοιχες παρτίδες του ίδιου κατασκευαστή και του ίδιου συστήματος παραγωγής αριθμούνται "1, 2, 3". Κύκλος: Προέρχεται από HEK διανυσματική παρτίδα· τρίγωνο: Sf{30}}προερχόμενη από διανυσματική παρτίδα· μαύρο: διανυσματική παρτίδα από τον κατασκευαστή Α· πορτοκαλί: παρτίδα διανυσμάτων από τον κατασκευαστή Β· πράσινο: παρτίδα διανυσμάτων από τον κατασκευαστή C.

Η ανοσολογική απόκριση στη διέγερση AAV στα pDCs δεν επηρεάζεται από τις διαφορές στην αναλογία καψιδίου/VG.

Οι προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι διαφορές στον αριθμό των πλήρων και κενών σωματιδίων φορέα στα εναιωρήματα φορέων AAV μπορούν να επηρεάσουν την ανοσολογική απόκριση18. Προκειμένου να εκτιμηθεί εάν οι διαφορές στις ανοσογονικές ιδιότητες μεταξύ των αναλυόμενων παρτίδων φορέων οφείλονταν σε διαφορές στην αναλογία πλήρων και κενών σωματιδίων φορέα, προσδιορίσαμε τον τίτλο των καψιδίων φορέα σε όλες τις παρτίδες AAV με ELISA τιτλοδότησης AAV και υπολογίσαμε το καψίδιο/VG αναλογία. Είναι ενδιαφέρον ότι μεγάλες διαφορές στην αναλογία καψιδίου/vg βρέθηκαν μεταξύ όλων των παρτίδων AAV (Εικ. 2). Περίπου δύο φορές περισσότερα καψίδια από το vg (2:1) βρέθηκαν σε παρτίδες AAV8-CMV-eGFP A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } και AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; και τέσσερις φορές περισσότερο (4:1) στην παρτίδα AAV8 A-Sf9-1. Στις υπόλοιπες παρτίδες παρατηρήθηκε αναλογία 1:1. Ωστόσο, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των αναλογιών καψιδίου/vg των παρτίδων "ανοσογόνου" και "μη ανοσογόνων" φορέων AAV στον AAV8 (P=0.27) ούτε στον AAV2 (P=0.37) διανυσματικές παρτίδες (Εικ. 2). Αυτό υποδηλώνει ότι οι διαφορές στις ανοσογονικές ιδιότητες των αναλυόμενων παρτίδων φορέων AAV δεν σχετίζονταν επίσης με διαφορές στην αναλογία πλήρων και κενών σωματιδίων φορέα.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-πώς να ενισχύσετε το ανοσοποιητικό σύστημα

Αναγνώριση παρτίδων "ανοσογόνου" φορέα AAV8 από TLR9.

Έχει αποδειχτεί ότι η έμφυτη ανοσολογική αναγνώριση του AAV από τα pDC ποντικού και ανθρώπου προκαλείται από την ανίχνευση DNA TLR99. Αντίστοιχα, αξιολογήσαμε εάν το TLR9 συμμετείχε επίσης στην αναγνώριση των παρτίδων μας "ανοσογόνου" φορέα AAV8. Για το σκοπό αυτό, τα pDC σπάρθηκαν όπως περιγράφεται και καλλιεργήθηκαν με τον ανταγωνιστή TLR9 H154 (50 μΜ) που ακολουθήθηκε από διέγερση με τις παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 και A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Μετά από 18 ώρες, δεν παρατηρήθηκαν ενδείξεις κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Εικ. 3α) και μετρήθηκε σημαντική μείωση στην απελευθέρωση IP-10, MIP-1, TNF- και IFN- (Εικ. 3β). Αυτό υποδεικνύει ότι οι ανοσοαποκρίσεις σε παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV8 σε ανθρώπινα pDC μεσολαβούνται από τη σηματοδότηση TLR9.

Σχήμα 2. Σύγκριση αναλογιών καψιδίου/vg μεταξύ διαφορετικών παρτίδων διανυσμάτων AAV8-CMV-eGFP και AAV2-CMV-eGFP. Οι αναλογίες καψιδίου/vg προέρχονται από μετρήσεις απορρόφησης (ELISA) και αποτελέσματα ddPCR (α) οκτώ παρτίδων φορέα AAV8 και (β) τεσσάρων παρτίδων φορέα AAV2. Οι διακεκομμένες γραμμές διαχωρίζουν τις "ανοσογόνους" από τις "μη ανοσογόνους" παρτίδες φορέων AAV. Οι ράβδοι υποδεικνύουν τα μέσα και τις τυπικές αποκλίσεις των αντιγράφων. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο Student t-test.

Σχήμα 3. Η αναγνώριση παρτίδων φορέων "ανοσογόνου" AAV8-CMV-eGFP από τα pDC εξαρτάται από το TLR9. Τα ανθρώπινα pDC υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον ανταγωνιστή TLR9 H154 (50 μΜ) και ακολούθησε διέγερση με "ανοσογόνους" παρτίδες φορέα AAV8 (MOI: 1:1× 106 vg) για 18 ώρες. (α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες φωτεινού πεδίου καθαρισμένων pDC που έχουν υποστεί επεξεργασία με παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV (επάνω εικόνα) ή "ανοσογόνο" παρτίδες φορέα AAV και H154 (κάτω εικόνα). Η γραμμή κλίμακας είναι 100 μm. (β) Απελευθέρωση κυτοκίνης IP-10, MIP-1 , TNF- και IFN- 2 από διεγερμένα pDC. Εφόσον στις μετρήσεις IFN- 2, ορισμένες τιμές έπεσαν κάτω από το εύρος της ανάλυσης, η σταθερά 1 προστέθηκε σε όλες τις μετρημένες τιμές IFN{- 2 για παρουσίαση σε ημιλογαριθμική γραφική παράσταση. Εμφανίζονται τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και ανάλυση post hoc του Holm-Sidak. Τιμές P: Μικρότερο ή ίσο με 0,05: *; Μικρότερο ή ίσο με 0,01: **; Μικρότερο ή ίσο με 0,001: ***.

Η θεραπεία με DNase μειώνει τις ανοσολογικές αποκρίσεις των «ανοσογόνων» παρτίδων φορέων AAV8 και AAV2.

