2 Μέθοδοι δοκιμής

2.1 Δικτυακή φαρμακολογική ανάλυση

2.1.1 Δραστικά συστατικά του Cistanche deserticola

Με βάση τις υπάρχουσες μελέτες [7, 22], "Echinacoside", "Βερμπασκοσίδη", "Κιστανοσίδη Α", "Σωληνοσίδη Α", "Ισοακτεοσίδη", "2-Ακετυλολακτεοσίδη" και "Σωληνοσίδη BΕπιλέχθηκαν ως τα βιοενεργά συστατικά για ανάλυση. Βρείτε τα τρισδιάστατα δεδομένα χημικής δομής των παραπάνω επτά συστατικών μέσω του Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) και αποθηκεύστε τα σε μορφή sdf.

2.1.2 Πρόβλεψη και έλεγχος πιθανών στόχων

Εισαγάγετε τα αρχεία τρισδιάστατης δομής τουενεργά συστατικά στη βάση δεδομένων PharmMapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html). Επιλέξτε "στόχους ανθρώπινης πρωτεΐνης μόνο" ως το είδος-στόχο και διατηρήστε τις άλλες επιλογές ως προεπιλογές για να λάβετε τα αντίστοιχα δεδομένα διαφορετικών συστατικών. Αντίστοιχος στόχος.

Η βάση δεδομένων UniProt (https://www.uniprot.org/) χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη του ονόματος πρωτεΐνης και του ονόματος γονιδίου που αντιστοιχούν σε κάθε στόχο. Συγχωνεύστε τα σημεία στόχου που αντιστοιχούν στα 7 στοιχεία.

Στη βάση δεδομένων GeneCards (https://www.genecards.org/), χρησιμοποιήστε τη "φλεγμονώδη νόσο του εντέρου" ως λέξη-κλειδί για να αναζητήσετε γονίδια που σχετίζονται με τη φλεγμονώδη νόσο του εντέρου και να οργανώσετε τα αποτελέσματα αναζήτησης.

Συμπλήρωμα Cistanche Αντιφλεγμονώδες συμπλήρωμα υποστήριξης PhGs75% Ech 30% Act 12%

2.1.3 Αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI)

Κατασκευή δικτύου Χρησιμοποιήστε το jvenn (https:/jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html) για να σχεδιάσετε ένα διάγραμμα Venn στο διαδίκτυο για να λάβετε τη διασταύρωση των στόχων ενεργού συστατικού Cistanche deserticola και των στόχων IBD. Ανεβάστε τους ληφθέντες στόχους διασταύρωσης στη βάση δεδομένων String για ανάλυση διαλογής PPI. Κατεβάστε το αρχείο TSV του δικτύου PPI, εισαγάγετε το στο Cytoscape 3.8.0, υπολογίστε την τιμή βαθμού του δικτύου αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών και, στη συνέχεια, ωραιοποιήστε το διάγραμμα δικτύου PPI με βάση την τιμή βαθμών.

2.1.4 Γονιδιακή Οντολογία (GO)

Ο λειτουργικός εμπλουτισμός και η ανάλυση εμπλουτισμού της οδού της Εγκυκλοπαίδειας Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG) πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) για τον εντοπισμό των στόχων των προστατευτικών επιδράσεων των δραστικών συστατικών Cistanche deserticola στην IBD. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση GO στα σημεία και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η βάση δεδομένων DAVID για τη διεξαγωγή ανάλυσης εμπλουτισμού της οδού KEGG στους στόχους όπου τα ενεργά συστατικά του Cistanche deserticola παίζουν προστατευτικό ρόλο στην IBD.

2.1.5 Κατασκευή δικτύου Cistanche deserticola "ενεργό συστατικό-στόχος-οδός"

Τα ενεργά συστατικά του Cistanche deserticola, οι στόχοι διασταύρωσης των δραστικών συστατικών Cistanche deserticola και η IBD και οι οδοί που εμπλουτίστηκαν με το KEGG χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός δικτύου δραστικών συστατικών-στόχων-οδών.