Ενώ οι "ανοσογόνοι" φορείς AAV8 προκάλεσαν μια εξαρτώμενη από TLR9-ανοσολογική απόκριση στα pDC, δεν προκλήθηκαν τέτοιες αποκρίσεις από τις "μη ανοσογόνες" παρτίδες. Το TLR9 ενεργοποιείται ως απόκριση στο DNA, ιδιαίτερα στο DNA που περιέχει μη μεθυλιωμένα μοτίβα CpG9. Είναι σημαντικό ότι οι μετρήσεις μας ddPCR επιβεβαίωσαν ότι τα ίδια συστατικά ιικού DNA υπήρχαν τόσο σε παρτίδες «ανοσογόνου» όσο και σε «μη ανοσογόνους» φορείς. Συλλογικά, αυτό πρότεινε ότι το μη συσκευασμένο/ελεύθερο DNA στο ιικό εναιώρημα και όχι στο ενδο-ιικό DNA θα μπορούσε να είναι ο αιτιολογικός παράγοντας των παρατηρούμενων ανοσοαποκρίσεων σε παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV. Ως εκ τούτου, εάν υπήρχε υπολειμματικό ελεύθερο DNA στο ιικό εναιώρημα των "ανοσογόνου" παρτίδων φορέων AAV8, η έμφυτη ανοσολογική απόκριση θα πρέπει να εξασθενεί από την DNase. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, «ανοσογόνες» παρτίδες φορέων AAV8 και AAV2 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με DNase I (100 μg/ml) για 30 λεπτά πριν από τη διέγερση με AAV. Για να αποκλειστούν οι μη ειδικές επιδράσεις της θεραπείας με DNase στα pDC ή στα σωματίδια AAV, στις διεγέρσεις μόνο με AAV, οι φορείς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία DNasemock πριν από τη διέγερση pDC. Σε αυτές τις ψευδείς θεραπείες χωρίς DNase, τα σωματίδια AAV επωάστηκαν στους 37 βαθμούς σε ένα πανομοιότυπο μέσο πέψης DNase για την ίδια χρονική περίοδο με τα AAV που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase. Δέκα, pDC σπάρθηκαν και διεγέρθηκαν με τις προκατεργασμένες με ϋΝάση ή τις παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV που είχαν υποστεί ψευδή επεξεργασία (MOI: 1:1 × 106 vg). Τα pDC που επωάστηκαν μόνο με DNase ή υποβλήθηκαν σε ψευδή επεξεργασία με ένα όχημα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Είναι ενδιαφέρον ότι η θεραπεία με DNase των "ανοσογόνου" παρτίδων φορέων AAV8 και AAV2 μείωσε τον αντιδραστικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικ. 4a) και είτε κατήργησε πλήρως (παρτίδες AAV8 A-HEK-2 και A-Sf9-1· παρτίδες AAV2 B-Sf9-1 και B-Sf9-2) ή μείωσε σημαντικά (AAV8 παρτίδες A-HEK-1 και A-HEK-3) την απελευθέρωση IP{{40} }, MIP-1, TNF- και IFN- μετά από διέγερση AAV (Εικ. 4b,c). Για να επιβεβαιώσουμε ότι το παρατηρούμενο αποτέλεσμα DNase προκλήθηκε στην πραγματικότητα από την πέψη του εξωιικού DNA και όχι από μια επίδραση της DNase στην ακεραιότητα του φορέα, ερευνήσαμε εάν η επεξεργασία με DNase παρτίδων φορέων AAV επηρέασε την ικανότητα μεταγωγής του AAV. Δεδομένου ότι η εφαρμογή AAV δεν οδήγησε σε καμία ανιχνεύσιμη μεταγωγή pDC, τα κύτταρα ΗΕΚ χρησιμοποιήθηκαν για αυτές τις αναλύσεις καθώς τα κύτταρα ΗΕΚ είναι ένα πολύ γνωστό κυτταρικό μοντέλο για την ανάλυση της αποτελεσματικότητας μεταγωγής κατά τη μεταγωγή ΑΑν19. Διεγείραμε κύτταρα HEK293T με παρτίδες φορέων AAV8 και AAV2 επεξεργασμένες με DNase και εικονική επεξεργασία (MOI: 1:8 × 104 vg) και αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα μεταγωγής με μικροσκοπία φθορισμού 3 ημέρες μετά την εφαρμογή του φορέα. Όπως περιγράφηκε, οι φορείς AAV2 έδειξαν υψηλότερη ισχύ μεταγωγής σε σύγκριση με τους φορείς AAV8. Είναι σημαντικό, επιπλέον, η προκατεργασία με DNase ούτε μείωσε την αποτελεσματικότητα μεταγωγής στις παρτίδες φορέων AAV8 και AAV2 που προέρχονται από HEK ούτε σε Sf9-προερχόμενες από κύτταρα AAV8 και AAV2 (Εικ. S5a,b). Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν περαιτέρω στοιχεία ότι η επίδραση της DNase στις ανοσογονικές ιδιότητες των παρτίδων φορέων οφείλεται στην αποικοδόμηση του εξωιικού DNA. Αν και ο ανταγωνιστής TLR9 H154 κατήργησε ουσιαστικά την απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών και για τις τέσσερις ανοσογόνους παρτίδες AAV8 (Εικ. 3), η προ-αγωγή με DNase θα μπορούσε επίσης να εξαλείψει την προφλεγμονώδη απόκριση κυτοκίνης για τις παρτίδες AAV8 A-HEK{{75} } και A-Sf9-1, ενώ δεν το αφαίρεσε πλήρως για τις παρτίδες AAV8 A-HEK-1 και A-HEK-3 (Εικ. 4). Για να ελέγξουμε εάν ένας αυξημένος χρόνος θεραπείας με DNase θα μπορούσε να ακυρώσει αυτήν την απόκριση κυτοκίνης, επαναλάβαμε τα πειράματα προσομοίωσης των pDC μετά από δεκαπλάσια αύξηση του χρόνου επώασης DNase των αντίστοιχων παρτίδων (A-HEK-1 και A-HEK{{87} }). Παρατηρήσαμε ότι μετά την επεξεργασία των φορέων με DNase για 5 ώρες, οι μέσες συγκεντρώσεις κυτοκίνης στο υπερκείμενο των διεγερμένων από ΑΑν κυττάρων μειώθηκαν περαιτέρω και δεν ήταν πλέον σημαντικά διαφορετικές από αυτές του φορέα ελέγχου. Αυτό το μοτίβο απόκρισης θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί σε τρία πειράματα, το καθένα εκτελούμενο με τα κύτταρα ενός μεμονωμένου δότη (Εικ. S6). Αυτό υποδηλώνει ότι η κεντρική αιτία της εξαρτώμενης από το TLR9-προφλεγμονώδη ανοσοαπόκριση στα pDC είναι πράγματι το εξωιικό DNA. Προκειμένου να ελέγξουμε εάν η απελευθέρωση ενδοιικού DNA αυξάνει την ανοσοδιεγερτική δραστηριότητα των φορέων AAV, ανοίξαμε σκόπιμα τα ιικά καψίδια της "ανοσογόνου" παρτίδας AAV8 A-HEK-1 με θερμική επεξεργασία στους 95 βαθμούς για 10 λεπτά . Η θερμικά επεξεργασμένη παρτίδα φορέα χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τη διέγερση των pDC. Παρόλο που δεν υπήρχαν διαφορές στον πολλαπλασιασμό των αντιδραστικών κυττάρων κατά τη διέγερση της παρτίδας AAV8 A-HEK-1 με και χωρίς θερμική επεξεργασία, υπήρξε σημαντική αύξηση στην απελευθέρωση IP-10, MIP-1 , TNF- και IFN- σε κατάσταση θερμικής επεξεργασίας, υποδεικνύοντας ότι η απελευθέρωση του ενθυλακωμένου ιικού DNA στο εναιώρημα του φορέα μπορεί να συμβάλει στην επαγωγή ανοσολογικών αποκρίσεων (Εικ. 5). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα παρασκευάσματα φορέα AAV μπορεί να περιέχουν εξω-ιικούς μολυντές DNA που μπορούν να προκαλέσουν ανοσοαποκρίσεις ειδικές για παρτίδα σε pDC. Αυτές οι αποκρίσεις διαμεσολαβούνται από τη σηματοδότηση TLR9 και μπορούν να μειωθούν/καταργηθούν με επεξεργασία των παρτίδων φορέων με DNase.

Εικόνα 4. Η προ-αγωγή με DNase μειώνει τις ανοσολογικές αποκρίσεις που προκαλούνται από παρτίδες φορέων "ανοσογόνου" AAV8-CMV-eGFP και AAV2-CMV-eGFP. Τα ανθρώπινα pDC διεγέρθηκαν με παρτίδες "ανοσογονικών" φορέων AAV8 επεξεργασμένες με DNase για 18 ώρες (MOI: 1:1 × 106 vg). (α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες φωτεινού πεδίου καθαρισμένων pDC που διεγείρονται με παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV (επάνω εικόνα) και "ανοσογόνος" παρτίδες φορέων AAV προεπεξεργασμένες με 1{{30}}0 ug/ml DNase I (κάτω εικόνα). Η ράβδος κλίμακας είναι 500 μm. (β) Απελευθέρωση κυτοκίνης IP-10, MIP-1 , TNF- και IFN- 2 από τα διεγερμένα από AAV8-pDC. (γ) Απελευθέρωση κυτοκίνης από pDC που διεγείρονται με AAV. Εφόσον στις μετρήσεις IFN- 2 (b και c) και στη μέτρηση TNF- (b), ορισμένες τιμές έπεσαν κάτω από το εύρος της ανάλυσης, η σταθερά 1 προστέθηκε σε όλες τις μετρημένες τιμές IFN{- 2 και TNF- για παρουσίαση σε ημιλογαριθμική γραφική παράσταση. Εμφανίζονται τα μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις. Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και την post hoc ανάλυση του Holm–Sidak. Τιμές P: Μικρότερο ή ίσο με 0,05: *; Μικρότερο ή ίσο με 0,01: **; Μικρότερο ή ίσο με 0,001: ***.

Διερευνητική ανάλυση εξω-ιικών προσμείξεων DNA σε παρασκευάσματα φορέα AAV8.