2.2 Επικύρωση ζωικού μοντέλου

2.2.1 Καθιέρωση ζωικού μοντέλου

Χρησιμοποιήθηκαν αρσενικά ποντίκια BALB/c βαθμού SPF (5~8 εβδομάδες, 18~21 g), που παρέχονται από το Κέντρο Δοκιμών Υγιεινής Τροφίμων της Σχολής Εφαρμοσμένων Τεχνών και Επιστημών, Πανεπιστήμιο Beijing Union [Αριθμός άδειας χρήσης πειραματικών ζώων: SYXK (Beijing ) 2017-0038], διατηρήθηκαν σε δωμάτιο ζώων βαθμού SPF με θερμοκρασία (23±2) βαθμούς , σχετική υγρασία 50% έως 70% και 12 ώρες έκθεσης σε φθορίζον φως εναλλάξ ημέρα και νύχτα . Τα πρωτόκολλα πειραμάτων σε ζώα εγκρίθηκαν όλα από το Animal Laboratory του Health Food Testing Center, School of Applied Arts and Sciences, Beijing Union University. Μετά από προσαρμοστική σίτιση για 3 ημέρες, 20 ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες ανάλογα με το σωματικό βάρος, με 5 ποντίκια σε κάθε ομάδα. ①Ομάδα ελέγχου (CZ): πίνετε ελεύθερα αποστειρωμένο νερό και καθαρίστε αποστειρωμένο νερό για 7 συνεχόμενες ημέρες. ②Ομάδα ελέγχου DSS

(DZ): Ελεύθερη κατανάλωση διαλύματος DSS 3% που παρασκευάζεται καθημερινά για 7 συνεχόμενες ημέρες. ③ Ομάδα χαμηλής δόσης ολικών γλυκοσιδών του Cistanche deserticola (LZ) (συγκέντρωση υγρού: 0.1 g/mL): Ελεύθερο προς κατανάλωση διάλυμα 3% DSS που παρασκευάζεται καθημερινά για 7 ημέρες. , υγρό καθετήρα για 7 συνεχόμενες ημέρες. ④ Cistanche deserticola ολικές γλυκοσίδες ομάδας υψηλής δόσης (HZ) (συγκέντρωση υγρού 0.4 g/

mL): Πίνετε το πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα 3% DSS κάθε μέρα ελεύθερα και χορηγήστε το διάλυμα με καθετήρα για 7 συνεχόμενες ημέρες. Μετά από 7 ημέρες συνεχούς μοντελοποίησης, νηστεύτηκαν για 12 ώρες και στη συνέχεια θυσιάστηκαν με εξάρθρημα του τραχήλου της μήτρας. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια κοτόπουλου εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά 4 ώρες πριν από την εκτέλεση. Αμέσως μετά την εκτέλεση, αφαιρέθηκαν οι βολβοί του ματιού για τη συλλογή αίματος. Το περιτοναϊκό υγρό εξήχθη και η κοιλιακή κοιλότητα ανοίχτηκε. Μετρήθηκε το μήκος του παχέος εντέρου και αφαιρέθηκαν ο σπλήνας του ποντικού, ο κόμπος Peyer και άλλα όργανα.

Συμπλήρωμα Cistanche Αντιφλεγμονώδες συμπλήρωμα υποστήριξης

2.2.2 Δείκτης δραστηριότητας ασθενειών (DAI)

Τα ποντίκια ζυγίζονταν πριν από την ενδογαστρική χορήγηση σε καθορισμένη ώρα κάθε μέρα και παρατηρήθηκαν η ψυχική κατάσταση και οι ιδιότητες των κοπράνων των ποντικών. Το κρυφό αίμα στα κόπρανα μετρήθηκε και βαθμολογήθηκε αναλόγως. Τα πρότυπα βαθμολόγησης εμφανίζονται στον Πίνακα 1. Βαθμολογία DAI=(βαθμολογία σωματικού βάρους + βαθμολογία χαρακτήρων κοπράνων + βαθμολογία κρυφού αίματος στα κόπρανα)/3 (1)

Πίνακας 1 Κριτήρια μοριοδότησης DAI

2.2.3 Ποσοτική ανίχνευση φθορισμού PCR σε πραγματικό χρόνο Ανίχνευση μονοπατιού ανοσοποιητικού σήματος (qRT-PCR)

Σπλήνες ποντικών συλλέχθηκαν, κόπηκαν σε μπλοκ ιστού 0,5 cm και εμποτίστηκαν σε διάλυμα σταθεροποίησης RNA ιστού για αποθήκευση. Αφαιρέστε τον ιστό και κόψτε τον σε κομμάτια, προσθέστε διάλυμα εκχύλισης RNA και τρίψτε σε κομμάτια για να εξαγάγετε το συνολικό RNA. Μετά την αντίστροφη μεταγραφή και την ενίσχυση PCR, ανιχνεύθηκε η ενεργοποίηση δύο βασικών μονοπατιών ανοσολογικής σηματοδότησης, του mTOR και του TGF- , σε σπλήνες ποντικών. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην qRT-PCR φαίνονται στον Πίνακα 2.

Πίνακας 2 Πίνακας ακολουθίας εκκινητών