Για να πραγματοποιηθεί ο πρώτος διερευνητικός χαρακτηρισμός των εξω-ιικών συστατικών DNA στις παρτίδες φορέων AAV, ένας αντιπροσωπευτικός "ανοσογόνος" (A-HEK-1) και "μη ανοσογόνος" (B-HEK-1) Η παρτίδα φορέα που προέρχεται από κύτταρα ΗΕΚ αναλύθηκε. Αυτές οι παρτίδες είτε υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase σε μέσο pDC για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς όπως περιγράφεται παραπάνω, είτε υποβλήθηκαν σε ψευδή επεξεργασία και υπερδιηθήθηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή φιλτραρίσματος κοπής 100 kDa ή υποβλήθηκαν μόνο σε εικονική επεξεργασία (Εικ. S7a– σολ). Ο διαδοχικός διαχωρισμός του Bioanalyzer LabChip και αξιολόγηση του καθαρισμένου DNA αποκάλυψε την παρουσία συγκρίσιμων ποσοτήτων DNA φορέα (Εικ. S7b–g) σε επεξεργασμένα και ψευδοκατεργασμένα δείγματα κάθε παρτίδας, επιβεβαιώνοντας ότι ούτε η υπερδιήθηση ούτε η επεξεργασία με DNase επηρέασαν το περιεχόμενο DNA μέσα στο καψίδιο. Επιπλέον, έδειξε ότι μόνο ο «ανοσογόνος» (Εικ. S7a–d) αλλά όχι ο «μη ανοσογονικός» φορέας (Εικ. S7a,e–g) περιείχε επιπλέον μόρια DNA που κυμαίνονταν σε μέγεθος από 100 έως 450 bp (Εικ. S7c,d και h). Είναι σημαντικό ότι αυτά τα πρόσθετα μόρια DNA μπορούσαν να ανιχνευθούν στο δείγμα που υποβλήθηκε σε ψεύτικη επεξεργασία και στο υπερδιηθημένο δείγμα, αλλά ουσιαστικά απουσίαζαν στο δείγμα που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNase (Εικ. S7a–d). Αυτό υποδεικνύει ότι αυτά τα μόρια DNA αντιπροσωπεύουν εξω-ιικούς μολυντές DNA που μπορούν να αποικοδομηθούν από την DNase αλλά δεν μπορούν να αφαιρεθούν από το εναιώρημα του φορέα με υπερδιήθηση. Η χρηματοδότηση ότι αυτοί οι μολυσματικοί παράγοντες θα μπορούσαν να ανιχνευθούν μόνο στον "ανοσογόνο" αλλά όχι στον "μη ανοσογονικό" φορέα αποδεικνύει ότι η εμφάνιση αυτών των εξωιικών μορίων DNA είναι ειδική για παρτίδα και μπορεί επιπλέον να υποδηλώνει ότι αυτά τα μόρια προκαλούν ή συνεισφέρουν στις ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες του φορέα. Για την αξιολόγηση της πιθανής πηγής του μολυντικού DNA στην "ανοσογόνο" (A-HEK-1) και "μη ανοσογόνο" (B-HEK-1) παρτίδες ποσοτικής (q)PCR ανάλυσης HEK Πραγματοποιήθηκε κυτταρικό DNA, πλασμιδικό DNA και DNA φορέα ΑΑν. Το πρότυπο DNA από επεξεργασμένα με DNase, ψευδοκατεργασμένα και υπερδιηθημένα και μόνο ψευδώς επεξεργασμένα δείγματα κάθε παρτίδας χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του Alu repeat, του γονιδίου NPIP πολλαπλών αντιγράφων του πυρηνικού γονιδιώματος και των μιτοχονδριακών αλληλουχιών γονιδίου 16S rRNA (mt16S) προέλευσης κυττάρων HEK , για την ενίσχυση ενός ανεστραμμένου τερματικού επαναλαμβανόμενου αμπλικονίου AAV8 (ITR2, φορέας και διαγονιδιακό πλασμιδικό DNA προέλευση) και για την ενίσχυση ενός αμπλικονίου για το γονίδιο blah (αντίσταση στην αμπικιλλίνη) (Amp, πλασμιδική προέλευση DNA) (Πίνακας S4). Σύγκριση των αναλογιών των τιμών ΔCt του αμπλικόνιου ειδικού για το DNA κυττάρων HEK έναντι του ενισχυτικού ITR2 (δηλαδή Alu έναντι ITR2, NPIP έναντι ITR2 και mt16S έναντι ITR2) και του πλασμιδικού DNA-ειδικού ενισχυτικού έναντι του ενισχυτικού ITR2 (Amp έναντι ITR2), αντίστοιχα υποδεικνύει ότι οι δύο παρτίδες περιέχουν αμελητέες ποσότητες πυρηνικού και μιτοχονδριακού DNA κυττάρων HEK. Αντίθετα, η ανάλυση αποκάλυψε μια αξιοπρεπή ποσότητα πλασμιδικού DNA τόσο στον «ανοσογόνο» όσο και στον «μη ανοσογονικό» φορέα (περίπου 1/32 και 1/50, αντίστοιχα, όσον αφορά τον αριθμό αντιγράφων σε σχέση με το DNA AAV). μια αναλογία που είναι αρκετά εντός του εύρους τιμών που αναφέρονται για άλλους φορείς AAV12 (Εικ. S7). Παρ' όλα αυτά, δεν υπήρχαν προφανείς διαφορές στη σχετική αναλογία του DNA του φορέα προς το DNA του πλασμιδίου και του κυττάρου ΗΕΚ μεταξύ των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DNase και ψευδοκατεργασμένα ή υπερδιηθημένα και υποβληθέντα με ψευδή επεξεργασία δειγμάτων και των δύο παρτίδων φορέων (Εικ. S8). Αυτό μπορεί να υποδηλώνει ότι το μη συσκευασμένο μολυσματικό DNA είναι παρόμοιο στη σύνθεση της αλληλουχίας στόχου με αυτό του συσκευασμένου DNA. Ωστόσο, ένας περιορισμός της ανάλυσης qPCR είναι το μέγεθος του μολυσματικού DNA (100–450 bp) το οποίο θα περιέχει ένα αξιοπρεπές κλάσμα θραυσμάτων με ελλιπή αλληλουχία στόχο.

Σχήμα 5. Η απελευθέρωση ενδο-ιικού DNA με θερμική επεξεργασία φορέων ενισχύει τις προφλεγμονώδεις αποκρίσεις κυτοκίνης στα pDC. Απελευθέρωση κυτοκίνης IP-10, MIP-1 , TNF- και IFN- 2 από pDC 18 ώρες μετά τη διέγερση με θερμικά επεξεργασμένη παρτίδα AAV8 A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Οι οριζόντιες γραμμές υποδεικνύουν τα μέσα και τις τυπικές αποκλίσεις. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των αποκρίσεων κυτοκίνης που προκαλούνται από θερμικά επεξεργασμένους και μη επεξεργασμένους φορείς προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το Student t-test. Τιμή P: Μικρότερη ή ίση με 0.01: **; Μικρότερο ή ίσο με 0,001: ***.

Συζήτηση

Οι φορείς AAV είναι ένα από τα πιο πολλά υποσχόμενα εργαλεία στη γονιδιακή θεραπεία. Ωστόσο, η συσσώρευση στοιχείων αμφισβητεί την άποψη ότι η ανοσογονικότητα του AAV είναι αμελητέα5. Υπό το πρίσμα αυτού, έχει γίνει όλο και πιο σημαντικό να κατανοηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί με τους οποίους εμφανίζονται οι ανοσολογικές αποκρίσεις στον AAV. Σε αυτή τη μελέτη αποδεικνύουμε ότι (1) οι AAV8 και AAV2 επάγουν ειδικές για παρτίδα έμφυτες ανοσοαποκρίσεις σε ανθρώπινα pDC που δεν είναι ειδικές για την αναλογία καψιδίου/vg ούτε για την πλατφόρμα παραγωγής ούτε για τη μέθοδο κατασκευαστή/καθαρισμού. (2) οι έμφυτες ανοσοαποκρίσεις στα pDC εξαρτώνται από τη σηματοδότηση TLR9 και μπορούν να μειωθούν με προ-αγωγή με DNase. (3) Η επεξεργασία με DNase δεν επηρεάζει την ακεραιότητα του σωματιδίου φορέα καθώς δεν μειώνει τον ρυθμό μεταγωγής των παρτίδων φορέων AAV8 και AAV2 σε κύτταρα HEK293T. και (4) Οι παρτίδες φορέα AAV μπορεί να περιλαμβάνουν μόρια DNA εξω-ιικού που μπορούν να αφαιρεθούν με επεξεργασία της παρτίδας φορέα με DNase. Αυτό υποδηλώνει ότι τόσο τα παρασκευάσματα AAV που προέρχονται από κύτταρα HEK όσο και Sf{15}}μπορούν να περιέχουν εξωιϊκές ακαθαρσίες DNA που διεγείρουν μια έμφυτη ανοσολογική απόκριση. Σε μια πρόσφατη μελέτη, πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση χρησιμοποιώντας φορείς AAV από διαφορετικά είδη κυττάρου ξενιστή (κύτταρα HEK και κύτταρα Sf9)11. Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι οι φορείς που προέρχονται από HEK και Sf9-διαφέρουν ως προς τα PTM τους και τις υπολειμματικές ακαθαρσίες πρωτεΐνης του κυττάρου ξενιστή σε όλους τους ορότυπους AAV και τους κατασκευαστές που εξέτασαν. Επιπλέον, ανέλυσαν την απόκριση κυτοκίνης των πρωτογενών ανθρώπινων ινοβλαστών στη μεταγωγή AAV και διαπίστωσαν ότι οι φορείς που προέρχονται από HEK και Sf9- μπορεί να διαφέρουν ως προς τις ανοσογονικές τους ιδιότητες. Στη μελέτη μας, συγκρίναμε επίσης αυτά τα δύο κύρια συστήματα παραγωγής χρησιμοποιώντας διαφορετικές παρτίδες της ίδιας κατασκευής AAV από διαφορετικούς κατασκευαστές και δύο διαφορετικούς ορότυπους. Ωστόσο, οι επαγόμενες από τον φορέα ανοσοαποκρίσεις που παρατηρήσαμε στο ανθρώπινο μοντέλο pDC δεν σχετίζονταν ειδικά με ένα δεδομένο σύστημα παραγωγής, κατασκευαστή ή ορότυπο, αντίθετα, ήταν ειδικές για παρτίδα. Προηγούμενες προκλινικές και κλινικές μελέτες γονιδιακής θεραπείας αμφιβληστροειδούς έχουν αναφέρει ότι οι ανοσοαποκρίσεις στους φορείς AAV, όπως η οφθαλμική φλεγμονή ή η διήθηση των ανοσοκυττάρων, μπορεί να επηρεάζονται από διαφορές στην αναλογία καψιδίου/vg18 ή διαφορές στη δόση5. Οι Timmers et al.18 έδειξαν ότι η αφαίρεση κενών καψιδίων AAV από το ιικό εναιώρημα μείωσε τη φλεγμονή και βελτίωσε τη μεταγωγή του ιού σε μια προκλινική μελέτη με πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπήρχαν αυξημένες αναλογίες καψιδίου/vg τόσο μεταξύ των «ανοσογόνων» όσο και των «μη ανοσογόνων» παρτίδων φορέων AAV, πράγμα που σημαίνει ότι μεγαλύτερος αριθμός καψιδίων (κενά καψίδια) στο ιικό εναιώρημα δεν ευθύνεται για την πρόκληση τις ειδικές για παρτίδα φορέα ανοσοαποκρίσεις στο ανθρώπινο μοντέλο pDC μας. Εκτός αυτού, έχουμε δείξει προηγουμένως ότι το AAV8 επάγει ανοσολογικές αποκρίσεις με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου6,8. Ωστόσο, η αύξηση της δόσης των «μη ανοσογόνων» φορέων AAV σε αυτή τη μελέτη δεν ήταν αρκετή για να πυροδοτήσει μια ανοσοαπόκριση σε ανθρώπινα pDC. Ως εκ τούτου, για να κατανοήσουμε την αιτία των διαφορών στις ανοσογονικές ιδιότητες των φορέων, διερευνήσαμε τον μηχανισμό που εμπλέκεται στην αναγνώριση των «ανοσογόνων» παρτίδων AAV. Η χρήση in vitro ανοσοεπαρκών κυτταρικών μοντέλων επέτρεψε στους επιστήμονες να μελετήσουν με μεγαλύτερη ακρίβεια τον ρόλο των μονοπατιών TLR στις εγγενείς ανοσολογικές αποκρίσεις που δημιουργούνται από φορείς AAV9,10. Οι Zhu et al.9frst περιέγραψαν ότι τα pDC, αλλά όχι τα συμβατικά DC ή τα μη pDCs, απελευθερώνουν μεγάλες ποσότητες IFN τύπου Ι και προφλεγμονώδεις κυτοκίνες ως απόκριση στη διέγερση AAV και απέδειξαν τη συμμετοχή της οδού TLR9 στην αναγνώριση των AAV8 και AAV2 χρησιμοποιώντας pDC ποντικιού. Οι συγγραφείς παρατήρησαν επίσης ότι ο AAV2 προκάλεσε ανοσοαποκρίσεις εξαρτώμενες από TLR9- σε ανθρώπινα pDC. Στη μελέτη μας, με τη χρήση ενός από τους πιο ειδικούς ανταγωνιστές του TLR9, του H1549,21-24, δείξαμε έμμεσα ότι όχι μόνο ο AAV2, αλλά και οι φορείς AAV8 επάγουν έμφυτες ανοσιακές αποκρίσεις που εξαρτώνται από TLR9- σε ανθρώπινα pDC, αλλά με πολύ συγκεκριμένο τρόπο. Καθώς το TLR9 είναι ένας υποδοχέας DNA, αυτό υποδηλώνει ότι οι ανοσοαποκρίσεις σε παρτίδες "ανοσογόνου" φορέα AAV προκλήθηκαν από συστατικά DNA. Ωστόσο, αν και οι μετρήσεις μας ddPCR είχαν επιβεβαιώσει ότι τα ίδια συσκευασμένα συστατικά DNA υπήρχαν τόσο σε παρτίδες "ανοσογόνου" και "μη ανοσογόνου" φορέων, οι "μη ανοσογόνες" παρτίδες δεν προκάλεσαν ανοσοαποκρίσεις στα pDC. Επιπρόσθετα, η θεραπεία με DNase είτε μείωσε είτε κατάργησε τις ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες των «ανοσογόνων» παρτίδων φορέων AAV, αλλά δεν μείωσε την ισχύ μεταγωγής αυτών των φορέων σε κύτταρα ΗΕΚ, υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία με DNase του AAV στόχευε το μη ενθυλακωμένο εξωιικό DNA στο εναιώρημα φορέα αλλά δεν επηρέασε την ακεραιότητα του γονιδιώματος του φορέα εντός του ανέπαφου καψιδίου. Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με συγκριτικές αναλύσεις DNA αντιπροσωπευτικών παρτίδων φορέων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DNase και ψευδο-επεξεργασμένες "ανοσογόνους" και "μη ανοσογόνους".

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Συλλογικά, όλα αυτά τα πειράματα υποδεικνύουν ότι η ανοσολογική απόκριση σε παρτίδες "ανοσογόνου" φορέων σε pDCs δεν ενορχηστρώθηκε από το DNA που περιέχεται στα σωματίδια AAV (δηλ. γονιδίωμα φορέα ή πιθανές ακαθαρσίες DNA συσκευασμένες στα καψίδια AAV) αλλά από προσιτό εξωιικό DNA συστατικά που περιέχονται στα ιικά εναιωρήματα (δηλαδή DNA εκτός ή απροστάτευτο από το ιικό καψίδιο). Παρατηρήσαμε επίσης ότι όταν το DNA που περιέχεται στα ιικά καψίδια μιας παρτίδας "ανοσογόνου" φορέα εκτέθηκε στα κύτταρα με θερμική επεξεργασία του φορέα, υπήρξε μια αύξηση στην ανοσολογική απόκριση. Δεν είναι σαφές εάν η αύξηση της ανοσοδιεγερτικής δραστηριότητας μετά το άνοιγμα των καψιδίων οφειλόταν στο μονόκλωνο DNA του φορέα ή σε πιθανές ακαθαρσίες συσκευασμένες στα καψίδια AAV όπως υπολειμματικά νουκλεϊκά οξέα κυττάρων ξενιστή, υπολειπόμενες αλληλουχίες βοηθητικού DNA, αλληλουχία ραχοκοκαλιάς θραύσματα συσκευασμένα μαζί με την κασέτα ή ανάστροφη εκκίνηση από ITR με αποτέλεσμα μικρά θραύσματα ραχοκοκαλιάς συσκευασμένα στο AAV12,25. Ο ακριβής μηχανισμός πρόσληψης εξωιικού DNA από τα pDC παραμένει άγνωστος. Η ανταπόκριση των pDC στα ολιγονουκλεοτίδια CpG δείχνει ότι τα pDC μπορούν να αντιδράσουν στο ελεύθερο DNA26. Αυτό υποδηλώνει ότι η ανοσολογική απόκριση στα pDC μπορεί να πυροδοτηθεί από την πρόσληψη ελεύθερου μολυντικού DNA που περιέχεται στο εναιώρημα φορέα. Επιπροσθέτως, έχει αποδειχθεί ότι τα pDC μπορούν να προσλάβουν φορείς AAV27, υποδηλώνοντας εναλλακτικά ότι το πιθανό συνδεδεμένο με καψίδιο DNA θα μπορούσε να μεταφερθεί στο κύτταρο κατά τη διάρκεια της πρόσληψης των σωματιδίων AAV. Η παρουσία εξω-ιικής μόλυνσης DNA σε παρασκευάσματα φορέα AAV θα μπορούσε είτε να είναι μια εγγενής ιδιότητα της αντίστοιχης παρτίδας φορέων που προκύπτει από τη διαδικασία παραγωγής και καθαρισμού των φορέων είτε μπορεί να οφείλεται στην απελευθέρωση εγκλεισμένου DNA λόγω ακατάλληλων συνθηκών αποθήκευσης . Όλες οι παρτίδες φορέων που εξετάστηκαν σε αυτά τα πειράματα ελήφθησαν κατά την ίδια χρονική περίοδο (5 από τις 8 παρτίδες φορέων AAV8 που εξετάστηκαν, από τις οποίες οι δύο ήταν "ανοσογόνες" (A-HEK-2; A-HEK-3) και τρία ήταν "μη ανοσογόνα" (A-Sf{9-2; B-Sf{9-1; B-Sf9-2) παρήχθησαν ακόμη και παράλληλα ειδικά για αυτήν τη μελέτη), οι παρτίδες από κάθε κατασκευαστής αποστέλλονταν στα ίδια κιβώτια μεταφοράς και, κατά την παραλαβή, όλες οι παρτίδες αποθηκεύτηκαν δίπλα-δίπλα στο ίδιο συρτάρι ενός καταψύκτη με προστασία από συναγερμό θερμοκρασίας -80 βαθμών προτού αποψυχθούν κλάσματα όλων των παρτίδων ταυτόχρονα και εφαρμοστούν στα pDC σε πειράματα δίπλα-δίπλα. Αυτό υποδηλώνει έντονα ότι η διαδικασία παραγωγής και καθαρισμού AAV, και όχι η ακατάλληλη αποθήκευση, ήταν υπεύθυνη για τις διαφορές στην περιεκτικότητα σε εξωιικό DNA και στις ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες αυτών των παρτίδων. Στο παρελθόν, παρτίδες φορέων AAV κλινικού βαθμού που παράγονται για γονιδιακή θεραπεία (alipogene tiparvovec, Glybera) δεν εγκρίνονταν πλέον λόγω υψηλών ποσοτήτων ακαθαρσιών συμπεριλαμβανομένου δυνητικά ανοσογόνου υπολειμματικού DNA του κυττάρου ξενιστή28. Η απομάκρυνση των ακαθαρσιών του DNA από τα ιικά εναιωρήματα πραγματοποιείται συνήθως κατά τη διαδικασία παραγωγής. Εδώ εφαρμόζεται συνήθως η θεραπεία με Benzonase29 ή DNase30 προκειμένου να εξαλειφθεί το υπολειμματικό DNA από το τελικό ιικό εναιώρημα. Αυτή η θεραπεία, ανάλογα με το πρωτόκολλο, διαρκεί από 30 λεπτά έως 3 ώρες και στη συνέχεια το ένζυμο απενεργοποιείται από χημικές ουσίες όπως τα άλατα χλωριούχου καισίου30. Στα πειράματά μας, τέσσερις από τις πέντε παρτίδες AAV8 που προέρχονται από την εγκατάσταση πυρήνων ιικού φορέα του Πανεπιστημίου της Αϊόβα και οι δύο παρτίδες φορέων AAV2 από το Virovek βρέθηκαν να είναι ανοσογόνες σε pDC. Όπως περιγράφεται στην ενότητα "Υλικά και μέθοδοι", η διαδικασία καθαρισμού των παρτίδων φορέα και από τους δύο αυτούς κατασκευαστές περιλαμβάνει διάφορα στάδια καθαρισμού, μερικά από τα οποία διαφέρουν πολύ μεταξύ τους. Έτσι, η διαδικασία καθαρισμού στο Core Facility στην Αϊόβα περιλαμβάνει επεξεργασία με τουρμπονουκλεάση, ακολουθούμενη από υπερφυγοκέντρηση με βαθμίδα ιωδξανόλης, χρωματογραφία στήλης ανταλλαγής ανιόντων, αποστείρωση με πτερυγισμό και ανταλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος με χρήση φυγοκεντρικών φίλτρων. Αντίθετα, η Virovek εφαρμόζει επεξεργασία με βενζονάση, υπερφυγοκέντρηση σε CsCl που ακολουθείται από αφαλάτωση και αποστείρωση με φίλτρο. Η διαδικασία καθαρισμού του Vigene, από την άλλη πλευρά, δεν περιλαμβάνει επεξεργασία με DNase, αλλά, όπως χρησιμοποιείται από την Core Facility στην Αϊόβα, περιλαμβάνει υπερφυγοκέντρηση βαθμίδωσης ιωδξανόλης. Παραδόξως, ωστόσο, καμία από τις τρεις παρτίδες φορέων που προέρχονται από το Vigene (AAV8: C-HEK{-1; AAV2: C-HEK-1 και 2) δεν προκάλεσε ανοσοαποκρίσεις σε pDCs, υποδηλώνοντας ότι "μη ανοσογόνο Οι παρτίδες φορέων μπορούν επίσης να δημιουργηθούν με διαδικασίες παραγωγής που δεν περιλαμβάνουν επεξεργασία με DNase.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-πώς να ενισχύσετε το ανοσοποιητικό σύστημα

Συνολικά, τα εν μέρει παρόμοια και εν μέρει διαφορετικά στάδια καθαρισμού που χρησιμοποιούνται από τους τρεις κατασκευαστές καθιστούν δύσκολη τη σύνδεση των ανοσογονικών ιδιοτήτων των φορέων που παρατηρούνται στο pDC με ένα μόνο στάδιο στη διαδικασία παραγωγής. Οι κλινικές δοκιμές χρησιμοποιούν φορείς ποιότητας καλής παραγωγής (GMP) που υπόκεινται σε αυστηρούς ποιοτικούς ελέγχους. Κανένας από τους φορείς από τους τρεις κατασκευαστές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη δεν είναι καλής εργαστηριακής πρακτικής (GLP) και μπορεί επομένως να είναι χαμηλότερης καθαρότητας από τους φορείς κλινικής ποιότητας. Επομένως, είναι σημαντικό να αναγνωριστεί ότι οι φορείς GMP που χρησιμοποιούνται σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους μπορεί να παρουσιάζουν ή να μην παρουσιάζουν τις διαφορές που παρατηρήσαμε στην παρούσα μελέτη και ότι η συνάφεια των ευρημάτων μας για την κλινική χρήση γονιδιακών θεραπειών δεν είναι ξεκάθαρη. Ωστόσο, σύμφωνα με τη δική μας εμπειρία, σημαντικές διαφορές ανάλογα με την παρτίδα στη συγκέντρωση των μολυσματικών συστατικών, όπως οι πρωτεΐνες του κυττάρου ξενιστή, μπορούν να συμβούν ακόμη και με φορείς ποιότητας GMP, και ακόμη και σε φορείς ποιότητας GMP δεν υπάρχουν ομοιόμορφα συμφωνημένες προδιαγραφές ως προς τα επίπεδα αποδεκτό 5. Συλλογικά, η βελτίωση της διαδικασίας κατασκευής των φορέων AAV είναι το κλειδί για την αποφυγή της παρουσίας υπολειμματικών ακαθαρσιών στα ιικά εναιωρήματα προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα ακούσιων ανοσολογικών αποκρίσεων. Συμπερασματικά, δείξαμε ότι οι εξωιικές ακαθαρσίες DNA μπορούν να επηρεάσουν τις ανοσογονικές ιδιότητες των φορέων AAV σε ανθρώπινα pDC. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση των επιπτώσεων αυτών των ευρημάτων για την ασφάλεια της γονιδιακής θεραπείας με τη μεσολάβηση AAV σε ζωικά μοντέλα ή σε ασθενείς ανθρώπους.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genome engineering using Adeno-associated virus: Βασικές και κλινικές εφαρμογές έρευνας. ΜοΙ. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, Μ. et al. Παράδοση γονιδίου με τη μεσολάβηση AAV σε τρισδιάστατα οργανοειδή του αμφιβληστροειδούς που προέρχονται από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα που προκαλούνται από τον άνθρωπο. Int. J. ΜοΙ. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια του voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) σε ασθενείς με κληρονομική δυστροφία αμφιβληστροειδούς με τη μεσολάβηση RPE: Μια τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη, ανοιχτή δοκιμή φάσης 3. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Εξελίσσοντας AAV-παρείχε θεραπείες προς τις τελικές θεραπείες. J. ΜοΙ. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Ανοσολογικές αποκρίσεις στη γονιδιακή θεραπεία του αμφιβληστροειδούς χρησιμοποιώντας αδενοσχετιζόμενους ιικούς φορείς—Επιπτώσεις για την επιτυχία και την ασφάλεια της θεραπείας. Επαιτώ. Retin. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. Το AAV8 μπορεί να προκαλέσει εγγενείς και προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις στο μάτι των πρωτευόντων. ΜοΙ. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Μειωμένη μεταγωγή αμφιβληστροειδούς και ενισχυμένη ανοσογονικότητα κατευθυνόμενη από διαγονίδια με ενδοϋαλοειδική χορήγηση rAAV μετά από οπίσθια υαλοειδεκτομή σε σκύλους. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Διαμήκης αξιολόγηση υπερ-αντανακλαστικών εστιών στον αμφιβληστροειδή μετά από υποαμφιβληστροειδική χορήγηση αδενοειδούς ιού σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου. Μετάφρ. Vis. Sci. Τεχνολ. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-Το μονοπάτι MyD88 είναι κρίσιμο για προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις σε φορείς γονιδιακής θεραπείας αδενοσυνδεόμενου ιού σε ποντίκια. J. Clin. Ερευνήστε. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, Μ. et αϊ. Ο υποδοχέας τύπου Toll 2-διαμεσολαβούσε την έμφυτη ανοσοαπόκριση σε ανθρώπινα μη παρεγχυματικά ηπατικά κύτταρα προς αδενοσχετιζόμενους ιικούς φορείς. Hepatology 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG et al. Οι μέθοδοι έχουν σημασία: Οι τυπικές πλατφόρμες παραγωγής για ανασυνδυασμένο AAV παράγουν χημικά και λειτουργικά διακριτούς φορείς. ΜοΙ. Ter. Μέθοδοι Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Ακαθαρσίες που σχετίζονται με το προϊόν σε ανασυνδυασμένους φορείς AAV κλινικής ποιότητας: Χαρακτηρισμός και εκτίμηση κινδύνου. Biomedicines 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Κατασκευή ανασυνδυασμένων αδενο-σχετιζόμενων ιικών φορέων για κλινικές δοκιμές. ΜοΙ. Ter. Μέθοδοι Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, Μ., François, Α., Clément, Ν. & Ayuso, Ε. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. ΜοΙ. Ter. Μέθοδοι Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Βιολογία των δενδριτικών κυττάρων πλασμακυτταροειδούς και ο ρόλος της σε ασθένειες που προκαλούνται από το ανοσοποιητικό. Clin. Μετάφρ. Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια της γονιδιακής θεραπείας του αμφιβληστροειδούς χρησιμοποιώντας φορέα ιού που σχετίζεται με αδενοειδές για ασθενείς με χοριοιδαιμία: Μια τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή. JAMA Ophthalmol. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. Αποτελέσματα 2 χρόνια μετά τη γονιδιακή θεραπεία για τη συγγενή αμαύρωση με ανεπάρκεια Leber με RPE και τη σοβαρή δυστροφία του αμφιβληστροειδούς από πρώιμη παιδική ηλικία. Ophthalmology 123, 1606–1620 (2016).

18. Timmers, ΑΜ et αϊ. Οφθαλμική φλεγμονώδης απόκριση σε ενδοϋαλοειδική ένεση αδενο-σχετιζόμενου φορέα ιού: Σχετική συμβολή γονιδιώματος και καψιδίου. Βουητό. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. et αϊ. Η κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση βελτιώνει την αποτελεσματικότητα μεταγωγής ανασυνδυασμένων φορέων AAV που προέρχονται από βιβλιοθήκη καψιδίων. ΜοΙ. Ter. Μέθοδοι Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL et αϊ. Μια έρευνα της ex vivo/in vitro αποτελεσματικότητας μεταγωγής πρωτογενών κυττάρων και κυτταρικών σειρών θηλαστικών με εννέα φυσικούς αδενο-σχετιζόμενους ιούς (AAV1-9) και έναν κατασκευασμένο αδενο-σχετιζόμενο ορότυπο ιού. Virol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, Η. et αϊ. Επίδραση του κατασταλτικού DNA στην επαγόμενη από CpG ανοσοενεργοποίηση. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, Ρ. et αϊ. Ο ανταγωνιστής του υποδοχέα 9 τύπου Toll καταστέλλει τη χυμική ανοσία σε πειραματική αυτοάνοση μυασθένεια gravis. ΜοΙ. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, ΥΚ et αϊ. Κατασκευή αδενο-σχετιζόμενων ιικών φορέων για αποφυγή έμφυτων ανοσολογικών και φλεγμονωδών αποκρίσεων. Sci. Μετάφρ. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, Ι. & Klinman, DM Structure, μηχανισμός και θεραπευτική χρησιμότητα των ανοσοκατασταλτικών ολιγονουκλεοτιδίων. Pharmacol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, ΜΑ et al. 547. Τα παρασκευάσματα AAV περιέχουν μόλυνση από αλληλουχίες DNA σε πλασμίδια παραγωγής ακριβώς έξω από τα ITR. ΜοΙ. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, Ε. et αϊ. Το TLR9 σηματοδοτεί μετά τη μετατόπιση από το ER στο CpG DNA στο λυσόσωμα. Nat. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, Ρ. et al. Τα κύρια υποσύνολα ανθρώπινων δενδριτικών κυττάρων μετατρέπονται αποτελεσματικά από αυτοσυμπληρωματικούς φορείς ιού 1 και 2 που σχετίζονται με αδενοειδείς αγωγούς. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Έκθεση αξιολόγησης: Γλυμπέρα. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Πρόσβαση στις 3 Μαρτίου 2022 (2012)

29. Arden, Ε. & Metzger, J. Φθηνό, ανεξάρτητο από ορότυπο πρωτόκολλο για καθαρισμό φυσικού και βιομηχανικού ανασυνδυασμένου αδενο-συνδεόμενου ιού. J. Biol. Μέθοδοι 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Παραγωγή και χαρακτηρισμός αδενο-σχετιζόμενων ιικών φορέων. Nat. Πρωτοκ. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, Τ. et al. Παραγωγή αδενοσυνδεόμενων φορέων ιών για in vitro και in vivo εφαρμογές. Sci. Απ. 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, Ε. et al. Η υψηλή καθαρότητα φορέα AAV οδηγεί σε ανεξάρτητη από τον ορότυπο και τον ιστό ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της μεταγωγής. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).